Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thay đổi Lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:162

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu thay đổi Lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao" với 2 mục tiêu: 1. Đánh giá thay đổi mức độ biểu hiện LOX của tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao. 2. Phân tích sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thay đổi Lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN NGÂN HÀ NGHIÊN CỨU THAY ĐỔI LYSYL OXIDASE CỦA TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU VÕNG MẠC Ở MÔI TRƢỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN NGÂN HÀ NGHIÊN CỨU THAY ĐỔI LYSYL OXIDASE CỦA TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU VÕNG MẠC Ở MÔI TRƢỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO Chuyên ngành : Nhãn khoa Mã số : 9720157 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trần Huy Thịnh 2. TS. Nguyễn Xuân Tịnh HÀ NỘI – 2020
LỜI CẢM ƠN Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Mắt Trường Đại học Y Hà Nội, Trường Y Đại học Boston, Ban Giám đốc Bệnh viện Mắt Trung Ương đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình tôi học tập và tiến hành nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Huy Thịnh và TS. Nguyễn Xuân Tịnh – những người thầy đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt tôi trong quá trình học tập, công tác chuyên môn nghề nghiệp và chỉ bảo giúp tôi giải quyết nhiều khó khăn, vướng mắc trong quá trình thực hiện nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Sayon Roy - Trường Y Đại học Boston và PGS.TS. Phạm Trọng Văn - Trưởng Bộ môn Mắt đã cho tôi nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thiện nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng, cùng hai nhà khoa học phản biện độc lập. Các thầy cô đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể anh chị em Phòng nghiên cứu biến chứng mạch máu nhỏ do đái tháo đường - Trường Y Đại học Boston và Bộ môn Mắt - Trường Đại học Y Hà Nội cùng các anh chị đi trước, bạn bè đồng nghiệp đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác. Sau nữa, tôi xin dành tình yêu thương và lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã chia sẻ và là chỗ dựa vững chắc để tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Hà Nôi, ngày 2 tháng 10 năm 2020 Tác giả luận án Nguyễn Ngân Hà
LỜI CAM ĐOAN Tôi là Nguyễn Ngân Hà, nghiên cứu sinh khóa 36, chuyên ngành Nhãn khoa, Trường Đại học Y Hà Nội, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trần Huy Thịnh và TS Nguyễn Xuân Tịnh. 2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là chính xác, trung thực và khách quan, đã được cơ sở nơi nghiên cứu xác nhận. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này. Hà Nội, ngày 02 tháng 10 năm 2020 Người thực hiện Nguyễn Ngân Hà
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APS : Ammonium Persulfate BAPN : β-Amin-opropionitrile BSA : Bovine serum albumin Coll IV : Collagen IV Cx : Connexin DAPI : 4',6-diamidino-2-phenylindole DMEM : Dulbecco Medified Eagle Medium FBS : Fetal Bovine Serum FITC : Fluorescein isothiocyanate FN : Fibronectin HIFs : Các yếu tố gây thiếu oxy HSPGs : Heparan sulfate proteoglycan LOX : Lysyl oxidase LOXsiRNA : LOX small interfering RNA NH4OH : Amonium Hydroxide PBS : Photphaste-buffered saline PDR : Bệnh võng mạc đái tháo đường tăng sinh PVR : Bệnh dịch kính võng mạc tăng sinh RRD : Bong võng mạc nguyên phát TGF- β : Yếu tố chuyển đổi tăng trưởng β TTBS : Tween Tris-buffered saline VEGF : Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu WB : Western blot
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................. 3 1.1. Đặc điểm mô học của mao mạch võng mạc ......................................... 3 1.1.1. Lớp nội mô ..................................................................................... 3 1.1.2. Màng đáy ........................................................................................ 4 1.1.3. Tế bào quanh mạch ........................................................................ 9 1.1.4. Bất thường mao mạch võng mạc ở chuột đái tháo đường ............. 9 1.2. Cơ chế sinh bệnh của các tổn thương mao mạch võng mạc do tình trạng đường huyết cao. ........................................................................... 11 1.2.1. Dày màng đáy mao mạch võng mạc ............................................ 11 1.2.2. Rối loạn kết nối tế bào-tế bào ...................................................... 14 1.2.3. Thay đổi cấu trúc ti thể................................................................. 18 1.3. Lysyl oxidase ...................................................................................... 