Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét và tính kháng thuốc sốt rét của Plasmodium falciparum tại một số tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:160

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xác định được thành phần, cơ cấu loài KSTSR tại ba tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam; đánh giá được tính đa hình di truyền của quần thể P. falciparum và P.vivax;.... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét và tính kháng thuốc sốt rét của Plasmodium falciparum tại một số tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam

§¹i häc quèc gia hµ néi Tr-êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn Tr-¬ng V¨n H¹nh Nghiªn cøu tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña ký sinh trïng sèt rÐt vµ tÝnh kh¸ng thuèc sèt rÐt cña Plasmodium falciparum t¹i mét sè tØnh biªn giíi thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hµ Néi - 2013
§¹i häc quèc gia hµ néi Tr-êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn Tr-¬ng V¨n H¹nh Nghiªn cøu tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña ký sinh trïng sèt rÐt vµ tÝnh kh¸ng thuèc sèt rÐt cña Plasmodium falciparum t¹i mét sè tØnh biªn giíi thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam Chuyªn ngµnh: Di truyÒn häc M· sè: 62 42 70 01 LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Ng-êi h-íng dÉn khoa häc: 1. PGS.TS. TrÞnh §×nh §¹t 2. PGS.TS. Hå §×nh Trung Hµ Néi - 2013
Lêi cam ®oan T«i xin cam ®oan ®©y lµ c«ng tr×nh nghiªn cøu cña b¶n th©n t«i. C¸c sè liÖu, kÕt qu¶ trong luËn ¸n nµy lµ trung thùc vµ ch-a tõng ®-îc c«ng bè trong bÊt kú c«ng tr×nh hoÆc tµi liÖu nµo. T¸c gi¶ Tr-¬ng V¨n H¹nh
Lêi c¶m ¬n T«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c tíi PGS.TS. TrÞnh §×nh §¹t, PGS.TS. Hå §×nh Trung ®· tËn t×nh h-íng dÉn, gióp ®ì t«i trong suèt qu¸ tr×nh häc tËp vµ nghiªn cøu. T«i v« cïng biÕt ¬n cè PGS.TS. NguyÔn §øc M¹nh, ThÇy ®· h-íng dÉn vµ gióp ®ì t«i trong nh÷ng n¨m ®Çu häc tËp nghiªn cøu sinh vµ thùc hiÖn ®Ò tµi nghiªn cøu. T«i xin tr©n träng c¶m ¬n L·nh ®¹o ViÖn Sèt rÐt-KST-CTT¦ ®· t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi, ñng hé t«i vÒ vËt chÊt, thêi gian vµ tinh thÇn trong qu¸ tr×nh thùc hiÖn luËn ¸n. T«i xin tr©n träng c¶m ¬n c¸c thÇy c« trong Bé m«n Di truyÒn, c¸c thÇy c« Khoa Sinh häc, Phßng §µo t¹o Sau ®¹i häc, c¸c thÇy c« trong Ban gi¸m hiÖu Tr-êng §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn ®· tËn t×nh gióp ®ì t«i trong qu¸ tr×nh häc tËp t¹i Tr-êng. T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n tËp thÓ c¸n bé nghiªn cøu Khoa Sinh häc Ph©n tö vµ c¸n bé c¸c Khoa/Phßng cña ViÖn Sèt rÐt-KST-CTT¦, c¸n bé c¸c Trung t©m phßng chèng sèt rÐt tØnh Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ vµ Thõa Thiªn HuÕ ®· gióp ®ì, ñng hé vµ ®éng viªn t«i trong qu¸ tr×nh häc tËp vµ thùc hiÖn ®Ò tµi trong phßng thÝ nghiÖm còng nh- ë t¹i c¸c ®Þa ®iÓm nghiªn cøu. C¶m ¬n gia ®×nh th©n yªu vµ b¹n bÌ ®· lu«n ®éng viªn, gióp ®ì, t¹o ®iÒu kiÖn cho t«i häc tËp vµ nghiªn cøu. Tr-¬ng V¨n H¹nh
Môc Lôc Më §Çu .......................................................................................................... 1 Ch-¬ng 1- Tæng quan tµi liÖu ............................................................ 5 1.1. BÖnh sèt rÐt ............................................................................................... 5 1.2. C¸c loµi ký sinh trïng g©y bÖnh sèt rÐt ë ng-êi .................................... 5 1.2.1. Thµnh phÇn loµi ký sinh trïng g©y bÖnh sèt rÐt ë ng-êi. ........................ 5 1.2.2. Chu kú ph¸t triÓn cña ký sinh trïng sèt rÐt. ............................................ 5 1.3. Muçi truyÒn bÖnh sèt rÐt. ....................................................................... 7 1.4. T×nh h×nh sèt rÐt trªn thÕ giíi vµ ViÖt Nam ........................................... 8 1.4.1. T×nh h×nh sèt rÐt trªn thÕ giíi. ................................................................. 