LUẬN VĂN: KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG BỂ NUÔI TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)

Chia sẻ: Nhu Chau | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:63

Thêm vào BST

Báo xấu

135
lượt xem 33
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thuỷ Sản, Quý Thầy Cô và toàn thể cán bộ Khoa Thuỷ Sản đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập. Đặc biệt tôi sinh chân thành biết ơn cô Phạm Thị Tuyết Ngân và chị Liễu Như Ý cùng các cán bộ bộ môn Thuỷ Sinh Học Ứng Dụng, các bạn lớp Bệnh Học Thuỷ Sản K 31 đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ để tôi hoàn thành luân văn. Cuối cùng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN: KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG BỂ NUÔI TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÂM TRUNG TÍNH KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG BỂ NUÔI TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN 2009
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÂM TRUNG TÍNH KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG BỂ NUÔI TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths. PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN 2009
LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thuỷ Sản, Quý Thầy Cô và toàn thể cán bộ Khoa Thuỷ Sản đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập. Đặc biệt tôi sinh chân thành biết ơn cô Phạm Thị Tuyết Ngân và chị Liễu Như Ý cùng các cán bộ bộ môn Thuỷ Sinh Học Ứng Dụng, các bạn lớp Bệnh Học Thuỷ Sản K 31 đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ để tôi hoàn thành luân văn. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, đặc biệt là cha mẹ đã dành cho tôi những tình cảm, sự động viên cũng như hỗ trợ về vật chất để tôi vượt qua khó khăn trong suốt quá trình học. Chân thành cảm tạ Sinh viên thực hiện Lâm Trung Tính i
TÓM TẮT Đánh giá khả năng làm sạch môi trường nước của nhóm vi khuẩn chọn lọc, được phân lập từ những ao nuôi tôm sú thâm canh đã được thực hiện, là một trong những bước quan trọng trong qui trình chọn lọc vi khuẩn hữu ích. Bacillus subtilis từ lâu đã được chứng minh là vi khuẩn tham gia trong quá trình phân hủy protein trong nuôi trồng thủy sản. Thí nghiệm được bố trí gồm có 4 nghiệm thức, trong đó 3 nghiệm thức bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis chủng 9, 41, 67 và một nghiệm thức đối chứng. Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần. Kết quả cho thấy thời gian tồn tại trong bể tôm của vi khuẩn dòng 9 là 7 ngày, dòng 41 và 67 là 5 ngày. Mật độ bào tử trong bùn của 3 chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 5,3×106, 5,95×105 và 3,5×105 bào tử/g. Trong khi đối chứng chỉ khoảng 22 bào tử/g cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p< 0.05). Trong nước mật độ chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 3×103, 4,9×102 và 2,9×102 bào tử/ml, còn đối chứng chỉ 10 bào tử/ml cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p< 0.05). Mật độ tổng vi khuẩn trung bình trong bùn chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 5,2 x 107, 6,7x 106, 6,7 x 106 CFU/g, còn đối chứng 3,8 x 108 CFU/g . Trong nước chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 3,7 x 105, 4,3x 105, 57 x ,105 CFU/ml, còn đối chứng 5 x 107 CFU/ml, có số lượng tăng cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p< 0.05). Mật độ vi khuẩn Vibrio trong bùn, chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 7,6 x 101, 2,1x 102 và 3,7 x 102 CFU/g, thấp hơn nhiều so với đối chứng (5,8 x 104 CFU/g). Trong nước mật độ chủng 9, 41,và 67 lần lượt là 4,1 x 101, 1,9x 102 và 3,5 x 102 CFU/ml, đối chứng 6,4 x 104 CFU/ml có số lượng tăng cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p< 0.05). Tỉ lệ tăng trưởng đạt cao nhất ở nghiệm thức 1 (chủng 9) tăng 10,7g/con và sai khác có rất có ý nghĩa thống kê (p
