Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tỷ lệ mang gene kháng nguyên bám dính F18 và tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa tại huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình

Chia sẻ: Xedapbietbay Xedapbietbay | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:71

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xác định tỷ lệ mang gene quy định kháng nguyên bám dính F18 tạo nguồn nguyên liệu cho nhiều hướng ứng dụng khác; Xác định khả năng kháng và mẫn cảm với một số kháng sinh của chủng vi khuẩn phân lập được. Từ đó, đề xuất loại kháng sinh điều trị hiệu quả cho lợn con mắc bệnh tiêu chảy tại huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tỷ lệ mang gene kháng nguyên bám dính F18 và tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa tại huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện cùng với sự giúp đỡ của TS. Lê Văn Phước, TS. Nguyễn Xuân Hòa ở Trường Đại học Nông Lâm Huế. Các số liệu, hình ảnh và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Trần Quang Trung PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của nhiều tổ chức, cá nhân. Nhân dịp này, tôi xin trân trọng cảm ơn: Ban Giám hiệu, quý thầy cô Khoa Chăn nuôi - Thú y, Phòng Đào tạo sau đại học của Trường Đại học Nông - Lâm Huế đã giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu khoa học. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Lê Văn Phước, người thầy đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn. Lãnh đạo Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, lãnh đạoTrung tâm Giống vật nuôi Quảng Bình, Trạm Thú y huyện Bố Trạch, Phòng xét nghiệm Vi trùng – Truyền nhiễm của Khoa Chăn nuôi Thú y đã cho phép, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu này. Các anh chị em đồng nghiệp, gia đình, bạn bè đã chia sẻ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Huế, tháng … năm 2016 Tác giả luận văn Trần Quang Trung PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iii TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện trên 123 mẫu phân tiêu chảy thuộc đối tượng lợn con sau cai sữa nuôi ở địa bàn huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình, nhằm xác định tỷ lệ mẫu dương tính, đặc tính hình thái, tính chất nuôi cấy, tỷ lệ mang gene kháng nguyên bám dính F18 và xác định mức độ mẫn cảm, kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên lợn con sau cai sữa. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mẫu phân tiêu chảy dương tính với vi khuẩn E. coli là 85,37%. Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái, tính chất nuôi cấy có đặc điểm chung, rất điển hình của vi khuẩn E. coli như các tài liệu mà các tác giả trong và ngoài nước đã công bố. Kết quả tỷ lệ mẫu phân lợn con sau cai sữa bị bệnh tiêu chảy mang gene quy định kháng nguyên bám dính F18 là 19,05%. Bằng phương pháp kháng sinh đồ, xác định mức độ kháng hoàn toàn (100%) là các kháng sinh Streptomycin, Gentamycine, Sulfamethoxazoll/Trimethoprim, Tetracyline, có tỷ lệ kháng cao như hai loại kháng sinh Cefotaxime và Kanamycine (75%), Rofampin (50%), mức độ mẫn cảm cao nhất là kháng sinh Colistin (75%). Khi điều trị thực nghiệm tại cơ sở, tỷ lệ điều trị lành bệnh lợn bị tiêu chảy bằng kháng sinh Colistin trong 3 ngày là 76,82%. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................ii TÓM TẮT...................................................................................................................... iii MỤC LỤC ...................................................................................................................... iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .........................................................vii DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. ix MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1 2. Mục đích của đề tài ...................................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ..................................................................................... 2 1) Ý nghĩa khoa học ........................................................................................................ 2 2) Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................................... 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ................................................................. 