8 1.4.2. T×nh h×nh sèt rÐt t¹i ViÖt Nam. .............................................................. 10 1.4.3. §Æc ®iÓm vÒ ®iÒu kiÖn tù nhiªn, kinh tÕ x· héi vµ t×nh h×nh sèt rÐt t¹i c¸c tØnh biªn giíi thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam. .................. 12 1.5. Mét sè kü thuËt sö dông trong chÈn ®o¸n, ph©n biÖt 4 loµi KSTSR. 15 1.5.1. Kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa. ....................................... 15 1.5.2. Kü thuËt chÈn ®o¸n nhanh b»ng que thö (Rapid diagnostic test) ......... 16 1.5.3. Kü thuËt PCR chÈn ®o¸n, ph©n biÖt bèn loµi ký sinh trïng sèt rÐt....... 16 1.6. Nghiªn cøu tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña ký sinh trïng sèt rÐt ............. 19 1.6.1. §a h×nh di truyÒn cña P. falciparum .................................................... 19 1.6.2. §a h×nh di truyÒn cña P. vivax .............................................................. 25 1.7. Ký sinh trïng sèt rÐt kh¸ng thuèc ........................................................ 28 1.7.1. §Þnh nghÜa vµ ph©n lo¹i ký sinh trïng sèt rÐt kh¸ng thuèc. ................. 28 1.7.2. Mét sè lo¹i thuèc sö dông trong ®iÒu trÞ bÖnh sèt rÐt ........................... 29 1.7.3. T×nh h×nh KSTSR kh¸ng thuèc trªn thÕ giíi vµ ViÖt Nam ..................... 31 1.7.4. C¬ chÕ t¸c ®éng cña thuèc sèt rÐt ®èi víi KSTSR ................................. 35 1.7.5. §ét biÕn gen ë P. falciparum liªn quan ®Õn kh¸ng thuèc sèt rÐt.......... 38 i
1.7.6. Mét sè kÕt qu¶ nghiªn cøu ph©n tÝch ®ét biÕn gen cña P. falciparum kh¸ng thuèc sèt rÐt. ......................................................................................... 41 Ch-¬ng 2 - §èi t-îng, vËt liÖu Vµ ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu ................................................................................................................ 43 2.1. §èi t-îng nghiªn cøu ............................................................................ 43 2.2. §Þa ®iÓm vµ thêi gian nghiªn cøu ......................................................... 43 2.2.1. §Þa ®iÓm nghiªn cøu ............................................................................. 43 2.2.2. Thêi gian nghiªn cøu ............................................................................. 43 2.3. VËt liÖu nghiªn cøu................................................................................. 43 2.3.1. Dông cô vµ hãa chÊt cho kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u ........................ 43 2.3.2. ThiÕt bÞ vµ hãa chÊt t¸ch chiÕt ADN ..................................................... 43 2.3.3. ThiÕt bÞ, dông cô vµ hãa chÊt ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR ................... 44 2.3.4. ThiÕt bÞ, dông cô vµ hãa chÊt cho ®iÖn di ph©n tÝch kÕt qu¶ PCR ........ 45 2.4. Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu ....................................................................... 45 2.4.1. ThiÕt kÕ nghiªn cøu ............................................................................... 45 2.4.2. MÉu nghiªn cøu. .................................................................................... 45 2.4.3. C¸c kü thuËt sö dông trong nghiªn cøu. ................................................ 47 2.4.4. C¸ch ®¸nh gi¸ kÕt qu¶ ..................................................................................... 58 2.4.5. C«ng thøc tÝnh c¸c chØ sè vµ ph©n tÝch sè liÖu nghiªn cøu ............................. 60 Ch-¬ng 3 - KÕt qu¶ vµ th¶o LuËn .................................................. 62 3.1. Thµnh phÇn, c¬ cÊu loµi KSTSR t¹i c¸c tØnh Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ vµ Thõa Thiªn HuÕ thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam. ....... 62 3.1.1. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh thµnh phÇn, c¬ cÊu loµi KSTSR b»ng kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa................................................................ 62 3.1.2. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh thµnh phÇn, c¬ cÊu loµi KSTSR b»ng kü thuËt PCR. ................................................................................................... 64 ii
