Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối (Termitomyces sp.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:211

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Y học "Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối (Termitomyces sp.)" trình bày các nội dung chính sau: Phân lập, định danh và giữ giống nấm mối; Khảo sát môi trường nhân giống nấm mối cấp 1, 2 dạng dịch thể; Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối trong Bioreactor 60 lít; Phân tích thành phần dinh dưỡng và khảo sát hoạt tính sinh học của sinh khối hệ sợi nấm mối.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối (Termitomyces sp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ NGỌC NHI NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT SINH KHỐI HỆ SỢI NẤM MỐI (Termitomyces sp.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 62420201 Cần Thơ, 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ NGỌC NHI MÃ SỐ NCS: P0915005 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT SINH KHỐI HỆ SỢI NẤM MỐI (Termitomyces sp.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 62420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS. TS. TRẦN NHÂN DUNG Cần Thơ, 2022
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu làm luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía thầy cô, bạn bè và người thân. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Quý thầy cô trong Ban Giám hiêu Trường Đại học Cần Thơ, Khoa Sau Đại học, Viên Nghiên cứu và Phát triển Công nghê Sinh học đã tạo điều kiên thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS. Trần Nhân Dũng – người luôn tận tụy với học trò, nhiêt tình hướng dẫn về chuyên môn, luôn đôn đốc, động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiên luận án. Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiêp, PGS.TS. Nguyễn Minh Chơn, PGS.TS. Nguyễn Văn Thành, GS.TS. Cao Ngọc Điêp, PGS.TS. Trương Trọng Ngôn, TS. Bùi Thị Minh Diêu, TS. Trương Thị Bích Vân, TS. Ngô Thanh Phong, PGS.TS. Lê Vinh Thúc, TS. Nguyễn Thị Pha, TS. Trần Đình Giỏi, PGS.TS. Phan Thị Phượng Trang, PGS.TS. Ngô Thị Phương Dung, TS. Dương Thị Hương Giang, TS. Huỳnh Ngọc Thanh Tâm đã cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt khóa học và trong quá trình hoàn thành luận án. Xin đông kính gửi lời chân thành cảm ơn đến quý thầy cô GS.TSKH. Thái Trần Bái, GS.TSKH. Trịnh Tam Kiêt, PGS.TS. Bùi Văn Lê, PGS.TS. Phạm Thành Hổ, PGS.TS. Đinh Minh Hiêp, PGS.TS. Ngô Đại Nghiêp, TS. Phạm Văn Ngọt, TS. Ngô Đại Hùng, PGS.TS. Võ Thanh Sang, TS. Phan Huy Dục, TS. Đỗ Tấn Khang, TS. Trần Trung Hiếu, TS. Nguyễn Thị Nhật Hằng, TS. Nguyễn Thị Liên Thương đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt kinh nghiêm quý báu cho tôi để hoàn thành luận án này. Nhân đây tôi cũng xin gửi lời biết ơn đến thầy PGS.TS. Nguyễn Văn Hiêp (chủ tịch hội đông trường) cùng quý thầy cô trường Đại học Thủ Dầu Một đã tạo điều kiên để tôi hoàn thành chương trình này. Xin cảm ơn anh Phạm Đình Khôi, anh Trần Văn Bé Năm, em Nguyễn Tường Vy, em Thạch Rưn, em Nguyễn Văn Luân, em Nguyễn Thị Diêu Thiên và các em sinh viên đã cùng tôi đi thu mẫu và động viên trong suốt quá trình học tập. Cảm ơn những người thân yêu trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Xin trân trọng cảm ơn tất cả! Nguyễn Thị Ngọc Nhi i
TÓM TẮT Luận án “ Nghiên cứu quy trình công nghê sản xuất sinh khối hê sợi nấm mối (Termitomyces sp.)” được thực hiên nhằm mục tiêu thiết lập một qui trình nuôi cấy sản xuât thử nghiêm sinh khối hê sợi nấm mối T. clypeatus trong hê thống nuôi cấy sinh học (bioreactor) 60L. Kết quả dựa trên khảo sát hình thái của quả thể nấm và khuẩn lạc, kết hợp giải trình tự gen các đoạn IST1, 5S và IST2 đặc trưng của nấm cho thấy bảy chủng nấm mối phân lập được đều thuộc chi Terminomyces, trong đó có hai chủng đã định danh được đến loài là T. clypeatus (N1) và T. microcarpus (BD). Nghiên cứu sản xuất thử nghiêm trên loài nấm mối T. clypeatus cho thấy môi trường nhân giống cấp một thích hợp cho sự phát triển của loài nấm này là môi trường có chứa KH2PO4 (0,1%), pepton (0,2%), glucose (4%), yeast extract (0,1%), MgSO4 (0,015%), thời gian nuôi tối ưu là 20 ngày. Trong khi đó môi trường nhân giống cấp 2 có khác biêt gôm gôm ty lê chủng giống 10% v/v với chế độ sục khí 0,4 v/v/m. Một qui trình sản xuất thử nghiêm nuôi sinh khối hê sợi nấm mối T. clypeatus đã được thiết lập trên hê thống nuôi cấy sinh học với bình nuôi thể tích 60L. Kết quả khảo sát cho thấy các điều kiên tối thích cho sinh khối hê sợi phát triển mạnh là tỉ lê giống chủng vào môi trường nuôi cấy 5% (v/v), pH 5,0, lượng khí sục là 0,4 v/v/m, tốc độ khuấy 180 vòng/phút, nhiêt độ môi trường 28oC. Lượng sinh khối thu nhận là 6,633±0,041 g/L. Sinh khối sợi nấm tươi (93,9% ẩm độ) có chứa protein (3,75%), carbohydrate (1,76%), acid amin tổng (2,16%) bao gôm các acid amin thiết yếu như valine, leucine, isoleucine, threonine, phenylalanine, lysine, arginine, histidine. Cao chiết methanol sinh khối khô hê sợi nấm T. clypeatus có thể trung hòa gốc tự do DPPH với IC50 trung bình 2,26 mg/mL, ở nông độ 5 mg/mL có thể ức chế lên đến 71,65-83,52% gốc tự do DPPH. Bên cạnh đó cao chiết này cũng có khả năng kháng các vi khuẩn gây bênh như Bacillus cereus ATCC 11778, Candida albicans ATCC 10231, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 và Staphylococcus aureus ATCC 6538 với MIC là 10,98 mg/mL. Độc tính của cao chiết cũng được xác định trên tế bào gan người LO-2, kết quả cho thấy tỉ lê sống của tế bào rất cao (90%) ở nông độ cao chiết là 2.500 μg/mL. Kết quả xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của cao chiết trên chuột cho thấy, trong cả hai trường hợp đều không có chuột tử vong ở liều 10.000 mg/kg thể trọng trong thử nghiêm độc tính cấp, và ở liều 1.000 mg/kg thể trọng trong thử nghiêm độc tính bán trường diễn. Từ khóa: Hê thống nuôi sinh học, hoạt tính sinh học, nấm mối, nuôi cấy chìm. ii