20 1.3.1. Đặc điểm lysyl oxidase ................................................................ 20 1.3.2. Các tình trạng bệnh lý liên quan đến thay đổi mức độ biểu hiện LOX .............................................................................................. 23 1.4. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới ............................. 26 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 30 2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 30 2.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 30 2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................... 30 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thử nghiệm ............................. 30 2.3.2. Mẫu............................................................................................... 30 2.3.3. Phương tiện nghiên cứu ............................................................... 31 2.3.4. Cách thức tiến hành ...................................................................... 32 2.3.5. Các chỉ số nghiên cứu .................................................................. 50 2.4. Phương pháp thu thập số liệu và xử lý số liệu .................................... 52 2.5. Đạo đức nghiên cứu ............................................................................ 52
Chƣơng 3: KẾT QUẢ ................................................................................. 53 3.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu .................................................................. 53 3.2. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao ........................ 54 3.2.1. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao đến mức độ biểu hiện của LOX ................................................................................ 54 3.2.2. Tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ biểu hiện của LOX . 62 3.2.3. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới hoạt động của tế bào ............................................................................. 66 3.3. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao ............................................................................................. 70 3.3.1. Thay đổi sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào . 70 3.2.2. Thay đổi mật độ liên kết của LOX với protein chất nền ngoại bào .... 72 Chƣơng 4: BÀN LUẬN ............................................................................... 80 4.1. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX.............................................. 80 4.1.1. Thay đổi mức độ biểu hiện của LOX ........................................... 80 4.1.2. Thay đổi hoạt động của tế bào liên quan đến thay đổi mức độ biểu hiện của LOX ................................................................................ 84 4.2. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào . 94 KẾT LUẬN ................................................................................................ 100 HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ................................................... 102 DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Độ dày màng đáy mạch máu ở các mô khác nhau trên cơ thể người .. 5 Bảng 1.2. Độ dày màng đáy mao mạch võng mạc ở các loài khác nhau ............. 5
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới LOX trong protein toàn phần ....................................................... 55 Biểu đồ 3.2. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới hàm lượng LOX tại chất nền ngoại bào. .................................... 56 Biểu đồ 3.3. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới LOX trong tế bào. ........................................................................ 57 Biểu đồ 3.4. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới mật độ LOX trong protein toàn phần. ............................................ 60 Biểu đồ 3.5. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới mật độ LOX trong protein chất nền ngoại bào. .............................. 61 Biểu đồ 3.6. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới hoạt động của LOX.............................................................................. 62 Biểu đồ 3.7. Tác động ức chế mức độ biểu hiện LOX của LOXsiRNA. 63 Biểu đồ 3.8. Sự thay đổi mật độ LOX trong protein toàn phần. ............. 64 Biểu đồ 3.9. Tác động ức chế hoạt động LOX của BAPN. .................... 65 Biểu đồ 3.10. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới độ thẩm thấu của tế bào nội mô mạch máu võng mạc. ........... 66 Biểu đồ 3.11. Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình biểu thị qua số lượng tế bào chết/1000 tế bào. .......................................................... 69 Biểu đồ 3.12. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám dính của LOX với Coll IV và FN trong protein toàn phần. 71 Biểu đồ 3.13. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám dính của LOX với Coll IV và FN trong protein chất nền ngoại bào............................................................................. 72