3.2. TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña quÇn thÓ P. falciparum t¹i khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam.......................................................................... 71 3.2.1. TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña P. falciparum theo locus msp1 .................. 71 3.2.2. TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña P. falciparum theo locus msp2. ................. 79 3.2.3. TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña P. falciparum theo locus glurp. ................. 86 3.3. TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña P. vivax ë khu vùc B¾c Tr-êng s¬n, ViÖt Nam....................................................................................................... ..89 3.3.1. TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña P. vivax theo locus Pvcs .......................... ..89 3.3.2. TÝnh ®a h×nh di truyÒn theo locus Pvmsp1 .......................................... ..93 3.4. §Æc ®iÓm KSTSR kh¸ng thuèc t¹i 3 tØnh Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ vµ Thõa Thiªn HuÕ thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n ViÖt Nam. .................... 97 3.4.1. Tû lÖ ®ét biÕn cña P. falciparum kh¸ng thuèc pyrimethamin. .............. 97 3.4.2. Tû lÖ ®ét biÕn cña P. falciparum kh¸ng thuèc sulfadoxin.................. 101 3.4.3. Tû lÖ ®ét biÕn cña P. falciparum kh¸ng thuèc chloroquin. ................. 106 KÕT LUËN Vµ KIÕN NGHÞ .................................................................... 112 KÕt luËn ................................................................................................... 112 KiÕn nghÞ .................................................................................................. 113 Danh môc c¸c c«ng tr×nh khoa häc liªn quan ®Õn Néi dung luËn ¸n ............................................................................... 114 Tµi liÖu tham kh¶o .......................................................................... 115 Phô lôc ..................................................................................................... 138 iii
Danh môc b¶ng B¶ng 1.1. T×nh h×nh sèt rÐt ë khu vùc T©y Th¸i B×nh D-¬ng n¨m 2008......... 11 B¶ng 1.2. T×nh h×nh sèt rÐt theo khu vùc ë ViÖt Nam n¨m 2006 vµ 2010 ...... 12 B¶ng 1.3. T×nh h×nh sèt rÐt t¹i khu vùc B¾c Tr-êng S¬n n¨m 2008 vµ 2011 .. 15 B¶ng 1.4. Thµnh phÇn vµ tªn cña mét sè thuèc sèt rÐt .................................... 30 B¶ng 1.5. Thêi gian KSTSR P. falciparum kh¸ng víi c¸c lo¹i thuèc sèt rÐt .. 33 B¶ng 1.6. §ét biÕn ®iÓm trªn gen dhfr cña P. falciparum liªn quan ®Õn kh¸ng pyrimethamin ................................................................................. 38 B¶ng 1.7. Mèi liªn quan gi÷a ®ét biÕn ®iÓm trªn gen dhfr vµ ®¸p øng víi pyrimethamin trªn in vitro cña mét sè chñng, ph©n lËp chuÈn ................. 39 B¶ng 1.8. §ét biÕn ®iÓm trªn gen dhps cña P. falciparum liªn quan ®Õn kh¸ng sulfadoxin ...................................................................................... 40 B¶ng 1.9. Mèi liªn quan gi÷a ®ét biÕn ®iÓm trªn gen dhps vµ ®¸p øng víi sulfadoxin trªn in vitro cña mét sè chñng, ph©n lËp chuÈn ...................... 40 B¶ng 2.1. Tr×nh tù c¸c cÆp måi nh©n b¶n c¸c kiÓu gen cña P. falciparum ..... 50 B¶ng 2.2. Tr×nh tù c¸c cÆp måi x¸c ®Þnh kiÓu gen nh¹y vµ ®ét biÕn ë c¸c vÞ trÝ ®ét biÕn trªn gen dhfr.............................................................................. 54 B¶ng 2.3. Tr×nh tù c¸c cÆp måi x¸c ®Þnh kiÓu gen nh¹y vµ ®ét biÕn ë c¸c vÞ trÝ ®ét biÕn trªn gen dhps ............................................................................ 56 B¶ng 3.1. Tû lÖ ng-êi d©n m¾c sèt rÐt t¹i 3 tØnh Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ vµ Thõa Thiªn HuÕ b»ng kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa ......... 