ABSTRACT The thesis “Studying on mycelium biomass production procedure from Termitomyces sp.” was carried out with the aim of establishing a culture process for experimental production of T. clypeatus mycelium in 60 L Bioreactor. The results based on the morphological survey of fungal fruiting bodies and colonies, combined with gene sequencing of ITS1, 5S and ITS2 fragments that are characteristic of fungi, showed that seven strains of termite mushroom, belonged to the genus Terminomyces, in which there are two strains that have been identified as T. clypeatus (N1) and T. microcarpus (BD). Research on experimental production on the termite mushroom T. clypeatus showed that the primary propagation medium suitable for the growth of this fungus was the medium containing KH2PO4 (0.1%), peptone (0.2%), glucose (4%), yeast extract (0.1%), MgSO4 (0.015%), optimal culture time is 20 days. Meanwhile, the secondary propagation medium was different, including the seed rate of 10% v/v with the aeration mode of 0.4 v/v/m. An experimental production procedure for T. clypeatus mycelium was established on a biological culture system with a cultural tank of 60 liters. The survey results showed that the optimal conditions for the growth of mycelium biomass were the seed rate 5% (v/v), pH 5, aeration mode of 0.4 v/v/m, stirring speed 180 rmp, the temperature of 28ºC. The amount of collected biomass was 6.633±0.041 g/L. Fresh mycelium biomass (93.9% moisture) contains proteins (3.75%), carbohydrates (1.76%), total amino acids (2.16%) including essential amino acids such as valine, leucine, isoleucine, threonine, phenylalanine, lysine, arginine, histidine. The dry biomass methanol extract of mycelium was able to neutralize DPPH free radicals with an average IC50 value of 2.26 mg/mL, at a concentration of 5 mg/mL inhibiting up to 71.65- 83.52% DPPH free radicals. Besides, this extract was also resistant to pathogenic bacteria such as Bacillus cereus ATCC 11778, Candida albicans ATCC 10231, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Staphylococcus aureus ATCC 6538 with MIC of 10.98 mg/mL. The toxicity of the extract was also determined on LO-2 hepatocytes, the results indicated extremely high cell survival (90%) at the extract concentration of 2500  g/mL. The results of determining acute toxicity and semi-permanent toxicity of the extract in rats showed that, in both cases, there was no death of rats at the dose of 10,000 mg/kg body weight in the acute toxicity test, and at the dose of 1,000 mg/kg body weight in the semi-permanent toxicity test. Keywords: Biological activity, bioreactor, submerged culture, termite mushroom. iii
LỜI CAM ĐOAN Quyển luận án là do bản thân nghiên cứu sinh thực hiên dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trần Nhân Dũng, không do người khác làm thay, các tài liêu tham khảo được nghiên cứu sinh xem xét, chọn lọc kỹ lưỡng và trích dẫn đầy đủ. Kết quả nêu ra trong luận án được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của bản thân và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. Cán bộ hướng dẫn Tác giả luận án PGS.TS. Trần Nhân Dũng Nguyễn Thị Ngọc Nhi iv
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i TÓM TẮT .............................................................................................................. ii ABSTRACT .......................................................................................................... iii LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ iiv MỤC LỤC .............................................................................................................. v DANH SÁCH BẢNG ......................................................................................... viii DANH SÁCH HÌNH ..............................................................................................x CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ..........................................................................................................1 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ...................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu .......................................................................................................... 2 1.2.2 Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 2 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ..................................................................... 