Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng thời sibutramine và một số dẫn xuất trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân bằng phương pháp LC-MS/MS

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:79

Thêm vào BST

Báo xấu

58
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của Luận văn nhằm xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời sibutramine desmethyl sibutramine và didesmethyl sibutramine trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân bằng LC-MS/MS. Ứng dụng phương pháp để phát hiện và định lượng SB và một số dẫn xuất của SB trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân trên địa bàn thành phố Hà Nội. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng thời sibutramine và một số dẫn xuất trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân bằng phương pháp LC-MS/MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN DƢƠNG THỊ MAI HOA XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI SIBUTRAMINE VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE HỖ TRỢ GIẢM CÂN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN DƢƠNG THỊ MAI HOA XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI SIBUTRAMINE VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE HỖ TRỢ GIẢM CÂN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS Chuyên ngành: Hóa Phân tích Mã số: 8440112.03 Cán bộ hƣớng dẫn: PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo PGS. TS. Phạm Thị Ngọc Mai Hà Nội - 2020
LỜI CẢM ƠN Đề tài đƣợc thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, 65 Phạm Thận Duật, Phƣờng Mai Dịch, Quận Cầu Giấy, Thành phố Hà Nội. Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo, PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Mai đã giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên đã nhiệt tình dạy dỗ, cung cấp cho em những kiến thức quan trọng, cần thiết và bổ ích. Đồng thời, em xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, ThS. Cao Công Khánh, phụ trách khoa Nghiên cứu phát triển, các đồng nghiệp trong Viện đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành đề tài. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình và ngƣời thân đã luôn quan tâm, động viên em trong suốt thời gian qua. Trong quá trình thực hiện đề tài, do trình độ lý luận cũng nhƣ kinh nghiệm thực tế còn hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc sự góp ý của quý thầy cô và các bạn đồng nghiệp. Xin chân thành cảm ơn!
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3 1.1. Giới thiệu sibutramine và các dẫn xuất của sibutramine ..................................... 3 1.1.1. Sibutramine ................................................................................................... 3 1.1.2. N-desmethyl sibutramine và N-didesmethyl sibutramine............................. 5 1.2. Tình trạng thừa cân, béo phì và một số biện pháp điều trị, phòng ngừa thừa cân, béo phì .................................................................................................................. 6 1.2.1. Tình trạng thừa cân, béo phì ......................................................................... 6 1.2.2. Một số biện pháp điều trị, phòng ngừa thừa cân, béo phì ............................. 7 1.3. Phƣơng pháp xác định SB, DSB và DDSB.......................................................... 9 1.3.1. Một số kỹ thuật xử lý mẫu ............................................................................ 9 1.3.2. Phƣơng pháp phân tích ................................................................................ 13 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 22 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................... 22 2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 22 2.2.1. Khảo sát các điều kiện LC-MS/MS ............................................................ 22 2.2.2. Khảo sát dung môi chiết, điều kiện chiết và quy trình làm sạch mẫu ........ 22 2.2.3. Xác nhận giá trị sử dụng ............................................................................. 23 2.2.4. Xác định hàm lƣợng sibutramine, desmethyl sibutramine và didesmethyl sibutramine trong mẫu thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm cân có mặt trên thị trƣờng ........................................................................................................... 23 2.3. Thiết bị phân tích ............................................................................................... 23 2.4. Dụng cụ phân tích .............................................................................................. 24
