Luận án Tiến sĩ Vật lý nguyên tử và hạt nhân: Nghiên cứu khả năng làm giảm mật độ các gốc tự do gây bởi bức xạ ion hóa của các hợp chất tự nhiên

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:139

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Vật lý nguyên tử và hạt nhân "Nghiên cứu khả năng làm giảm mật độ các gốc tự do gây bởi bức xạ ion hóa của các hợp chất tự nhiên" trình bày các nội dung chính sau: Xác định mức độ tổn thương của DNA bị chiếu xạ trong điều kiện có/không có các chất chống oxy hóa; Tính toán tỷ lệ sống sót của tế bào bị chiếu xạ với các bức xạ khác nhau trong điều kiện có hoặc không có các chất chống oxy hóa. Dùng phương trình LQ để mô tả sự suy giảm tỷ lệ sống sót (S) theo liều hấp thụ (D).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Vật lý nguyên tử và hạt nhân: Nghiên cứu khả năng làm giảm mật độ các gốc tự do gây bởi bức xạ ion hóa của các hợp chất tự nhiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN NĂNG LƯỢNG NGUYÊN TỬ VIỆT NAM ---------&&&------- TRẦN THỊ NHÀN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÀM GIẢM MẬT ĐỘ CÁC GỐC TỰ DO GÂY BỞI BỨC XẠ ION HÓA CỦA CÁC HỢP CHẤT TỰ NHIÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2023
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN NĂNG LƯỢNG NGUYÊN TỬ VIỆT NAM ---------&&&------- TRẦN THỊ NHÀN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÀM GIẢM MẬT ĐỘ CÁC GỐC TỰ DO GÂY BỞI BỨC XẠ ION HÓA CỦA CÁC HỢP CHẤT TỰ NHIÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vật lý nguyên tử và hạt nhân Mã số chuyên ngành: 9440106 Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. Izumi Yoshinobu 2. TS Vương Thu Bắc Cố vấn khoa học: TS. Đặng Đức Nhận Hà Nội - 2023
LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định. Tác giả Trần Thị Nhàn i
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới, GS. Izumi Yoshinubu, TS. Vương Thu Bắc những người Thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Lời cảm ơn của tôi cũng xin được gửi đến TS. Đặng Đức Nhận, PGS. Trần Minh Quỳnh và PGS. Youichirou Matuo, những người đã dành thời gian thảo luận khoa học và đóng góp các ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quý Cô, Thầy tại Trung tâm đào tạo hạt nhân, viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện luận án này. Xin cảm ơn tất cả bạn bè, đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Nhân dịp này, tôi muốn dành những tình cảm sâu sắc nhất, trân trọng nhất đến những người thân trong gia đình luôn động viên hỗ trợ tôi về mọi mặt, các thành viên trong gia đình đã chia sẻ những khó khăn, thông cảm và giúp đỡ tôi trong cuộc sống. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả Trần Thị Nhàn ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .........................................................................................................i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...................................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .............................................................................viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ..................................................................................... ix MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................................ 9 1.1. Gốc tự do .............................................................................................................. 9 1.2. Tác động của bức xạ ion hóa lên các phần tử sinh học ........................................ 11 1.2.1. Cơ chế tác dụng trực tiếp .................................................................................. 12 1.2.2. Cơ chế tác dụng gián tiếp ................................................................................. 13 1.2.3. Tổn thương do bức xạ ion hóa .......................................................................... 16 1.2.3.1. Tổn thương ở mức độ phân tử .............................................................. 16 1.3. Tổng quan về hợp chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa............................... 25 1.3.1. Sự oxy hóa, chất chống oxy hóa, các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa ...................................................................................................................... 25 1.3.1.1. Sự oxy hóa........................................................................................... 25 1.3.1.2. Chất chống oxy hóa ............................................................................. 