Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:196

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Y học "Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng" trình bày các nội dung chính sau: Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020); Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -----------------*----------------- PHẠM THỊ HÀ TRANG NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ TRÊN NGƯỜI Ở HAI XÃ TRỌNG ĐIỂM THUỘC NINH BÌNH, PHÚ YÊN VÀ CHẾ TẠO KIT LAMP ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN TẠI CỘNG ĐỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2024
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -----------------*----------------- PHẠM THỊ HÀ TRANG NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ TRÊN NGƯỜI Ở HAI XÃ TRỌNG ĐIỂM THUỘC NINH BÌNH, PHÚ YÊN VÀ CHẾ TẠO KIT LAMP ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN TẠI CỘNG ĐỒNG CHUYÊN NGÀNH: DỊCH TỄ HỌC MÃ SỐ: 9720117 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Trần Thanh Dương 2. TS. Trương Văn Hạnh HÀ NỘI – 2024
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của PGS.TS Trần Thanh Dương, TS Trương Văn Hạnh và các thầy cô là giảng viên cán bộ của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương. Trong quá trình thực hiện luận án, tôi được Chủ nhiệm đề tài và các thành viên tham gia đề tài cho phép sử dụng mẫu và một phần số liệu của đề tài cấp nhà nước: “Nghiên cứu chế tạo các bộ kít LAMP để chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, giun lươn đường ruột tại thực địa.”. Các số liệu và kết quả trong luận án là hoàn toàn trung thực, chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác. Các bước tiến hành của đề tài đúng như đề cương nghiên cứu, chấp hành các quy định đạo đức trong tiến hành nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng năm 2024 Tác giả Phạm Thị Hà Trang
LỜI CẢM ƠN Với lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trần Thanh Dương, TS. Trương Văn Hạnh đã hướng dẫn và giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Đình Cảnh, Viện trưởng cùng Ban Lãnh đạo Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương, các Khoa Sinh học phân tử, Ký sinh trùng đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Cao Bá Lợi cùng các cán bộ của Phòng Khoa học và Đào tạo, đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi nhiệt tình trong thời gian nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Lãnh đạo, cán bộ y tế của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Ninh Bình và Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Phú Yên, cán bộ y tế tại Trung tâm y tế huyện Kim Sơn, huyện Tuy An và Trạm Y tế của hai điểm nghiên cứu đã hợp tác, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu tại thực địa. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Sở Y tế Hà Nội, phòng Quản lý hành nghề y dược tư nhân và toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, khuyến khích và hỗ trợ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bố, mẹ, chồng, con đã luôn khuyến khích, chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn để hoàn thành luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2024 Tác giả Phạm Thị Hà Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TĂT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt CBCC Cán bộ công chức CĐN Cường độ nhiễm EPG Eggs per gram Số trứng trung bình trong 1 gram phân HNB Hydroxy naphthol blue IARC International Agency for Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc Research on Cancer tế ITS Internal Transcribed Spacer KAP Knowledge, Attitudes, Kiến thức, Thái độ, Thực hành Practices LAMP Loop-Mediated Isothermal Khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng Amplification OR Odd Ratio Tỷ suất chênh PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polymerase TCCN, Trung học chuyên nghiệp, Cao CĐ, ĐH đẳng, Đại học THCS Trung học cơ sở THPT Trung học phổ thông WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................3 1.1. Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm sán lá gan nhỏ ................................ 3 1.1.1. Tác nhân gây bệnh ............................................................................ 3 1.1.2. Vật chủ .............................................................................................. 5 1.1.3. Đường lây và cơ chế lây truyền bệnh ............................................... 7 1.1.4. Sức cảm thụ và miễn dịch ................................................................. 8 1.1.5. Một số yếu tố liên quan đến nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ......... 8 1.1.6. Các biện pháp phòng chống ............................................................ 11 1.1.7. Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ ở người trên thế giới và Việt Nam ....................................................................... 12 1.2. Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán và điều trị bệnh sán lá gan nhỏ trên người .............................................................................................. 18 1.2.1. Đặc điểm lâm sàng bệnh sán lá gan nhỏ trên người ....................... 