3 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................3 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................ 3 1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ...................3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................4 2.1 Nấm ................................................................................................................... 4 2.1.1 Khái quát về nấm ............................................................................................4 2.1.2 Chu trình sống của nấm ................................................................................. 5 2.1.3 Các giai đoạn phát triển của nấm ..................................................................6 2.1.4 Đặc điểm biến dưỡng của nấm ...................................................................... 7 2.1.5 Điều kiện sinh trưởng của nấm ...................................................................... 7 2.2 Nấm mối ............................................................................................................9 2.2.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại .............................................................................9 2.2.2 Chu trình sống của nấm mối .......................................................................... 9 2.2.3 Đặc điểm hình thái quả thể nấm mối ........................................................... 10 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm mối ..................................19 2.2.5 Mối quan hệ cộng sinh giữa nấm mối và mối ..............................................20 2.2.6 Giá trị dinh dưỡng và dược tính của nấm mối ............................................ 22 2.3 Tổng quan về nuôi cấy chìm .........................................................................28 2.3.1 Tổng quan nuôi cấy chìm các loài nấm ....................................................... 28 2.3.2 Tổng quan về nuôi cấy chìm nấm mối ......................................................... 31 2.4 Giới thiệu về nuôi cấy chìm trong hệ thống Bioreactor ............................ 32 2.5 Tình hình nghiên cứu nấm mối trên thế giới và Việt Nam .......................35 2.5.1 Tình hình nghiên cứu về nấm mối trên thế giới ........................................... 35 2.5.2 Tình hình nghiên cứu nấm mối ở Việt Nam ................................................. 35 2.6 Định danh nấm ăn và nấm dược liệu dựa trên cơ sở sinh học phân tử .. 36 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................38 v
3.1 Thời gian và địa điểm ....................................................................................38 3.2 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................38 3.2.1 Mẫu vật nghiên cứu ...................................................................................... 38 3.2.2 Hóa chất ........................................................................................................38 3.2.3 Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 39 3.3 Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................39 3.3.1 Nội dung 1: Phân lập, định danh và giữ giống nấm mối ............................ 39 3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát môi trường nhân giống nấm mối cấp 1, 2 dạng dịch thể ...........................................................................................................................42 3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối trong Bioreactor 60 lít ....................................................................................47 3.3.4 Nội dung 4: Phân tích thành phần dinh dưỡng và khảo sát hoạt tính sinh học của sinh khối hệ sợi nấm mối ......................................................................... 52 3.3.5 Nội dung 5: Sản xuất và thử nghiệm độc tính của sản phẩm ...................... 56 3.4 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................ 59 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................60 4.1 Kết quả phân lập và định danh nấm mối ................................................... 60 4.1.1 Kết quả phân lập và định danh nấm mối Termitomyces clypeatus ............. 60 4.1.2. Kết quả phân lập và định danh nấm mối Termitomyces microcarpus .......63 4.1.3 Kết quả phân lập và định danh nấm mối Termitomyces sp.1 ......................65 4.1.4 Kết quả phân lập một số chủng nấm mối khác ............................................ 66 4.1.5 Phân tích mối quan hệ di truyền của các chủng nấm mối phân lập ........... 68 4.2 Khảo sát môi trường nhân giống nấm mối T. clypeatus ............................ 69 4.2.1 Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy lên sự tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối .......................................................................................................69 4.2.2 Tối ưu hóa hàm lượng các chất chủ yếu ảnh hưởng đến sự tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối ...............................................................................................71 4.2.3 Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy chủ yếu ảnh hưởng tới sự tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối .............................................................................................778 4.2.4 Tác động của tỷ lệ cấp giống và chế độ sục khí tới sự phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối .......................................................................................................84 4.3. Sản xuất thử nghiệm sinh khối nấm mối trong Bioreactor ..................... 