Luận án Tiến sĩ Y học: Tính kháng thuốc oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012

Chia sẻ: Hoa La Hoa | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:139

Thêm vào BST

Báo xấu

76
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Y học, chuyên ngành Vi sinh Y học với đề tài "Tính kháng thuốc oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012" do Hoàng Vũ Mai Phương thực hiện nhằm mục tiêu Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam; xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50); đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Y học: Tính kháng thuốc oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG -----------------*------------------- HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI – 2014
ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG -----------------*------------------- HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012 Chuyên ngành: Vi sinh Y học Mã số : 62.72.01.15 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Đặng Đức Anh 2. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai HÀ NỘI – 2014
iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. NGHIÊN CỨU SINH Hoàng Vũ Mai Phương
iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn:  Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.  Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương. Đã tạo điều khiện tốt nhất, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến GS.TS Đặng Đức Anh, người đã tạo điều kiện cho tôi đến với chuyên ngành vi rút, cho tôi những lời khuyên hữu ích, sự động viên và lòng nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai, người đã tận tình dìu dắt giúp đỡ tôi từ những ngày đầu tiên bước chân vào lĩnh vực vi rút học, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và luôn khuyến khích tôi bước về phía trước, tiếp cận với những kiến thức nâng cao và mở rộng để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Ths Nguyễn Cơ Thạch, Ths Lê Thị Thanh, CN Phạm Thị Hiền cùng các bạn đồng nghiệp công tác tại Phòng thí nghiệm Cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của Trung tâm Cúm thuộc Viện sức khỏe Hàn Quốc (KNIH )trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Mendi Jamsran, TS Aeron Hurt, chuyên viên của Tổ chức Y tế Thế giới, cho những hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu. Tôi xin gửi tặng Gia đình, bạn bè và những người thân trong gia đình đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trên con đường sự nghiệp khoa học để tôi đạt được thành quả ngày hôm nay. Hà nội, ngày 22 tháng 10 năm 2013 HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG
v MỤC LỤC Trang phụ bìa.................................................................................................... i Lời cam đoan..................................................................................................... ii Lời cảm ơn......................................................................................................... iii Mục lục .............................................................................................................. iv Chữ viết tắt ........................................................................................................ vii Danh mục bảng ................................................................................................. viii Danh mục hình, biểu đồ, sơ đồ ......................................................................... ix ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................... 1 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN............................................................................ 4 1.1. Vi rút cúm A ............................................................................................... 4 1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A................................................. 4 1.1.2. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A.............................................................. 11 1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A ...................... 13 1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A ............................... 15 1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm............................................................. 16 1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A ......................................................................... 17 1.2. Phòng và điều trị cúm A ............................................................................ 18 1.2.1. Văc xin phòng cúm ................................................................................... 18 1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A ....................................................................... 20 1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới ....................................................................... 23 1.3. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút ............ 25 1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine ..................... 25 1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir...................... 26 1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A...... 27
vi 1.4.1. Nguyên nhân của hiện tượng kháng thuốc ................................................. 27 1.4.2. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm ........................................................... 28 1.4.3. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase ..................................................................................................... 32 1.4.4. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm........................................................... 34 CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 37 2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 37 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 37 2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm ................................................................. 38 2.3.1. Vật liệu ..................................................................................................... 38 2.3.2. Kỹ thuật xét nghiệm .................................................................................. 