18 1.2.2. Chẩn đoán ....................................................................................... 19 1.2.3. Điều trị bệnh sán lá gan nhỏ trên người.......................................... 20 1.3. Các phương pháp xét nghiệm xác định tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người .............................................................................................. 20 1.4. Kỹ thuật LAMP và nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP xét nghiệm phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ................................................... 22 1.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật LAMP ....................................................... 22 1.4.2. Thành phần phản ứng LAMP ......................................................... 22 1.4.3. Cơ chế của phản ứng LAMP .......................................................... 23 1.4.4. Đánh giá kết quả của LAMP .......................................................... 25 1.4.5. Quy trình thực hiện LAMP ............................................................. 26 1.4.6. Tính ưu việt của kỹ thuật LAMP .................................................... 27
1.4.7. Một số hạn chế của kỹ thuật LAMP ............................................... 27 1.4.8. Một số ứng dụng của kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ ở người .............................................................................. 28 1.4.9. Chế tạo và chuẩn hóa bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ ...... 30 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........36 2.1. Mục tiêu 1: Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020) ................................................................................... 36 2.1.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................. 36 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 37 2.2. Mục tiêu 2: Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mô phòng thí nghiệm ............ 43 2.2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................. 43 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 45 2.3. Đạo đức trong nghiên cứu ..................................................................... 58 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................59 3.1. Thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020) .......... 59 3.1.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ............................................... 59 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 60 3.1.3. Một số yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ ở người .. 70 3.2. Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mô phòng thí nghiệm.................................. 78 3.2.1. Thiết kế, đánh giá lựa chọn các bộ mồi LAMP .............................. 78 3.2.2. Đánh giá tính đặc hiệu và khả năng hoạt động của bộ mồi LAMP thiết kế. ............................................................................. 79 3.2.3. Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng LAMP ...................... 81 3.2.4. Đóng gói thành phẩm bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ...... 87
3.3. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ, so sánh bộ mồi ........................................................................ 88 3.3.1. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán O. viverrini tại phòng thí nghiệm. ........................................................................... 88 3.3.2. Độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP chẩn đoán C. sinensis ..... 88 3.3.3. Kết quả so sánh bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ với bộ mồi có cùng mục đích. ........................................................................... 89 3.3.4 Đánh giá độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ . 90 3.4. Kết quả đánh giá bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ tại thực địa tỉnh Phú Yên và Ninh Bình ................................................................... 95 3.4.1. Đánh giá bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini tại thực địa tỉnh Phú Yên ..................................................................... 95 3.4.2. Kết quả đánh giá bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis tại thực địa tỉnh Ninh Bình.............................................................. 96 3.5. Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm định các bộ kít LAMP .......................... 98 3.5.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở ............................................................. 98 3.5.2. Kết quả kiểm định các bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ .... 99 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................. 100 4.1. Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020).............. 100 4.1.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ............................................. 100 4.1.2. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ, cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người .. 102 4.2. Một số yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ ở người ........ 107 4.2.1. Liên quan giữa tuổi và tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ ....................... 107 4.2.2. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và giới tính ................ 109 4.2.3. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và nghề nghiệp.......... 111 4.2.4. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và trình độ học vấn ... 112 4.2.5. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và việc sử dụng nhà tiêu .... 114