2.5. Dung môi, hóa chất ............................................................................................ 24 2.5.1. Dung môi ..................................................................................................... 24 2.5.2. Chất chuẩn ................................................................................................... 24 2.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ........................................................................... 24 2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................... 25 2.6.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) .......................... 25 2.6.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu .............................................................................. 27 2.6.3. Phƣơng pháp thẩm định .............................................................................. 29 2.6.4. Phƣơng pháp lấy mẫu .................................................................................. 30 2.6.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu........................................................................... 30 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 31 3.1. Kết quả khảo sát điều kiện LC-MS/MS xác định đồng thời SB, DSB và DDSB trong TPBVSK hỗ trợ giảm cân ......................................................................... 31 3.1.1. Điều kiện MS/MS ....................................................................................... 31 3.1.2. Khảo sát điều kiện LC ................................................................................. 32 3.2. Khảo sát quá trình chuẩn bị mẫu ........................................................................ 36 3.2.1. Khảo sát dung môi chiết.............................................................................. 36 3.2.2. Khảo sát thời gian siêu âm và số lần chiết .................................................. 36 3.2.3. Khảo sát quy trình làm sạch mẫu ................................................................ 40 3.2.4. Khảo sát khối lƣợng than hoạt tính ............................................................. 42 3.3. Thẩm định phƣơng pháp .................................................................................... 45 3.3.1. Độ đặc hiệu ................................................................................................. 45 3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) .......................... 47 3.3.3. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 49 3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ............................................................................... 51 3.4. Phân tích mẫu thực tế ......................................................................................... 52 KẾT LUẬN ................................................................................................................... 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các điều kiện MS/MS để phân tích SB, DSB và DDSB Phụ lục 2. Các thông số tối ƣu của MS để phân tích SB, DSB và DDSB Phụ lục 3. Kết quả khảo sát số lần chiết Phụ lục 4. Danh sách các mẫu TPBVSK hỗ trợ giảm cân đƣợc