4 1.1. VI KHUẨN E. COLI ................................................................................................ 4 1.1.1. Đặc tính hình thái .................................................................................................. 4 1.1.2. Đặc tính nuôi cấy ................................................................................................... 4 1.1.3. Đặc tính sinh hóa ................................................................................................... 5 1.1.4. Sức đề kháng ......................................................................................................... 5 1.1.5. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli ......................................................... 6 1.2. CÁC YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA E. COLI ............................................................ 7 1.2.1. Yếu tố bám dính của E. coli .................................................................................. 8 1.2.2. Yếu tố xâm nhập của E. coli .................................................................................. 9 1.2.3. Yếu tố dung huyết (Hly) của E. coli ...................................................................... 9 1.2.4. Yếu tố kháng khuẩn Colicin V của E. coli (ColV) .............................................. 10 1.2.5. Tính kháng thuốc kháng sinh của E. coli ............................................................ 10 1.2.6. Độc tố của E. coli ................................................................................................ 12 1.3. BỆNH DO VI KHUẨN E. COLI GÂY RA Ở LỢN.............................................. 14 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
v 1.3.1. Điều kiện xuất hiện bệnh ..................................................................................... 14 1.3.2. Cơ chế sinh bệnh ................................................................................................. 14 1.3.3. Triệu chứng của bệnh .......................................................................................... 15 1.3.4. Bệnh tích .............................................................................................................. 16 1.3.5. Chẩn đoán ............................................................................................................ 17 1.3.6. Phòng bệnh .......................................................................................................... 18 1.3.7. Điều trị ................................................................................................................. 18 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH TIÊU CHẢY DO E. COLI ......................... 19 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................................ 19 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................................ 20 1.5. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH TRÊN ĐÀN LỢN Ở HUYỆN BỐ TRẠCH .............. 21 1.5.1. Một số đặc điểm tự nhiên của huyện Bố Trạch ................................................... 21 1.5.2. Tình hình dịch bệnh trên đàn lợn......................................................................... 22 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 23 2.1. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU ............................................................. 23 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 23 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................. 23 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................................. 23 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 23 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu .............................................................. 25 2.3.2. Phân lập vi khuẩn ................................................................................................ 25 2.3.3. Giám định các đặc tính sinh vật và hóa học của vi khuẩn E. coli ....................... 26 2.3.4. Phương pháp xác định gene sản sinh kháng nguyên bám dính F18 .................... 27 2.3.5. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm của chủng E. coli phân lập được đối với một số loại kháng sinh thường dùng ....................................................................... 