4.2.6. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và việc sử dụng phân tươi để chăn nuôi, trồng trọt.......................................................... 115 4.2.7. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và có nuôi chó mèo... 116 4.2.8. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và tình trạng ăn gỏi cá .... 118 4.2.9. Một số yếu tố khác liên quan đến tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ ...... 119 4.3. Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mô phòng thí nghiệm................................ 122 4.3.1. Khảo sát vùng bảo thủ của gen đích, thiết kế và lựa chọn mồi LAMP ... 122 4.3.2. Tối ưu thành phần và điều kiện hoạt động của phản ứng LAMP .... 125 4.3.3. Khảo sát ngưỡng phát hiện của kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ .. 130 4.3.4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định của kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ, so sánh kít LAMP với bộ mồi cùng mục tiêu ...... 131 4.3.5. Đánh giá bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ tại thực địa tỉnh Phú Yên và Ninh Bình .................................................................. 133 KẾT LUẬN...................................................................................................... 136 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 138 HẠN CHẾ CỦA LUẬN ÁN .......................................................................... 139 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN............................................. 140 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Phân loại cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ ............................................41 Bảng 2.2. Yêu cầu về độ dài của mồi .................................................................50 Bảng 2.3. Yêu cầu về nhiệt độ nóng chảy của từng mồi ....................................51 Bảng 3.1. Đặc điểm nhân khẩu học của đối tượng nghiên cứu ........................59 Bảng 3.2. Đặc điểm gia đình của đối tượng nghiên cứu ...................................60 Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ..............................................60 Bảng 3.4. Tỷ lệ người nhiễm sán lá gan nhỏ theo nhóm tuổi ...........................61 Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo giới tính .........................................62 Bảng 3.6. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nghề nghiệp ...................................63 Bảng 3.7. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo trình độ học vấn ............................64 Bảng 3.8. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ tại điểm nghiên cứu ......................65 Bảng 3.9. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nhóm tuổi ..............................66 Bảng 3.10. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ theo giới tính ...............................67 Bảng 3.11. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nghề nghiệp .........................68 Bảng 3.12. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ theo trình độ học vấn ..................69 Bảng 3.13. Lý do ăn gỏi cá của người dân tại địa điểm nghiên cứu .................70 Bảng 3.14. Liên quan giữa nhiễm sán lá gan nhỏ và tiền sử ăn gỏi cá sống .....71 Bảng 3.15. Liên quan giữa ăn gỏi cá và nhiễm sán lá gan nhỏ ở nam giới ......71 Bảng 3.16. Liên quan giữa ăn gỏi cá và nhiễm sán lá gan nhỏ ở nữ giới ...............72 Bảng 3.17. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và tần suất ăn gỏi cá sống ...................73 Bảng 3.18. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và nguồn cá sử dụng ăn gỏi .................73 Bảng 3.19. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và sử dụng hố xi hợp vệ sinh ...............................................................................................74 Bảng 3.20. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và sử dụng phân tươi để chăn nuôi, trồng trọt ....................................................................75 Bảng 3.21. Liên quan giữa nhiễm sán lá gan nhỏ và có nuôi chó/mèo ................75