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt, Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng việt ký hiệu ACN Acetone nitril Acetone nitril DDSB Didesmethyl sibutramine Didesmethyl sibutramine DSB Desmethyl sibutramine Desmethyl sibutramine EtOH Ethanol Ethanol MeOH Methanol Methanol HCl Acid chlorhidric Axít clohidric KH2PO4 Potassium dihydrophotphate Kali dihydro phốt phát NH4OH Ammonium hydoxide Amoni hydoxit HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPTLC- Sắc ký lớp mỏng hiệu High performance thin layer chromatography UV năng cao LC Liquid chromatography Sắc ký lỏng LC-EIS- Liquid chromatography-electrospray Sắc ký lỏng khối phổ ion MS ionization mass spectrometry hóa phun điện tử LC-MS Liquid chromatography-mass spectrometry or Sắc ký lỏng khối phổ hay hay High performance liquid chromatography sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC mass spectrometry khối phổ MS LC- Liquid chromatography with tandem mass Sắc ký lỏng hai lần khối MS/MS spectrometry phổ LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lƣợng GCB Graphitized carbon black Than hoạt tính RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối S/N Signal to noise Tín hiệu/nhiễu SB Sibutramine Sibutramine SPE - Solid phase extraction – hydrophilic lipophilic Chiết pha rắn – cột HLB
Viết tắt, Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng việt ký hiệu HLB balance Solid phase extraction – strong cation Chiết pha rắn – cột trao SPE SCX exchange đổi cation mạnh Thực phẩm bảo vệ sức TPBVSK Health supplement food khỏe Ultra-high performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu UHPLC chromatography năng UV Vis Ultra violet - visible Tử ngoại – khả kiến IS (V) Ion Spray Voltage Thế phun ion TEM Temperature Nhiệt độ (oC) GS1 (psi) Ion Source Gas 1 Khí nguồn ion 1 GS2 (psi) Ion Source Gas 2 Khí nguồn ion 2 EP (V) Entrance potential Thế đầu vào CUR Curtain Gas Khí màng (psi) CAD Collision Gas Khí va chạm (psi)
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sibutramine và các dẫn xuất của sibutramine ................................................ 3 Bảng 1.2. Tổng hợp kết quả một số kỹ thuật xử lý mẫu ............................................... 12 Bảng 2.1. Quy trình làm sạch mẫu ................................................................................ 28 Bảng 3.1. Các điều kiện MS/MS phân tích SB, DSB, DDSB ...................................... 31 Bảng 3.2. Các thông số tối ƣu của MS để phân tích SB, DSB và DDSB ..................... 32 Bảng 3.3. Chƣơng trình gradient dung môi phân tích SB, DSB, DDSB ...................... 33 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của pha động đến diện tích píc các chất phân tích .................... 34 Bảng 3.5. Chƣơng trình dung môi tối ƣu ...................................................................... 34 Bảng 3.6. Kết quả hiệu suất thu hồi (H%) của SB, DSB và DDSB ............................. 36 Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi SB, DSB và DSB sau khi làm sạch .................................. 41 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng lƣợng GCB đến hiệu suất thu hồi SB, DSB, DDSB .................. 42 Bảng 3.9. Tỷ lệ ion và sai số cho phép ......................................................................... 45 Bảng 3.10. Khoảng đƣờng chuẩn và độ chệch.............................................................. 50 Bảng 3.11. Độ lặp lại (RSD%) và độ thu hồi (R%) của SB, DSB và DDSB trên các nền mẫu ..................................................................................................... 51 Bảng 3.12. Kết quả định lƣợng SB, DSB và DDSB một số mẫu TPBVSK ................. 54
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của sibutramine ................................................................. 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo N- desmethyl sibutramine ................................................. 5 Hình 1.3. Công thức cấu tạo N-didesmethyl sibutramine ............................................... 5 Hình 2.1. Thiết bị LC-MS/MS 5500QQQ đƣợc lựa chọn sử dụng............................... 26 Hình 3.1. Sắc ký đồ của SB (3.1a), DSB (3.1b) và DDSB (3.1c) sau khi tối ƣu hóa chƣơng trình dung môi pha động ................................................................. 35 Hình 3.2. Kết quả hiệu suất thu hồi SB, DSB, DDSB trên nền viên nang cứng .......... 37 Hình 3.3. Kết quả hiệu suất thu hồi SB, DSB, DDSB trên nền viên nang mềm .......... 37 Hình 3.4. Kết quả hiệu suất thu hồi SB, DSB, DDSB trên nền trà túi lọc .................... 