MỤC LỤC PHẦN I: GIỚI THIỆU................................................................................................1 2.1 Đặc điểm sinh học của tôm sú (Penaeus monodon) ..........................................3 2.1.1 Vị trí phân loại:............................................................................................3 Theo hệ thống phân loại của Holthuis, 1989. Tôm sú .........................................3 2.1.2 Phân bố ........................................................................................................3 2.1.3 Vòng đời .......................................................................................................3 2.1.4 Tập tính ăn và loại thức ăn ........................................................................4 2.1.5 Lột xác..........................................................................................................4 2.2 Sự siến động các yếu tố thuỷ lý trong ao nuôi thuỷ sản....................................4 2.2.1 Nhiệt độ ........................................................................................................4 2.2.2 pH .................................................................................................................4 2.2.3 Độ mặn .........................................................................................................5 2.2.4 Oxy hoà tan (DO).........................................................................................5 2.3 Sử dụng chế phẩm sinh học (Probiotic) trong nuôi trồng thủy sản .................5 2.3.1 Sơ lược về probiotic .....................................................................................5 3.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản ............................6 2.4 Đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .............................................................7 2.4.1 Vị trí phân loại .............................................................................................7 2.4.2 Quá trình hình thành bào tử ở Bacillus subtilis .........................................7 2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis .........................................................................8 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................10 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ..................................................................10 3.1.1 Thời gian nghiên cứu................................................................................. 10 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu.................................................................................. 10 3.2 Phương pháp nghiên cứu.................................................................................10 3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị: ......................................................................... 10 3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm................................................................. 10 3.2.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu nước ................................................ 12 3.2.4 Phương pháp thu mẫu bùn ...................................................................... 14 3.2.4.1 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn................................................ 14 3.2.5 Xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn Bacillus subtilis. .... 