29 2.3.6. Thử nghiệm phác đồ điều trị cho lợn bị tiêu chảy ............................................... 30 2.4. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................................................... 30 2.4.1. Mẫu thí nghiệm.................................................................................................... 30 2.4.2. Dụng cụ, trang thiết bị phòng thí nghiệm ............................................................ 30 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vi 2.4.3. Môi trường, dung dịch, hóa chất ......................................................................... 30 2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ...................................................................... 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................................... 34 3.1. TỶ LỆ MẪU DƯƠNG TÍNH VỚI VI KHUẨN E. COLI ..................................... 34 3.2. KẾT QUẢ KIỂM TRA HÌNH THÁI, ĐẶC TÍNH NUÔI CẤY ........................... 36 3.3. KẾT QUẢ KIỂM TRA ĐẶC TÍNH SINH VẬT VÀ HÓA HỌC ......................... 38 3.4. KẾT QUẢ KIỂM TRA KHẢ NĂNG DUNG HUYẾT ......................................... 41 3.5. TỶ LỆ MANG GENE KHÁNG NGUYÊN BÁM DÍNH F18 .............................. 42 3.6. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ MẪN CẢM KHÁNG SINH ........................... 44 3.7. KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM ............................................................... 46 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 49 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................ 49 4.2. ĐỀ NGHỊ ................................................................................................................ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 50 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT (-): Âm tính (+): Dương tính NCCLS: Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm (tên mới CLSI). TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam. E. coli: Escherichia coli. ETEC: Enterotoxigenic E. coli. EPEC: Enteropathogenic E. coli. EIEC: Enteroinvasive E. coli. EMB: Eosin Methyl Blue. MR: Methyl Red. VP: Voges Proskauer. EHEC: Enterohemorhagic E. coli. VIEC: Vectoytotoxin-producing E. coli. KIA: Kligler – Ion – Agar. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli. (TCVN 8400-16:2011) .................... 5 Bảng 2.1. Các cặp mồi và trình tự các cặp mồi ............................................................. 28 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR đơn với các cặp mồi F18 .................................. 28 Bảng 2.3. Chương trình chạy PCR đơn với các cặp mồi F18 ....................................... 29 Bảng 3.4. Trích bảng tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh (NCCLS – 2007) ............................................................................................................ 29 Bảng 3.1. Tỷ lệ mẫu dương tính với vi khuẩn E. coli. .................................................. 34 Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả sinh hóa ............................................................................ 39 Bảng 3.3. Kết quả xác định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli phân lập được ... 39 Bảng 3.4. Tỷ lệ dung huyết của vi khuẩn E. coli .......................................................... 41 Bảng 3.5. Tỷ lệ mẫu bệnh phẩm phân lợn con bị bệnh tiêu chảy mang gene quy định kháng nguyên bám dính F18 ......................................................................................... 43 Bảng 3.6. Kết quả xác định tính mẫn cảm với một số kháng sinh ................................ 45 Bảng 3.7. Kết quả điều trị thực nghiệm......................................................................... 47 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Lợn bị bệnh tiêu chảy ................................................................................... 16 Hình 3.1. Lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy.................................................................... 35 Hình 3.2. Phân lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy. ........................................................... 36 Hình 3.3. Vi khuẩn E. coli tăng sinh trong môi trường EMB lỏng ............................... 