38 Hình 3.5. Hiệu suất thu hồi của SB, DSB, DDSB sau 1 lần chiết, 2 lần chiết, 3 lần chiết / nền viên nang cứng ........................................................................... 39 Hình 3.6. Hiệu suất thu hồi của SB, DSB, DDSB sau 1 lần chiết, 2 lần chiết, 3 lần chiết / nền viên nang mềm ........................................................................... 39 Hình 3.7. Hiệu suất thu hồi của SB, DSB, DDSB sau 1 lần chiết, 2 lần chiết, 3 lần chiết / nền trà túi lọc .................................................................................... 40 Hình 3.8. Dung dịch mẫu trƣớc và sau khi sử dụng làm sạch bằng GCB .................... 42 Hình 3.9. Quy trình tối ƣu xác định SB, DSB và DDSB trong mẫu............................. 44 Hình 3.10. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn SB ............................... 46 Hình 3.11. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn DSB ............................ 46 Hình 3.12. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn DDSB ......................... 47 Hình 3.13. Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn SB (0,05 µg/kg) trên nền mẫu nang mềm .. 48 Hình 3.14. Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn DSB (0,1 µg/kg) trên nền mẫu nang mềm.. 48 Hình 3.15. Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn DDSB (0,1 µg/kg) ...................................... 48 Hình 3.16. Đƣờng chuẩn SB ......................................................................................... 49 Hình 3.17. Đƣờng chuẩn DSB ...................................................................................... 50 Hình 3.18. Đƣờng chuẩn DDSB ................................................................................... 50 Hình 3.19. Sắc đồ các mẫu có chứa sibutramine .......................................................... 52 Hình 3.20. Sắc đồ các mẫu chứa desmethyl sibutramine .............................................. 53
MỞ ĐẦU Thừa cân và béo phì đƣợc coi là một trong những vấn đề nghiêm trọng trên toàn thế giới. Thực trạng này dẫn đến việc cần tìm kiếm một số loại thuốc giảm cân và đặc biệt là một số sản phẩm điều trị có nguồn gốc thảo dƣợc hay các sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Nhu cầu các sản phẩm hỗ trợ giảm cân, các thực phẩm bổ sung có nguồn gốc từ các thảo dƣợc tự nhiên đang gia tăng rõ rệt, với niềm tin các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên là vô hại, không gây ra tác dụng phụ nhƣ các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa học [4, 44]. Từ việc gia tăng nhu cầu ngày càng lớn trên toàn thế giới, thị phần của các sản phẩm giảm cân có nguồn gốc thảo dƣợc, các thực phẩm bảo vệ sức khỏe, đã có tính cạnh tranh cao. Do đó, một số nhà sản xuất đã pha trộn trái phép một số hoạt chất nguồn gốc tân dƣợc, có tác dụng gây chán ăn để cải thiện hiệu quả của các sản phẩm giảm cân. Sibutramine hydrochloride là một trong những loại thuốc gây chán ăn phổ biến nhất đƣợc tìm thấy trong các thực phẩm điều trị giảm cân có nguồn gốc thảo dƣợc [9, 17, 38]. Bên cạnh đó các các chất tƣơng tự sibutramine (SB) là N-desmethylsibutramine (DSB), N-didesmethylsibutramine (DDSB) cũng đƣợc thêm vào thực phẩm bổ sung để tăng hiệu quả giảm cân cho sản phẩm. Những chất trộn trái phép này gây nguy hiểm đến sức khỏe con ngƣời [16]. Nếu không có biện pháp kiểm soát chất lƣợng chặt chẽ, những ngƣời sử dụng các thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ điều trị giảm cân trong thành phần có chứa SB và chất tƣơng tự SB mà không đƣợc khai báo có thể chịu một số tác động khó lƣờng về sức khỏe nhƣ: đau đầu, chóng mặt, tê liệt thần kinh, hoặc ảnh hƣởng nghiêm trọng đến tim mạch tùy thuộc vào lƣợng sản phẩm đã tiêu thụ [3, 43]. Để kiểm soát chất lƣợng thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân nhằm bảo vệ sức khỏe ngƣời tiêu dùng, việc phát triển một phƣơng pháp phân tích phù hợp để xác định các chất trộn trái phép này có vai trò rất quan trọng. Xác định SB và các chất chuyển hóa của SB đã có một số phƣơng pháp phân tích đƣợc sử dụng đó là phƣơng pháp HPLC, LC-MS [23, 33, 36], GC, .v..v. Những phƣơng pháp này đã xác định đƣợc SB, DSB trong nền mẫu thảo dƣợc, mẫu huyết tƣơng [3, 31], mẫu nƣớc tiểu [17] . Năm 2007, Zou et al đã xây dựng phƣơng pháp LC ghép nối khối phổ (MS) 3 tứ cực, nhƣng phƣơng pháp chỉ thành công ở bƣớc nhận dạng SB, chất chuyển hóa của SB và một chất tƣơng tự SB trong mẫu thảo dƣợc hỗ trợ giảm cân, không phải là phƣơng pháp định lƣợng [44]. Năm 2008, ZiqiangHuang đã xây dựng 1