62 B¶ng 3.2. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tû lÖ nhiÔm ®¬n, nhiÔm phèi hîp c¸c loµi KSTSR b»ng kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa............................ 63 B¶ng 3.3. C¬ cÊu loµi KSTSR t¹i khu vùc B¾c Tr-êng S¬n b»ng kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa ............................................................... 64 B¶ng 3.4. Tû lÖ ph¸t hiÖn bÖnh nh©n nhiÔm ®¬n, nhiÔm phèi hîp loµi KSTSR theo kü thuËt PCR ............................................................................... 65 B¶ng 3.5. So s¸nh tû lÖ bÖnh nh©n nhiÔm ®¬n vµ nhiÔm phèi hîp ë khu iv
vùc B¾c Tr-êng S¬n ViÖt Nam ........................................................................ 67 B¶ng 3.6. C¬ cÊu loµi KSTSR t¹i khu vùc B¾c Tr-êng S¬n theo kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa vµ PCR ........................................................ 69 B¶ng 3.7. Tû lÖ ph©n bè c¸c kiÓu gen cña P. falciparum theo locus msp1 ..... 71 B¶ng 3.8. Tû lÖ mÉu nhiÔm ®¬n vµ nhiÔm phèi hîp kiÓu gen theo locus msp1……………………………………………………………..72 B¶ng 3.9. TÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen K1 ............................... 73 B¶ng 3.10. TÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen MAD20 .................... 75 B¶ng 3.11. Tû lÖ ph©n bè c¸c kiÓu gen cña P. falciparum theo locus msp2 ... 79 B¶ng 3.12. TÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen FC ............................. 81 B¶ng 3.13. TÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen IC .............................. 83 B¶ng 3.14. Sè l-îng vµ tÇn suÊt c¸c alen theo locus glurp ............................. 86 B¶ng 3.15. Sè l-îng vµ tÇn suÊt alen cña P. vivax theo locus Pvcs ............... 90 B¶ng 3.16. Tû lÖ kiÓu gen vµ nhiÔm ®¬n, nhiÔm phèi hîp theo locus Pvcs .... 91 Bảng 3.17. Tần suất c¸c alen cña P. vivax theo locus Pvmsp1 ...................... 95 B¶ng 3.18. KÕt qu¶ ph©n tÝch ®ét biÕn trªn gen dhfr cña P. falciparum ......... 98 B¶ng 3.19. Tû lÖ mÉu bÖnh nh©n nh¹y, kh¸ng víi pyrimethamin ................... 98 B¶ng 3.20. Tû lÖ P. falciparum mang kiÓu gen nh¹y vµ ®ét biÕn kh¸ng pyrimethamin trong quÇn thÓ ............................................................... 99 B¶ng 3.21. Sè l-îng ®ét biÕn ®iÓm vµ møc ®é ®¸p øng víi pyrimethamin .. 100 B¶ng 3.22. KÕt qu¶ ph©n tÝch ®ét biÕn trªn gen dhps.................................... 102 B¶ng 3.23. Tû lÖ mÉu bÖnh nh©n nh¹y, kh¸ng víi sulfadoxin ...................... 103 B¶ng 3.24. Tû lÖ P. falciparum mang kiÓu gen nh¹y vµ ®ét biÕn kh¸ng víi thuèc sulfadoxin trong quÇn thÓ ................................................... 109 B¶ng 3.25. Sè l-îng ®ét biÕn ®iÓm vµ møc ®é ®¸p øng víi sulfadoxin ........ 105 B¶ng 3.26. KÕt qu¶ ph©n tÝch ®ét biÕn ®iÓm 76 trªn gen Pfcrt ..................... 106 B¶ng 3.27. Tû lÖ mÉu bÖnh nh©n nh¹y, kh¸ng víi thuèc chloroquin ............ 107 B¶ng 3.28. Tû lÖ P. falciparum mang kiÓu gen nh¹y, vµ kiÓu gen ®ét biÕn kh¸ng víi thuèc chloroquin trong quÇn thÓ ........................................... 107 v
Danh môc h×nh H×nh 1.1. Chu tr×nh ph¸t triÓn cña ký sinh trïng sèt rÐt ................................. ..6 H×nh 1.2. B¶n ®å c¸c quèc gia vµ vïng l·nh thæ cã lan truyÒn sèt rÐt n¨m 2012 ........................................................................................................ 10 H×nh 1.3. B¶n ®å ®Þa h×nh khu vùc B¾c Tr-êng S¬n ....................................... 13 H×nh 1.4. S¬ ®å cÊu tróc locus msp1 cña P. falciparum ................................. 19 H×nh 1.5. S¬ ®å cÊu tróc locus msp2 cña P. falciparum ................................. 20 H×nh 1.6. S¬ ®å m« t¶ cÊu tróc locus Pvcs cña P. vivax ................................. 26 H×nh 1.7. S¬ ®å m« t¶ cÊu tróc locus Pvmsp1 cña P. vivax ........................... 26 H×nh 1.8. T¸c ®éng cña pyrimethamin vµ sulfadoxin lªn enzym dihydrofolate reductase vµ dihydropteroate synthase trong chu tr×nh sinh tæng hîp axit folic.......................................................................................................... 