36 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc E. coli trên môi trường EMB agar ................................ 37 Hình 3.5. Vi khuẩn được cấy trong môi trường nước thịt ............................................. 37 Hình 3.6. Hình thái vi khuẩn E. coli sau khi nhuộm Gram ........................................... 38 Hình 3.7a. Đối chứng âm tính chất sinh hóa ................................................................. 38 Hình 3.7b. Kết quả xác định tính chất sinh hóa ............................................................ 40 Hình 3.8. Khả năng dung huyết của vi khuẩn E. coli phân lập được ............................ 42 Hình 3.9. Sản phẩm PCR của gene mã hóa kháng nguyên bám dính F18 .................... 43 Hình 3.10. Kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli. ........................... 45 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển về kinh tế và mức sống của người dân ngày một nâng cao thì nhu cầu về thực phẩm sạch càng lớn. Bên cạnh đó, cùng với sự hội nhập sâu rộng là sự cạnh tranh với các nước có trình độ chăn nuôi và quản lý chăn nuôi tiên tiến là một thách thức lớn đối với ngành chăn nuôi và công tác thú y ở nước ta. Đòi hỏi ngành chăn nuôi có những bước chuyển dịch mạnh mẽ về giống và chất lượng giống. Công tác thú y cần kiểm soát chặt chẽ hơn các chất cấm, kháng sinh, đảm bảo an toàn dịch bệnh cho vật nuôi, nhất là chăn nuôi lợn để tạo nên sản phẩm sạch, chất lượng, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu (Chỉ thị số 7285/CT-BNN-CN, 2015). Hiện nay, chăn nuôi lợn là ngành phát triển hơn cả. Tuy nhiên, chăn nuôi lợn còn nhiều vấn đề nan giải mà nổi lên là tình hình dịch bệnh và sử dụng thuốc trong điều trị bệnh tại các cơ sở chăn nuôi. Trong đó, bệnh tiêu chảy do Escherichia coli (E. coli) gây ra là phổ biến và gây thiệt hại kinh tế đáng kể. Theo mô tả của Nguyễn Xuân Hòa và cs (2009), bệnh làm giảm năng suất, chất lượng đàn vật nuôi vì bệnh xảy ra ở tất cả các giống lợn, ở mọi lứa tuổi và thường xuất hiện khi thời tiết thay đổi đột ngột, thức ăn kém phẩm chất, chăm sóc nuôi dưỡng không đảm bảo,… Nhiều kết quả của các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đã tìm ra nguyên nhân chính của bệnh tiêu chảy ở lợn là do các vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh độc tố đường ruột (Enterotoxigenic E. coli-ETEC). Vi khuẩn E. coli tham gia vào quá trình gây bệnh nhờ hai yếu tố độc lực chủ yếu: khả năng bám dính vào các tế bào niêm mạc ruột nhờ các kháng nguyên bám dính có trên bề mặt của vi khuẩn như F4, F5, F6, F18 và khả năng sản sinh một hay nhiều độc tố đường ruột, bao gồm độc tố bền nhiệt và độc tố không bền nhiệt (Nagy và cs, 1999, Nguyễn Xuân Hòa, 2013). Các chủng vi khuẩn ETEC gây bệnh tiêu chảy ở lợn con thường xuyên mang yếu tố bám dính F4 và F18 và sản sinh hai loại độc tố phổ biến là STb và EAST1 ở nhiều nước trên thế giới. Tương tự, các nghiên cứu ở miền Bắc, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên Việt Nam cũng thường xuyên phát hiện được yếu tố bám dính F4, F18 và độc tố STb (Võ Thành Thìn và cs, 2011). Quảng Bình là tỉnh thuộc vùng duyên hải Miền Trung, ngành chăn nuôi lợn đã có những bước chuyển dịch mạnh mẽ, nhưng vẫn thuộc tỉnh có quy mô tổng đàn nhỏ. Song, ở đây nghề chăn nuôi lợn ảnh hưởng khá lớn đến đời sống, thu nhập của người dân. Qua thực tế trong công tác và tìm hiểu tại các trang trại, gia trại, hộ chăn PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2 nuôi lợn, thú y cơ sở trên địa bàn huyện Bố Trạch thì bệnh tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa khá phổ biến và thường xuyên xảy ra. Bệnh có triệu chứng tiêu chảy, phân vàng nâu, lông xù, vận động khó khăn, mí mắt sưng, mủ gèn, tỷ lệ chết khá cao (Phạm Hồng Sơn, 2005). Việc sử dụng kháng sinh để điều trị còn tùy tiện, dùng kháng sinh này không lành thì đổi kháng sinh khác hoặc tăng liều lượng lên theo tư duy cá nhân, cách làm đó không đúng khoa học, tốn kém và còn gây nguy hiểm về sau cho sức khỏe con người. Thực tế ở Quảng Bình có nhiều nhà nghiên cứu về tình hình bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra, các nghiên cứu tập trung ở mức độ tổng thể toàn tỉnh (Nguyễn Văn Chào và Hồ Trung Thông, 2014), chưa có nghiên cứu nào xác định tỷ lệ các gene bám dính và gene độc tố cụ thể có trong các chủng E. coli đang lưu hành. Vì vậy, việc nghiên cứu xác định tỷ lệ các gene mang kháng nguyên bám dính và kháng nguyên sản sinh độc tố gây tiêu chảy của chủng vi khuẩn E. coli trên địa bàn huyện Bố Trạch để làm nguyên liệu cho ứng dụng sản xuất vacxin, thuốc thú y. Đồng thời, tìm ra loại kháng sinh phù hợp để điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn là rất cần thiết. Xuất phát từ cơ sở lý luận, yêu cầu thực tiễn trên và khả năng cho phép, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tỷ lệ mang gene kháng nguyên bám dính F18 và tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa tại huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình”. 