thành công phƣơng pháp phân tích đồng thời SB và N-didesmethyl sibutramine trong thực phẩm bổ sung. Phƣơng pháp có độ nhạy, độ chính xác và quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản [16]. Trong đề tài này, dựa trên nghiên cứu của ZiqiangHuang, nhóm nghiên cứu tiếp tục phát triển phƣơng pháp định lƣợng N-didesmethyl sibutramine, một chất tƣơng tự SB và DSB, có thể đƣợc trộn trái phép trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân bằng phƣơng pháp LC-MS/MS, đồng thời cũng tìm phƣơng pháp làm sạch mẫu phù hợp để loại tạp màu tăng hiệu suất thu hồi các chất phân tích. Do đó, đề tài ―Xác định đồng thời sibutramine và một số dẫn xuất trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân bằng phương pháp LC-MS/MS‖ đã đƣợc thực hiện với các mục tiêu nhƣ sau: 1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp xác định đồng thời sibutramine desmethyl sibutramine và didesmethyl sibutramine trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân bằng LC-MS/MS. 2. Ứng dụng phƣơng pháp để phát hiện và định lƣợng SB và một số dẫn xuất của SB trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân trên địa bàn thành phố Hà Nội. 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu sibutramine và các dẫn xuất của sibutramine Công thức phân tử, khối lƣợng phân tử của sibutramine và dẫn xuất của sibutramine đƣợc thể hiện trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Sibutramine và các dẫn xuất của sibutramine Công thức Khối lƣợng TT Tên hợp chất Kí hiệu phân tử phân tử 1 Sibutramine SB C17H26ClN 278,9 2 N-Desmethyl sibutramine DSB C16H24ClN 265,0 3 N-Didesmethyl sibutramine DDSB C15H22ClN 251,1 1.1.1. Sibutramine a) Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của sibutramine Sibutramine HCl là tinh thể kết tinh có màu từ trắng đến kem. Công thức phân tử: C17H26ClN (Khối lƣợng phân tử 279,86 g/mol), pKa = 9,6 [11]. Hình 1.1. Công thức cấu tạo của sibutramine Danh pháp quốc tế: (+/-)-1-(p-chlorophenyl)-α-isobutyl-N-N- dimethylcyclobutan-methylamine. Trong các chế phẩm chúng thƣờng tồn tại ở dạng sibutramine hydroclorid monohydrate, nhiệt độ nóng chảy ở 119oC, ở dạng kiềm có nhiệt độ nóng chảy 55,15oC và enthalpy là 60,75 J/mol. 3
Độ tan: Độ tan của sibutramine hydrocloride monohydrate trong nƣớc là 5,2 mg/mL ở pH = 5,2 [3, 11], độ tan trong methanol và nƣớc là 2,9 mg/L ở pH = 5,2 [26], độ tan trong octanol : H2O là 30,9 ở pH = 5,0 [11]. Sibutramine kiềm tan nhiều hơn trong alcol, độ tan tăng dần theo độ dài mạch C từ methanol đến octhanol [3]. b) Tính chất dược động học, tác dụng dược lý Tính chất dƣợc động học - Hấp thu: Sibutramine hấp thu tốt qua đƣờng tiêu hóa (77 %). Thời gian để thuốc đạt nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng là 1 giờ và thời gian bán thải là 1,1 giờ. - Phân bố: Phân bố nhanh chóng và rộng rãi đến các mô. - Chuyển hóa: Khi dùng đƣờng uống sibutramine bị chuyển hóa đáng kể khi qua gan lần đầu. Sibutramine đƣợc chuyển hóa bởi cytochrome P450 CYPA4 thành hai amin (gọi là chất chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2) với chu kỳ bán rã tƣơng ứng là 14 giờ và 16 giờ. Nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng của chất chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2 đạt đƣợc sau 3 – 4 giờ. - Thải trừ: Các chất chuyển hóa thải trừ chủ yếu qua đƣờng nƣớc tiểu [24]. Tác dụng dƣợc lý Sibutramine đã đƣợc đánh giá nhƣ một thuốc chống trầm cảm tiềm tàng do các cơ chế đã đƣợc chứng minh là tác động đó cũng tƣơng tự nhƣ các thuốc chống trầm cảm ba vòng, chẳng hạnh nhƣ amitriptyline. Tuy nhiên, sibutramine không có tác dụng phụ của thuốc chống trầm cảm ba vòng bao gồm cả buồn ngủ, tác dụng kháng acetylcholine thế đứng [24]. Sibutramine là một chất ức chế tái thu hồi serotonin - noradrenalin, thúc đẩy giảm cân ở ngƣời béo phì. Sibutramine làm giảm cảm giác thèm ăn, cho cảm giác no và gây ra sự sinh nhiệt. Trong cơ thể, sibutramine chuyển hóa nhanh chóng thành các chất chuyển hóa desmethyl: M1 (mono-desmethyl sibutramine) và M2 (di-desmethyl sibutramine) và sibutramine tác động dƣợc lý chủ yếu thông qua 2 chất chuyển hóa này để gây ra tác dụng giảm cân [37]. Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh sibutramine có hiệu quả nhƣ một chất giảm cân với liều lƣợng khác nhau, từ 10 đến 20 mg/ngày. 4