Biểu đồ 3.14. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với Coll IV trong protein toàn phần. ..................... 73 Biểu đồ 3.15. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với FN trong protein toàn phần. ............................ 75 Biểu đồ 3.16. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với Coll IV trong protein chất nền ngoại bào. ....... 76 Biểu đồ 3.17. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với FN trong protein chất nền ngoại bào. .............. 79
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc mao mạch võng mạc .................................................... 3 Hình 1.2. Cấu trúc màng đáy mao mạch .................................................... 6 Hình 1.3. Hiện tượng rò mạch máu trong bệnh võng mạc đái tháo đường ở chuột ......................................................................................... 10 Hình 1.4. Hiện tượng mao mạch không có tế bào ở võng mạc chuột đái tháo đường ................................................................................ 10 Hình 1.5. Cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường ............................. 13 Hình 1.6. Cấu trúc và vị trí của connexon ................................................ 14 Hình 1.7. Sự ghép cặp của các connexon hình thành mối liên kết khe .... 15 Hình 1.8. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường do dày màng đáy mao mạch và rối loạn kết nối tế bào-tế bào ....................... 18 Hình 1.9. Cơ chế bệnh sinh bệnh võng mạc đái tháo đường do thay đổi cấu trúc ti thể............................................................................. 19 Hình 1.10. Quá trình hình thành LOX trưởng thành .................................. 21 Hình 1.11. Điều hoà quá trình hình thành và hoạt động của LOX ............. 21 Hình 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào ................................... 33 Hình 2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong tủ hút .............................. 33 Hình 2.3. Các tế bào nuôi cấy trong các đĩa môi trường. ......................... 35 Hình 2.4. Các tế bào được nuôi cấy trên các lam kính đặt trong các đĩa tế bào.. 40 Hình 2.5. Chuẩn bị kháng thể sơ cấp ........................................................ 41 Hình 2.6. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang ngày thứ nhất .......... 42 Hình 2.7. Phân tích hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua phần mềm Image J ............................................................................. 43 Hình 3.1. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong protein toàn phần .. 54
Hình 3.2. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong protein chất nền ngoại bào ................................................................................... 55 Hình 3.3. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong tế bào. ............. 56 Hình 3.4. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới LOX bên ngoài tế bào. .............................................................................. 58 Hình 3.5. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein toàn phần .................................................................................. 59 Hình 3.6. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein chất nền ngoại bào. ................................................................... 61 Hình 3.7. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX ở các nhóm tế bào. ... 63 Hình 3.8. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein chất nền ngoại bào. ................................................................... 64 Hình 3.9. Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hoạt động AKT67 Hình 3.10. Hình ảnh nhuộm huỳnh quang thể hiện hiện tượng chết tế bào theo chương trình ở các nhóm tế bào........................................ 68 Hình 3.11. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và hàm lượng LOX liên kết với FN trong protein toàn phần. ....... 70 Hình 3.12. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và hàm lượng LOX liên kết với FN trong protein chất nền ngoại bào. ...... 71 Hình 3.13. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử thể hiện liên kết của LOX với Coll IV trong protein toàn phần. ... 73 Hình 3.14. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi đồng tiêu thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần. 74 Hình 3.15. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần.75 Hình 3.16. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang thể hiện liên kết của LOX với Coll IV trong protein chất nền ngoại bào. ................. 77