42 2.4. Phân tích số liệu.......................................................................................... 51 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ............................................................................... 53 3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 – 2012 ............................ 53 3.2. Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A .......................... 54 3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A ....................................... 60 3.4. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng cúm A liên quan đến kháng thuốc oseltamivir .............................................................................................. 65 3.5. Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012 .......................................................................................................... 69 3.6. Sự tương đồng về gen HA và NA giữa các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ nhạy oseltamivir với các vi rút cùng phân típ lưu hành trong giai đoạn nghiên cứu .......................................................................................................... 72
vii CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN............................................................................. 86 4.1. Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu .......... 86 4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50)............................................................................... 88 4.3. Sự liên quan của các đột biến trên gen NAvới quá trình kháng thuốc oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam ..................... 94 4.4. Sự liên quan về mặt di truyền học của các chủng vi rút A mang gen đột biến và các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian. ...................................................... 98 KẾT LUẬN ....................................................................................................... 101 KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 103 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
viii CHỮ VIẾT TẮT ABI Applied Biosystems Association of Public Health Laboratories APHL (Tổ chức của các PTN trong hệ thống Y tế Cộng đồng) ATSH An Toàn Sinh Học DNA Deoxiribonucleic Acid Global Influenza Surveillance and Response System GISRS (Hệ thống phản ứng và giám sát cúm toàn cầu) IC50 Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50% vi rút) IQR Interquartile Range (Khoảng liên tứ phân vị) International Society for Influenza and other Respiratory Virus Diseases – Antiviral Group (Hiệp hội quốc tế về ISIRV-AVG cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác – Nhóm nghiên cứu thuốc kháng vi rút) Kb Kilobase NAI Neuraminidase Inhibition (Ức chế neuraminidase) National Institute of Infectious Diseases - Japan NIID (Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia – Nhật Bản) PCR Polymerase Chain Reaction pdm Pandemic PTN Phòng Thí Nghiệm RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction SOP Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn) TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới United States- Centers for Disease Control and Prevention US-CDC (Trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
ix DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A ............................................................ 6 3.1. Phân bố theo năm các phân típ virut cúm A sử dụng trong nghiên cứu ......... 53 3.2. Giá trị trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn ................................ 56 3.3. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và 2009 ............................................................................................................. 60 3.4. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm 2009 và 2011 ................................................................................................ 61 3.5. Giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012 ........................... 62 3.6. Giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008 ................................ 62 3.7. Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với oseltamivir................................................................................................64 3.8. Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm đột biến ........................................................................................................ 70 3.9. Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen).......... 71
x DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Hình Tên hình Trang 1.1. Cấu trúc vi rút cúm ....................................................................................... 4 1.2. Hình ảnh vi rút cúm ...................................................................................... 4 1.3. Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm ........... 10 1.4. Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm .................................................... 10 1.5. Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút ........... 12 1.6. Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine ........................ 21 1.7. Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir .......................................................... 22 1.8. Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase trong quá trình giải phóng vi-rút ra khỏi tế bào ............................................. 23 2.1. Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen ................................................ 50 3.1. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1............. 66 3.2. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1pdm09 ............................................................................................. 67 3.3. Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1.............. 68 3.4. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1.............. 69 3.5. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 .............................. 74 3.6. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 – nhóm 2, 2001-2009 ....................................................................................... 75 3.7. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 .............................. 76 3.8. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm 2, 2001-2009 ................................................................................................ 77 3.9. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1pdm09 ................................79 3.10. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1pdm09 ................................80 3.11. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 ................................................. 83