26 1.3.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa ................................... 27 1.3.2. Tổng quan về hợp chất polyphenol có tác dụng chống oxy hóa ....................... 30 1.3.3. Cơ chế hoạt động của các hợp chất chống oxy hóa polyphenol ........................ 36 1.3.3.1. Cơ chế chuyển nguyên tử hydro (Hydrogen Atomic Transfer-HAT) ... 36 1.3.3.2. Cơ chế chuyển một electron chuyển proton (Single Electron Transfer- Proton Transfer − SET−PT) .............................................................. 36 1.3.3.3. Cơ chế chuyển proton mất electron (Sequential Proton Loss Electron Transfer − SPLET). ............................................................................ 37 1.3.4. Khả năng chống oxy hóa của các polyphenol trong chè xanh ........................... 37 iii
1.3.4.1. Thành phần catechin trong lá chè xanh ................................................ 37 1.3.4.2. Khả năng chống oxy hóa của EGCG, EC............................................. 40 1.4. Các phương pháp đánh giá, đo lường tổn thương do bức xạ ở mức độ phân tử và tế bào. ................................................................................................................... 44 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 46 2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 46 2.1.1. DNA Plasmid ................................................................................................... 47 2.1.1.1. Tổng quan về plasmid.......................................................................... 47 2.1.1.2. Phân loại plasmid ................................................................................ 47 2.1.1.3. Hình thái và sự nhân lên của Plasmid .................................................. 49 2.1.2. Nấm men Saccharomyces cerevisiae ................................................................ 50 2.1.2.1. Một số đặc tính của tế bào nấm men Saccharomyces ........................... 50 2.1.2.2. Cấu tạo ................................................................................................ 51 2.1.2.3. Sinh sản của tế bào nấm men ............................................................... 52 2.2. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu. .............................................................. 53 2.3. Phương pháp nghiên cứu. .................................................................................... 54 2.3.1. Sơ đồ các bước nghiên cứu đánh giá khả năng bảo vệ phóng xạ của EGCG, EC, AA đối với DNA. ............................................................................................... 54 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu với tế bào nấm men ................................................. 61 2.3.2.1 Môi trường nuôi cấy tế bào nấm men ................................................... 62 2.3.2.2. Tỷ lệ sống sót của tế bào...................................................................... 63 2.3.2.3 Phương trình LQ (Linear- quadratic) .................................................... 63 2.4. Phương pháp bố trí mẫu và xử lý chiếu xạ ......................................................... 64 2.4.1 Chiếu xạ gamma (LET thấp) ............................................................................. 64 2.4.2. Chiếu xạ chùm ion (LET cao) .......................................................................... 65 2.4.3. Xác định liều hấp thụ ....................................................................................... 65 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 68 3.1. Đứt gãy DNA, giá trị G và tổn thương tương đối của DNA khi trong môi trường chứa DNA có EGCG, EC, AA........................................................................ 68 iv
3.2. Tỷ lệ sống sót của tế bào khi trong môi trường nuôi cấy có chứa EGCG, AA ..... 82 3.3. Thảo luận ............................................................................................................ 90 3.3.1. Ảnh hưởng của độ truyền năng lượng tuyến tính (LET) đến mức độ tổn thương (DNA và tế bào sống) của bức xạ .................................................................. 90 3.3.2. Khả năng chống oxy hóa của EGCG là lớn hơn EC ......................................... 93 3.3.3. So sánh khả năng chống oxy hóa của EGCG và AA......................................... 97 3.3.4. Tỷ lệ sống sót của tế bào không tỷ lệ thuận với số mol chất chống oxy hóa... 100 3.3.5. Kết quả thu được tổn thương trên DNA chỉ có đứt gãy đơn (SSB) ................. 