Hình 3.17. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần....... 78 Hình 4.1. Giảm LOX giúp ngăn ngừa rò mạch máu võng mạc trong bệnh đái tháo đường .......................................................................... 85 Hình 4.2. Giảm lượng LOX giúp ngăn ngừa chết tế bào theo chương trình ở các tế bào mạch máu trong mạng mao mạch võng mạc. ....... 90 Hình 4.3. Tác động của đái tháo đường và giảm nồng độ LOX tới sự phát triển của mạch máu không có tế bào và chết tế bào ngoại mạch ở võng mạc chuột ........................................................... 93 Hình 4.4. Hình ảnh cắt ngang mao mạch võng mạc chuột qua sinh hiển vi điện tử ....................................................................................... 95 Hình 4.5. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới sự kết dính của LOX với chất nền ngoại vào và LOX quay trở lại tế bào biến thiên theo thời gian ........................................................... 98
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh võng mạc đái tháo đường là nguyên nhân hàng đầu gây giảm thị lực trong dân số trong độ tuổi lao động [1-2]. Các giai đoạn đầu của bệnh võng mạc đái tháo đường được đặc trưng bởi sự hiện diện của mao mạch không có tế bào và sự chết tế bào ngoại mạch, tiếp đó là sự chết tế bào mạch máu võng mạc theo chương trình [3-4]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng màng đáy mao mạch dày lên là dấu hiệu mô học của bệnh võng mạc đái tháo đường [5-6] và có thể thúc đẩy quá trình chết tế bào mạch máu [7-8]. Ngoài ra, màng đáy dày góp phần làm tổn thương hàng rào máu võng mạc dẫn đến hiện tượng tăng tính thấm thành mạch và rò rỉ mạch máu võng mạc [4], một dấu hiệu lâm sàng của bệnh võng mạc đái tháo đường. Cơ chế bệnh sinh của bệnh lý vi mạch do đái tháo đường bị ảnh hưởng bởi những thay đổi về chất lượng và số lượng của màng đáy mao mạch. Mặc dù những thay đổi về mô học và chức năng đi kèm với bệnh lý vi mạch do đái tháo đường đã được biết khá rõ [9], nhưng các cơ chế nội bào và ngoại bào cụ thể liên quan đến những thay đổi này dần dần dẫn đến rối loạn chức năng của bệnh võng mạc đái tháo đường vẫn chưa rõ ràng. Lysyl oxidase (LOX) là một enzyme ngoại bào đã được chứng minh là rất cần thiết cho sự hình thành và chức năng của màng đáy [10]. Ức chế enzyme này có thể gây ra bệnh loãng xương [11], nhưng đồng thời, các loại tế bào khối u gây tăng lượng enzyme này có thể thúc đẩy sự di căn của khối u hiện có, khiến nó trở nên ác tính [12-13]. LOX được tổng hợp và tiết ra dưới dạng tiền enzyme glycosyl hóa (proLOX, 50 kDa), tiếp tục trải qua quá trình phân giải protein ngoại bào thành dạng trưởng thành (LOX 32 kDa) [14]. LOX trưởng thành một phần quay trở lại tế bào, một phần bám vào chất nền ngoại bào thực hiện chức năng sinh học. Enzym LOX xúc tác quá trình khử
2 oxy hóa lượng peptidyllysine và hydroxylysine dư thừa trong tiền chất collagen và lượng lysine dư thừa trong elastin. Các aldehyd này trải qua các phản ứng tự ngưng tụ dẫn đến hình thành chất nền ngoại bào [14-15]. Vì vậy, LOX đóng vai trò rất quan trọng trong việc duy trì tính ổn định và tính toàn vẹn của màng đáy. LOX đã được xác định trong một số mô, bao gồm da, động mạch chủ, tim, phổi, gan, sụn, xương, thận, vú, võng mạc và não [16-18]. Có khá nhiều nghiên cứu về LOX tại tim, xương, vú, phổi,... đem lại những hiểu biết sâu hơn về cơ chế sinh bệnh và mở ra các hướng nghiên cứu biện pháp can thiệp hiệu quả. Nghiên cứu của Song và cộng sự chỉ ra rằng hàm lượng LOX tăng trong võng mạc của chuột đái tháo đường và điều hoà LOX giúp ngăn ngừa tổn thương võng mạc do đái tháo đường [19]. Ngoài ra, báo cáo gần đây cũng cho thấy LOX được điều hòa bởi các yếu tố gây thiếu oxy (HIFs), một nhân tố quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình tân mạch võng mạc trong bệnh võng mạc đái tháo đường [12]. Nghiên cứu mới đây trên mẫu dịch kính bệnh nhân mắc võng mạc đái tháo đường tăng sinh biểu hiện tăng đáng kể nồng độ LOX so với người không mắc bệnh đái tháo đường [20]. Tuy nhiên, cơ chế gây ra những rối loạn này cũng như những bất thường LOX ở cấp độ tế bào còn chưa rõ ràng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu "Nghiên cứu thay đổi Lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao" với 2 mục tiêu: 1. Đánh giá thay đổi mức độ biểu hiện LOX của tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao. 2. Phân tích sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao.