xi 3.12. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 1 ................................84 3.13. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 2.3.4 ............................... 84 Sơ đồ Tên sơ đồ Trang 2.1. Quá trình phân lập vi rút cúm ................................................................ 43 2.2. Quá trình xác định giá trị ức chế 50% của oseltamivir với vi rút cúm .......... 45 Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1. Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012 ................. 55 3.2. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên cứu ............................................................................................................... 57 3.3. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 trong nghiên cứu ................................................................................................58 3.4. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên cứu ............................................................................................................... 58 3.5. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng H5N1 trong nghiên cứu ............................................................................................................... 59 4.1. Sự lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam 2006 – 2012 ........................................ 86
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh truyền nhiễm trong thế kỷ XX và những năm đầu của thế kỷ XXI vẫn đang là một thách thức lớn với các nhà khoa học trong ngành y học dự phòng ở Việt Nam. Nếu như trước đây, bệnh truyền nhiễm có nguyên nhân chủ yếu từ vi khuẩn thì hiện nay căn nguyên vi rút lại là nguyên nhân chính gây ra những vụ dịch nguy hiểm, đe dọa tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người. Các vụ dịch điển hình xảy ra gần đây như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998, dịch SARS năm 2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013. Bệnh cúm tại Việt Nam, theo thống kê của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương trong quá trình giám sát các ca nhiễm cúm phối hợp với trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US-CDC), số người mắc cúm có xu hướng tăng lên từ 19,1% năm 2007, lên 21% năm 2008, 26,1% năm 2009 (Hệ thống giám sát cúm Quốc gia-NISS), đặc biệt đã có những trường hợp tử vong do nhiễm cúm gia cầm có độc lực cao. Các phương pháp áp dụng trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu. Tuy nhiên, văc xin cúm đang lưu hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch cúm. Hơn nữa, muốn đạt hiệu quả cao, chủng cúm trong thành phần văc xin phải có sự tương đồng kháng nguyên với chủng cúm lưu hành. Ngoài ra, đáp ứng miễn dịch khi tiêm văc xin cúm còn phụ thuộc vào cơ địa của từng cá thể và loại văc xin sử dụng (văc xin cúm bất hoạt truyền thống, văc xin cúm bán phần (split vaccine)…). Do vậy, hiện tại sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine, oseltamivir...) là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút cúm, đặc biệt là vi rút cúm A/H5N1. Tuy nhiên, sự tương tác của thuốc với vi rút có thể gây ra thay đổi trong vật liệu di truyền của vi rút mà một trong những hệ quả là xuất hiện vi rút kháng thuốc ở thế hệ sau. Hiện tượng kháng thuốc có thể ảnh hưởng đến quá trình điều trị của bệnh nhân: thời gian điều trị kéo dài, khả năng hồi phục sau điều trị chậm và tăng khả năng lây truyền chủng vi rút cúm kháng thuốc ra cộng đồng, làm tăng thêm gánh nặng bệnh tật cho bản thân bệnh nhân và xã hội [28, 81, 90, 121]. Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc, mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan
2 truyền của hiện tượng kháng thuốc trong quần thể. Đặc tính kháng thuốc cũng như mức độ tiến hoá của vi rút đã được tiến hành tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN) trên thế giới như Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan.... Các nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện, giám sát và theo dõi các trường hợp kháng thuốc đơn lẻ hoặc theo nhóm, tìm hiểu các đột biến trên gen có liên quan đến khả năng kháng thuốc của vi rút cúm trên người và trên gia cầm [8,11,12,26,51]. Số liệu từ các nước Châu Âu, Úc, Mỹ và các nước khu vực Đông Nam Á cho thấy vi rút A/H1N1 lưu hành trước năm 2007 có tỉ lệ kháng oseltamivir thấp (0,3-2,2%), từ 2007 đến 2009 tỉ lệ kháng tăng dần (23% năm 2007, 43-60% năm 2008 và 95% năm 2009) [27, 66, 110]; các vi rút A/H3N2 được xác định kháng hoàn toàn (100%) với amantadine. Tại Việt Nam, quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại học Oxford thuộc bệnh viện Bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh [18,36,37]. Tại phòng thí nghiệm Cúm - viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, những trường hợp nhiễm vi rút cúm có mang gen kháng thuốc đơn lẻ đã được xác định từ những năm 2001 [56, 58, 60]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ hoàn thành ở mức độ ca bệnh riêng lẻ hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, chưa có nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá theo thời gian của chủng vi rút cúm A mang gen kháng thuốc. Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành, tần suất, mức độ và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại thuốc của vi rút cúm A. Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu “Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012” với mục tiêu: - Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam. - Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50).
3 - Đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012.