15 3.2.6 Phương pháp xác định sự biến động các yếu tố thuỷ lý. .......................... 15 3.2.7 Cách cho ăn và quản lý tôm nuôi thí nghiệm ........................................... 15 3.2.8 Tính tốc độ tăng trưởng của tôm .............................................................. 16 3.2.9 Tính tỉ lệ sống của tôm .............................................................................. 16 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 17 4.1 Sự biến động các chỉ tiêu thủy lí......................................................................17 4.1.1 ảnh hưởng của pH ..................................................................................... 17 4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................ 17 4.1.3 Ảnh hưởng của độ kiềm ............................................................................ 17 4.1.4 Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan (DO) .......................................... 17 iii
4.2 Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập. ..........................................................................................................................18 4.4 Biến động mật độ Vi khuẩn Bacillus subtilis trong bể nuôi tôm Sú ...............23 4.5 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong bể nuôi tôm Sú. .................................24 4.6 Biến động mật độ tổng vi khuẩn Vibrio trong bể nuôi tôm Sú .......................26 4.7 Tỉ lệ sống..........................................................................................................27 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT......................................................................31 4.1 Kết luận. ...........................................................................................................31 4.2 Đề xuất..............................................................................................................31 PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................32 iv
DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1 Các bước pha loãng mẫu…………….......................... 13 Hình 3.2 Cách cấy mẫu vào môi trường thạch…………............. 13 Hình 4.1 Khuẩn lạc sau 24 giờ…………………………………….. 19 Hình 4.2 Nhuộm Gram…………………………………................. 19 Hình 4.3 Nhuộm bào tử………………………………………….... 20 Hình 4.4 Phản ứng Starch……………………………………….... 20 Hình 4.5 Phản ứng Gelatin……………………………….............. 21 Hình 4.6 Phản ứng Thủy phân Casein……………………………. 21 Hình 4.7 Thời gian tồn tại của vi khuẩn Bacillus subtiilis trong bùn….. 22 Hình 4.8 Thời gian tồn tại của vi khuẩn Bacillus subtiilis trong nước… 22 Hình 4.9 Biến động mật độ Bacillus subtiilis trong bùn……........ 23 Hình 4.10 Biến động mật độ Bacillus subtiilis trong nước……….. 23 Hình 4.11 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong bùn……………. 25 Hình 4.12 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước…………… 25 Hình 4.13 Biến động mật độ Vibrio trong bùn…………………… 27 Hình 4.14 Biến động mật độ Vibrio trong nước………………..... 27 Hình 4.15 Tỉ lệ sống của tôm sú……………………...................... 28 Hình 4.16 Tỉ lệ tăng trưởng của tôm sú………………….................. 29 Hình 4.17 Tôm sú sau khi thu hoạch………………………………... 30 v
DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1 Tỉ lệ sống của tôm sú……………………………................................23 Bảng 4.2 Tỉ lệ tăng trưởng của tôm sú………………………………………… 24 Bảng 4.3 Các chỉ tiêu sinh hóa để nhận dạng Bacillus subtilis ……………… 27 vi