3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm mô học của mao mạch võng mạc Thành mao mạch võng mạc mỏng, từ trong ra ngoài gồm có lớp nội mô, màng đáy và tế bào quanh mạch. 1.1.1. Lớp nội mô Lớp nội mô là một hàng tế bào đa giác dẹt lợp mặt trong thành mao mạch. Phần bào tương chứa nhân lồi vào lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tế bào toả thành lá mỏng. Các tế bào nội mô liên kết với nhau bởi mối liên kết khe. Dưới sinh hiển vi điện tử có thể thấy ở lá bào tương tế bào nội mô có những cửa sổ (lỗ nội mô), màng bào tương ở cả hai mặt tế bào có những vết lõm siêu vi, trong bào tương có những không bào vi ẩm. Những bào quan như lưới nội bào, ti thể, ribosom nằm rải rác nhưng tập trung nhiều quanh nhân, bộ Golgi nhỏ, thường nằm sát nhân [6-21-23]. A B Hình 1.1. Cấu trúc mao mạch võng mạc [24] A. Thiết đồ dọc. B. Thiết đồ cắt ngang
4 1.1.2. Màng đáy 1.1.2.1. Cấu trúc Màng đáy là lớp màng mỏng dày khoảng 50nm, nằm giữa lớp tế bào nội mô và tế bào ngoại mạch của mạch máu [25]. Màng đáy mạch máu chứa các protein chất nền ngoại bào được sắp xếp một cách có tổ chức để hình thành giá đỡ cho tế bào [25]. Màng đáy là nơi thực hiện nhiều chức năng quan trọng của tế bào do đó nó rất quan trọng với sự sống còn của tế bào và cân bằng nội môi võng mạc. Màng đáy mạch máu cung cấp môi trường vi mô, tại đó tín hiệu hai chiều thông qua các integrin điều chỉnh sự gắn kết và chức năng của tế bào. Chức năng chính của màng đáy là tạo bộ khung gắn kết tế bào [26], tạo điều kiện cho kết nối tế bào-tế bào [27], và điều khiển việc chữa lành vết thương [28]. Màng đáy có cấu trúc nhiều lớp tạo bởi rất nhiều thành phần trong đó các thành phần chính là collagen IV (Coll IV), fibronectin (FN), laminin và heparan sulfate proteoglycans được sắp xếp theo trình tự nghiêm ngặt để đảm bảo chức năng và tính toàn vẹn của màng đáy. Ở võng mạc, chất nền ngoại bào được sản xuất chủ yếu bởi các tế bào nội mô mạch máu và tế bào ngoại mạch [6-21-22]. Các loại tế bào khác cũng sản xuất một lượng nhỏ chất nền ngoại bào là tế bào Muller [29], tế bào hình sao [30], tế bào hạch [31] và các tế bào biểu mô võng mạc [32]. Bằng phương pháp đo lường siêu cấu trúc sử dụng sinh hiển vi điện tử cho thấy có sự khác nhau về độ dày màng đáy mạch máu giữa các mô (bảng 1) và giữa các lớp động vật (bảng 2). Màng đáy bao gồm 2 vùng riêng biệt là lá sáng (lamina lucida) và lá đặc (lamina densa), nơi tiếp giáp phía trước với màng tế bào, phía sau liên tục với mô liên kết của chất nền ngoại bào [33].