Tác dụng không mong muốn: Sibutramine kích thích quá mức hệ thần kinh trung ƣơng và ảnh hƣởng một vài khía cạnh nhƣ bồn chồn, khô miệng, đau đầu, tê liệt và những dị cảm (cảm giác khác thƣờng nhƣ bị châm chích, kiến bò) có thể xảy ra. Hơn thế nữa nó còn liên quan đến tăng nguy cơ tim mạch nhƣ tăng áp lực máu, nhịp tim và thƣơng tăng nguy cơ đau tim cũng nhƣ đột quỵ [17]. 1.1.2. N-desmethyl sibutramine và N-didesmethyl sibutramine Sibutramine ban đầu đƣợc phát triển nhƣ một thuốc chống trầm cảm, đƣợc kết hợp với serotonin (5- HT) và chất ức chế tái hấp thu noradrenaline (NA). Trong cơ thể sibutramine đƣợc chuyển hóa nhanh chóng thông qua dethyl hóa tạo thành N-desmethyl sibutramine (DSB) (hình 1.2) và N-didesmethyl sibutramine (DDSB) (hình 1.3) [33]. Hình 1.2. Công thức cấu tạo N- desmethyl sibutramine - Danh pháp quốc tế: 1-[1-(4-chlorophenyl) cyclobutyl]-N,3-dimethylbutan- 1-amine. - Công thức phân tử: C16H24ClN - Khối lƣợng mol: 265,83 g/mol Hình 1.3. Công thức cấu tạo N-didesmethyl sibutramine - Danh pháp quốc tế: 1–[1–(4–chlorophenyl) cyclobutyl]–3–methylbutan–1– amine. - Công thức phân tử: C15H22ClNO 5
- Khối lƣợng mol: 251,1 g/mol DSB và DDSB đều có hoạt tính dƣợc lý gây cảm giác no và kích thích sinh nhiệt. Các tác dụng phụ của DSB và DDSB đã đƣợc ghi chép lại rõ ràng. Ba trƣờng hợp loạn thần có liên quan đến việc sử dụng các sản phẩm giảm béo có chứa DSB và các tác dụng lên tim mạch ở một ngƣời đàn ông đã sử dụng thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân dạng thảo dƣợc có chứa DDSB cũng đã đƣợc ghi nhận lại. DSB và DDSB đã đƣợc tìm thấy trong một số mẫu thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân dạng thảo dƣợc. Nguồn tài liệu tham khảo cũng chỉ ra rằng DSB và DDSB có tác dụng dƣợc lý in vivo tƣơng tự nhƣ sibutramine. Dựa trên sự hấp thu của norepinephrine, serotonin và dopamine, các tác giả đã ƣớc tính DSB và DDSB có tác dụng mạnh gấp 50 lần so với SB [32]. 1.2. Tình trạng thừa cân, béo phì và một số biện pháp điều trị, phòng ngừa thừa cân, béo phì 1.2.1. Tình trạng thừa cân, béo phì Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), thừa cân béo phì là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thƣờng tại một vùng cơ thể hay toàn thân gây ra nhiều nguy hại tới sức khỏe. Nhìn chung, bệnh thừa cân béo phì đƣợc thể hiện khi trọng lƣợng cơ thể cao hơn trọng lƣợng chuẩn ở một ngƣời khỏe mạnh. Bệnh thừa cân béo phì là bệnh mãn tính do sự dƣ thừa quá mức lƣợng mỡ trong cơ thể. Trong cơ thể chúng ta luôn có một lƣợng mỡ nhất định và lƣợng mỡ này cần thiết để lƣu trữ năng lƣợng, giữ nhiệt, hấp thụ những chấn động và thể hiện các chức năng khác [29]. Dấu hiệu dễ nhận thấy nhất của thừa cân béo phì là sự gia tăng trọng lƣợng cơ thể, khối lƣợng mỡ tích tụ tại một số phần đặc biệt của cơ thể nhƣ: bụng, đùi, eo, và ngực [11]. Thừa cân béo phì khiến cơ thể trở nên quá khổ, vì vậy nó gây ra cảm giác tự ti, căng thẳng cho bản thân ngƣời thừa cân hay béo phì. Ngƣời thừa cân béo phì thƣờng mất tự tin trong giao tiếp, ngại giao tiếp và xuất hiện trƣớc đám đông kèm theo tình trạng căng thẳng, kém linh hoạt trong cuộc sống hàng ngày... dẫn đến làm giảm sút hiệu quả công việc [28]. 6