36 H×nh 1.9 (A,B). C¬ chÕ t¸c ®éng cña chloroquin trong lysosome cña KST.... 37 H×nh 2.1. S¬ ®å kü thuËt PCR lång chÈn ®o¸n, ph©n biÖt 4 loµi KSTSR ........ 49 H×nh 2.2. S¬ ®å kü thuËt PCR x¸c ®Þnh kiÓu gen cña P. falciparum ............. 51 H×nh 3.1. ¶nh điện di sản phẩm PCR mẫu bệnh nh©n nhiễm đơn P. falciparum và P. vivax ............................................................................... 66 H×nh 3.2. ¶nh ®iÖn di sản phẩm PCR c¸c mẫu bệnh nh©n nhiễm phèi hîp 2, 3 loµi KSTSR ................................................................................ 66 H×nh 3.3. Tû lÖ bÖnh nh©n nhiÔm ®¬n vµ nhiÔm phèi hîp theo kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa vµ PCR ........................................................ 67 H×nh 3.4. BiÓu ®å c¬ cÊu loµi KSTSR ë khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam.............................................................................. 68 H×nh 3.5. BiÓu ®å biÓu diÔn sù ph©n bè c¸c kiÓu gen theo locus msp1….......72 H×nh 3.6. BiÓu ®å tÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen K1 ................... 74 H×nh 3.7. ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm PCR mét sè mÉu nhiÔm kiÓu gen K1 .......... 74 H×nh 3.8. BiÓu ®å tÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen MAD20 .......... 76 vi
H×nh 3.9. ¶nh ®iÖn di mét sè mÉu bÖnh nh©n nhiÔm kiÓu gen MAD20 ........ 76 H×nh 3.10. ¶nh ®iÖn di mét sè mÉu bÖnh nh©n nhiÔm kiÓu gen RO33 .......... 77 H×nh 3.11. BiÓu ®å biÓu diÔn sù ph©n bè c¸c kiÓu gen theo locus msp2 ........ 80 H×nh 3.12. BiÓu ®å tÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen FC ................. 82 H×nh 3.13. ¶nh ®iÖn di mét sè bÖnh nh©n nhiÔm kiÓu gen FC ...................... 82 H×nh 3.14. BiÓu ®å tÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen IC .................. 84 H×nh 3.15. ¶nh ®iÖn di mét sè bÖnh nh©n nhiÔm kiÓu gen IC ....................... 84 H×nh 3.16. BiÓu ®å tÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen cña locus glurp ............... 87 H×nh 3.17. ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm PCR cña mét sè mÉu bÖnh nh©n nhiÔm c¸c alen theo locus glurp ...................................................................... 87 H×nh 3.18. ¶nh điện di s¶n phÈm PCR cña c¸c alen ë locus Pvcs ................. 89 H×nh 3.19. ¶nh ®iÖn di c¸c mÉu mang kiÓu gen VK210 vµ VK247............... 90 H×nh 3.20. BiÓu ®å tÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë locus Pvcs ................... 91 H×nh 3.21. ¶nh ®iÖn di c¸c alen ®Æc tr-ng ë ®o¹n F1 ..................................... 93 H×nh 3.22. ¶nh ®iÖn di c¸c alen ®Æc tr-ng ë ®o¹n F2 ..................................... 94 H×nh 3.23. ¶nh ®iÖn di c¸c alen ®Æc tr-ng ë ®o¹n F3 ..................................... 94 H×nh 3.24. TÇn suÊt cña c¸c alen ë ®o¹n F1, F2 vµ F3 cña quÇn thÓ P. vivax ....................................................................................... 96 H×nh 3.25. ¶nh ®iÖn di ph¸t hiÖn ®ét biÕn ë vÞ trÝ 108 cña gen dhfr .............. 99 H×nh 3.26. ¶nh ®iÖn di ph¸t hiÖn ®ét biÕn ë vÞ trÝ 581 cña gen dhps ........... 103 H×nh 3.27. ¶nh ®iÖn di ph¸t hiÖn ®ét biÕn ë vÞ trÝ 613 cña gen dhps ........... 103 H×nh 3.28. ¶nh ®iÖn di ph¸t hiÖn ®ét biÕn kh¸ng víi chloroquin ................. 108 vii
C¸c ch÷ viÕt t¾t Ch÷ viÕt t¾t TiÕng Anh TiÕng ViÖt AO Acridine Orange BNSR BÖnh nh©n sèt rÐt bp base pairs CÆp baz¬ nit¬ dhfr dihydrofolate reductase gene dhps dihydropteroate synthase gene dNTPs deoxynucleotide triphosphate EDTA ethylenediaminetetraaetic acid ELISA Enzyme linked Immuno-Sorbant Assay glurp glutamate rich protein gene IFA Indirect Fluorescent Antibody IHA Indirect Heamagglutination KST Ký sinh trïng KSTSR Ký sinh trïng sèt rÐt L Ladder Thang ®o kÝch th-íc ph©n tö ADN MOI Multiplicity Of Infection NhiÔm ®a alen msp1 merozoite surface protein 1 gene Gen m· hãa protein bÒ mÆt 1 msp2 merozoite surface protein 2 Gen m· hãa protein bÒ mÆt 2 RFLP Restriction Fragment Length §a h×nh ®é dµi ®o¹n Polymorphism giíi h¹n PBS Phosphate buffered saline viii
