Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin 3 phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:192

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm Tạo được chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cho cá làm ứng viên cho nghiên cứu sản xuất vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển nuôi lồng có giá trị kinh tế. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin 3 phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI VŨ THỊ BÍCH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 9.42.01.21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1: PGS.TS. Nguyễn Xuân Viết 2: PGS.TS. Phạm Thị Tâm HÀ NỘI- NĂM 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi là Vũ Thị Bích Huyền, nghiên cứu sinh khóa K34 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Xuân Viết và PGS.TS. Phạm Thị Tâm. 2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố. 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng năm Nghiên cứu sinh Vũ Thị Bích Huyền
LỜI CẢM ƠN Để thực hiện và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ trợ, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên từ nhiều cơ quan, tổ chức, cá nhân. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất đến hai thầy, cô giáo kính mến của mình, PGS.TS. Nguyễn Xuân Viết (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội) và PGS. TS. Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội). Thầy cô là người trực tiếp hướng dẫn khoa học, tận tình chỉ bảo, định hướng, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm nghiên cứu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Thầy cô luôn luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận án này. Tôi xin cảm ơn nhóm nghiên cứu đã nhiệt tình hỗ trợ tôi thực hiện đề tài của mình bao gồm Th.S Mẫn Hồng Phước (Viện Công nghệ sinh học), Th.S Cao Thị Thanh Hương, ThS. Nguyễn Thị Hải Yến; Th.S Huỳnh Việt Tùng, ThS. Đặng Thị Hồng Thắm và các sinh viên Đỗ Thanh Vân, Nguyễn Đăng Quang (ĐHSPHN), Đàm Thận Quảng, Nguyễn Mạnh Hùng, Hà Huy Tùng (Viện ĐH Mở HN). Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các cán bộ - giảng viên - sinh viên trong bộ môn Di truyền học - Hóa Sinh, các cán bộ - giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã ủng hộ tạo điều kiện để tôi có thể thực hiện các nội dung trong đề tài. Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành chương trình học Nghiên cứu sinh tại Trường. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ - giảng viên - sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn để tôi có thể triển khai thuận lợi các nội dung của đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm Nghiên cứu sinh Vũ Thị Bích Huyền
DANH MỤC VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ và nghĩa Việt 1 A Adenine 2 Ala Alanine 3 Asn Asparagine 4 Asp Aspartic acid 5 bp Base pair 6 BHI Brain Heart Infusion 7 CFU Colony Forming Units 8 C Cytosine 9 DNA Deoxyribonucleic acid (axit nucleic) 10 Gln Glutamine 11 Glu Glutamic acid 12 Gly Glycine 13 G Guanine 14 His Histidine 15 Ile Isoleucine 16 KIA Kligler Iron Agar 17 KP Kanagawa phenomenon 18 Leu Leucine 19 LPS Lipopolysaccharides 20 LD50 Lethal dose (Liều gây chết trung bình) 21 LB Luria Broth 22 Met Methionine 23 NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia) 24 Phe Phenylalanine 25 PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) 26 Pro Proline 27 OMPs Outer membrane proteins (Protein màng ngoài) 28 ORF Open reading frame (Khung đọc mở)
29 PBS Phosphate buffered saline 30 RRDR Rifampicin-resistance determining region (Vùng xác định kháng rifampicin) 31 RNA Ribonucleic acid 32 Ser Serine 33 TRH TDH-related haemolysin 34 TDH Thermostable direct haemolysin 35 TLH Thermolabile haemolysin 36 TCBS Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose 37 Thr Threonine 38 RPS Relative percent survival (Tỉ lệ bảo hộ) 39 T Tymine 40 Tyr Tyrosine 41 Val Valine 42 & cs Và cộng sự 42 VPGs Vibrio parahaemolyticus ghosts
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài .................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 3 3. Nội dung nghiên cứu............................................................................................... 3 4. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 4 5. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................ 4 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.................................................................. 4 7. Tính mới, tính độc đáo của đề tài ............................................................................ 4 8. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................................ 5 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 6 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá ........................................................................................................................ 6 1.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio........................ 6 1.1.2. Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus ......................................................... 8 1.1.3. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin ................................................... 9 1.1.4. Gen rpoB và tính kháng rifampicin .................................................................. 12 1.1.5. Kháng nguyên của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus...................................... 14 1.2. Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển .......................................................................... 15 1.2.1. Triệu chứng .................................................................................................... 15 1.2.2. Chẩn đoán và điều trị ...................................................................................... 17 1.3. Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động.................................................................... 18 1.3.1. Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá ................................................................ 18 1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương ........................................................................ 21 1.3.3. Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá............................................................ 23 1.4. Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá................................................................................................................... 25
1.4.1. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân vật lý ............................................... 25 1.4.2. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân hóa học ........................................... 26 1.4.3. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng kĩ thuật gen ................................................... 32 1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận do cho cá .......... 35 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 35 1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ................................................................... 38 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 41 2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................ 41 2.1.1. Cá bệnh .......................................................................................................... 41 2.1.2. Cá thí nghiệm ................................................................................................. 41 2.1.3. Vi khuẩn ......................................................................................................... 41 2.1.4. Hóa chất ......................................................................................................... 41 2.1.5. Thiết bị ........................................................................................................... 42 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 43 2.2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính ....................................................................... 43 2.2.2. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh .................. 43 2.2.3. Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn ........................................................... 44 2.2.4. Phương pháp nhuộm Gram.............................................................................. 44 2.2.5. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn ...................... 44 2.2.6. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh hóa, đặc tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn ......................................................................................................... 44 2.2.7. Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn .................................................... 47 2.2.8. Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin ..................................................... 48 2.2.9. Phương pháp đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin. .......... 49 2.2.10. Nhóm phương pháp sinh học phân tử ............................................................ 50 2.2.10.1. Phương pháp thiết kế mồi....................................................................... 50 2.2.10.2. Phương pháp tách DNA tổng số ............................................................. 50