101 3.3.6. Hệ số α và tỉ số α/β ........................................................................................ 103 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN ..................................................................................... 105 NHỮNG ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ........................................... 107 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN......................... 108 v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt AA Ascorbic acid Vitamin C BDE Bond dissociation energy Năng lượng phân ly liên kết C (+)Catechin (+)-Catechin CG (-)-Catechin gallate (-)-Catechin gallate Da Absorbed dose Liều hấp thụ Dr Dose rate Suất liều chiếu DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic (DNA) DSB Double strain break Đứt gãy đôi E Energy Năng lượng EC (-)-Epicatechin (-)-Epicatechin ECG (-)- Epicatechin gallate (-)- Epicatechin gallate EGC (-)-Epigallocatechin (-)-Epigallocatechin EGCG (-)-Epigallocatechingallate (-)-Epigallocatechingallate ETE Electron transfer enthalpy Năng lượng chuyển electron GC (-)-Gallocatechin (-)-Gallocatechin HAT Hydrogen atomic transfer Chuyển nguyên tử hydro IE Ionization energy Năng lượng ion hóa vi
IRC Internal reaction coordinates Tọa độ phản ứng nội LB Luria betani medium Môi trường LB (nuôi cấy vi khuẩn E.Coli) LET Linear energy transfer Truyền năng lượng tuyến tính OH Hydroxyl group Nhóm hydroxyl QF Qualitive factor Hệ số chất lượng bức xạ RBE Relative biological effectiveness Hiệu quả sinh học tương đối REM Roentgen equivalent man Đơn vị đo liều tương đương, liều hiệu dụng (1 rem = 0,01 Sv) REP Roentgen equivalent physical Đương lượng vật lý của bức xạ Rơnghen. ROS Reactive oxygen species Các chất chứa oxy phản ứng S Survival rate Tỷ lệ sống sót SET−PT Single electron transfer- proton Cơ chế chuyển một electron transfer chuyển proton SPLET Sequential proton loss electron Cơ chế chuyển proton mất transfer electron SSB Single strain break Đứt gãy đơn TE Tris ethylene diamine tricactric Môi trường Tris EDTA acid X Ronghen X rays Bức xạ tia X YPD Yeast extract - peptone - D- Môi trường nuôi cấy nấm men glucose YPD Hydroxyl radicals Gốc tự do hydroxyl vii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Giá trị LET của một số bức xạ ion hóa chủ yếu . .............................. 10 Bảng 1.2. Mối tương quan giữa giá trị QF và LET của bức xạ . ........................ 22 Bảng 1.3. Mối tương quan giữa giá trị QF và loại bức xạ ion hóa . ................... 22 Bảng 1.4. Các catechin đã được phân lập trong chè xanh . ............................... 39 Bảng 2.1. Ảnh hưởng của vị trí đặt mẫu và thời gian chiếu xạ đến liều chiếu và suất liều chiếu khi chiếu xạ trên nguồn Co-60. ............................................ 64 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của thời gian chiếu xạ đến liều chiếu và suất liều khi chiếu xạ chùm helium ...................................................................................... 65 Bảng 3.1. Tác dụng (bảo vệ phóng xạ) giảm tỷ lệ đứt gãy sợi đơn với DNA bị chiếu xạ gamma của các chất chống oxy hóa................................................ 72 Bảng 3.2. Tác dụng (bảo vệ phóng xạ) giảm tỷ lệ đứt gãy sợi đơn với DNA bị chiếu xạ bởi chùm helium của các chất chông oxy hóa................................. 77 Bảng 3.3. So sánh giá trị BDE (O-H) của một số hợp chất trong tự nhiên ....... 96 Bảng 3.4. Bảng so sánh hằng số tốc độ bắt gốc OH  của EGCG và AA. ......... 99 viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Chu kỳ tế bào với các quá trình (kỳ) nguyên phân . .......................... 19 Hình 1.2. Sự mất khả năng phân chia tế bào có thể xảy ra ở ngay tế bào bị chiếu xạ hoặc ở các thế hệ tiếp sau. .................................................................. 20 Hình 1.3. Tỷ lệ sống sót biểu diễn trên trục tọa độ nửa lôgarit . ........................ 21 Hình 1.4. Sự phụ thuộc tỷ lệ sống sót của tế bào vào liều chiếu xạ. Đường 1 tương ứng với tỷ lệ sống sót của tế bào khi chiếu xạ một lần với liều chiếu D, đường 2 tương ứng với tỷ lệ sống sót của tế bào khi chia D thành hai liều nhỏ cách nhau 10 giờ ....................................................................................... 23 Hình 1.5. Ảnh hưởng của suất liều đối với độ mẫn cảm phóng xạ của tế bào. Tỷ lệ sống sót của tế bào ở suất liều cao nhất (đường A), tỷ lệ sống sót của tế bào ở suất liều thấp nhất (đường C), tỷ lệ sống sót của tế bào ở suất liều nằm trong khoảng cao nhất và thấp nhất (đường B) . ....................................... 