PCR: Polymerase Chain Reaction Pfcrt Chloroquine resistance transporter Gen vËn chuyÓn kh¸ng gene chloroquin Pvcs Plasmodium vivax Gen m· hãa protein thÓ circumsporozoite protein gene thoa trïng cña P. vivax Pvmsp1 Plasmodium vivax merozoite Gen m· hãa protein bÒ surface protein 1 gene mÆt merozoit 1 cña P. vivax QBC Quantitative Buffy Coat SDS Sodium dodecyl sulphate WHO World Heath Organization Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi ix
Më §Çu Sèt rÐt (SR) lµ mét trong nh÷ng bÖnh phæ biÕn, ¶nh h-ëng nghiªm träng tíi søc khoÎ con ng-êi còng nh- ®êi sèng kinh tÕ - x· héi, ®Æc biÖt lµ ë c¸c n-íc nghÌo. Theo b¸o c¸o cña Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi (WHO), hiÖn cã 99 quèc gia vµ vïng l·nh thæ cã SR l-u hµnh. -íc tÝnh kho¶ng 3,3 tØ ng-êi sèng trong vïng cã nguy c¬ SR vµ ng-êi d©n sèng trong vïng cËn sa m¹c Sahara cña Ch©u Phi cã nguy c¬ m¾c bÖnh cao nhÊt. N¨m 2010, -íc tÝnh trªn thÕ giíi cã kho¶ng 216 triÖu ca bÖnh sèt rÐt vµ 655 ngh×n ng-êi tö vong trong ®ã chñ yÕu lµ trÎ em d-íi 5 tuæi vµ phô n÷ cã thai ë Ch©u Phi [152]. ViÖt Nam n»m trong vïng SR l-u hµnh, ®iÒu kiÖn thêi tiÕt, sinh c¶nh phï hîp cho bÖnh ph¸t triÓn. Tõ n¨m 1980, bÖnh SR quay trë l¹i vµ ngµy cµng nghiªm träng víi ®Ønh cao lµ n¨m 1991 c¶ n-íc cã h¬n 1 triÖu ng-êi m¾c, cã 4.646 ng-êi chÕt, h¬n 144 vô dÞch lín x¶y ra ë nhiÒu ®Þa ph-¬ng [3]. ViÖc thùc hiÖn tèt c¸c ho¹t ®éng phßng chèng SR nh÷ng n¨m qua ®· lµm gi¶m râ rÖt tû lÖ m¾c vµ tö vong do SR vµ ViÖt Nam trë thµnh mét trong nh÷ng quèc gia thµnh c«ng nhÊt trong c«ng t¸c phßng chèng SR trªn thÕ giíi [48]. N¨m 2011, c¶ n-íc cã 45.588 bÖnh nh©n SR vµ 14 ng-êi tö vong do sèt rÐt [58]. C¸c tØnh NghÖ An, Hµ TÜnh, Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ vµ Thõa Thiªn HuÕ n»m trong khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, cã ®-êng biªn giíi víi Lµo [45]. Ng-êi d©n sinh sèng t¹i vïng biªn giíi nµy chñ yÕu lµ ng-êi d©n téc thiÓu sè, giao th«ng khã kh¨n, kinh tÕ chËm ph¸t triÓn, cïng víi sù giao l-u lín gi÷a ng-êi d©n hai vïng biªn giíi cho nªn c«ng t¸c phßng chèng sèt rÐt gÆp nhiÒu khã kh¨n [17, 32, 46]. Theo kÕt qu¶ ph©n vïng dÞch tÔ sèt rÐt can thiÖp t¹i ViÖt Nam n¨m 2009, vïng träng ®iÓm sèt rÐt ë khu vùc nµy tËp trung chñ yÕu ë hai tØnh Qu¶ng B×nh vµ Qu¶ng TrÞ trong ®ã sèt rÐt l-u hµnh nÆng ë c¸c huyÖn cã biªn giíi víi Lµo nh- huyÖn LÖ Thñy tØnh Qu¶ng B×nh, huyÖn H-íng Hãa tØnh Qu¶ng TrÞ [22]. HuyÖn A L-íi tØnh Thõa Thiªn HuÕ n¨m 2005 cßn lµ vïng sèt rÐt l-u hµnh nÆng nh-ng ®Õn nay t×nh h×nh SR ®· gi¶m nhiÒu [21]. Ba huyÖn 1
nµy mang nhiÒu ®iÓm ®Æc tr-ng cho t×nh h×nh lan truyÒn sèt rÐt cña khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam nªn ®-îc lùa chän lµm ®Þa ®iÓm nghiªn cøu. C¸c ph-¬ng ph¸p cæ ®iÓn nh- ph-¬ng ph¸p chÈn ®o¸n ký sinh trïng sèt rÐt (KSTSR) b»ng kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa, ®¸nh gi¸ KSTSR nh¹y, kh¸ng víi thuèc ®iÒu trÞ sèt rÐt b»ng kü thuËt in vivo vµ in vitro t¹i thùc ®Þa ®-îc ¸p dông trong c«ng t¸c phßng chèng sèt rÐt ë nhiÒu n-íc trªn thÕ giíi vµ ë ViÖt Nam [55]. Tuy vËy, c¸c ph-¬ng ph¸p nµy cßn cã mét sè h¹n chÕ nh- kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa khã ph¸t hiÖn ®-îc nh÷ng tr-êng hîp ng-êi bÖnh nhiÔm KSTSR víi mËt ®é thÊp hoÆc nh÷ng tr-êng hîp bÖnh nh©n nhiÔm phèi hîp nhiÒu loµi KSTSR trong ®ã chØ cã mét loµi tréi h¼n vÒ sè l-îng [9, 74]. §¸nh gi¸ KSTSR nh¹y, kh¸ng víi thuèc ®iÒu trÞ sèt rÐt b»ng kü thuËt in vivo vµ in vitro t¹i thùc ®Þa ®ßi hái ph¶i theo dâi dµi ngµy, tiªu chuÈn lùa chän bÖnh nh©n nghiªm ngÆt vµ khã ph©n biÖt chÝnh x¸c c¸c tr-êng hîp t¸i ph¸t hay nhiÔm míi [11, 138, 152]. ViÖc ¸p dông c¸c ph-¬ng ph¸p sinh häc ph©n tö trong nghiªn cøu vÒ thµnh phÇn, c¬ cÊu loµi KSTSR [9, 136], tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña quÇn thÓ KSTSR [102, 138], x¸c ®Þnh KSTSR mang ®ét biÕn gen liªn quan ®Õn kh¸ng mét sè lo¹i