2.2.10.3. Phương pháp PCR, giải trình tự gen ....................................................... 50 2.2.11. Phương pháp tin sinh..................................................................................... 52 2.2.12. Phương pháp đánh giá tính ổn định về độc lực và độ an toàn của dòng vi khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam ................................................................. 52 2.2.13. Phương pháp đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng giảm độc lực trên cá mú ................................................................................................................ 53 2.2.14. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 54 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................... 55 3.1. Phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận................. 55 3.1.1. Phân lập vi khuẩn Vibrio ................................................................................. 55 3.1.2. Phân tích đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập............................. 58 3.1.3. Xác định chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng phương pháp phân tử ......... 62 3.1.4. Đánh giá khả năng gây bệnh cho cá mú của các chủng vi khuẩn phân lập......... 65 3.1.5. Phân lập, giải trình tự các gen độc tố toxR, tlh và gen rpoB các chủng vi khuẩn phân lập .................................................................................................................... 68 3.2. Kết quả tạo dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực ................................. 78 3.2.1. Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin ............................... 78 3.2.2. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực ..................... 90 3.2.3. So sánh trình tự gen toxR, tlh và rpoB của các dòng giảm độc lực so và chủng vi khuẩn dại .............................................................................................................. 90 3.2.3.1. So sánh trình tự gen toxR và tlh của dòng giảm độc lực và chủng vi khuẩn dại........................................................................................................................ 90 3.2.3.2. So sánh trình tự rpoB của chủng dại với các dòng giảm độc lực ................ 99 3.3. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch, khả năng sinh trưởng của dòng vi khuẩn giảm độc lực ............................................................................................................... 104 3.3.1. Đánh giá tính ổn định độc lực, khả năng sinh trưởng của dòng giảm độc lực..... 104 3.3.2. Xác định tính an toàn của dòng L4650 ........................................................... 106
3.3.3. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn giảm độc lực ở cá mú ..................................................................................................................... 107 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 112 4.1. Kết luận ............................................................................................................... 112 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 113 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ............................................................ 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 115 Tài liệu tiếng Việt ....................................................................................................... 115 PHỤ LỤC
DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính ............................................................... 43 Hình 2.2. Tiêm truyền dịch khuẩn gây nhiễm bệnh cho cá mú ............................... 48 Hình 3.1. Khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường TCBS ........................ 57 Hình 3.2. Phản ứng lên men trên môi trường KIA (A) và phản ứng sinh indol với thuốc thử Kovac (B) của các mẫu vi khuẩn ............................................ 59 Hình 3.3. Vi khuẩn VCTT 12233 (A) và HH3.34 (B) sinh enzym catalase làm sủi bọt khi thử nghiệm với H2O2 ................................................................... 60 Hình 3.4. Vi khuẩn LBT6 gây hiện tượng tan huyết trên môi trường thạch máu (A) và có khả năng di động trên môi trường LB bán lỏng (B) ...................... 60 Hình 3.5. Vi khuẩn N13.1.1 nuôi trên BHI agar với 5 đĩa giấy kháng sinh ............ 61 Hình 3.6. DNA tổng số của các vi khuẩn điện di trên gel agarose ......................... 62 Hình 3.7. Sản phẩm PCR khuếch đại gen toxR của các mẫu vi khuẩn với cặp mồi toxR-4, toxR-7.......................................................................................... 64 Hình 3.8. Sản phẩm PCR (~450 bp) khuếch đại gen tlh của các mẫu vi khuẩn với cặp mồi tlhF-tlhR .................................................................................... 65 Hình 3.9. Cá mú chết ở ngày thứ 3 sau gây nhiễm chủng LBT6 (A) và ở ngày thứ 9 sau gây nhiễm chủng LBT6 với hiện tượng nội tạng bị tổn thương nghiêm trọng (B) ..................................................................................... 66 Hình 3.10. Sản phẩm PCR (~1000 bp) khuếch đại gen toxR của các chủng vi khuẩn với cặp mồi toxR2, toxR4 ........................................................................ 68 Hình 3.11. So sánh hai trình tự gen toxR của chủng LBT6 được khuếch đại bởi 2 cặp mồi toxR2-toxR4 (LBT6-toxR-seqA) và toxR-4, toxR-7 (LBT6-toxR-seqB) ......... 70 Hình 3.12. Sơ đồ minh họa các đoạn trình tự gen toxR của các chủng V. parahaemolyticus trên NCBI với trình tự tương ứng trên gen toxR hoàn chỉnh của chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13 .......................................... 71 Hình 3.13. Sản phẩm PCR (~1500 bp) khuếch đại gen tlh của các chủng vi khuẩn với cặp mồi tlh1- tlh3 .............................................................................. 72