24 Hình 1.6. Công thức cấu tạo phân tử DPPH  ................................................... 28 Hình 1.7. Cơ chế phản ứng của chất chống oxy hóa và DPPH  . ...................... 28 Hình 1.8. Cơ chế phản ứng của chất chống oxy hóa và ABTS•+ . .................... 29 Hình 1.9. Công thức cấu tạo của phân tử DMPD. ............................................. 30 Hình 1.10. Công thức cấu tạo của phân tử TPTZ. ............................................. 30 Hình 1.11. Cấu tạo phân tử của các hợp chất polyphenol đơn giản ................... 31 Hình 1.12. Cấu tạo phân tử điển hình của các flavonoid . ................................. 32 Hình 1.13. Cấu tạo phân tử của hợp chất flavone . ........................................... 32 Hình 1.14. Cấu tạo phân tử của hợp chất Flavonol . ......................................... 33 Hình 1.15. Cấu tạo phân tử của hợp chất flavanone . ........................................ 33 Hình 1.16. Cấu tạo phân tử của hợp chất dihydroflavonol . .............................. 34 Hình 1. 17. Cấu tạo phân tử của hợp chất flavanol . ......................................... 34 Hình 1.18. Cấu tạo phân tử của hợp chất chalcone . ......................................... 35 Hình 1.19. Cấu tạo phân tử của hợp chất isoflavone . ....................................... 35 Hình 1.20. Cấu trúc của hợp chất anthocyanidin .............................................. 35 Hình 1.21. Sơ đồ các cơ chế chống oxy hóa . ................................................... 37 Hình 1.22. Công thức phân tử tổng quát của catechin. ...................................... 38 Hình 1.23. Một số cấu tạo phân tử catechin điển hình. ..................................... 38 ix
Hình 1.24. Sự ổn định của electron không cặp đôi trong vòng gallate của catechin. ........................................................................................................... 41 Hình 1.25. Cấu tạo phân tử của AA . ................................................................ 42 Hình 1.26. Tương tác của AA với gốc tự do hydroxyl. ..................................... 43 Hình 2.1. Sơ đồ thực nghiệm với plasmid DNA. .............................................. 54 Hình 2.2. Phân tách DNA của plasmid ColE1 qua cột lọc gradien nồng độ. .... 55 Hình 2.3. Nuôi cấy E. coli trong môi trường lỏng LB đặt trong tủ ấm ............. 56 Hình 2.4. Hình ảnh hệ điện di gel agarose ....................................................... 58 Hình 2.5. Mẫu DNA khi tra vào băng điện di .................................................. 59 Hình 2.6. Hình ảnh của DNA sau khi chạy hệ điện di..................................... 59 Hình 2.7. Hình ảnh thu được sau khi điện di quan sát mắt thường sau khi chiếu bằng bức xạ UV ...................................................................................... 60 Hình 2.8. Hình ảnh thu được trên máy chụp ảnh ............................................. 60 Hình 2.9. Xác định tỷ lệ phần trăm các đứt gãy của DNA bằng phần mềm xử lý ảnh điên di ImageJ lab 6.0. ...................................................................... 61 Hình 2.10. Sơ đồ thực nghiệm với tế bào nấm men. ......................................... 61 Hình 2.11. Các tế bào nấm men được đặt trên màng lọc, đặt vào đĩa chuẩn bị cho chiếu xạ ..................................................................................................... 62 Hình 2.12. Sơ đồ sắp xếp các mẫu chiếu trong buồng chiếu xạ gamma ........... 65 Hình 2.13. Mô tả phương pháp đo liều chiếu xạ chùm ion helium ................... 66 Hình 2.14. Hình minh họa lắp đặt đường truyền tia và buồng ion hóa. ............. 67 Hình 2.15. Mẫu được gắn cố định trên bàn chiếu xạ. Đĩa phủ giấy lọc màu vàng là mẫu chứa tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae. Giấy lọc màu vàng là loại giấy đặc biệt cho phép bức xạ đi qua mà không mất năng lượng. Lăng kính vuông màu trắng là tấm chắn silicon cho chùm tia chuẩn trực. ........ 67 Hình 3.1. Hình ảnh điện di trên gel agarose 1,0% (w/v) của plasmid pUC118 bị chiếu xạ gamma với các liều xạ khác nhau. Giếng 1 - 3 ứng với liều chiếu 0 Gy; giếng 4 - 6 ứng với liều chiếu 25 Gy; giếng 7 - 9 ứng với liều chiếu 50 Gy; giếng 10-12 ứng với liều chiếu 75 Gy và giếng 12-14 ứng với liều chiếu 100 Gy. Giếng 16 là giếng đánh dấu trọng lượng phân tử DNA. ............................................................................................................... 68 Hình 3.2. Tỷ lệ phần trăm đứt gãy đơn (SSB) của DNA plasmid sau khi chiếu xạ gamma không hoặc có bổ sung 300 µM EC hoặc EGCG hoặc AA. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5). .......... 69 x