2. Mục đích của đề tài - Phân lập và giám định đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn E. coli từ mẫu phân lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy; - Xác định tỷ lệ mang gene quy định kháng nguyên bám dính F18 tạo nguồn nguyên liệu cho nhiều hướng ứng dụng khác; - Xác định khả năng kháng và mẫn cảm với một số kháng sinh của chủng vi khuẩn phân lập được. Từ đó, đề xuất loại kháng sinh điều trị hiệu quả cho lợn con mắc bệnh tiêu chảy tại huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1) Ý nghĩa khoa học - Xác định sự có mặt của gene sản sinh kháng nguyên bám dính F18 của vi khuẩn E. coli phân lập trên địa bàn huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình. - Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu chứng minh được tính khả thi của nguyên lý phòng trị bệnh do E. coli trong hội chứng tiêu chảy bằng cách sử dụng kháng sinh. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
3 2) Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu đưa ra phác đồ điều trị có hiệu quả, giúp cho thú y cơ sở, các trang trại, hộ chăn nuôi thực hiện phòng, trị hội chứng tiêu chảy cho lợn, góp phần giảm thiệt hại và tăng thu nhập trong chăn nuôi lợn. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. VI KHUẨN E. COLI 1.1.1. Đặc tính hình thái Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia, loài Escherichia coli. E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước 2 – 3µm x 0,5µm, hai đầu tròn. Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong môi trường nuôi cấy có khi quan sát thấy những trực khuẩn dài 4 - 8µm và thường gặp trong canh khuẩn già. Phần lớn vi khuẩn E. coli có khả năng di động do có lông roi và lông xung quanh thân. Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu, không sinh nha bào và có thể có giáp mô (Phạm Hồng Sơn, 2005; Nguyễn Như Thanh và cs, 1997). 1.1.2. Đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng ở phổ nhiệt độ khá rộng (5 - 400C), nhiệt độ thích hợp là 370C và cũng thích hợp với pH từ 7,2 - 7,4. Vi khuẩn E. coli dể dàng phát triển được trên môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển ở môi trường tổng hợp nên người ta chọn chúng để nghiên cứu về sinh vật học. Để phân lập thường nuôi cấy khởi đầu trên môi trường tuyển lựa như môi trường Istrati, MacConkey, Endo, desoxycholate,.. Trên môi trường thạch thường, ở 35 – 370C, sau 12 - 18 giờ hình thành khuẩn lạc tròn, lồi, không trong suốt, bóng láng. Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả khuẩn lạc dạng R (Rough) và dạng M (Mucous). Trên môi trường thạch máu, sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, đa số chủng không gây dung huyết, nhưng cũng có chủng dung huyết. Trên môi trường nước thịt, sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn phát triển rất nhanh, môi trường đục, có cặn màu tro trắng lắng xuống, đôi khi có váng xám nhạt trên mặt môi trường. Trên môi trường Mac Conkey, sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, khuẩn lạc có màu cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997). PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