4 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1.1. Vi rút cúm A 1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A Cấu tạo chung Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae gồm 3 típ A, B và C, trong đó típ A và B thường gây thành dịch, típ C gây bệnh nhẹ và không lan thành dịch. Hệ gen của vi rút cúm A là Axit Ribonucleic (RNA) đơn âm, chia 8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein. Về mặt cấu trúc, nucleocapsid được bao bọc bởi Hình 1.1. Cấu trúc vi rút cúm màng protein nền (M1), phía ngoài Nguồn: http://viralzone.expasy.org/ màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ. Protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênh ion, làm cho pH trong endosome thay đổi, có vai trò quan trọng trong việc hình thành hạt Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm vi rút mới. Trên phần vỏ có 2 loại Nguồn: www.nature.com glycoprotein xuyên màng là heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Heamagglutinin có cấu trúc hình trụ, được cấu tạo bởi hai phân tử riêng biệt HA1 và HA2 nối với nhau bằng cầu disulphua, các phân tử trên HA gắn vào màng lipid bằng đầu kỵ nước. Glycoprotein quan trọng thứ hai trên bề mặt vi rút cúm là neuraminidase (NA). Cấu trúc NA có dạng hình nấm, các phân tử NA ở phần thân gắn với lớp màng qua các đầu kỵ nước. Phần lõi của vi rút bao gồm các phức hợp
5 ribonucleoprotein: các polymerase protein PB1 (polymerase basic 1), PB2 (polymerase basic 2) và PA (polymerase acidic); NP (nucleoprotein). Nucleoprotein gắn với các đoạn RNA của vi rút tạo thành nucleocapsid. Tồn tại trong thành phần của vi rút cúm còn có các RNA-RNA polymerase PB1, PB2, PA và các protein không cấu trúc NS (non structure). Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A Hệ gen của vi rút cúm A Vi rút cúm A có 8 phân đoạn gen, mã hóa cho 11 protein. Các gen của vi rút cúm được đánh số theo độ dài nucleotide giảm dần (Bảng 1). Đoạn RNA 1, 3, 4, 5 và 6 chỉ mã hóa cho một protein tương ứng là PB2, PA, HA, NP và NA. Mỗi phân đoạn 2, 7 và 8 mã hóa cho 2 protein tương ứng là PB1-PB1F2, M1-M2 và NS1- NS2. Tại hai đầu mỗi phân đoạn gen có trình tự nucleotide bảo tồn gồm 13 nucleotide ở đầu 5' (5'-AGUAGAAACAAGG) và 12 nucleotide ở đầu 3' (3'UCGUUUUCGUCC), trừ phân đoạn gen 1, 2, 3 và 7 nucleotide thứ 4 C thay cho U [47]. Trình tự nucleotide này đặc trưng riêng cho vi rút cúm mà không tồn tại ở các vi rút các, có ý nghĩa lớn trong việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích trình tự gen của vi rút. Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút Heamagglutinin (HA): Heamagglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã hóa bởi đoạn RNA số 4, có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể. Protein HA được tổng hợp ở dạng tiền thân là một chuỗi polypeptide HA0. Dưới điều kiện pH axit và các enzyme phân tách protein dạng trypsin và furin, HA0 phân tách ra hai phần: HA1 và HA2, kết với nhau qua cầu nối di-sulphua [19]. Phần đầu chỏm của HA1 tại các vị trí xác định (106, 203, 222) có khả năng gắn với thụ thể axit sialic trên màng tế bào cảm nhiễm.