Hình 3.3. Tỷ lệ phần trăm đứt gãy đơn (SSB) của DNA plasmid sau khi chiếu xạ gamma không hoặc có bổ sung 500 µM EGCG hoặc EC hoặc AA. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5). .......... 70 Hình 3.4. Tỷ lệ phần trăm đứt gãy đơn (SSB) của DNA plasmid sau khi chiếu xạ gamma không hoặc có bổ sung 1000 µM EGCG hoặc EC hoặc AA. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5). .......... 71 Hình 3.5. Hình ảnh điện di trên gel agarose 1,0% (w/v) của plasmid pUC118 bị chiếu xạ helium với các liều xạ khác nhau. Giếng 1 là giếng đánh dấu trọng lượng phân tử DNA. Giếng 2- 4 ứng với liều chiếu 0 Gy; giếng 5 -7 ứng với liều chiếu 25 Gy; giếng 8 - 10 ứng với liều chiếu 50 Gy; giếng 11- 13 ứng với liều chiếu 100 Gy. .......................................................................... 73 Hình 3.6. Tỷ lệ phần trăm SSB của DNA plasmid sau khi chiếu xạ bằng ion helium không hoặc có bổ sung 300 µM EGCG hoặc EC hoặc AA. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5). ....................... 74 Hình 3.7. Tỷ lệ phần trăm SSB của DNA plasmid sau khi chiếu xạ bằng chùm helium không hoặc có bổ sung 500 µM EGCG hoặc EC hoặc AA. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5). ................. 75 Hình 3.8. Tỷ lệ phần trăm SSB của DNA plasmid sau khi chiếu xạ bằng chùm ion helium không hoặc có bổ sung 1000 µM EGCG hoặc EC hoặc AA. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5).... 76 Hình 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng EC, EGCG, AA đến giá trị G của bức xạ gamma đối với DNA plasmid. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5). ........................................................................... 78 Hình 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng EC, EGCG đến giá trị G (G value) của chùm helium đối với DNA plasmid. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5). ................................................................. 79 Hình 3.11. Tổn thương tương đối của DNA khi bị chiếu xạ bằng bức xạ gamma theo hàm lượng chất chống oxy hóa bổ sung vào dịch chiết DNA chiếu xạ. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5). ................................................................................................................. 80 Hình 3.12. Tổn thương tương đối của DNA khi bị chiếu xạ bằng chùm ion helium theo hàm lượng chất chống oxy hóa bổ sung vào dịch chiết DNA chiếu xạ. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5). ................................................................................................................. 81 xi
Hình 3.13. Số khuẩn lạc phát triển sau khi chiếu xạ trên môi trường thạch YPD sau 2 ngày ở nhiệt độ 30 0C (a. không bổ sung chất chống oxy hóa, b. có bổ sung chất chống oxy hóa EGCG với hàm lượng 500 µM)....................... 82 Hình 3.14. Tỷ lệ sống sót của tế bào nấm men được chiếu xạ bằng bức xạ gamma trong môi trường chứa EGCG, AA với hàm lượng 300 µM. Đường cong đáp ứng liều được mô phỏng theo phương trình LQ. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (số mẫu là 5). ............................................ 83 Hình 3.15. Tỷ lệ sống sót của tế bào nấm men được chiếu xạ bằng chùm bức xạ gamma trong sự có mặt của EGCG, AA hàm lượng 500 µM. Đường cong đáp ứng liều được mô phỏng theo phương trình LQ. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (số mẫu là 5). ......................................................... 84 Hình 3.16. Tỷ lệ sống sót của tế bào nấm men được chiếu xạ bằng bức xạ gamma trong môi trường chứa EGCG, AA hàm lượng 1000 µM. Đường cong đáp ứng liều được mô phỏng theo phương trình LQ. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (số mẫu là 5). ............................................ 85 Hình 3.17. Tỷ lệ sống sót của tế bào nấm men được chiếu xạ bằng chùm helium trong môi trường chứa EGCG, AA với hàm lượng 300 µM. Đường cong đáp ứng liều được mô phỏng theo phương trình LQ. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (số mẫu là 5). ............................................ 86 Hình 3.18. Tỷ lệ sống sót của tế bào nấm men được chiếu xạ bằng chùm helium trong môi trường chứa EGCG, AA với hàm lượng 500 µM. Đường cong đáp ứng liều được mô phỏng theo phương trình LQ. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (số mẫu là 5). ............................................ 87 Hình 3.19. Tỷ lệ sống sót của tế bào nấm men được chiếu xạ bằng chùm helium trong môi trường chứa EGCG, AA với hàm lượng 1000 µM. Đường cong đáp ứng liều được mô phỏng theo phương trình LQ. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD (số mẫu là 5). ............................................ 87 Hình 3.20. Ảnh hưởng của hàm lượng EGCG, AA đến hằng số α của phương trình LQ mô phỏng tác hại của bức xạ gamma đối với tế bào nấm men. ................................................................................................................. 88 Hình 3.21. Ảnh hưởng của hàm lượng EGCG, AA đến hằng số α của phương trình LQ mô phỏng tác hại của chùm helium đối với tế bào nấm men. ................................................................................................................. 89 Hình 3.22. Ảnh hưởng của hàm lượng EGCG, AA đến tỉ số α/β của phương trình LQ mô phỏng tác hại của bức xạ gamma đối với tỷ lệ sống của tế bào nấm men........................................................................................................... 89 xii
Hình 3.23. Ảnh hưởng của hàm lượng EGCG, AA đến tỉ số α/β của phương trình LQ mô phỏng tác hại của chùm helium đối với tỷ lệ sống của tế bào nấm men........................................................................................................... 90 Hình 3.24. So sánh tỷ lệ sống của tế bào khi chiếu xạ bởi bức xạ gamma và bức xạ helium. .................................................................................................. 91 Hình 3.25. Tỷ lệ sống của tế bào V79-4 chuột phụ thuộc vào liều chiếu và LET . ................................................................................................................ 92 Hình 3.26. Sự phụ thuộc SSB, DSB của DNA theo LET của bức xạ . .............. 93 Hình 3.27. Hoạt tính chống oxy hóa được đo bằng các phương pháp ABTS, FRAP và DPPH . .............................................................................................. 94 Hình 3.28. Tỷ lệ sống sót của tế bào nấm men khi chiếu xạ bởi bức xạ gamma ............................................................................................................. 95 Hình 3.29. Tỷ lệ tế bào nấm men được bảo vệ bởi EGCG và AA với hàm lượng khác nhau khỏi tác hại bức xạ gamma. ................................................... 97 Hình 3.30. Tỷ lệ tế bào nấm men được bảo vệ bởi EGCG và AA với hàm lượng khác nhau khỏi tác hại của chùm helium. ............................................... 97 Hình 3.31. Hệ số Ra, Rd của một số hợp chất ................................................. 98 Hình 3.28. Hiệu quả bảo vệ tế bào của EGCG trong trường hợp chiếu xạ bởi bức xạ gamma. CFU là số lượng khuẩn lạc sau khi chiếu xạ. CFU0 là số lượng khuẩn lạc khi không bị chiếu xạ . ......................................................... 101 Hình 3.33. Tỷ lệ sống của các tế bào nấm men đối chứng và được chỉnh sửa với các gen tái tổ hợp Rad 52- khi bị chiếu xạ bởi bức xạ gamma .................. 102 xiii
MỞ ĐẦU Bức xạ ion hóa có thể bắt nguồn từ quá trình phân rã của các hạt nhân không bền hoặc do khử kích thích các nguyên tử và hạt nhân của chúng trong các lò phản ứng hạt nhân, máy X-quang, máy gia tốc cyclotron và các thiết bị khác. Cả các nguồn bức xạ ion hóa từ tự nhiên và có sẵn trên mặt đất hoặc từ nguồn con người tạo ra đều góp phần khiến con người bị phơi nhiễm và tạo thành mối nguy hiểm cho sức khỏe. Trong trường hợp xảy ra sự cố hạt nhân, một lượng lớn chất phóng xạ thoát ra môi trường. Đặc biệt, kể từ sau sự cố hạt nhân Fukushima Daiichi, rủi ro phơi nhiễm phóng xạ càng được quan tâm hơn. Khi tương tác với tế bào và cơ thể sống, bức xạ ion hóa tạo ra các gốc tự do (là các nguyên tử, phân tử hoặc ion có một hay một số điện tử hóa trị chưa ghép cặp hoặc có lớp vỏ điện tử mở, nên có thể xem là sản phẩm trung gian có một hoặc nhiều liên kết cộng hóa trị “lơ lửng” tồn tại độc lập). Các gốc tự do này tác động đến các phân tử sinh học (màng tế bào, protein, lipid, DNA có trong nhân tế bào) dẫn đến làm chết hoặc gây đột biến tế bào [1]. Các tổn thương do những gốc tự do này gây ra đối với DNA có thể bao gồm các đứt gẫy sợi đơn (SSB) trên các liên kết phosphodiester, hoặc đứt gãy sợi đôi (DSB) trên các vị trí đối diện hoặc bị dịch chuyển, tổn thương cơ sở, liên kết chéo protein-DNA và liên kết ngang protein-protein. Trong đó, đứt gãy đôi gây ra những tổn thương nghiêm trọng hơn đối với các tế bào bởi vì đây là tổn thương rất khó để sửa chữa hoặc quá trình sửa chữa sẽ không hoàn thiện và có thể làm xuất hiện những đột biến (tế bào lạ) [2, 3]. Hơn nữa, các tác động sinh học của bức xạ ion hóa thường được cho là phụ thuộc vào sự truyền năng lượng tuyến tính (LET) [1]. Bức xạ LET cao có khả năng gây ra nhiều DSB hơn. Bức xạ LET thấp tương tác với nước trong tế bào để tạo ra các gốc tự do sau đó tấn công DNA (tác động gián tiếp). Hầu hết năng lượng từ bức xạ LET cao được DNA hấp thụ trực tiếp để tạo ra các tổn thương DNA (thông qua tác động trực tiếp). Do vậy đánh giá tỷ lệ đứt gãy của DNA, tỷ lệ sống sót của tế bào là những nhân tố quan trọng trong việc xác định tác động sinh học của các bức xạ ion hóa [4]. 1