85 4.3.1 Ảnh hưởng của nông độ môi trường dịch thể tới sự tích lũy sinh khối nấm mối ......................................................................................................................... 85 4.3.2 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy tới sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối ......87 4.3.3 Quy trình công nghê sản xuất thử nghiêm sinh khối hê sợi nấm mối trong Bioreactor ...............................................................................................................88 4.4 Phân tích thành phần dinh dưỡng của sinh khối nấm mối .......................90 4.5 Kết quả thử hoạt tính sinh học .....................................................................93 4.5.1 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa sinh khối nấm mối .................................93 vi
4.5.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ...................................................................94 4.6 Thử độc tính của dịch chiết sinh khối nấm mối .........................................99 4.6.1 Thử độc tính tế bào của dịch chiết sinh khối nấm mối ................................ 99 4.6.2 Thử độc tính cấp của dịch chiết sinh khối nấm mối .................................. 101 4.6.3 Thử độc tính bán trường diễn của dịch chiết sinh khối nấm mối ..............104 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................... 1099 5.1 Kết luận ..........................................................................................................109 5.2 Đề xuất ...........................................................................................................109 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 110 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .......................................126 PHỤ LỤC .................................................................................................................. vii
DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Tóm tắt hình thái quả thể của các loài nấm mối (Termitomyces) (Tibuhwa et al., 2010) ........................................................................................... 16 Bảng 2.2: Thành phần dịch chiết tổ mối (Zeleke et al., 2013) ............................. 19 Bảng 2.3: Kết quả sự phát triển và hoạt độ enzyme nấm mối trên các môi trường khác nhau (Zeleke et al., 2013) ............................................................................. 20 Bảng 2.4: Thành phần dinh dưỡng của nấm mối (% khối lượng khô) .................23 Bảng 2.5: Thành phần khoáng chất của nấm mối (mg/100g khối lượng khô) (Gbolagade et al., 2006) ........................................................................................ 23 Bảng 2.6: Hàm lượng saponin và polysaccharides từ sinh khối khô trong nuôi cấy lỏng (DMCB) và quả thể của nấm mối T. albuminosus (Lu et al., 2008) ............26 Bảng 2.7: Thành phần môi trường trong nuôi cấy chìm nấm trong sản xuất các hợp chất sinh học ................................................................................................... 29 Bảng 2.8: Sinh khối nấm trong nuôi cấy chìm các loại nấm có sử dụng Glucose (Elisashvili, 2012) ..................................................................................................30 Bảng 2.9: Các loại nấm nuôi cấy trong Bioreactor ...............................................33 Bảng 3.1: Thành phần môi trường YESS…………………..…………………...41 Bảng 3.2: Thành phần môi trường PDB có bổ sung muối khoáng ...................... 42 Bảng 3.3: Sự tác động của môi trường và thời gian nuôi cấy lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối .............................................................................................. 43 Bảng 3.4: Bố trí thí nghiêm khảo sát sự tác động đông thời của nông độ (g/L) glucose, pepton và KH2PO4 ...................................................................................44 Bảng 3.5: Sự tác động của ty lê cấp giống và chế độ sục khí tới sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối .............................................................................................. 47 Bảng 3.6: Nhiêt độ cô quay ở các mẫu nấm chiết bằng ethanol ...........................55 Bảng 3.7: Bố trí thử nghiêm độc tính cấp ............................................................. 58 Bảng 3.8: Bố trí thử nghiêm độc tính bán trường diễn .........................................59 Bảng 4.1: Kết quả phân tích ANOVA khối lượng khô ………………………...70 Bảng 4.2: Các nông độ glucose, nông độ pepton và nông độ khoáng KH2PO4 có tác động lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối được lựa chọn ....................... 74 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nông độ glucose, nông độ pepton và nông độ khoáng KH2PO4 lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối ................................................75 Bảng 4.4: Kết quả phân tích hôi quy và ANOVA của sản lượng sinh khối khô của hê sợi nấm Termitomyces clypeatus ......................................................................76 Bảng 4.5: Các pH, tốc độ lắc và nhiêt độ có tác động lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối được lựa chọn ................................................................................... 81 viii