Ngƣời thừa cân béo phì dễ bị thoái hóa khớp, loãng xƣơng, đau nhức triền miên do áp lực từ trọng lƣợng cơ thể gây lên xƣơng khớp. Khớp gối, cột sống tổn thƣơng sớm nhất. Ngƣời thừa cân béo phì dễ mắc bệnh gout [28]. Ngƣời thừa cân béo phì thƣờng đi kèm với bệnh rối loạn lipid máu hay thƣờng gọi là bệnh mỡ trong máu hoặc cholesterol cao. Khi cholesterol cao gây xơ hóa lòng mạch máu, tăng huyết áp, đột quỵ, nhồi máu cơ tim. Mặt khác, ở ngƣời thừa cân béo phì thì tim phải thƣờng xuyên làm việc nhiều hơn để bơm máu đi nuôi cơ thể và lâu dài gây quá tải cho tim do đó ở ngƣời béo phì dễ mắc các bệnh về tim mạch. Hiện nay, tỷ lệ tử vong do bệnh tim mạch đang đứng đầu trong các nguyên nhân, trong đó rất nhiều trƣờng hợp là biến chứng của bệnh béo phì. Bệnh thừa cân béo phì có liên quan mật thiết với bệnh tiểu đƣờng type 2 do gây đề kháng insulin (hormon điều hòa đƣờng huyết và đƣa nhanh glucose vào tế bào để sử dụng) nên là nguyên nhân trực tiếp gây ra đái tháo đƣờng týp 2 ở ngƣời béo phì [29]. Hậu quả của thừa cân béo phì còn gây rối loạn chuyển hóa mỡ, sinh ra sỏi mật, suy giảm trí nhớ, một số bệnh lý đƣờng hô hấp, rối loạn nội tiết, và cũng gia tăng nguy cơ mắc bệnh ung thƣ [29]. 1.2.2. Một số biện pháp điều trị, phòng ngừa thừa cân, béo phì Để giảm thiểu nguy cơ gặp những biến chứng nặng nề do thừa cân béo phì, các bác sĩ khuyến cáo mỗi ngƣời nên kiểm soát cân nặng của mình với một chế độ dinh dƣỡng khỏe mạnh, cân bằng, kết hợp với vận động hợp lý để nâng cao sức khỏe cũng nhƣ phòng tránh các căn bệnh nguy hiểm do thừa cân béo phì gây nên. Một số trƣờng hợp kiểm soát cân nặng bằng chế độ tập luyện và dinh dƣỡng là chƣa đủ, họ phải kết hợp với sử dụng thuốc [32]. Một số thuốc đƣợc sử dụng trong điều trị thừa cân, béo phì là: Phentermine, sibutramine, tetrahydrolipostatin, ephedrine, caffeine… Để tăng hiệu quả sử dụng, một số thuốc có phối hợp nhiều hơn một dƣợc chất nhƣ ephedrine kết hợp caffeine [30]. Năm 1997, cơ quan quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa kỳ đã phê duyệt sibutramine sử dụng để điều trị bệnh béo phì, hiện nay sibutramine là một loại thuốc đƣợc khuyên dùng để giúp những ngƣời béo phì giảm cân [16]. Các thử nghiệm 7
kiểm soát ở bệnh nhân béo phì đã cho thấy hàm lƣợng tối ƣu cho mỗi ngày là 10-15 mg, đƣợc duy trì khoảng 12 tháng [30]. Sau khi ngƣời và động vật uống sibutramine, sibutramine sẽ chuyển hóa thành N-desmethyl sibutramine và N-didesmethyl sibutramine. Tác dụng dƣợc lý đƣợc gây ra bởi sibutramine chính là do hai chất chuyển hóa này. Trong trƣờng hợp quá liều, sibutramine sẽ gây ra một số tác dụng phụ nghiêm trọng bao gồm buồn nôn, khô miệng, tức ngực, suy gan [16]. Thực phẩm bổ sung (thực phẩm chức năng, thực phẩm bảo vệ sức khỏe) là một sản phẩm đƣợc bổ sung thêm vào khẩu phần ăn uống. Các thành phần của thực phẩm bổ sung bao gồm: vitamin, khoáng chất, thảo dƣợc hoặc các thành phần khác nhƣ axit amin, các enzyme hỗ trợ quá trình chuyển hóa chất [16]. Tập luyện kết hợp với sử dụng thực phẩm bổ sung là sự lựa chọn của nhiều bệnh nhân mắc bệnh thừa cân, béo phì. Hiện nay, thực phẩm bổ sung đƣợc bán rộng rãi thông qua nhiều kênh phân phối nhƣ quầy thuốc, hiệu thuốc, siêu thị, các cửa hàng thảo dƣợc và đặc biệt qua kênh phân phối internet. Các sản phẩm thực phẩm bổ sung đƣợc quảng cáo có nguồn gốc từ các thảo dƣợc tự nhiên, có tác dụng giảm cân an toàn. Với một thị trƣờng rất rộng lớn và dễ tiếp cận, vấn đề pha trộn các tân dƣợc không an toàn ngày càng tăng [8, 10, 43], bởi vì thực phẩm bổ sung không trải qua quá trình kiểm tra nghiêm ngặt nhƣ thuốc. Các thành phần đƣợc mô tả trên nhãn chỉ dựa trên công bố của nhà sản xuất. Việc bổ sung sibutramine trái phép gần đây đã đƣợc phát hiện trong nhiều loại thực phẩm bảo vệ sức khỏe, ảnh hƣởng nghiêm trọng sức khỏe ngƣời tiêu dùng [6, 39, 41]. Vào năm 2010, sibutramine đã bị rút khỏi thị trƣờng Châu Âu (Cơ quan Dƣợc phẩm Châu Âu 2010) và Hoa Kỳ (FDA 2010) vì tỷ lệ rủi ro cao và khả năng gây ra các biến chứng tim mạch hoặc đột quỵ. Ngày 14/4/2011 Cục quản lý Dƣợc - Bộ Y Tế đã ban hành Quyết định số: 120/QĐ-QLD về việc rút số đăng ký của thuốc do phản ứng có hại, theo đó tất cả các thuốc có chứa hoạt chất sibutramine ra khỏi danh mục các loại thuốc đƣợc cấp số đăng ký thông hành trên thị trƣờng Việt Nam. 8