Đã từ lâu những chất có từ thiên nhiên đã được sử dụng làm chất chống oxy hóa để làm giảm tác động có hại của các bức xạ nói chung và bức xạ ion hóa nói riêng. Trong khi tổn thương do bức xạ gây ra có thể được xác định thông qua số lượng các gốc tự do hình thành bằng thử nghiệm 2, 2′ - azinobis - (3 – ethylbenzothiazoline - 6 - sulfonic axit) (ABTS), 2, 2 – diphenyl – 1 – picrylhydrazyl (DPPH), tỷ lệ đứt gãy DNA, phân tích sai hình nhiễm sắc thể, hình thái tế bào, kích thước khối u… [5]. Hiệu quả “bảo vệ phóng xạ” của chất chống oxy hóa có thể được đánh giá thông qua khả năng làm giảm mật độ các gốc tự do, giảm thiểu tổn thương do bức xạ khi chúng được bổ sung vào dịch chiết của các đại phân tử sinh học, thức ăn hoặc môi trường sống của sinh vật. Vì các hợp chất chống oxy hóa có thể ngăn chặn sự hình thành không kiểm soát của các gốc tự do hoặc ức chế phản ứng của chúng với các đối tượng sinh học. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tìm kiếm các hợp chất nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng bảo vệ DNA, tế bào và cơ thể sống chống lại các tác động có hại của bức xạ. Chất chống oxy hóa có thể được phân loại dựa trên hoạt động của chúng thành chất chống oxy hóa enzyme và không enzyme. Chất chống oxy hóa enzyme hoạt động bằng cách phá vỡ và loại bỏ các gốc tự do. Loại chất chống oxy hóa này chuyển đổi các sản phẩm oxy hóa nguy hiểm thành hydro peroxyt (H2O2) và sau đó thành nước thông qua một quy trình gồm nhiều bước với sự có mặt của các đồng xúc tác, chẳng hạn như đồng, kẽm, mangan và sắt. Chất chống oxy hóa phi enzyme hoạt động bằng cách làm gián đoạn hoặc dừng chuỗi phản ứng gốc tự do [2]. Khả năng bảo vệ các phần tử sinh học khỏi tác động không mong muốn gây bởi bức xạ ion hóa của các hợp chất tự nhiên đã được nhiều nhà khoa học ở Việt Nam quan tâm và nghiên cứu trong những năm gần đây. Có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng loại bỏ các gốc tự do của một số hợp chất nguồn gốc thực vật phổ biến [6 - 10]. Điển hình như công trình nghiên cứu của các tác giả đến từ đại học Y Hà Nội và Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam (Vinatom). Ví dụ như những nghiên cứu của nhóm tác giả Trần Minh Quỳnh và cộng sự về khả năng tiêu hủy gốc tự do sinh ra khi bị chiếu xạ bởi bức xạ 2
gamma của dịch chiết thực vật và đông trùng hạ thảo [8, 9]. Các công trình nghiên cứu của nhóm tác giả Phạm Cẩn Nam và cộng sự (Đại học Đà Nẵng ) đã tiến hành nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của các hợp chất chiết xuất từ gừng và chè xanh [10]. Trong đó, tác giả đã chọn các hợp chất như cucumin, (-)- epigallo-catechin gallate (EGCG), (-) - epicatechin (EC) để nghiên cứu khả năng chống oxy hóa [10]. Tuy nhiên, số lượng các công trình nghiên cứu trong nước về khả năng bảo vệ của các chất chống oxy hóa tới các phần tử sinh học như DNA và tế bào bị chiếu xạ vẫn còn rất hạn chế. Trên thế giới, vai trò làm giảm các gốc tự do sinh ra bởi các bức xạ ion hóa của các hợp chất trong tự nhiên hoặc tổng hợp, cũng như hiệu quả bảo vệ phóng xạ của chúng đã được quan tâm nghiên cứu từ rất lâu [11]. Hướng nghiên cứu này tiếp tục được quan tâm và phát triển với các mô hình tính toán và thực nghiệm mới sau sự cố Fukushima Daiichi năm 2011. Các nhà khoa học tại viện nghiên cứu Hạt nhân – Đại học Fukui, Nhật Bản cũng đang tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu để đo tỷ lệ đứt gãy của DNA và tính toán tỷ lệ sống của tế bào nhằm đánh giá sự suy giảm các gốc tự do sinh ra do bức xạ ion hóa khi trong môi trường sống của tế bào và dịch chiết DNA được bổ sung các hợp chất chống oxy hóa nguồn gốc tự nhiên. Vitamin C (Acid ascorbic (AA)) được coi là một chất chống oxy hóa mạnh được tìm thấy tự nhiên trong một số loại trái cây, bao gồm trái cây họ cam quýt, nhiều loại rau và được sử dụng như thành phần của thực phẩm chức năng [12,13] Với cấu trúc hóa học gồm 4 nhóm cho liên kết hydro và 6 nhóm nhận liên kết hydro, AA là nguồn cung cấp điện tử tuyệt vời cho các gốc tự do đang tìm kiếm điện tử để lấy lại sự ổn định của chúng [12 - 14]. Từ lâu, AA đã được biết đến như một chất có khả năng bảo vệ cơ thể sống khỏi bức xạ ion hóa [13 - 15]. Khả năng bảo vệ phóng xạ của EGCG, EC đối với chiếu xạ gamma ở chuột cũng đã được nghiên cứu [16 - 18]. Hơn nữa, đã có báo cáo rằng EGCG, EC có hiệu quả trong việc ngăn chặn sự đứt gãy phân tử DNA do bức xạ ion hóa [19]. Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu trong đó tác dụng bảo vệ của các chất chống gốc tự do được thực hiện đồng thời ở cấp độ tế bào và DNA. Cần có thêm các 3