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của pH, tốc độ lắc và nhiêt độ lên sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối ........................................................................................................... 81 Bảng 4.7: Kết quả phân tích hôi quy và ANOVA của sản lượng sinh khối khô của hê sợi nấm Termitomyces clypeatus ......................................................................82 Bảng 4.8: Kết quả phân tích ANOVA sinh khối hê sợi nấm ................................85 Bảng 4.9: Tác động của nông độ môi trường dịch thể tới sự tích lũy sinh khối nấm mối ................................................................................................................. 86 Bảng 4.10: Tác động của tốc độ khuấy tới sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối88 Bảng 4.11: Thành phần dinh dưỡng của sinh khối nấm mối T. clypeatus ........... 92 Bảng 4.12: Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm mối T.clypeatus ............... 93 Bảng 4.13: Hiêu suất chiết của cao sinh khối nấm mối ........................................95 Bảng 4.14: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch 96 Bảng 4.15: Định lượng khả năng kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp MIC ........................................................................................................................ 98 Bảng 4.16: Ty lê tế bào gan LO-2 sống sót khi được xử lý với cao SK nấm ...... 99 Bảng 4.17: Khối lượng và ty lê tử vong của chuột sau khi uống cao SK nấm .. 101 Bảng 4.18: Các chỉ số sinh lý máu trong thử nghiêm độc tính cấp ....................102 Bảng 4.19: Khối lượng và ty lê tử vong của chuột trong thử nghiêm độc tính bán trường diễn ...........................................................................................................104 Bảng 4.20: Các chỉ số sinh lý máu trong thử nghiêm độc tính bán trường diễn 105 Bảng 4.21: Các chỉ số sinh hóa máu ................................................................... 106 ix
DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Hê thống phân loại sinh giới ................................................................... 4 Hình 2.2: Chu trình sống của nấm đảm ...................................................................5 Hình 2.3: Hình thái quả thể nấm ............................................................................. 7 Hình 2.4: Nấm mối tự nhiên ....................................................................................9 Hình 2.5: Sơ đô chu trình sống của nấm mối ........................................................10 Hình 2.6: Mô tả hình thái của quả thể nấm mối ....................................................11 Hình 2.7: Termitomyces clypeatus ........................................................................ 11 Hình 2.8: Termitomyces eurrhizus ........................................................................ 12 Hình 2.9: Termitomyces heimii ............................................................................ 13 Hình 2.10: Termitomyces microcarpus ................................................................. 14 Hình 2.11: Hình ảnh một số loài nấm mối ............................................................15 Hình 2.12: Mô hình về sự cộng sinh giữa mối và nấm mối ................................. 21 Hình 2.13: Các giả thuyết về quan hê cộng sinh giữa mối và nấm mối ...............21 Hình 2.15: Hoạt tính chống oxy hoá của chiết xuất methanol hê sợi từ nấm G. frondosa, M. esculenta và T. albuminosus ............................................................25 Hình 2.16: Vùng trình tự ITS ................................................................................ 37 Hình 3.1: Bản vẽ tổng thể hê thống Bioreactor 60 lít…………………………...49 Hình 3.2: Bản vẽ chi tiết bôn nuôi sinh khối nấm mối ......................................... 50 Hình 3.3: Sơ đô quy trình công nghê sản xuất sinh khối nấm mối ...................... 52 Hình 3.4: Phản ứng trung hòa gốc DPPH ............................................................. 53 Hình 3.5. Phản ứng khử màu MTT ....................................................................... 58 Hình 4.1: Hình dạng nấm mối T. clypeatus……….……………………………..60 Hình 4.2: Bào tử nấm mối T. clypeatus dưới kính hiển vi quang học ..................60 Hình 4.3: Hình thái khuẩn lạc T. clypeatus sau 20 ngày ...................................... 61 Hình 4.4: Hình thái khuẩn lạc T. clypeatus sau khi cấy truyền 45 ngày .............. 62 Hình 4.5: Kết quả điên di sản phẩm PCR ............................................................. 63 Hình 4.6: Kết quả so sánh trình tự DNA của mẫu nấm mối phân lập được với các trình tự từ ngân hàng gene NCBI .......................................................................... 63 Hình 4.7: Nấm mối T. microcarpus ...................................................................... 64 Hình 4.8: Hình thái khuẩn lạc nấm mối T. microcarpus ...................................... 64 Hình 4.9: Hình dạng nấm mối Termitomyces sp.1 ............................................... 65 Hình 4.10: Hình thái khuẩn lạc Termitomyces sp.1 trong các MT sau 20 ngày .. 65 x