1.3. Phƣơng pháp xác định SB, DSB và DDSB 1.3.1. Một số kỹ thuật xử lý mẫu Thực phẩm bổ sung là sản phẩm mà trong đó có chứa thêm thành phần bổ sung, phần bổ sung này đa dạng có thể là vitamin, khoáng, thảo dƣợc, amino acid, enzyme, chất chuyển hóa...[16]. Xác định đƣợc sibutramine và dẫn xuất của SB trong nền thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân cũng gặp khó khăn vì nền mẫu phức tạp. Mục tiêu của quá trình xử lý mẫu là chiết chọn lọc chất phân tích, loại bớt tạp để giảm ảnh hƣởng của tạp đối với thiết bị phân tích. Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu đã đƣợc sử dụng bao gồm chiết bằng dung môi, lọc dịch chiết bằng màng lọc có kích thƣớc lỗ lọc nhỏ, chiết pha rắn, chiết QuEChERS. 1.3.1.1. Chiết bằng dung môi Peng Zou và các cộng sự đã xây dựng thành công phƣơng pháp phát hiện sibutramine, 2 chất chuyển hóa của sibutramine và một chất tƣơng tự sibutramine trong mẫu thảo dƣợc hỗ trợ giảm cân bằng phƣơng pháp LC-MS-TOF, trong đó tác giả đã xử lý mẫu bằng cách cân 1 gam mẫu, chiết bằng 10 mL dung môi methanol, siêu âm 30 phút, dịch chiết thu đƣợc sẽ đƣợc lọc qua màng lọc và đƣợc bơm vào hệ thống sắc ký lỏng khối phổ. Đây là bài báo đầu tiên nghiên cứu phát hiện đƣợc 2 chất chuyển hóa của sibutramine và một chất mới tƣơng tự sibutramine trong sản phẩm thảo dƣợc bằng phƣơng pháp LC/MS/MS [44]. Ziqiang Huang và cộng sự cũng xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời sibutramine và N-didesmethyl sibutramine trong thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân bằng phƣơng pháp HPLC-ESI-MS. Để có thể xác định đƣợc SB và DSB, tác giả đã chuẩn bị dung dịch mẫu bằng cách cân 0,5 gam mẫu rắn đã đƣợc đồng nhất và chiết bằng MeOH, siêu âm 10 phút. Sau khi lọc, dung dịch mẫu đƣợc pha loãng thành 10 mL với MeOH, 5 µL dung dịch mẫu đƣợc bơm vào hệ thống HPLC, độ thu hồi của 2 chất nằm trong khoảng 93,3 – 106,7% [16]. Methanol là dung môi đang đƣợc sử dụng phổ biến để chiết SB và dẫn xuất của SB, tuy nhiên nếu nền mẫu thực phẩm bổ sung có thêm một số chất màu thì việc loại bỏ các tạp này là không thực hiện đƣợc. 9
1.3.1.2. Chiết và loại tạp bằng phương pháp chiết pha rắn Một trong những phƣơng pháp chiết đang đƣợc phát triển để nhận biết các tân dƣợc là phƣơng pháp chiết pha rắn. Dung dịch thu đƣợc sau chiết pha rắn có thể đƣợc bơm thẳng vào hệ thống sắc ký lỏng. Kỹ thuật chiết pha rắn SPE – HLB đã đƣợc Tarita Kamardi và cộng sự xây dựng để nhận dạng sibutramine HCl trong thuốc truyền thống bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng. acid phosphoric 3% đƣợc lựa chọn làm dung môi chiết sibutramine HCl ra khỏi nền mẫu thuốc. Sau khi lắc 30 phút và lọc, dung dịch chiết đƣợc làm sạch bằng cột chiết pha rắn SPE (cột đƣợc hoạt hóa bằng ethanol và nƣớc). Rửa tạp bằng ammoni hydroxide trong ethanol 80%, chất phân tích đƣợc rửa giải bằng Acetonitril. Độ thu hồi của phƣơng pháp thu đƣợc là 38,0 – 45,0 % [40]. Trong nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp nhanh và nhạy để xác định chất chuyển hóa của sibutramine trong huyết thanh ngƣời bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng pha đảo ghép nối khối phổ, Jignesh Bhatt và cộng sự cũng sử dụng phƣơng pháp chiết pha rắn, rút ngắn quá trình xử lý mẫu. Hút chính xác 0,5 mL dịch huyết thanh có chứa DSB, DDSB, thêm nội chuẩn imipramine nồng độ 40 ng/mL, lắc voltex. Mẫu sau đó đƣợc acid hóa bằng acid phosphoric 10%. Hỗn hợp mẫu đƣợc nạp lên cột SPE - HLB đã đƣợc hoạt hóa bằng 1,0 mL MeOH và 2,0 mL nƣớc. Rửa tạp bằng nƣớc, MeOH 30%/ H2O. Chất phân tích đƣợc rửa giải bằng 0,8 mL Acetonitrile và đƣợc phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ. Kết quả độ thu hồi của DSB và DDSB tƣơng ứng là 93,5% và 77,9% [7]. 1.3.1.3. Kỹ thuật QuEChERS Trong nghiên cứu của Juanhui Li và cộng sự, tuy tác giả không áp dụng phƣơng pháp chiết QuEChERS làm sạch mẫu để phân tích sibutramine và dẫn xuất của sibutramine trong nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân, nhƣng tác giả đã sử dụng phƣơng pháp chiết này để phân tích đƣợc 14 chất thuộc nhóm β- agonist cũng trong nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng UHPLC kết nối khối phổ. Mẫu đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: Cân chính xác một lƣợng mẫu vào ống ly tâm, thêm 3 mL nƣớc, lắc voltex 30 giây, thêm 10 mL ACN, lắc tay 30 giây, thêm 2,0 gam MgSO4 (magie sulfate), 1,0 gam NaCl (natri clorua) lắc mạnh 1 phút. Dịch chiết sau ly tâm sẽ đƣợc làm sạch bằng 150 mg chất chất phụ có thêm 900 mg MgSO4. Kết quả 14 β-agonist đã đƣợc tách 10