nghiên cứu đánh giá khả năng bảo vệ bức xạ của AA, EGCG, và/hoặc EC đối với phân tử mang thông tin di truyền DNA và tế bào sống thông qua các cơ chế tác dụng trực tiếp hoặc gián tiếp của bức xạ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ đánh giá và phân tích cơ chế bảo vệ DNA và tế bào của một số chất có trong tự nhiên trong việc chống lại các tác hại của bức xạ ion hóa. Để đánh giá khả năng bảo vệ bức xạ của những chất này đối với các bức xạ có mức truyền năng lượng tuyến tính (LET) khác nhau, chúng tôi sử dụng tia gamma (LET thấp) và chùm ion helium (LET cao) để chiếu xạ. Tính cấp thiết của luận án: Nhân viên bức xạ khi phải ứng phó sự cố bức xạ cũng như sự cố hạt nhân, trong vận hành các cơ sở hạt nhân hoạt động bình thường, kể cả lò phản ứng nghiên cứu công suất thấp; các bác sĩ, kỹ thuật viên của các khoa X-quang can thiệp, kỹ thuật viên xạ hình công nghiệp phải tiếp xúc với các nguồn phóng xạ hoạt độ lớn và trường bức xạ có năng lượng cao có nhiều khả năng phải chịu những liều bức xạ cao hơn mức liều nghề nghiệp làm tăng nguy cơ rủi ro sức khỏe. Cơ chế gây rủi ro sức khỏe đối với cơ thể sống khi bị chiếu xạ được chứng minh là do năng lượng bức xạ trực tiếp ion hóa các phân tử, bẻ gãy các liên kết hóa học của DNA, lipid, protein… hoặc gián tiếp ion hóa các phân tử nước trong cơ thể tạo ra các phần tử có tính oxy hóa mạnh, đó là các gốc tự do, các ion và peroxyde như OH•, H+, H2O-, H2O2 tham gia vào quá trình oxy hóa làm thay đổi cấu trúc mô và tế bào. Việc nghiên cứu khả năng bảo vệ phóng xạ của các hợp chất tự nhiên do đó là rất cần thiết để phát triển các sản phẩm bảo vệ bức xạ cho nhân viên hoặc nạn nhân trong các sự cố bức xạ và hạt nhân. Mục tiêu của luận án: Với đề tài luận án: “Nghiên cứu khả năng làm giảm mật độ các gốc tự do gây bởi bức xạ ion hóa của các hợp chất tự nhiên”, mục tiêu chính của chúng tôi là đánh giá và phân tích cơ chế bảo vệ DNA và tế bào của các chất chống oxy hóa tự nhiên thông qua khả năng làm giảm mật độ các gốc tự do hình thành trong quá trình DNA và tế bào bị chiếu xạ. Các mục tiêu cụ thể của luận án gồm: 4
- Làm rõ ảnh hưởng của bức xạ ion hóa đến DNA plasmid và tế bào sống. - Xác định mức độ tổn thương của DNA bị chiếu xạ trong điều kiện có/không có các chất chống oxy hóa. - Tính toán tỷ lệ sống sót của tế bào bị chiếu xạ với các bức xạ khác nhau trong điều kiện có hoặc không có các chất chống oxy hóa. Dùng phương trình LQ để mô tả sự suy giảm tỷ lệ sống sót (S) theo liều hấp thụ (D). Ý nghĩa khoa học của luận án: Triển khai một hướng nghiên cứu mới, phù hợp với xu thế chung trên thế giới cũng như các điều kiện của Việt Nam: Tìm kiếm chất chống oxy hóa nguồn gốc tự nhiên thân thiện môi trường. Luận án còn có vai trò đóng góp vào việc đánh giá và định lượng khả năng bảo vệ phóng xạ của một số chất chống oxy hóa nhằm giảm tổn thương do bức xạ ion hóa đối với DNA và tế bào sống, hướng tới việc ứng dụng thực tiễn. Những kết quả nghiên cứu của luận án: 1. Đã định lượng được tỷ lệ đứt gãy của DNA plasmid khi bị chiếu xạ bởi bức xạ gamma (LET thấp), bức xạ helium (LET cao) trong điều kiện môi trường chứa DNA không có các chất chống oxy hóa và chứa các chất chống oxy hóa như AA, EGCG, EC. Khi môi trường chứa DNA plasmid có các chất chống oxy hóa, tỷ lệ tổn thương trên DNA plasmid giảm mạnh. Nói cách khác, các chất chống oxy hóa tự nhiên AA, EGCG, EC có tác dụng bảo vệ DNA plasmid khỏi tác động có hại của bức xạ ion hóa. 2. Đã định lượng được tỷ lệ sống sót của tế bào nấm men khi bị chiếu xạ bởi bức xạ ion hóa (bức xạ gamma, bức xạ helium) khi nấm men được nuôi cấy trong môi trường YPD lỏng không có chất chống oxy hóa và chứa chất chống oxy hóa như AA và EGCG. Trong các hàm lượng khảo sát 300 µM, 500 µM và 1000 µM của AA và EGCG, kết quả thực nghiệm đều cho thấy tỷ lệ sống sót của tế bào tăng, nghĩa là AA và EGCG có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại các bức xạ ion hóa. 3. Đã đưa ra kết quả thực nghiệm về ảnh hưởng của độ truyền năng lượng tuyến tính (LET) đến mức độ tổn thương bức xạ (DNA và tế bào sống). 5