Hình 3.14. So sánh hai trình tự gen tlh của chủng LBT6 được khuếch đại bởi 2 cặp mồi tlhF - tlhR (LBT6-tlh-seqA) và tlh1-tlh3 (LBT6-tlh-seqB) ........................ 74 Hình 3.15. Sơ đồ minh họa các đoạn trình tự gen tlh của các chủng V. parahaemolyticus trên NCBI với trình tự tương ứng trên gen tlh hoàn chỉnh của chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13 .......................................... 75 Hình 3.16. Sản phẩm PCR (~984 bp) gen rpoB của các chủng vi khuẩn với cặp mồi 1110F-CM32b ......................................................................................... 76 Hình 3.17. Tỉ lệ sống sót của cá ngựa vằn sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh từ chủng dại A3.3 .................................................................... 78 Hình 3.18. Cá ngựa vằn chết do nhiễm khuẩn A3.3 sau 12 giờ............................... 79 Hình 3.19. Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh từ chủng dại A3.3 .................................................................................... 80 Hình 3.20. Cá rô phi chết do nhiễm vi khuẩn (A) A3.3; (B) A400 ......................... 80 Hình 3.21. Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh từ chủng dại LBT6 .................................................................................. 83 Hình 3.22. Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm bằng các dòng vi khuẩn phát sinh từ chủng vi khuẩn dại B3.13 ............................................................ 87 Hình 3.23. Đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực ....................... 90 Hình 3.24. Sản phẩm PCR gen toxR của các dòng giảm độc lực trên gel agarose .. 91 Hình 3.25. Sản phẩm PCR gen tlh của các dòng giảm độc lực trên gel agarose .... 91 Hình 3.26. Sự tương đồng vị trí các amino acid Ser152, Gly203, Asn247 và His392 của TLH ở 3 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus LBT6, A3.3, B3.13 và VvPla của chủng V. vulnificus................................................................. 97 Hình 3.27. Mô hình cấu trúc 3D protein TLH của chủng vi khuẩn LBT6 (A) và dòng L4650 (B) ....................................................................................... 98 Hình 3.28. Vị trí xoắn a 250-252 của TLH ở các dòng vi khuẩn và chủng dại khi được xây dựng bằng phần mềm Phyre2 .................................................. 99 Hình 3.29. Sản phẩm PCR của gen rpoB ở các dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực trên gel agarose 1% ......................................................... 100
Hình 3.30. Cá mú bình thường (A) và cá mú bị chết do vi khuẩn LBT6 (B) ........ 105 Hình 3.31. Đường cong tăng trưởng của chủng vi khuẩn LBT6 và dòng L4650 .. 105 Hình 3.32. Tỉ lệ cá chết cộng dồn khi được tiêm với chủng LBT6 và dòng L4650 ............................................................................................................... 106
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn V. parahaemolyticus .............................. 7 Bảng 1.2. Danh sách một số vắc-xin được cấp phép sử dụng cho cá ...................... 20 Bảng 2.1. Trình tự và đặc điểm của các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR .......... 51 Bảng 3.1. Các vi khuẩn phân lập từ mẫu cá bị bệnh ................................................ 55 Bảng 3.2. Đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập ................................. 58 Bảng 3.3. Đặc tính kháng 5 loại kháng sinh của 11 mẫu vi khuẩn phân lập............ 61 Bảng 3.4. Sự có mặt của các gen độc tố ở các mẫu vi khuẩn phân lập .................... 63 Bảng 3.5. Tỉ lệ sống sót của các mú khi gây nhiễm với chủng vi khuẩn phân lập .. 66 Bảng 3.6. So sánh trình tự gen toxR của chủng V. parahaemolyticus LBT6 với các trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST................................................................ 69 Bảng 3.7. So sánh trình tự gen tlh của chủng V. parahaemolyticus LBT6 với các trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST ............................................... 73 Bảng 3.8. So sánh trình tự gen rpoB của chủng V. parahaemolyticus LBT6 với các trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST ............................................... 76 Bảng 3.9. Giá trị LD50 của chủng A3.3 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin ... 81 Bảng 3.10. Giá trị LD50 của chủng LBT6 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin 84 Bảng 3.11. Giá trị LD50 của chủng B3.13 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin87 Bảng 3.12. Sự thay đổi nucleotide của gen tlh ở các dòng giảm độc lực so với các chủng dại ................................................................................................. 