6 Bảng 1.1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A Chiều dài Protein Chiều dài protein Đoạn đoạn gen được mã được mã hóa Chức năng RNA (Nucleotide) hóa (Axit amin) 1 2341 PB2 759 Polymerase khởi đầu phiên mã Kéo dài phiên mã, hoạt hóa PB1 757 enzyme nội bào 2 2341 Thúc đẩy quá trình chết của tế PB1-F2 87 bào chủ 3 2233 PA 716 Kéo dài phiên mã Ngưng kết hồng cầu, bám gắn 4 1778 HA 550 xâm nhập vào tế bào chủ Bám gắn với RNA, điều khiển 5 1565 NP 498 quá trình nhân lên của vi rút. Giải phóng vi rút khỏi tế bảo 6 1413 NA 454 chủ Protein nền: Thành phần chính M1 252 của vi rút. 7 1027 Kênh ion, cởi áo và lắp ráp M2 97 thành phần vi rút Protein đối kháng interferon, NS1 230 điều khiển dấu ấn của vi rút trên tế bào chủ 8 890 Chuyển RNA vi rút từ nhân ra NS2 121 tế bào chất (trong tế bào chủ)
7 Trên bề mặt tế bào biểu mô đường hô hấp của người, HA gắn vào thụ thể α2,6 axit sialic; đối với gia cầm, HA gắn vào thụ thể α2,3 axit sialic; trên tế bào của lợn có mang cả hai loại thụ thể α2,3 axit sialic và α2,6 axit sialic. Ngoài ra, HA gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào hồng cầu người nhóm máu O, hồng cầu chuột lang, hồng cầu ngỗng, hoặc gà tây gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu [118]. Năm vị trí quyết định kháng nguyên khác cũng đã được xác định trên protein HA1, tương tác với kháng thể của vật chủ. Các thay đổi có liên quan đến thay đổi đặc tính kháng nguyên xảy ra chủ yếu trên phần HA1, do vậy, HA1 được sử dụng để tìm hiểu đặc tính kháng nguyên và tiến hóa của vi rút. Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme, neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6. Neuraminidase sau khi được phiên mã, protein có dạng hình nấm bao gồm 4 chuỗi polypeptide. NA xúc tác cho quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ. Việc loại bỏ phần axit sialic khỏi phần HA mới được tổng hợp còn có tác dụng tránh sự tự ngưng kết giữa các hạt vi rút mới sau khi được giải phóng ra khỏi tế bào, đảm bảo vi rút mới sau khi được giải phóng có khả năng gây nhiễm. Neuraminidase cũng đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi rút cúm. Sự hoạt động của neuraminidase làm tăng hoạt động của các cytokine, thúc đẩy nhanh quá trình chết của tế bào chủ. Ngoài ra, các nhà khoa học đã chứng minh được vi khuẩn gây nhiễm trùng thứ phát như viêm phổi đặc biệt nguy hiểm cho các bệnh nhân có bệnh mạn tính, trẻ nhỏ, người già và phụ nữ có thai, có quan hệ chặt chẽ với những hoạt động của neuraminidase như nhiễm Streptococcus pneumonia, có thể làm quá trình viêm nhiễm đường hô hấp trầm trọng hơn [122]. Vi rút cúm A được chia thành các phân típ dựa trên hai kháng nguyên bề mặt heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) của vi rút. Sử dụng HA để xác định phân nhóm của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định được 17 loại hemagglutinin khác nhau, trong đó H17 được xác định từ vi rút phân lập từ dơi
8 [105]. Các phân típ NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1 đại dịch), N2 (H3N2, H9N2) và gần đây là N9 (H7N9). Dựa vào sự khác nhau về axit amin tại vùng đầu phía ngoài, neuraminidase của vi rút cúm được chia làm 2 nhóm riêng biệt [109]:  Nhóm 1 gồm N1, N4, N5 và N8  Nhóm 2 gồm N2, N3, N6, N7 và N9. Sự thay đổi axit amin tại vị trí 147-152 đã tạo nên vùng khác biệt về hình khối nằm ngay cạnh vị trí hoạt động của N1 mà không xảy ra trên N2. Vùng khác biệt này có thể được coi là vùng đích của thuốc kháng vi rút trong tương lai. Thuốc kháng vi rút oseltaminvir, zanamivir gắn vào NA, ức chế khả năng giải phóng của vi rút cúm dựa trên hiểu biết về hoạt động của neuraminidase, xúc tác quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic giữa axit sialic và thụ thể HA. Tuy nhiên, các đột biến về axit amin trên phân đoạn gen mã hóa NA tại các vị trí bám gắn với thuốc là nguyên nhân của sự kháng thuốc của vi rút, cụ thể với N1 tại vị trí I117V, I222K, S246N, H275Y và N294S; với N2 tại các vị trí E119V, Q136K, R292K và N294S. Protein màng (M-matrix): Đoạn RNA số 7 được coi là gen có tính bảo tồn cao, mã hóa cho hai protein M1 và M2. Protein M1 được mã hóa từ nucleotide vị tí 26 đến 784, protein M2 được tổng hợp qua quá trình ghép nối từ nucleotide vị trí 26- 51 và từ 740-1007 [19, 65]. Protein M1 là protein nền (matrix) nằm ngay dưới lớp vỏ của vi rút, làm cầu nối giữa các thành phần bên trong và các protein bề mặt của vi rút, có vai trò quan trọng trong việc lắp ráp các thành phần để tạo nên hạt vi rút, tạo điều kiện cho vi rút nảy chồi. M2 là một protein xuyên màng, phần ngoài tương tác với hệ miễn dịch của vật chủ [54] và phần xuyên màng hoạt động như một kênh ion có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút, phá vỡ mối liên kết protein-protein trên protein nền M1 với RNP, giải phóng các RNP của vi rút vào trong nội bào của tế bào cảm nhiễm [3] [22, 56, 57].