thuèc ®iÒu trÞ sèt rÐt [8, 125, 146] sÏ kh¾c phôc ®-îc nh÷ng khã kh¨n mµ c¸c ph-¬ng ph¸p cæ ®iÓn kh«ng gi¶i quyÕt ®-îc, cung cÊp c¸c sè liÖu chÝnh x¸c víi ®é tin cËy cao, ®em l¹i hiÖu qu¶ cho c«ng t¸c phßng chèng vµ lo¹i trõ SR. §Ó gãp phÇn ®¸nh gi¸ chÝnh x¸c t×nh h×nh sèt rÐt, møc ®é ®a h×nh di truyÒn cña c¸c quÇn thÓ KSTSR vµ cung cÊp sè liÖu vÒ thùc tr¹ng KSTSR kh¸ng thuèc t¹i mét sè tØnh thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi: “ Nghiªn cøu tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña ký sinh trïng sèt rÐt vµ tÝnh kh¸ng thuèc sèt rÐt cña Plasmodium falciparum t¹i mét sè tØnh biªn giíi thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam” . 2
Môc tiªu cña ®Ò tµi: 1. X¸c ®Þnh ®-îc thµnh phÇn, c¬ cÊu loµi KSTSR t¹i 3 tØnh Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ vµ Thõa Thiªn HuÕ thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam. 2. §¸nh gi¸ ®-îc tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña quÇn thÓ P. falciparum vµ P. vivax. 3. X¸c ®Þnh ®-îc tû lÖ ®ét biÕn kh¸ng cña P. falciparum ®èi víi thuèc sèt rÐt pyrimethamin, sulfadoxin vµ chloroquin. Néi dung cña ®Ò tµi: 1. §iÒu tra c¾t ngang t¹i c¸c ®iÓm nghiªn cøu ë 3 tØnh Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ vµ Thõa Thiªn HuÕ ®Ó thu thËp lam m¸u vµ mÉu m¸u trªn giÊy thÊm Whatman 3MM, ph¸t hiÖn vµ ph©n biÖt KSTSR b»ng kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa vµ PCR. 2. Ph©n tÝch kiÓu gen cña P. falciparum dùa trªn 3 locus gen msp1, msp2 vµ glurp; kiÓu gen cña P. vivax dùa trªn locus gen Pvcs vµ Pvmsp1 ®Ó ®¸nh gi¸ tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña c¸c quÇn thÓ P. falciparum vµ P. vivax. 3. Ph©n tÝch c¸c vÞ trÝ ®ét biÕn ®iÓm trªn gen dhfr ®Ó x¸c ®Þnh tû lÖ P. falciparum mang ®ét biÕn kh¸ng víi thuèc pyrimethamin. 4. Ph©n tÝch c¸c vÞ trÝ ®ét biÕn ®iÓm trªn gen dhps ®Ó x¸c ®Þnh tû lÖ P. falciparum mang ®ét biÕn kh¸ng víi thuèc sulfadoxin. 5. Ph©n tÝch ®ét biÕn ®iÓm ë vÞ trÝ 76 trªn gen Pfcrt ®Ó x¸c ®Þnh tû lÖ P. falciparum mang ®ét biÕn kh¸ng víi thuèc chloroquin. ý nghÜa cña luËn ¸n: • VÒ mÆt khoa häc: KÕt qu¶ cña luËn ¸n cung cÊp nh÷ng sè liÖu khoa häc ®Ó ®¸nh gi¸ chÝnh x¸c thµnh phÇn, c¬ cÊu loµi KSTSR; tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña c¸c quÇn thÓ KSTSR vµ tÝnh kh¸ng thuèc sèt rÐt cña P. falciparum ë khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam. • VÒ mÆt thùc tiÔn: KÕt qu¶ thu ®-îc cña nghiªn cøu gãp phÇn ®¸nh gi¸ t×nh h×nh lan truyÒn sèt rÐt, thùc tr¹ng KSTSR kh¸ng mét sè thuèc sèt rÐt ë 3 3
tØnh thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam. §©y lµ c¬ së khoa häc gióp Ch-¬ng tr×nh Quèc gia phßng chèng vµ lo¹i trõ sèt rÐt lùa chän biÖn ph¸p phßng chèng vµ thuèc ®iÒu trÞ sèt rÐt thÝch hîp, gãp phÇn b¶o vÖ søc kháe céng ®ång. §ãng gãp míi cña luËn ¸n: 1. LÇn ®Çu tiªn cã ®-îc sè liÖu vÒ ®Æc ®iÓm kiÓu gen cña quÇn thÓ P. vivax t¹i c¸c tØnh Qu¶ng B×nh vµ Thõa Thiªn HuÕ thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam. 2. LÇn ®Çu tiªn cã ®-îc sè liÖu vÒ tû lÖ ®ét biÕn kh¸ng cña P. falciparum víi thuèc pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin t¹i 2 tØnh Qu¶ng B×nh vµ Thõa Thiªn HuÕ. Ngoµi ra, luËn ¸n ®· cung cÊp c¸c sè liÖu t-¬ng ®èi ®Çy ®ñ vÒ thµnh phÇn c¬ cÊu loµi, ®a h×nh di truyÒn cña c¸c quÇn thÓ KSTSR, kÕt qu¶ nghiªn cøu kh¸ng thuèc ë giai ®o¹n 2008-2012 kh¼ng ®Þnh P. falciparum cã tû lÖ ®ét biÕn kh¸ng cao víi thuèc pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin. §©y lµ nguån th«ng tin quan träng ®Ó Ch-¬ng tr×nh phßng chèng vµ lo¹i trõ sèt rÐt lùa chän thuèc ®iÒu trÞ sèt rÐt thÝch hîp. Bè côc cña luËn ¸n: - LuËn ¸n cã 138 trang trong ®ã cã 40 b¶ng vµ 39 h×nh - Më ®Çu (4 trang) - Ch-¬ng 1 – Tæng quan tµi liÖu (38 trang) - Ch-¬ng 2 - §èi t-îng, vËt liÖu vµ ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu (19 trang) - Ch-¬ng 3 – KÕt qu¶ vµ th¶o luËn (50 trang) - KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ (2 trang) - C¸c c«ng tr×nh khoa häc cã liªn quan ®Õn luËn ¸n (1 trang) - Tµi liÖu tham kh¶o (23 trang, 59 tµi liÖu tiÕng ViÖt, 95 tµi liÖu tiÕng Anh) - Phô lôc (tõ trang 138) 4