92 Bảng 3.13. Những vị trí amino acid thay đổi trong đoạn trình tự gen rpoB (930 bp) của các dòng giảm độc lực so với các chủng dại .................................. 101 Bảng 3.14. Đánh giá tính ổn định độc lực của dòng vi khuẩn L4650 ................... 104 Bảng 3.15. Đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam được tiêm vắc-xin L4650 sau 15 ngày và 60 ngày................................................................................ 107 Bảng 3.16. Tỉ lệ cá chết và tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá được tiêm vắc-xin L4650 ở các khoảng thời gian khác nhau ............................................................ 110
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Với lợi thế bờ biển dài (3.260 km) lại trải suốt từ Bắc đến Nam, tiềm năng kinh tế từ biển của nước ta là rất lớn. Nghề đánh bắt và khai thác thủy hải sản có từ ngàn đời xưa đang ngày càng khẳng định vị trí và vai trò là ngành kinh tế mũi nhọn, đóng góp to lớn vào nền kinh tế quốc dân. Theo Tổng cục Thống kê, năm 2018 GDP toàn ngành thủy sản đạt 190.123 tỷ đồng, chiếm 3,43% toàn nền kinh tế và 23,57% toàn ngành nông nghiệp, tăng trưởng 6,46% so với năm 2017, đạt tốc độ tăng trưởng cao nhất trong ngành nông nghiệp, đóng góp 0,22 điểm phần trăm vào tăng trưởng chung toàn ngành nông nghiệp và cả nước [187]. Ngành nuôi trồng thủy sản nước ta liên tục tăng trưởng trong suốt 17 năm qua cả về diện tích và sản lượng. Tổng sản lượng thủy sản nước ta năm 2018 đạt 7,76 triệu tấn, trong đó sản lượng thủy sản nuôi trồng đạt 4,15 triệu tấn (chiếm 53,48%); tăng 6,7% so với năm 2017 [183]. Nhiều loài cá có giá trị kinh tế được nuôi phổ biến như cá chẽm (Lates calcarifer), cá hồng (Latjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú (Epionephelus spp)… Sản lượng cá nuôi lồng đạt 32 nghìn tấn trên diện tích nuôi 6.000 ha [183]. Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam cũng như trên thế giới luôn phải đối mặt với những khó khăn và thách thức, đặc biệt những tổn thất do bệnh dịch gây ra. Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), bệnh dịch gây thiệt hại cho ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu hơn 6 tỷ USD mỗi năm, xảy ra ở hầu hết các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, ước tính mỗi năm ngành thủy sản thiệt hại gần 1 tỷ USD do bệnh dịch gây ra [22]. Bệnh hoại tử gan thận cá phát hiện ở 14 quốc gia, trên 48 loài cá khác nhau, trong đó có nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao, được biết là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra [112]. Cá bị bệnh này thường biểu hiện các triệu chứng đặc trưng: xuất hiện các đốm đỏ, lở loét da, vẩy tróc, vây mòn cụt, nội quan xuất huyết, đặc biệt ở gan và thận, cá bị bệnh có thể chết hàng loạt, tỉ lệ chết lên đến 90% [112, 138]. Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận làm cá chết hàng loạt với số lượng lớn được báo cáo hằng năm ở cá nuôi lồng thuộc các
2 tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Bà Rịa - Vũng Tàu… [184, 185, 186]. Cho đến nay, việc kiểm soát và điều trị bệnh hoại tử gan thận cho cá nuôi của người nuôi cá chủ yếu là sử dụng kháng sinh để tiêu diệt vi khuẩn V. parahaemolyticus [34, 61]. Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh một cách thường xuyên và thiếu sự kiểm soát chặt chẽ trong điều trị bệnh trên cá đã dẫn tới hiện tượng kháng thuốc ở nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh [26]. Mặt khác, dư lượng kháng sinh trong sản phẩm từ cá gây ảnh hưởng chất lượng thực phẩm cũng như sức khỏe của người tiêu thụ [107]. Do đó, sử dụng vắc-xin phòng bệnh là một giải pháp hiệu quả và mang đến sự phát bền vững cho ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta. Vắc-xin phòng bệnh do vi khuẩn gồm nhiều loại khác nhau: vắc-xin bất hoạt, vắc-xin nhược độc, vắc-xin tái tổ hợp, vắc-xin tiểu phần, vắc-xin DNA [125]. Hầu hết các vắc-xin phòng bệnh vi khuẩn cho cá đã được thương mại hóa trên thế giới là vắc-xin bất hoạt bởi tính an toàn cao của loại vắc-xin này. Tuy nhiên, vắc-xin bất hoạt được đánh giá là có thời gian bảo hộ không dài [152]. Mặc dù, đã có một vài nghiên cứu tạo vắc-xin bất hoạt, vắc-xin tái tổ hợp hoặc vắc-xin DNA phòng bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus ở cá đã được công bố, nhưng cho đến nay các vắc- xin như thế được cấp phép thương mại hóa để sử dụng trên cá là chưa có. Vắc-xin nhược độc sử dụng vi khuẩn giảm độc lực đang là một hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng ứng dụng trong sản xuất vắc-xin thương mại cho cá nhờ khả năng cho tỉ lệ bảo hộ cao và thời gian bảo hộ dài. Tạo được chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cho cá có ý nghĩa quan trọng và mang tính quyết định sự thành bại của việc phát triển loại vắc-xin nhược độc. Vì vậy, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận là rất cần thiết, phù hợp với xu hướng và mang đến triển vọng ứng dụng cao trong phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển nuôi lồng có giá trị kinh tế. Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin
3 phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển” được tiến hành nhằm tạo làm cơ sở ban đầu cho việc hướng đến sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoạt tử gan thận ở cá biển. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu chung Tạo được chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cho cá làm ứng viên cho nghiên cứu sản xuất vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển nuôi lồng có giá trị kinh tế. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Tạo được vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực từ chủng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan thận cá phân lập được bằng phương pháp xử lý với kháng sinh rifampicin. - Xác định được cơ sở di truyền liên quan đến những biến đổi trình tự nucleotide trong các gen mã hóa protein độc tố (gen độc tố toxR, tdh, trh, tlh) và gen rpoB ở các dòng vi khuẩn Vibrio giảm độc lực. - Đánh giá được khả năng bảo hộ của dòng vi khuẩn giảm độc lực đã tạo ra. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu phân lập và xác định các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển nuôi (cá mú, cá hồng, cá bớp) tại vùng biển miền Bắc Việt Nam. - Nghiên cứu tạo các dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực từ các chủng vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp xử lý các chủng gây bệnh với rifampicin và phân tích những sai khác về trình tự nucleotide của một số gen mã hoá protein độc tố (toxR, tdh, trh, tlh) và gen rpoB của các dòng V. parahaemolyticus giảm độc lực so với vi khuẩn dại. - Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng V. parahaemolyticus trên loài cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) và chọn dòng V. parahaemolyticus làm ứng viên nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển nuôi.
4 4. Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển. 5. Phạm vi nghiên cứu Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập từ cá biển nuôi tại các vùng biển quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng); vùng biển Đồng Châu (Thái Bình); vùng biển Hải Thịnh (Nam Định) và các dòng đột biến giảm độc lực được tạo ra. 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 6.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp thêm cơ sở dữ liệu các chủng V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho cá nuôi ở một số vùng biển miền Bắc về các đặc điểm hình thái, hóa sinh và khả năng kháng kháng sinh, đồng thời, cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu dịch tễ và xây dựng các giải pháp chẩn đoán bệnh. Phát hiện những đột biến trong gen độc tố và gen ropB của các dòng V. parahaemolyticus kháng rifampicin, giảm độc lực là có ý nghĩa khoa học góp phần định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển vắc-xin sống nhược độc sử dụng trong phòng bệnh cho cá biển nuôi lồng. Kết quả đánh giá khả năng bảo hộ (RPS) của dòng V. parahaemolyticus giảm độc lực đối với bệnh hoại tử gan thận trên cá mú chấm cam (E. coioides) đã cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu miễn dịch và phòng bệnh cho cá biển nuôi lồng. 6.2. Ý nghĩa thực tiễn Vi khuẩn V. parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả năng gây đáp ứng miễn dịch sẽ là ứng viên để sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá mú chấm cam cũng như một số loài cá biển khác. 7. Tính mới, tính độc đáo của đề tài Luận án là một trong những công trình đầu tiên nghiên cứu tạo vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực làm ứng viên cho sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá biển bằng phương pháp xử lý kháng sinh
5 rifampicin. Lần đầu tiên kích thước đầy đủ của gen tlh ở vi khuẩn V. parahaemolyticus được nhân bản thành công. Phát hiện được các sai khác trình tự nucleotide trong các gen tlh và rpoB giữa các dòng giảm độc lực và chủng dại, cung cấp cơ sở di truyền chứng minh mối liên quan giữa các đột biến trong gen độc tố tlh và gen rpoB với tính giảm độc lực ở vi khuẩn V. paraheamolyticus. Chọn được dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực L4650 là ứng viên tiềm năng cho nghiên cứu phát triển vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển nuôi lồng. Dòng đột biến giảm độc lực L4650 biểu hiện ổn định về độc lực, tỉ lệ sống sót của cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) được tiêm liều 100 µl/con, 105 CFU/ml đạt 100%. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá mú được tiêm chủng vi khuẩn L4650 đạt cao, từ 96,91 - 100% sau 15 ngày tiêm chủng và 93,33 - 100% sau 6 tháng tiêm chủng. 8. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Di truyền - Hóa sinh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2014 đến tháng 4/2019.