Hình 4.11: Bào tử nấm mối Termitomyces sp.1 dưới kính hiển vi quang học .....66 Hình 4.12: Kết quả so sánh trình tự DNA của mẫu nấm mối phân lập được với các trình tự từ ngân hàng gene .............................................................................. 66 Hình 4.13: Hình thái khuẩn lạc chủng BD3 sau 10 ngày ..................................... 67 Hình 4.14: Hình thái khuẩn lạc nấm mối chủng BD3 sau 30 ngày khi cấy truyền qua MT YESS ........................................................................................................67 Hình 4.15: Hình thái khuẩn lạc chủng BD5 sau 10 ngày ..................................... 68 Hình 4.16: Hình thái khuẩn lạc chủng BD6 sau 10 ngày ..................................... 68 Hình 4.17: Cây phát sinh loài được phân tích bằng phương pháp Maximum Likehood trong Mega X dựa vào trình tự của các chủng nấm mối ...................... 69 Hình 4.18: Tác động của các môi trường nuôi cấy và thời gian nuôi cấy lên khối lượng khô hê sợi nấm mối T. clypeatus ................................................................ 71 Hình 4.19: Tác động của các nông độ glucose đến khối lượng khô hê sợi nấm mối T. clypeatus .....................................................................................................72 Hình 4.20: Tác động của các nông độ pepton đến khối lượng khô hê sợi nấm T. clypeatus ................................................................................................................ 73 Hình 4.21: Tác động của các nông độ KH2PO4 đến khối lượng khô hê sợi nấm T. clypeatus ................................................................................................................ 74 Hình 4.22: Tác động của nhân tố nông độ glucose và nông độ pepton lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với nông độ khoáng là 1,5 g/L ......................................... 76 Hình 4.23: Tác động của nhân tố nông độ glucose và nông độ khoáng lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với nông độ pepton là 0,4% ............................................. 77 Hình 4.24: Tác động của nhân tố nông độ khoáng và nông độ pepton lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với nông độ glucose là 6% ............................................... 77 Hình 4.25: Tác động của pH ban đầu tới sự tích lũy sinh khối hê sợi nấm mối .. 79 Hình 4.26: Tác động của tốc độ lắc tới sự phát triển sinh khối hê sợi nấm mối ..80 Hình 4.27: Tác động của nhiêt độ tới sự phát triển sinh khối hê sợi nấm mối .... 80 Hình 4.28: Tác động của nhân tố nhiêt độ và tốc độ lắc lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với pH 5,5 ................................................................................................ 83 Hình 4.29: Tác động của nhân tố nhiêt độ và pH lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với tốc độ lắc 140 vòng/phút ......................................................................... 83 Hình 4.30: Tác động của nhân tố tốc độ lắc và pH lên sự sinh trưởng của hê sợi nấm với nhiêt độ 28ºC ........................................................................................... 84 Hình 4.31: Đường cong sinh trưởng của nấm mối T.clypeatus trong nuôi cấy Bioreactor 60 lít ..................................................................................................... 87 Hình 4.32: Sơ đô quy trình công nghê sản xuất sinh khối nấm mối .................... 89 Hình 4.33: Biểu đô đường chuẩn giữa hiêu suất bắt gốc tự do với các nông độ của cao chiết sinh khối nấm mối T. clypeatus ...................................................... 94 Hình 4.34: Kết quả thử nghiêm kháng khuẩn trên đia thạch ................................ 97 xi
Hình 4.35: Tế bào gan LO-2 khi được xử lý với cao SK nấm (phóng đại 100 lần) ..............................................................................................................................100 Hình 4.36: Mẫu tiêu bản gan chuột .....................................................................107 Hình 4.37: Mẫu tiêu bản thận chuột ....................................................................108 xii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AF (Anti foam) Chống tạo bọt AkP Alkaline Phosphatase AOA antioxidant activity BIOREACTOR Hê thống nuôi cấy sinh học BUN (Blood Urea Nitrogen) Nông độ urea nitrogen CPE Chiết xuất polysaccharide thô CMC Carboxymethyl Cellulose CSDL Cơ sở dữ liêu CSE Chiết xuất saponin thô CTAB Cetyl trimethylammoniumbromide dL Decilit DMCB Dry matter of culture broth DNA Deoxyribonucleic acid DO (Dessolved Oxygen) Hàm lượng oxy hòa tan DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EC50 effective concentration 50% EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EPC extracellular phenolic compounds EPS (Extracellular Polysaccharide) Polysaccharide ngoại bào fL Femtolit = 10-15 lít HCT (Hematocrit) Thể tích khối hông cầu HGB (Hemoglobin) Lượng huyết sắc tố IC50 Inhibitory concentration 50% IPS (Intracellular Polysaccharide) Polysaccharide nội bào ITS Internal Transcribed Spacer LSU Large subunit LYM (Lymphocyte) Bạch cầu lympho Lượng huyết sắc tố trung bình hông MCH (Mean corpuscular hemoglobin) cầu MCHC (Mean orpuscular hemoglobin Nông độ huyết sắc tố trung bình concentration) hông cầu xiii