Bảng 3.22. Liên quan giữa nhiễm sán lá gan nhỏ và có ao nuôi cá ..................76 Bảng 3.23. Mô hình hồi quy đa biến...................................................................77 Bảng 3.24. Trình tự mồi LAMP thiết kế để chẩn đoán O. viverrini. .................78 Bảng 3.25. Trình tự mồi LAMP thiết kế để chẩn đoán C. sinensis. ..................79 Bảng 3.26. Kết quả đánh giá sự chuyển màu của mẫu âm tính, dương tính với các nồng độ HNB sử dụng cho phản ứng LAMP............................84 Bảng 3.27. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán O. viverrini ..........88 Bảng 3.28. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán C. sinensis. ..........88 Bảng 3.29. So sánh độ tương đồng kết quả xét nghiệm giữa bộ kit LAMP chế tạo với kỹ thuật LAMP sử dụng bộ mồi theo Lê Thanh Hòa và cs ..........89 Bảng 3.30. So sánh độ tương đồng kết quả xét nghiệm giữa bộ kit LAMP chế tạo với kỹ thuật LAMP sử dụng bộ mồi của Rahman và cs ...........90 Bảng 3.31. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini sau 6 tháng bảo quản......................................91 Bảng 3.32. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini sau 4 lần làm tan và đông đá ................................91 Bảng 3.33. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ Kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini sau 12 tháng bảo quản ....................................92 Bảng 3.34. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis sau 6 tháng bảo quản .......................................93 Bảng 3.35. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis sau 4 lần làm tan và đông đá ..................................94 Bảng 3.36. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis sau 12 tháng bảo quản ............................................94 Bảng 3.37. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ O. viverrini phát hiện bằng Kato-Katz và bộ kít LAMP ................................................................................95 Bảng 3.38. So sánh hệ số tương đồng kết quả xét nghiệm phát hiện sán lá gan nhỏ O. viverrini bằng bộ kít LAMP và real time PCR ...................96
Bảng 3.39. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis phát hiện bằng Kato-Katz và bộ kít LAMP .....................................................................................97 Bảng 3.40. So sánh hệ số tương đồng kết quả xét nghiệm phát hiện sán lá gan nhỏ C. sinensis bằng bộ kít LAMP và real time PCR .....................97 Bảng 3.41. Tiêu chuẩn cơ sở của bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini .......................................................................98 Bảng 3.42. Tiêu chuẩn cơ sở của bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis ...........................................................................98
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thể sán lá gan nhỏ trưởng thành ...................................................3 Hình 1.2. Hình ảnh sán lá gan nhỏ trưởng thành C. sinensis nhuộm màu với carmine .................................................................................................3 Hình 1.3. Hình thể trứng của các loài sán lá gan nhỏ...........................................4 Hình 1.4. Ấu trùng (Metacercariae) của sán lá gan nhỏ ......................................5 Hình 1.5. Loài ốc mang ấu trùng sán lá gan nhỏ tại Việt Nam ............................6 Hình 1.6. Cá lóc đồng ...........................................................................................6 Hình 1.7. Cá chép .................................................................................................6 Hình 1.8. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ C. sinensis .................................8 Hình 1.9. Phân bố của sán lá gan nhỏ tại Việt Nam ...........................................14 Hình 1.10. Các mồi thiết kế và vị trí bắt cặp trên gen đích ...............................23 Hình 1.11. Sơ đồ phản ứng LAMP ở giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu ...............24 Hình 1.12. Sơ đồ phản ứng LAMP giai đoạn tái bản và kéo dài chuỗi ..............24 Hình 1.13. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP ...................................................25 Hình 1.14. Sản phẩm LAMP khi quan sát bằng mắt thường .............................25 Hình 1.15. Hình ảnh sản phẩm LAMP nhuộm bằng SYBR green ....................26 Hình 1.16. Quy trình thực hiện LAMP ...............................................................26 Hình 2.1. Bản đồ địa điểm nghiên cứu tại Ninh Bình ........................................37 Hình 2.2. Bản đồ địa điểm nghiên cứu tại Phú Yên ...........................................37 Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ ................................................................................................45 Hình 3.1. Tỷ lệ người dân ăn gỏi cá ...................................................................70 Hình 3.2. Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi F3-B3 của O. viverrini ..................80 Hình 3.3. Sản phẩm LAMP điện di trên gel agarose 2% sử dụng bộ mồi thiết kế đặc hiệu cho sán lá gan nhỏ O. viverrini và C. sinensis ....................81 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm khảo sát nhiệt độ ủ mồi của phản ứng LAMP chẩn đoán O. viverrini. .......................................................................82 Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm LAMP khảo sát với các nồng độ MgSO4 ..........82
Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm khảo sát thời gian của phản ứng LAMP ............83 Hình 3.7. Ảnh sản phẩm LAMP với các nồng độ HNB khảo sát khi quan sát bằng mắt thường .................................................................................84 Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm LAMP trên gel agarose 2% xác định ngưỡng phát hiện sơ cấp của kít LAMP ..........................................................85 Hình 3.9. Ảnh sản phẩm LAMP quan sát bằng mắt thường xác định ngưỡng phát hiện sơ cấp của kít LAMP ..........................................................86 Hình 3.10. Biểu đồ ngưỡng phát hiện của kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini ..........................................................................................86 Hình 3.11. Biểu đồ ngưỡng phát hiện thứ cấp của kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis ...................................................................87 Hình 3.12. Hình ảnh bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ ...........................87 Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP chẩn đoán O. viverrini sau 1 tháng ...92 Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP chẩn đoán O. viverrini sau 6 tháng ...92 Hình 3.15. Hình ảnh sản phẩm LAMP chẩn đoán O. viverrini sau 1 tháng dựa vào chỉ thị màu ....................................................................................92 Hình 3.16. Hình ảnh sản phẩm LAMP chẩn đoán O. viverrini sau 6 tháng dựa vào chỉ thị màu ....................................................................................92 Hình 3.17. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP chẩn đoán C. sinensis sau 1 tháng...93 Hình 3.18. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP chẩn đoán C. sinensis sau 6 tháng....93 Hình 3.19. Hình ảnh sản phẩm LAMP chẩn đoán C. sinensis sau 1 tháng dựa vào chỉ thị màu ....................................................................................94 Hình 3.20. Hình ảnh sản phẩm LAMP chẩn đoán C. sinenis sau 6 tháng dựa vào chỉ thị màu ....................................................................................94
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm sán lá gan nhỏ là bệnh truyền nhiễm qua đường ăn uống gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng. Sán lá gan nhỏ gây bệnh ở người có 3 loài đó là Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini và Opisthorchis felineus phân bố ở nhiều nơi trên thế giới trải dài từ Đông và Đông Nam châu Á đến châu Âu [1]. Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới, điều kiện tự nhiên, xã hội và tập quán ăn uống, canh tác, sinh hoạt thuận lợi cho sự lưu hành bệnh giun sán, trong đó có bệnh sán lá gan nhỏ. Việt Nam ghi nhận hai loài sán lá gan nhỏ là C. sinensis và O. viverrini phân bố ở ít nhất 32 tỉnh thành [2]. Hai địa phương Ninh Bình và Phú Yên được coi là điểm nóng với tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ khá cao với nhiều yếu tố liên quan như thời tiết thuận lợi, địa hình nhiều sông ngòi, ao hồ,…, trong đó, nguyên nhân chính do tập quán ăn gỏi cá của nhân dân đã tồn tại lâu đời [3]. Bệnh nhân nhiễm sán lá gan nhỏ thường không có các triệu chứng trong một thời gian dài hoặc có triệu chứng nhưng không rõ ràng, điều này gây khó khăn cho việc chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh. Điều đáng chú ý là người nhiễm sán lá gan nhỏ lâu ngày có thể bị xơ gan ở nhiều mức độ khác nhau, đặc biệt có nguy cơ ung thư biểu mô đường mật [4]. Vì vậy việc chẩn đoán sán lá gan nhỏ là rất cần thiết. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp xét nghiệm nhiễm sán lá gan nhỏ Trong đó, xét nghiệm phân bằng kỹ thuật Kato-Katz được sử dụng rộng rãi, dễ thực hiện, nhanh chóng và rẻ tiền, có thể ước tính cường độ nhiễm trùng. Tuy nhiên, độ nhạy của kỹ thuật Kato-Katz thấp, đặc biệt là đối với các trường hợp nhiễm cường độ nhẹ [5], [6]. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán các tác nhân sinh học gây bệnh ngày càng được phát triển, đặc biệt là các kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini hay C. sinensis cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng gặp nhiều
2 khó khăn khi áp dụng tại thực địa, phù hợp với những trung tâm y học lớn [7]. Gần đây, nhiều nghiên cứu có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt (trong đó được áp dụng nhiều nhất là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng trung gian - Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP) với những ưu điểm là độ nhạy và đặc hiệu tương đương kỹ thuật PCR nhưng chỉ cần các thiết bị xét nghiệm đơn giản, thời gian xét nghiệm rút ngắn xuống còn 30 - 60 phút, có khả năng phát triển thành các bộ sinh phẩm xét nghiệm (sau đây gọi là kit) phân tử cho phép ứng dụng được tại thực địa [8], [9]. Đến nay, tại Việt Nam chưa có kit LAMP được thương mại hóa để chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ trên người. Cần có các nghiên cứu, phát triển ứng dụng kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ trên người, giúp khắc phục được một số tồn tại của các phương pháp chẩn đoán khác nhằm giải quyết các vấn đề trong nghiên cứu, đặc biệt có thể áp dụng rộng rãi tại thực địa. Xuất phát từ những yêu cầu khoa học và thực tiễn trên đây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng” với các mục tiêu sau: 1. Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020). 2. Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mô phòng thí nghiệm.