9 Amantadine gắn vào kênh ion xuyên màng, ngăn chăn sự “cởi áo” này. Tuy nhiên, những thay đổi axit amin tại vị trí bám gắn 26, 27, 30, 31 và 34 trên kênh ion với amantadine đã tạo ra sự kháng thuốc của vi rút (vị trí gắn kết V27A Valin chuyển sang Alanin, A30T Alanin sang Threonin, S31N Serin sang Asparagin và G34E Glycin sang Axit Glutamic), trong đó vị trí 31 chuyển từ Serin sang Asparagin là vị trí có tần suất xuất hiện nhiều [47, 52]. Hiện tượng kháng amantadine xảy ra phổ biến trên gen M của vi rút cúm A/H3N2, ít gặp ở các chủng cúm A/H1N1, tuy nhiên khi chủng cúm A/H1N1pdm09 xuất hiện thì hầu hết gen M, do hiện tượng trao đổi và tích hợp gen, mang gen M của chủng vi rút cúm lợn Á Âu có đột biến kháng thuốc amantadine tại vị trí 31 (S31N) [18, 53]. Các polymerase PB1, PB2 và PA: Tồn tại trong hệ gen của vi rút cúm có các phân đoạn gen 1, 2 và 3 chịu trách nhiệm tạo ra các RNA-RNA polymerase. Phức hợp PA-PB1-PB2 ở trong nhân tế bào cảm nhiễm có nhiệm vụ khởi đầu và kích hoạt quá trình tổng hợp mRNA của vi rút [15] (hình 1.3 và hình 1.4). Trong quá trình hoạt động của vi rút cúm, đột biến xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa PB2 có liên quan đến khả năng thích nghi của vi rút [56, 99], đặc biệt với vi rút cúm gia cầm H5N1. Đột biến E627K (Glutamin chuyển thành Lysin) trên PB2 của vi rút cúm gia cầm làm tăng khả năng thích nghi với điều kiện sống của vi rút trên vật chủ mới - người (vi rút tồn tại và nhân lên trên gia cầm tại nhiết độ tối ưu là 37oC, khi mang gen đột biến, vi rút có khả năng thích nghi và phát triển được trên tế bào đường hô hấp trên của người – với nhiệt độ tối ưu là 33oC) [99]. Đột biến này đã được xác định trên gen PB2 của chủng cúm gia cầm mới xuất hiện A/H7N9 [62, 63]. Một protein có kích thước nhỏ PB1-F2 (87 axit amin) có chức năng thúc đẩy quá trình chết của tế bào chủ mà không tìm thấy dạng tương tự trong hệ gen của vi rút cúm B và C [65, 122]. Nucleoprotein (NP): NP được mã hóa bởi phân đoạn thứ 5 trong bộ gen của vi rút cúm có tính bảo tồn cao đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên, tạo thành hạt vi rút mới [43]. Chức năng chủ yếu của NP là tham gia vào quá trình tổng hợp RNA của vi rút và quá trình tạo thành hạt vi rút mới. Ngoài ra, NP tương tác