MCV (Mean corpuscular volume) Thể tích trung bình hông cầu MIC (Minimum Inhibition Nông độ ức chế tối thiểu Concentration) MID Bạch cầu monoxit MPV (Mean platelet volume) Thể tích trung bình của tiểu cầu MT Môi trường MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide MTDT Môi trường dịch thể NCBI National Center for Biotechnology Information NSAIDs Thuốc kháng viêm không steroid NT Nghiêm thức PCR Polymerase chain reaction PCT (Plateletcrit) Thể tích khối tiểu cầu PDA Potato dextrin agar PDB Potato dextrin broth PDW (Platelet disrabution width) Độ phân bố tiểu cầu pg Picogam = 10 - 12g P-LCR (Platelet larger cell ratio Ty lê tiểu cầu có kích thước lớn PLT (Platelet count) Số lượng tiểu cầu RBC (Red blood cell) Số lượng hông cầu RDW (Red distribution width) Dải phân bố kích thước hông cầu rRNA Ribosomal ribonucleic acid RSM Response surface methodology SK Sinh khối WBC (White blood cell) Số lượng bạch cầu xiv
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Các loại nấm lớn, bao gôm nấm ăn và nấm dược liêu đã gắn liền với cuộc sống của con người từ rất lâu. Nấm không những dùng làm thực phẩm để chế biến các món ăn hằng ngày mà còn làm dược liêu (nấm linh chi) hay sản xuất các loại thực phẩm chức năng, các loại thuốc điều trị một số bênh (Wasser, 2005; Okigbo & Nwatu, 2015; Bulam et al., 2018). Một số nấm rất giàu khoáng chất đặc biêt là K, P, Ca, Mg, Mn và Se; quan trọng nhất là vitamin D, B (Manzi et al., 1999; Sanmee et al., 2003; Kurtzman, 2005; Khan & Tania, 2012; Wang, 2014). Nấm là nguôn protein chất lượng có chứa tất cả các acid amin thiết yếu cần thiết cho con người (Mattila et al., 2002; Colak et al., 2009; González et al., 2020). Nấm chứa rất ít cholesterol nhưng giàu axít béo không bão hòa và nhiều carbohydrate dễ tiêu hóa (Breene, 1990; Wani et al., 2010; Valverde et al., 2015), đó là những đặc tính tốt của một thực phẩm lý tưởng cho những người béo phì và phòng chống bênh tiểu đường (De Silva et al., 2012; Martel et al., 2017; Harada et al., 2020). Một số nấm được cho là đang được sử dụng như thực phẩm điều trị hữu ích trong viêc ngăn ngừa các bênh như cao huyết áp, tăng cholesterol máu, xơ vữa động mạch, ung thư, bảo vê gan và chống oxy hóa (Tidke et al., 2006; Woldegiorgis et al., 2015; Abidin et al., 2017 ; Waktola & Temesgen, 2018; Kundu et al., 2021). Nấm mối (Termitomyces) là loại nấm được thiên nhiên ban tặng với giá trị dinh dưỡng rất cao và hương vị rất thơm ngon (Pegler & Piearce, 1980). Nó chứa đầy đủ các acid amin không thay thế và khoáng chất với hàm lượng cao (Masamba et al., 2010; Davidson et al., 2012; Nakalembe et al., 2013; Nakalembe et al., 2015). Trong nấm mối có nhiều hoạt chất sinh học có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, điều hòa miễn dịch, ức chế sự phát triển các khối u (Hsieh & Ju, 2018). Một số loài nấm mối được sử dụng làm dược liêu như T. robustus, T. striatus tác dụng chống lão hóa (Adewusi et al., 1993); T. heimii chứa axit béo ergosterol, linoleic tăng cường hê thống miễn dịch, ngăn ngừa bênh cao huyết áp (Abd Malek et al., 2012). Ngoài ra, T. heimii được xem như thuốc bổ trong quá trình chữa lành vết thương và giúp đông máu (Chandrawati el al., 2014); T. microcarpus giàu dinh dưỡng chứa 40% protein và 55% carbohydrate khối lượng khô, (Chandra et al., 2009), đặc biêt nó có β-D-glucan có khả năng ức chế các tế bào ung thư (Villares et al., 2012); T. eurrhizus hỗ trợ điều trị bênh về khớp, tiêu chảy và bênh cao huyết áp (Sachan et al., 2013); T. clypeatus kháng trực khuẩn Pseudomonas aeruginosa (Subrata et al., 2012); hỗ trợ điều trị bênh thủy đậu (Dutta et al., 2014); có hoạt tính chống oxy hoá cao (Mau et al., 2004, Pattanayak et al., 2015). trong nấm T. clypeatus còn có chứa AkP, đây có thể là một phân tử sinh học hiêu quả để giết chết tế bào ung thư (Majumder et al., 1