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm sán lá gan nhỏ 1.1.1. Tác nhân gây bệnh Trên thế giới, có ba loài sán lá gan thuộc họ Opisthorchiidae gây bệnh cho người là Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini và Opisthorchis felineus với đặc điểm sinh học, vòng đời và lâm sàng tương đối giống nhau [10]. Ở Việt Nam hiện chỉ ghi nhận sự có mặt của 2 loài sán lá gan nhỏ là Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini. 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái của sán lá gan nhỏ trưởng thành A: O. felineus (7 - 12 x 2 - 3 mm) Hình 1.2. Hình ảnh sán lá gan B: O. viverrini (5,5 - 10 x 0,77 - 1,65 mm) nhỏ trưởng thành C. sinensis C: C. sinensis (10 - 25 x 3 - 5 mm) nhuộm màu với carmine Hình 1.1. Hình thể sán lá gan nhỏ (Nguồn: cdc.gov.vn) trưởng thành [11] Sán lá gan nhỏ là loài sán lá lưỡng tính, sán trưởng thành có hình phẳng, thon dài, hình lá hoặc dẹt, kích thước phụ thuộc vào từng loài. O. viverrini là loài có hình thái nhỏ nhất. C. sinensis trưởng thành kích thước lớn nhất [12]. Trên thân sán có cả bộ phận sinh dục đực và cái. Hai tinh hoàn nằm ở phía sau, chia nhiều múi (O. viverrini và O. felineus) hoặc chia nhiều nhánh nhỏ (C.
4 sinensis). Tử cung nhỏ xếp khúc nằm ở giữa thân, hoàng thể hai bên. Ổ trứng hình bầu dục, nhỏ, dưới ổ trứng là túi tinh, sau tinh hoàn là ống bài tiết [13]. 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái trứng sán lá gan nhỏ Trứng sán lá gan nhỏ C. sinensis, O. felineus và O. viverrini rất giống nhau và giống với trứng của các loài sán lá ruột nhỏ thuộc họ Heterophyidae [3]. Vì vậy, trong nhiều trường hợp, phân loại dựa vào hình thái gặp nhiều khó khăn và có thể bị nhầm lẫn. Trứng hình bầu dục, dài khoảng 19 - 35μm và rộng khoảng 10 - 20μm. Trứng có một lớp vỏ mỏng bắt màu vàng nhạt. Một đầu trứng có nắp, hai gờ của nắp nổi rõ. Đuôi trứng có núm con nhỏ gọi là mấu. Các mấu của mỗi loài là khác nhau. Bề mặt của vỏ trứng thô và không đều [14]. C. sinensis [15] O. viverrini [16] O. felineus [17] Hình 1.3. Hình thể trứng của các loài sán lá gan nhỏ 1.1.1.3. Đặc điểm hình thái ấu trùng sán lá gan nhỏ Trong khuôn khổ luận án này chỉ đề cập tới giai đoạn ấu trùng nang là giai đoạn ấu trùng truyền qua cá cho người và các động vật có vú khác được gọi là metacercaria, nó được bao bọc trong các mô khác nhau của vật chủ (tôm, cá). Metacercaria của các loài sán lá gan nhỏ hình tròn hoặc bầu dục, kích thước khác nhau tùy loài. Metacercaria của C. sinensis kích thước 0,13- 0,14 x 0,09-0,10 mm [18]. Metacercaria O. viverrini kích thước 0,19-0,25 x 0,15-0,22m [14]. Metacercaria O. felineus kích thước 0,25-0,30 x 0,19- 0,23mm [11].