PHẦN I: GIỚI THIỆU Trong khoảng 10 năm gần đây nghề nuôi tôm ở Vịêt Nam đang phát triển mạnh mẽ. Tính đến tháng 6/2005 diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 542.900 ha, tăng 11.2% so với cùng kỳ năm 2004, sản lượng nuôi đạt 562.800 tấn, trong đó Đồng Bằng Sông Cửu Long chiếm 67.1% (Bộ Thuỷ Sản, 2006). Chính lợi nhuận từ việc nuôi thuỷ sản quá cao mà người dân không ngừng mở rộng diện tích nuôi, tăng mật độ nuôi và mùa vụ thả nuôi. Từ đó, dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thuỷ sản do phần lớn các vật chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và chất thải khác đọng lại dưới đáy ao nuôi. Ngoài ra, còn các hoá chất, kháng sinh sử dụng trong quá trình nuôi tích luỹ không được xử lý. Do đó, vấn đề cần thiết nhất hiện nay là quản lý tốt môi trường ao nuôi nhằm hạn chế tình trạng bệnh trên các đối tượng thuỷ sản, giúp nuôi trồng thuỷ sản phát triển bền vững và bảo vệ môi truờng. Xu hướng hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng để giải quyết vấn đề trên là sử dụng các vi sinh vật hữu ích được phân lập từ bùn đáy và nước ao nuôi. Các sản phẩm vi sinh vật hữu ích này gọi là chế phẩm sinh học (Probiotic). Trong nuôi tôm thâm canh cao sản, hai yếu tố quan trọng quyết định năng suất là tôm giống sạch bệnh và môi trường ao nuôi. Hiện nay, tình hình trên đang đặt ra cho các nhà khoa học nhiều vấn đề cần giải quyết đặc biệt là phương pháp xử lý bùn đáy trong những ao, đầm nuôi tôm việc làm sạch và duy trì ao nuôi sạch vẫn còn nhiều bất cập khiến cho những người nuôi tôm gặp rất nhiều rủi ro. nuôi tôm mật độ cao. Tình trạng nhiễm bẩn nặng của ao nuôi tôm mặc dù đã được khắc phục bằng giải pháp thay nước sạch thường xuyên hay nước đã được xử lý, song phần bùn ao - nơi các chất thải tích tụ trong quá trình nuôi là môi trường lý tưởng cho các vi khuẩn và ký sinh trùng gây bệnh phát triển. Mỗi năm, lượng bùn tích tụ ở đáy ao nuôi tôm thâm canh hình thành một lớp bùn dày 10-15 cm, tương đương 30-50 tấn chất khô giàu hữu cơ/ha. Bùn có thành phần chủ yếu là chất hữu cơ, bao gồm sinh khối vi sinh vật và xác động, thực vật thủy sinh. Khi phân hủy tự nhiên sẽ làm cạn kiệt lượng oxy hòa tan và sinh ra các chất độc hại đối với tôm như NH3, H2S, CH4 (trích dẫn Nguyễn Thị Chính, 2006). Trước tình hình trên, xu hướng chung của thế giới là “phòng bệnh hơn chữa bệnh”. Hiện nay, nhiều mô hình nuôi tôm bền vững được đề xuất và áp dụng như nuôi tôm thân thiện với môi trường, nuôi tôm an toàn sinh học… 1
Gần đây các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu việc sử dụng các vi sinh vật hữu ích để tạo các chế phẩm sinh học. Một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất là nhóm Bacillus, hầu hết các loài thuộc giống Bacillus không độc hại cho người và động vật thủy sản (trích dẫn bởi Olmos, 2005) Hiện nay, ở nước ta người dân nuôi thủy sản sử dụng chế phẩm sinh học rất phổ biến để cải thiện chất lượng nước. Nhưng chưa có nghiên cứu nào đánh giá xem các chủng vi sinh vật hữu ích khi đưa vào môi trường nước có tồn tại và phát triển hay không từ vấn đề trên đề tài "Khảo sát Sự biến động mật độ của vi khuẩn Bacillus subtilis trong bể nuôi tôm sú (Penaueus monodon)” được thực hiện với mục tiêu và nội dung sau. Mục tiêu Xác định thời gian cần thiết để bổ sung vi khuẩn hữu ích Bacillus subtilis vào bể nuôi tôm sú. Xác định mật độ và sự biến động của Bacillus subtilis trong một chu kỳ nuôi. Phân lập và xác định các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn chiếm ưu thế trong bể nuôi tôm sú. Nhằm khẳng định lại dòng ưu thế là dòng đã bổ sung. Nội dung Theo dõi và xác định thời gian bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis và theo dõi biến động mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi bổ sung vào bể nuôi. Xác định sự biến động của tổng vi khuẩn, tổng Vibrio trong bể nuôi tôm sú trên môi