5 Bảng 1.1. Độ dày màng đáy mạch máu ở các mô khác nhau trên cơ thể ngƣời [6] Loại mô Độ dày (nm) Tài liệu tham khảo Võng mạc 250-480 [34] Tiểu cầu thận 330±50 [35-36] Cơ xương 220 [37] Cơ tim 77±4 [38] Cơ tứ đầu đùi 108-246 [39] Bảng 1.2. Độ dày màng đáy mao mạch võng mạc ở các loài khác nhau [6] Loài Độ dày (nm) Tài liệu tham khảo Chuột nhắt 93±19 [40] Chuột cống 51-112 [41] Mèo 72±12 [42] Chó 90-140 [43] Người 250-450 [34] 1.1.2.2. Thành phần Màng đáy bao gồm nhiều thành phần sắp xếp một cách có tổ chức. Một số thành phần chính tạo nên bộ khung của màng bao gồm Coll IV, FN, laminin và heparan sulfate proteoglycan. Ngoài ra màng cũng chứa các thành
6 phần khác như nidogen, tenascin, perlecan, agrin collagen I, II, III và chondroitin sulfate proteoglycan [44-45]. Collagen IV là thành phần phong phú nhất trong chất nền ngoại bào, và chỉ được tìm thấy trong màng tế bào. Coll IV có trọng lượng phân tử khoảng 500 kD với chiều dài trung bình 400 nm [46] và cấu trúc bộ ba xoắn ốc nguồn gốc từ 3 chuỗi α, bao gồm 2 chuỗi α1 giống hệt nhau và 1 chuỗi α2 [47]. Mỗi chuỗi chứa 3 vùng riêng biệt: đầu amino giàu cysteine và lysin, vùng amino axit với chuỗi Gly-X-Y lặp lại khoảng 1400 lần và đầu carboxyl chứa khoảng 230 amino axit [48]. Tổng thể cấu trúc của Coll IV sắp xếp dạng như mạng tinh thể được tổng hợp khi vùng gen khởi động tương tác với vị trí NC1 tại đầu tận carboxyl tạo nên các dimer [49]. Các dimer này sau đó được liên kết chéo với nhau tại vùng 7S nằm tại đầu tận amino [33]. Collagen có các vị trí kết dính tương tác trực tiếp với các intergrin α1β1 và α2β1 cho phép tế bào kết nối với màng tế bào và khởi động các tín hiệu tế bào [50]. Coll IV cũng tạo thành một giá đỡ để liên kết các thành phần chất nền ngoại bào khác [51]. Hình 1.2. Cấu trúc màng đáy mao mạch [24]
7 Fibronectin, 1 glycoprotein lớn, là thành phần quan trọng của màng đáy được biết đến với khả năng hoạt động như một chất keo phân tử và duy trì cấu trúc phân tử ổn định của màng đáy. FN là một dimer bao gồm 2 tiểu đơn vị lớn, giống hệt nhau, mỗi đơn vị nặng khoảng 250 kD được liên kết cộng hoá trị thông qua liên kết disulfide ở đầu tận C [26-52-53]. Sau khi được tổng hợp, FN tập hợp thành 1 mạng lưới sợi phụ thuộc integrin [26], sử dụng vị trí RGD (Arg-Gly-Asp) bám vào vị trí α5β1 của integrin [52]. FN tạo điều kiện cho sự kết dính của tế bào, di chuyển, tăng trưởng tế bào và biệt hoá thông qua các tương tác đặc hiệu bao gồm các vị trí kết dính cho collagen, heparan và các proteoglycan khác. FN gắn kết các thành phần chất nền ngoại bào thành một cấu trúc có tổ chức, do đó đóng góp vào sự toàn vẹn và chức năng của chất nền ngoại bào [52-54]. Laminin là 1 glycoprotein không chứa collagen, được tìm thấy chủ yếu trong lớp lá sáng [55]. Laminin có trọng lượng phân tử khoảng 820 kD và chứa 3 chuỗi polypeptid: α, β, và γ. Cả 3 chuỗi đều chứa nhánh dài xoắn ốc (dài khoảng 75 nm), ngoài ra chuỗi α có thêm nhánh ngắn (dài khoảng 35 nm) [56]. Phần cơ bản của nhánh dài là miền G chứa các chuỗi tương tự yếu tố tăng trưởng biểu bì [56]. Chuỗi ba lần lặp đầu tiên, gọi là G1-3 chịu trách nhiệm kết dính với các integrin, trong khi chuỗi 2 lần lặp cuối cùng (ví dụ G4- 5) chịu trách nhiệm kết dính với các heparan [57]. Laminin tương tác với collagen IV bằng cách cùng bám dính vào nhiều thành phần khác của chất nền ngoại bào bao gồm FN và integrin [58]. Laminin là lớp chất nền ngoại bào bao quanh bề mặt tế bào và đóng vai trò thiết yếu trong giá đỡ của nhiều mô khác nhau [59]. Ngoài ra, laminin có vai trò trong kết dính, biệt hoá, di chuyển của tế bào và sự sống còn của mô [58]. Heparan sulfate proteoglycan (HSPGs) là một trong các thành phần chính của màng đáy. Đây là loại glycosaminoglycan phổ biến trong các tế bào