5 C. sinensis O. viverrini O. felineus Hình 1.4. Ấu trùng (Metacercariae) của sán lá gan nhỏ [17] 1.1.2. Vật chủ - Vật chủ chính: Vật chủ chính của sán lá gan nhỏ gồm người và một số động vật có vú như chó, mèo, lợn, chuột (Rattus norvegicus), một số động vật ăn cá hoang dã, có thể cả chim, tuy nhiên người được coi là vật chủ dự trữ mầm bệnh quan trọng nhất [12]. Tỷ lệ nhiễm C. sinensis cao ở động vật có vú bao gồm chó, mèo (0,8 – 4,85%) do đó kiểm soát lây nhiễm của vật chủ trong ổ chứa bằng cách cho vật nuôi ăn thức ăn nấu chín hoặc chế biến đặc biệt và cải thiện việc quản lý phân của vật nuôi cũng đóng vai trò trong phòng chống nhiễm sán ở người [12], [19]. - Vật chủ trung gian thứ nhất: Vật chủ trung gian thứ nhất của sán lá gan nhỏ gồm nhiều loài ốc khác nhau tùy địa điểm nghiên cứu. Ở các vùng lưu hành, Ốc nhiễm sán lá gan nhỏ thường được tìm thấy ở các nguồn nước gần làng, trong các hồ nước nông, ruộng lúa và đất ngập nước [20], [21], nơi có mức độ ô nhiễm phân cao [22]. Việt Nam là quốc gia duy nhất lưu hành cả O. viverrini và C. sinensis, do đó sự phân bố của ốc P. manchouricus ở miền bắc và Bithynia spp. ở miền Trung - Nam là yếu tố quyết định sự khác biệt về địa lý giữa hai loài sán lá gan nhỏ ở nước ta. Cần có nghiên cứu chi tiết hơn về vật chủ trung gian của ốc sên cũng như các vật chủ khác ở các vùng nối giữa các vùng lưu hành bệnh sán lá gan nhỏ.
6 Hình 1.5. Loài ốc mang ấu trùng sán lá gan nhỏ tại Việt Nam (Nguyễn Văn Đề, Đại học Y Hà Nội, 2012) - Vật chủ trung gian thứ hai: Vật chủ trung gian thứ hai của sán lá gan nhỏ C. sinensis gồm nhiều loài cá nước ngọt, chủ yếu là cá họ Cyprinidae (chép) [12]. Một nghiên cứu (2020) tại chợ cá tỉnh Yên Bái cho thấy tỷ lệ nhiễm C. sinensis trên cá khá cao là 69,7%, cường độ nhiễm là 81,2% metacercariae/cá [23]. Ấu trùng sán O. viverrini được xác định ký sinh trên nhiều loài cá khác nhau, phổ biến nhất là cá diếc (Carassius auratus) với tỷ lệ nhiễm ấu trùng nang là 28,1%, ngoài ra có các loài khác như cá lóc, cá chép,… [24]. Hình 1.6. Cá lóc đồng (C. striata) [25] Hình 1.7. Cá chép (C. carpio) [26] Vòng đời của sán lá gan nhỏ liên quan tới hai vật chủ trung gian nên đặc điểm dịch tễ học cũng liên quan tới hai vật chủ trung gian này trong đó vật chủ trung gian thứ nhất (ốc) có vai trò quyết định đến phân bố của sán do chỉ một số ít ốc có thể nhiễm sán. Vai trò của vật chủ trung gian thứ hai ít quan trọng hơn do rất nhiều loài cá có thể mang ấu trùng sán, tuy nhiên khả năng lây nhiễm vào vật chủ chính phụ thuộc vào cá.