trường Nutrient Agar (NA) và Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar (TCBS). Xác định sự biến động của vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường chuyên biệt đồng thời định danh lại các dòng vượt trội này bằng một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản của vi khuẩn 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học của tôm sú (Penaeus monodon) 2.1.1 Vị trí phân loại: Theo hệ thống phân loại của Holthuis, 1989. Tôm sú thuộc Ngành: Arthopoda – Ngành chân khớp Ngành phụ: Antennata – Ngành phụ có râu Lớp: Crustacea - Lớp giáp xác Bộ: Decapoda - Bộ 10 chân Bộ phụ: Natantia - Bộ phụ bơi lội Họ chung: Penaeidea Họ: Penaeidea - Họ tôm he Giống: Penaeus Loài: Penaeus monodon 2.1.2 Phân bố Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan phía đông Tahiti, phía Nam Châu Úc và phía Tây Châu Phi (Racek, 1955; Holthuis và Rosa, 1965; Motol, 1981,1985). Tôm bột, tôm giống và tôm tiền trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và vùng rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành di chuyển xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn. 2.1.3 Vòng đời Tôm cái có kích thước lớn hơn tôm đực, tuổi thành thục từ tháng thứ 8 trở đi. Tôm đẻ quanh năm nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính là tháng 3-4 và tháng 7-10. Tôm cái đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ), trứng sau khi đẻ được 14-15 giờ ở nhiệt độ 27-28ºC nở thành ấu trùng. Ấu trùng phát triển qua các giai đoạn sau: Nauplius: 6 giai đoạn; Zoea: 3 giai đoạn; Mysis: 3 giai đoạn. Tuổi thọ tôm đực khoảng 1,5 năm; tôm cái khoảng 2 năm. 3
2.1.4 Tập tính ăn và loại thức ăn Tôm sú thích ăn động vật sống hơn xác thối rửa hay mảnh vụn hữu cơ. Tôm bắt mồi nhiều hơn khi thuỷ triều rút. Nuôi tôm sú trong ao hoạt động bắt mồi nhiều vào sáng sớm và chiều tối. Trong tự nhiên tôm chịu được sự biến động về độ mặn rất lớn (3- 45‰), độ mặn tối ưu là 15-25‰. Ở nhiệt độ 28ºC tôm sú lớn tương đối chậm, ở nhiệt độ 30ºC tôm lớn nhanh hơn nhưng dễ mắc bệnh. Nhiệt độ tối ưu cho tôm sú phát triển ở vùng ao hồ nhiệt đới là 28-30ºC 2.1.5 Lột xác Theo Phạm Văn Tình (2000) Trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kích thước tăng lên mức độ nhất định, tôm phải lột bỏ lớp vỏ củ để lớn lên. Sự lột xác thường xảy ra vào ban đêm, sự lột xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trường hợp lột xác mà không tăng thể trọng. Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xác xảy ra như sau. Lớp biểu bì giữa khớp đầu ngực và phần bụng nứt ra, các phần phụ của đầu ngực rút ra trước, theo sau là phần bụng và phần phụ phía sau, rút ra khỏi lớp vỏ cứng, với động tác uốn cong mình toàn cơ thể. Lớp vỏ mới mềm sẽ cứng lại sau 1-2 giờ đối với tôm nhỏ, 1-2 ngày đối với tôm lớn. Tôm sau khi mới lột xác, vỏ còn mềm nên rất nhạy cảm với môi trường sống thay đổi đột ngột. Trong quá trình nuôi tôm, thông qua hiện tượng này, có thể điều chỉnh môi trường nuôi kịp thời (Phạm Văn Tình, 2004). 2.2 Sự siến động các yếu tố thuỷ lý trong ao nuôi thuỷ sản. 2.2.1 Nhiệt độ Trong các ao nuôi nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp các chất hữu cơ cho cơ thể sinh vật, cũng như vai trò phân huỷ của vi sinh vật và trao đổi chất của tôm nuôi. Theo Whetstone et al., (2002) tôm có thể sống tốt ở nhiệt độ 23- 340C tối ưu là 26 - 290C nhưng không thay đổi quá 50C trong ngày (Boyd et al., 2003). 2.2.2 pH Theo Chanratchakool et al., (1995) thì pH của nước rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tôm nuôi. pH thích hợp cho tôm nuôi 7.50 - 8.35 và khoảng dao động hằng ngày không vượt quá 0.5 đơn vị pH. Theo Phạm Văn Tình (1994) thì pH trong ao nuôi thương thấp vào buổi sáng và cao vào buổi chiều, pH của nước trong ao tốt nhất là 7.50 - 8.50 là thích hợp cho ao nuôi tôm sú. 4