2016). Ở Ấn Độ, T. heimii và T. microcarpus được sử dụng trong điều trị sốt, cảm lạnh và nhiễm trùng nấm, hỗ trợ điều trị ung thư (Venkatachalapathi & Paulsamy, 2016; Njue et al. 2018). Ở Cameroon, T. titanicusis được sử dụng để điều trị các biến chứng dạ dày (Rosemary et al., 2017). Ở Tanzania, T. microcarpus được sử dụng để tăng cường hê miễn dịch; T. titanicus, T. letestui, T. eurrhizus và T. aurantiacus được xem là thuốc bổ hỗ trợ điều trị các bênh về đường tiêu hóa chẳng hạn như đau bụng, táo bón, đau và loét dạ dày (Tibuhwa, 2012). Thời gian gần đây thời tiết không thuận lợi cộng với tình trạng ô nhiễm môi trường do hoạt động sản xuất nông nghiêp nên nấm mối mọc giảm hơn nhiều so với thời gian trước đây. Nếu không có biên pháp kịp thời có lẽ một ngày không xa chúng ta sẽ không còn cơ hội để nhìn thấy và thưởng thức nấm mối. Về mặt khoa học chúng ta có thể nuôi trông được tất cả các vật thể sống (từ cấp độ tế bào cho đến cơ thể sống) nhưng có lẽ nấm mối là loài đặc biêt, có đặc điểm sinh lý và cơ chế biến dưỡng khác biêt hơn so với các loài nấm khác nên tới nay con người vẫn chưa thể trông được. Theo kết quả nghiên cứu của Ulziijargal và Mau (2011) khi phân tích hàm lượng các thành phần cơ bản của quả thể và hê sợi (mycelia) ở các loài nấm thuộc chi như Agaricus, Auricularia, Cordyceps, Trametes, Flammulina, Ganoderma, Lentinus, Pleurotus, … cho thấy gần giống nhau. Chính vì vậy viêc nghiên cứu quy trình sản xuất sinh khối hê sợi nấm mối bằng phương pháp nuôi cấy dịch thể là viêc hết sức thiết thực, là tiền đề cho các nghiên cứu nuôi cấy các loài khác sau này. Chính vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối (Termitomyces sp.)” được đề xuất. 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu Tối ưu được điều kiên nuôi cấy nấm mối được phân lập từ tự nhiên bằng hê thống lên men sinh học và đánh giá được thành phần dinh dưỡng cũng như hoạt tính sinh học của dịch và cao sinh khối nấm mối. 1.2.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiên với các nội dung chính sau: (1) Phân lập, định danh và giữ giống nấm mối (2) Khảo sát môi trường nhân giống nấm mối cấp 1, 2 dạng dịch thể (3) Nghiên cứu quy trình công nghê sản xuất sinh khối hê sợi nấm mối trong Bioreactor 60 lít (4) Phân tích thành phần dinh dưỡng và khảo sát hoạt tính sinh học của sinh khối hê sợi nấm mối 2
(5) Sản xuất và thử nghiêm độc tính tế bào, độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sản phẩm. 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu - Giống nấm mối thuần khiết được phân lập từ một loài nấm mối mọc tự nhiên ở Viêt Nam. - Các điều kiên nuôi cấy dịch thể tơ nấm mối. 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu - Nguôn mẫu nấm mối thu ở khu vực phía Nam. - Quy trình sản xuất sinh khối nấm mối trong Hê thống nuôi cấy sinh học (Bioreactor) 60 lít. 1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Luận án đã có những đóng góp mới, ý nghia khoa học trong linh vực nghiên cứu về nấm mối tại Viêt Nam thể hiên rõ thông qua kết quả của luận án: - Đề tài đã phân lập và xác định chi của 07 chủng nấm mối là Termitomyces, trong đó có 2 chủng xác định được đến loài là Termitomyces clypeatus và Termitomyces microcapus. - Môi trường nhân giống nấm mối cấp 1, 2 dạng dịch thể đã được xác định điều kiên thích hợp nuôi cấy chìm nấm mối Termitomyces clypeatus. - Quy trình công nghê sản xuất sinh khối hê sợi nấm mối trong Bioreactor 60 lít đã được xây dựng và tìm ra đường cong sinh trưởng của nấm mối Termitomyces clypeatus. - Các thành phần dinh dưỡng đã được phân tích, hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của sinh khối hê sợi nấm mối Termitomyces clypeatus đã được đánh giá. Đông thời sản xuất thành công sinh khối nấm mối và chiết, cô đặc cao để thử nghiêm hoạt tính sinh học, độc tính tế bào, độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sản phẩm cao. - Ngoài ra, kết quả luận án đã mở ra hướng nghiên cứu nhân giống các loại nấm bằng phương pháp nuôi cấy chìm nhằm tiết kiêm thời gian, công sức và đặc biêt là có thể cung cấp một lượng lớn các giống nấm có chất lượng đông nhất. Kết quả nghiên cứu còn có ý nghia thực tiễn to lớn trong viêc sản xuất sinh khối các loại nấm dược liêu, đặc biêt là những loài nấm quý mà con người chưa thể trông được ra quả thể, thì con đường nuôi cấy dịch thể bằng các bể phản ứng sinh học là một giải pháp hữu hiêu. 3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm 2.1.1 Khái quát về nấm Trong lịch sử, vào năm 1753 nấm đã được Linnaeus phân loại thuộc nhóm Thallophyta (nhóm Tản thực vật). Điều này do phần lớn các thuộc tính cấu trúc giải phẫu tương đối đơn giản của nấm như không có rễ thật, thân, lá, hoa, và hạt. Sự hiên diên của thành tế bào ở nấm liên quan đến thực vật hơn là động vật. Nó bao gôm các loại tảo, vi khuẩn, nấm và địa y. Các nghiên cứu hiên đại đã chứng minh rằng hê sinh vật nấm, cùng với các loại nấm khác, có các tính năng của riêng mình. Các loại nấm khác biêt so với giới thực vật và động vật là do khác nhau trong thành phần, cấu tạo của thành tế bào, dinh dưỡng theo kiểu dị dưỡng (osmotrophic), nhưng không phải là tiêu hóa như các loài động vật. Đây là các đặc điểm khác biêt để đặt chúng trong một giới riêng đó là giới Nấm (Miles et al., 2004). Năm 1969, Whitaker đã nêu hê thống phân loại 5 giới: Khởi sinh, Nguyên sinh, Nấm, Thực vật và Động vật (Hình 2.1). Giới Thực vật Giới Nấm Giới Động vật Giới Nguyên sinh Giới Khởi sinh Hình 2.1: Hê thống phân loại sinh giới (Whittaker, 1969) Vào năm 1977, Woese dựa vào trình tự nucleotide của 16S rRNA đã phân chia sinh giới thành 3 lãnh giới hay “siêu giới” là Bacteria, Archaea và Eukarya. Thực vật, động vật và nấm xếp chung vào Eukarya. Như vậy, nấm là một giới riêng trong lãnh giới Eukarya. Giới nấm gôm những sinh vật nhân thực, cơ thể đơn bào hoặc đa bào, cấu trúc dạng sợi, phần lớn thành tế bào chứa kitin, không có lục lạp, không có lông 4