Ch-¬ng 1- Tæng quan tµi liÖu 1.1. BÖnh sèt rÐt BÖnh sèt rÐt lµ mét bÖnh truyÒn nhiÔm do ký sinh trïng Plasmodium ë ng-êi g©y nªn. BÖnh l©y qua ®-êng m¸u, do muçi Anopheles truyÒn. BÖnh biÓu hiÖn l©m sµng b»ng nh÷ng c¬n sèt rÐt víi ba triÖu chøng c¬ b¶n: rÐt run, sèt, ra må h«i. Cã nhiÒu thÓ sèt rÐt ë ng-êi kh¸c nhau nh-: thÓ mang ký sinh trïng l¹nh, thÓ th«ng th-êng ®iÓn h×nh (sèt rÐt ch-a biÕn chøng), thÓ sèt rÐt ¸c tÝnh, thÓ sèt rÐt ®¸i huyÕt cÇu tè. Sèt rÐt l-u hµnh kh¸c nhau ë tõng ®Þa ph-¬ng, trong ®iÒu kiÖn thuËn lîi cã thÓ g©y thµnh dÞch. BÖnh cã thuèc ®iÒu trÞ ®Æc hiÖu vµ cã thÓ phßng chèng ®-îc [24, 26, 29]. 1.2. C¸c loµi ký sinh trïng g©y bÖnh sèt rÐt ë ng-êi 1.2.1. Thµnh phÇn loµi ký sinh trïng g©y bÖnh sèt rÐt ë ng-êi Ký sinh trïng (KST) sèt rÐt thuéc ngµnh ®éng vËt nguyªn sinh, líp Protozoa, hä Plasmodidae, gièng Plasmodium. Cã 4 loµi KST g©y bÖnh sèt rÐt ë ng-êi lµ P. falciparum (Welch, 1897), P. vivax (Grassi vµ Feletti, 1890), P. malariae (Laveran, 1881, Grassi vµ Feletti, 1890) vµ P. ovale (Stephens, 1922). GÇn ®©y, ®· ph¸t hiÖn mét sè tr-êng hîp ng-êi m¾c sèt rÐt do nhiÔm KSTSR P. knowlesi cña khØ (tõ khØ l©y sang ng-êi) t¹i Ma-lai-xi-a, Th¸i Lan, ViÖt Nam... [35, 42]. 1.2.2. Chu kú ph¸t triÓn cña ký sinh trïng sèt rÐt Chu kú ph¸t triÓn cña KSTSR gåm 2 giai ®o¹n: Giai ®o¹n ph¸t triÓn v« tÝnh ë ng-êi: Sau khi th©m nhËp vµo c¬ thÓ, thoa trïng do muçi truyÒn sÏ qua ®-êng m¸u x©m nhËp vµo nhu m« gan, ph©n chia thµnh c¸c merozoite. Sau kho¶ng 6-16 ngµy tïy thuéc vµo loµi KST, tÕ bµo gan bÞ ph¸ vì gi¶i phãng ra c¸c merozoite. C¸c merozoite gan x©m nhËp hång cÇu ph¸t triÓn thµnh thÓ t- d-ìng, thÓ ph©n liÖt, cuèi cïng ph¸ vì hång cÇu. C¸c merozoite hång cÇu ®-îc gi¶i phãng ra ngoµi, mét sè x©m nhËp vµo 5
hång cÇu kh¸c tiÕp tôc giai ®o¹n v« tÝnh hång cÇu, mét sè ph¸t triÓn thµnh thÓ h÷u tÝnh lµ c¸c giao bµo (gametocyte) [35]. Giai ®o¹n ph¸t triÓn h÷u tÝnh ë muçi: Muçi Anopheles hót m¸u ng-êi cã giao bµo sÏ bÞ nhiÔm vµ KST l¹i tiÕp tôc mét giai ®o¹n sinh s¶n h÷u tÝnh trong c¬ thÓ muçi, vµo cuèi cña chu kú nµy s¶n sinh mét thÕ hÖ míi KST gäi lµ thoa trïng. Thoa trïng di chuyÓn vÒ tuyÕn n-íc bät cña muçi ®Ó tiÕp tôc truyÒn khi muçi ®èt ng-êi. Chu kú ph¸t triÓn ë muçi tõ 8 ®Õn 35 ngµy phô thuéc vµo nhiÖt ®é bªn ngoµi [35, 49]. Chu tr×nh ph¸t triÓn cña KSTSR ®-îc tr×nh bµy tæng qu¸t ë H×nh 1.1. H×nh 1.1. Chu tr×nh ph¸t triÓn cña ký sinh trïng sèt rÐt (theo tµi liÖu cña Jan A. Rozendaal [49]) 6
1.3. Muçi truyÒn bÖnh sèt rÐt Ronald Roos (ng-êi Anh) ®· x¸c ®Þnh ®-îc muçi Anopheles lµ thñ ph¹m truyÒn bÖnh sèt rÐt vµo n¨m 1897 t¹i Ên §é. ¤ng ®· ph¸t hiÖn KSTSR ph¸t triÓn trong c¬ thÓ muçi Anopheles hót m¸u bÖnh nh©n sèt rÐt [31]. Sù ph©n bè thµnh phÇn Anopheles vµ sù cã mÆt cña c¸c vect¬ chÝnh truyÒn bÖnh sèt rÐt cã vai trß quan träng chi phèi c¸c ®Æc ®iÓm dÞch tÔ häc sèt rÐt cña mét vïng [47]. Trªn thÕ giíi cã kho¶ng 493 loµi Anopheles kh¸c nhau, trong ®ã cã kho¶ng 70 loµi ®-îc x¸c ®Þnh lµ vect¬ truyÒn bÖnh sèt rÐt. Do c¸c ®Æc ®iÓm vÒ ®Þa lý, khÝ hËu, sinh th¸i ë mçi vïng, mçi n-íc cã kh¸c nhau nªn c¸c loµi muçi truyÒn bÖnh sèt rÐt chÝnh còng kh¸c nhau [47, 153]. ë ViÖt Nam, c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu vÒ Anopheles cña TrÇn §øc Hinh, NguyÔn §øc M¹nh, Lª Kh¸nh ThuËn cho thÊy cã 62 loµi Anopheles [18, 28, 47]. Trong ®ã vect¬ truyÒn bÖnh chÝnh gåm 3 loµi lµ: An. minimus, An. dirus vµ An. epiroticus. Trong ®ã: + An. minimus sèng ë trong nhµ, b×a rõng, trong rõng, vïng ®åi. Bä gËy sèng ë ven suèi quang, n-íc ch¶y chËm. + An. dirus sèng ë rõng rËm, vïng b×a rõng th-a. Bä gËy sèng ë vòng n-íc ®äng d-íi bãng r©m trong rõng. + An. epiroticus sèng ë vïng n-íc lî ven biÓn Nam Bé. - Vect¬ truyÒn bÖnh phô gåm 7 loµi: + An. maculatus, An. aconitus, An. jeyporiensis: c¸c loµi muçi nµy sèng ë vïng rõng, b×a rõng, ®åi nói. + An. sinensis, An. vagus, An. subpictus, An. indefinitus: c¸c loµi muçi nµy sèng ë vïng n-íc lî, ven biÓn. 7