2.2.3 Độ mặn Tôm sú là đối tương nuôi rộng muối, chúng có thể sống ở những nơi có độ mặn từ 3- 45‰. Wannina Yake et al., (2001) cho rằng độ mặn tối ưu cho sinh trưởng và phát triển của tôm sú là 15-20‰. 2.2.4 Oxy hoà tan (DO) Oxy hoà tan lý tưởng cho tôm sú là trên 5ppm (Swingle, 1969 được trích bởi Lê Bảo Ngọc., 2005) và không vượt quá 15ppm (Whetstone et al.,2002) theo nghiên cứu của Summerfelt (1996) thì hàm lượng oxy hoà tan trong nước chịu sự chi phối của nhịêt độ, nhịêt độ càng tăng thì oxy hoà tan trong nước càng giảm. Hàm lượng DO ở mức thích hợp cho sự sinh trưởng tối ưu cho tôm là 5-6ppm (Boyd et al., 2003). 2.3 Sử dụng chế phẩm sinh học (Probiotic) trong nuôi trồng thủy sản 2.3.1 Sơ lược về probiotic “Probiotic là hổn hợp bổ sung mang bản chất của các vi sinh vật sống tác động có lợi đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật chủ hoặc sống tự do trong môi trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của môi trường sống” (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). Probiotic bao gồm những vi khuẩn có lợi (vi sinh vật hữu ích) và trong thủy sản hầu hết những sinh vật này là vi khuẩn lactic acid (Lactobacillus plantarum, L. acidophillus, L. casei, L. rhamnosus, L. bulgaricus, Carnobacterium…), giống Vibrio (Vibrio alginolyticus), giống Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. polymyxa,…), Actinomycetes, Nitrobacteria…được áp dụng trong các bể ương nuôi, trong ao để hạn chế sự nhiễm bệnh đối với các vi khuẩn gây bệnh (Xiang-Hong et al., 1998; Lê Đình Duẩn và ctv, 2007). Cũng theo nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) một số thành phần khác cũng được tìm thấy trong probiotic là tập hợp các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như amylase, protease, lipase, cellulase, chitinase, một số vitamin thiết yếu và chất khoáng. Ngoài ra, trong các chế phẩm sinh học giúp xử lý nước và nền đáy ao thường bổ sung thêm các chủng nấm sợi và xạ khuẩn (thuộc nhóm Aspergillus, Streptomyses...). Theo Nair et al., 1985 vi khuẩn lactic acid và một số nhóm vi khuẩn khác có khả năng tiết ra chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus. Sử dụng các nhóm vi khuẩn có lợi phân lập từ ruột cá bơn 5
(Scophthalmus maximus) trong ao nuôi có thể kìm hãm vi khuẩn V. anguillarum gây bệnh (Olsson et al., 1992), điều này chứng tỏ nhóm vi khuẩn có lợi đã cạnh tranh có hiệu quả với nhóm vi khuẩn gây bệnh (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). Nghiên cứu của Xiang-Hong et al., (1998) cũng cho biết một số vi khuẩn hữu ích có thể kích thích hoặc ức chế sự phát triển của tảo. Tác giả còn cho biết thêm những vi khuẩn có lợi trong nước sẽ loại trừ nhanh NH3, H2S, vật chất hữu cơ có hại. Ngoài ra, chúng còn có thể cân bằng pH trong ao nuôi. Cải thiện chất lượng nước là một trong những vai trò quan trọng của vi sinh vật hữu ích trong nuôi trồng thủy sản. Vì thế, Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải tiến chất lượng nước, do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2. Vì vậy, Bacillus sp giúp giảm tích lủy chất hữu cơ và các chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). 3.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản. Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi đây là biện pháp tăng hiệu quả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn (Xiang-Hong et al., 1998). Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế phẩm sinh học cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học không những làm tăng khả năng phân giải các chất hữu cơ, làm sạch, và ổn định môi trường nước mà còn tăng năng suất gấp gần 2 lần so với đối chứng. Theo (Vijayabaskar et al., 2008) ứng dụng thành công các vi khuẩn có lợi mà cụ thể là nhóm vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi cá rô phi nhằm để hạn chế mầm bệnh do vi khuẩn A. hydrophila gây ra. Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm ở Philippine, khi việc sử dụng kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩn kháng thuốc, mà xa hơn nữa là vi khuẩn có nhiều khả năng gây bệnh đến con người nếu sử dụng quá liều lượng. Vì lý do đó mà probiotic được ứng dụng rộng rãi cho nghề nuôi tôm ở Philippine, nghiên cứu cho thấy rằng có thể cứu sống 80% tôm bệnh khi trong ao nuôi có sử dụng chế phẩm sinh học (Moriarty, 1999). Một nghiên cứu khác về việc ứng dụng các chế phẩm sịnh học trong nuôi thủy sản cho kết quả rất khả quan, không chỉ cải thiện chất lượng nước, giảm lượng dùng kháng 6
sinh, giảm mầm bệnh trong ao mà còn có thể nâng cao năng suất nuôi và chất lượng của sản phẩm (Xiang-Hong et al., 1998). Probiotic đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi thủy sản. Nhưng việc sử dụng Probiotic còn phụ thuộc nhiều vào sự am hiểu về bản chất của các vi sinh vật có ích và đặc điểm sinh học của đối tượng vật nuôi (Balcázar et al., 2006). 2.4 Đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 2.4.1 Vị trí phân loại Giới : Bacteria Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Bacillates Họ : Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/subtilisin) Năm 1872, Ferdinand Cohn (một sinh viên của Robert Koch), đã phát hiện và đặt tên là B. subtilis. B. subtilis là trực khuẩn gram dương, di động, có kích thước 2–3 x 0,7 - 0,8µm. Chúng có khả năng hình thành bào tử khi môi trường biến đổi đột ngột, cũng như khi sống thời gian dài dưới những điều kiện bất lợi như khang hiếm chất dinh dưỡng. Ở điều kiện 100ºC, bào tử B. subtilis chịu được 180 phút. Bào tử có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp, sự khô cạn, tác động của hóa chất và tia bức xạ. (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/subtilisin 2.4.2 Quá trình hình thành bào tử ở Bacillus subtilis Khi môi trường bị thay đổi một cách đột ngột hoặc thiếu thức ăn, các loài thuộc giống Bacillus và Clostridia tạo ra một loại tế bào ngừng hoạt động tạm thời gọi là nội bào tử giúp chống lại sự phá hủy thành tế bào (Driks, 1999). Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải để sinh sôi nảy nở mà để chịu đựng được với điều kiện bất lợi. Đó là loại tế bào ở trạng thái nghỉ mà trong chúng các quá trình sống bị ức chế rất mạnh (Nguyễn Lân Dũng, 1983). Cách đây 100 năm, một nghiên cứu của Koch về bào tử của B. anthracis có thể sống sót ở điều kiện đun sôi, đã tạo cảm hứng cho các nhà khoa học nghiên cứu về bào tử với mục đích khám phá ra như thế nào loại tế bào ngưng hoạt 7
động đặc biệt có thể chịu nhiệt độ và các điều kiện gây sốc khác. Theo Driks (1999), bào tử có khả năng chịu nhiệt là nhờ lớp áo bào tử. Áo bào tử là một cấu trúc gồm nhiều lớp bao quanh bào tử được cấu thành bởi 25 loại polypeptide liên kết chéo chặc chẽ với nhau. Tuy nhiên lớp áo bào tử cũng cho phép bào tử hồi sinh khi điều kiện môi trường thích hợp. Bào tử có thể chuyển đổi thành tế bào phát triển thông qua một quá trình gọi là sự nẩy mầm. Trong quá trình hình thành nội bào tử, vi khuẩn cũng tạo ra các chất kháng sinh. Nhiều loài hình thành bào tử có thể phân hủy một cách hiệu quả các polymer sinh học (protein, starch, pectin,….), đóng vai trò quan trọng trong các chu trình sinh học Nitơ và Carbon. Quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn khoảng 8 giờ để hoàn thành (Driks, 1999). Trong quá trình hình thành bào