6 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá 1.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh cho rất nhiều loài thủy sản bao gồm cả tôm, cá. Theo khóa phân loại của Bergey, V. parahaemolyticus thuộc [56]: Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Vibrionales Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio Loài: V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, dạng hình dấu phẩy, kích thước khoảng (0,5-0,8) x (1,4-2,4) µm, không sinh bào tử, có tiên mao, có khả năng di động, kỵ khí không bắt buộc, ưa môi trường kiềm mặn và có thời gian thế hệ là 8 - 9 phút [30]. V. parahaemolyticus thường sống ở các cửa sông và ven biển của hầu hết các vùng biển trên thế giới, phân lập được từ cát, bùn và nước biển, cũng như ở thủy sản bị bệnh [150]. Trên môi trường chọn lọc TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile- Salts-Sucrose), khuẩn lạc của V. parahaemolyticus có mầu xanh đậm, dạng tròn đều và bóng với kích thước từ 2 - 3 mm [101]. Vì thế, môi trường TCBS thường được dùng để chọn lọc các loài thuộc vi khuẩn Vibrio spp. Tuy nhiên, sử dụng môi trường TCBS để chọn lọc vẫn không phân biệt được V. parahaemolyticus với Vibrio vunlnificus và Vibrio mimicus [27]. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể được phân biệt với nhau bằng kiểu huyết thanh (serotype). Kiểu huyết thanh O4:K48; O1:K6; O3:K6 được phát hiện phổ biến trong các mẫu bệnh phẩm, đặc biệt là vi khuẩn có kiểu huyết thanh O3:K6 [101]. Đặc điểm sinh hóa là loại chỉ tiêu rất quan trọng để định danh một loài vi khuẩn cụ thể. Vi khuẩn V. parahaemolyticus có các đặc điểm hóa sinh đặc trưng như: có khả năng sinh enzyme catalase, sinh enzyme oxidase, khả năng sử dụng
7 lysine, ornithine, arginine, khả năng lên men glucose nhưng không lên men lactose, không sinh H2S, sinh indole và có khả năng di động (Bảng 1.1) [14]. Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn V. parahaemolyticus [14] Các phản ứng sinh hóa V. parahaemolyticus Sinh catalase + Sinh oxidase + Phản ứng lên men yếm khí + Phản ứng lên men hiếu khí + Sinh beta – galactosidase - Agrinine - Lysine + Ornithine - Sử dụng citrate - Sinh H2S - Sinh urease - Sinh tryptophane - Sinh indole + Phản ứng Voges - Proskauer + Sinh gelatinase + Sử dụng đường Glucose + Manitol + Inositol - Sorbotol - Rhamnose - Sucrose - Melibiose - Amygdalin + Arabinose - Lactose - Ghi chú: (+) dương tính, (-) âm tính Một trong những đặc tính sinh hóa quan trọng của vi khuẩn V. parahaemolyticus là phản ứng KP (Kanagawa phenomenon). Đây là phản ứng làm tan huyết dạng β (tan huyết hoàn toàn, xuất hiện vòng ly giải trong suốt quanh khuẩn lạc) cho kết quả dương tính KP do vi khuẩn sinh độc tố haemolysin phá hủy hồng cầu trên môi trường thạch máu [101]. V. parahaemolyticus là vi khuẩn hiếu khí tùy ý có thể sinh trưởng ở điều kiện có hoặc không có O2 [53]. Sự phân bố của V. parahaemolyticus trong môi trường tự nhiên có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ của môi trường nước. Vi khuẩn này có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 5℃- 43℃, tối ưu ở 37℃. Ở vùng nước có nhiệt độ trên 15℃, V. parahaemolyticus xuất hiện quanh