tử, nhiểm sắc thể nhân đôi thành các bản sao riêng biệt. Cuối cùng chỉ có một bản sao nhiểm sắc thể nằm trong bào tử, sau đó hình thành hai tế bào, các phần còn lại bị hủy đi và bào tử được phóng thích. Theo Nguyễn Lân Dũng (1983) phần lớn vi khuẩn trong tế bào chỉ có thể có một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử này sẻ nẩy mầm và mỗi bào tử sẽ chỉ cho ra một tế bào dinh dưỡng. Trong tất cả các loài, không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở trong bất kì điều kiện nào, chưa có thông tin giải thích tại sao một vài tế bào trong môi trường nuôi hình thành bào tử và một số khác thì không. Tuy nhiên, có sự chấp nhận rằng sự hình thành bào tử bắt đầu sau pha tăng trưởng nhanh và trong suốt pha tĩnh (Banwart, 2000). 2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis Mô hình nuôi thuỷ sản thâm canh thường tích lũy nhiều vật chất hữu cơ ở đáy ao do thức ăn dư thừa, phân và các chất thải khác của thuỷ sinh vật làm môi trường sống của vật nuôi bị ô nhiễm tạo điều kiện cho mầm bệnh bộc phát gây thiệt hại lớn trong nuôi thuỷ sản. Chất lượng nước và việc kiểm soát bệnh là vấn đề rất quan trọng trong các ao nuôi, nó có quan hệ trực tiếp và ảnh hưởng nhiều bởi hoạt động của vi sinh vật (Jory, 1998). Vì vậy, vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ trong thuỷ vực giữ vai trò rất quan trọng trong việc điều chỉnh chất lượng nước đối với các hệ thống nuôi thuỷ sản thâm canh (Avnimelech et al., 1995). Hoạt động của vi sinh vật ảnh hưởng đến chất lượng nước chủ yếu là sử dụng oxygen, tái tạo lại các dưỡng chất vô cơ và loại trừ các sản phẩm độc trong trao đổi chất như NH3, NO2-, H2S (Moriarty, 1996). Nhóm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình thành bào tử là Bacillus spp đã được sử dụng như một chế phẩm sinh học từ rất lâu giúp cải tiến chất lượng nước nhờ vào tác 8
dụng phân hủy các hợp chất hữu cơ và làm giảm số lượng mầm bệnh tiếp cận với các loài thuỷ sản nuôi (Wang et al., 1999). Không chỉ vậy bào tử Bacillus cũng được sử dụng như một tác nhân sinh học giúp giảm bệnh Vibrio trong hệ thống nuôi thuỷ sản (Skjermo và Vadstein, 1999; Rengipipat et al., 2000). Bào tử vi khuẩn Bacillus IP5832 đưa vào môi truờng nuôi luân trùng dùng làm thức ăn cho cá bơn (Gatesoupe, 1991) Meunpol et al., (2002) sử dụng probiotic với dòng vi khuẩn Bacillus S11 trộn vào thức ăn viên công nghiệp cho ấu trùng tôm sú ăn. Sau khi cho ăn thức ăn trộn probiotic trong 1 tháng thì cấy vi khuẩn Vibrio harveyi rồi sục ozone vào từng bể (0,3333 - 0,341 mg O3/ml). Tỉ lệ sống của tôm được xác định sau 6 ngày đạt cao nhất 75% so với nghiệm thức đối chứng tỷ lệ sống chỉ có 18%. Vi khuẩn hữu ích đóng vai trò quan trọng trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là liên quan đến sản xuất sơ cấp, phân hủy chất hữu cơ, cải thiện chất lượng nước trong ao. Chúng còn chuyển hóa các chất độc như ammoniac và hợp chất nitơ. Trong thủy vực, các vật chất hữu cơ không ngừng bị phân hủy bởi các vi sinh vật vì chúng cần các hợp chất này để làm thức ăn. Các chất hữu cơ được chúng hấp thụ làm tiền chất cho việc xây dựng cấu trúc cơ thể và tạo năng lượng cho các hoạt động sống. Khi ấy, hợp chất hữu cơ được vi sinh vật biến đổi thành các chất nghèo năng lượng và cuối cùng trong những điều kiện thích hợp thì chuyển hóa ngược lại thành các chất vô cơ ban đầu được gọi là quá trình vô cơ hoá. Quá trình này sẽ tái tạo trở lại vòng tuần hoàn trong thủy vực, tạo nên sự sinh trưởng mới của thực vật. Nếu không có vi sinh vật phân hủy hữu cơ thì toàn bộ quá trình chuyển hóa vật chất trong thủy vực sẽ ngừng lại và sự sống sẽ không tồn tại được (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2005 ). 9