5 Trên môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc màu tím đen, có ánh kim. Trên môi trường thạch SS: E. coli phát triển thành các khuẩn lạc có màu đỏ. Trên môi trường thạch Brilliant Green Agar: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc dạng S (Smooth), màu vàng chanh. Trên môi trường Endo: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, có hoặc không có ánh kim. 1.1.3. Đặc tính sinh hóa E. coli có phản ứng indol dương tính, methyl red (MR) dương tính, Voges Proskauer (VP) âm tính, phản ứng sử dụng citrate âm tính, phản ứng sinh H2S âm tính, di động dương tính, lysine decarboxylase dương tính, lên men lactose và mannit (Phạm Hồng Sơn, 2002). Phản ứng lên men đường: Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi các loại đường Lactose, Fructose, Glucose, Levulose, Galactose, Xylose, Manitol. Hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli đều lên men đường Lactose nhanh và sinh hơi. Bảng 1.1. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli. (TCVN 8400-16:2011) Khả năng sử dụng citrat Vogesr Proskauer Sinh indol Đỏ metyl Manitol Sucrose Lactose Indol Urê H2 S Vi khuẩn E. coli + + - + - + + + - - Chú thích: (+) dương tính, (-) âm tính. 1.1.4. Sức đề kháng Cũng như các loại vi khuẩn không sinh nha bào khác, E. coli không chịu được nhiệt độ, đun 500C trong 1 giờ, 600C trong 30 phút, và 1000C vi khuẩn chết ngay. Các chất sát trùng thông thường: axít phenic, biclorua thuỷ ngân, formol (0,2%) diệt vi khuẩn sau 5 phút. Ở môi trường bên ngoài các chủng E. coli độc tố PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
6 có thể tồn tại đến 4 tháng. Vi khuẩn E. coli có khả năng đề kháng với sự sấy khô và hun khói (Đào Trọng Đạt và cs, 1995). Trong đất và nước E. coli sống được khoảng vài tháng. Chúng có độ nhạy cảm cao với nhiều loại kháng sinh (Đào Trọng Đạt và cs, 2000). 1.1.5. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia súc rất đa dạng và phức tạp với 4 nhóm kháng nguyên chính là các kháng nguyên O (kháng nguyên thân) chịu nhiệt, kháng nguyên H (kháng nguyên lông) không chịu nhiệt, kháng nguyên K (kháng nguyên giáp mô) và kháng nguyên F (kháng nguyên bám dính) chịu nhiệt ở mức độ trung gian. Sự đa dạng về tính kháng nguyên này gây rất nhiều khó khăn cho công tác phòng chống bệnh trên gia súc (Phạm Hồng Sơn, 2002). Kháng nguyên O (xuất phát từ chữ Ohne Hauch - không có màng hơi) là các hợp chất lipopolysaccharide có trong thành phần vách tế bào, là chất gây sốt rất độc đối với động vật, chịu nhiệt (100 0C, hơn 2 giờ), không bị ethanol 50% phá hủy nhưng bị formol 0,5% làm biến tính. Các kháng nguyên thân đều nằm trên bề mặt nên có thể tiếp xúc với hệ thống miễn dịch của cơ thể động vật trừ một số trường hợp bị kháng nguyên bề mặt che lấp. Khi trộn kháng nguyên thân với kháng thể tương ứng thì xuất hiện phản ứng ngưng kết gọi là ngưng kết O: thân tế bào vi khuẩn dính với nhau, hình thành những hạt nhỏ lắc rất khó tan, huyền dịch vi khuẩn trong. Kháng nguyên H (xuất phát từ chữ Hauch - màng hơi) là những phân tử protein flagellin gần giống myosin trong cơ của động vật, không chịu nhiệt, dễ bị ethanol 50% và enzyme proteinase phá hủy, nhưng bảo tồn trong formol 0,5%. Khi gặp kháng thể tương ứng, kháng nguyên H hình thành ngưng kết gọi là phản ứng lên bông do các tế bào vi khuẩn dính nhau gián tiếp qua các lông roi nên hình thành các khối nhỏ không bền, dễ vỡ khi lắc. Kháng nguyên K (xuất phát từ chữ Kapsule - vỏ bọc) là kháng nguyên bao bọc thân vi khuẩn. Tuy gọi là kháng nguyên vỏ bọc nhưng về mặt hình thái học lại có nguồn gốc từ những hợp chất có trên bề mặt tế bào chứ không phải trong thành phần của vỏ nhầy. Điều đáng chú ý là những kháng nguyên này ức chế phản ứng ngưng kết O rất mạnh, vì vậy khi thí nghiệm với các kháng thể O phải rất lưu ý. Hiện nay, người ta phát hiện được rằng bản chất của nhiều kháng nguyên K là các sợi lông nhung (hay Fimbria) có thuộc tính giúp vi khuẩn bám dính nên người ta gọi các kháng nguyên nhóm này là kháng nguyên F (F antigen, từ chữ Fimbria – lông nhung), là kháng nguyên bám dính hay yếu tố bám dính (Adhesin), vì vậy xuất hiện các ký hiệu F1, F2,… (Phạm Hồng Sơn, 2013). PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
7 Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae - kháng nguyên bám dính): Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính. Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính. Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày để xâm nhập và gây bệnh, đồng thời chống lại khả năng đào thải vi khuẩn của nhu động ruột. Một số loại kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC (Enteroxigenic E. coli) gây bệnh chủ yếu cho lợn là F4, F18 và F41 (Carter G. R và cs,1995). Võ Thành Thìn và cs (2011) cũng đã tách chiết thành công kháng nguyên bám dính F4, F18 từ chủng vi khuẩn E. coli GIS26 và F107/86 bằng phương pháp phá vỡ cơ học kết hợp với ly tâm và kết tủa. Tác giả cho thấy nồng độ kháng nguyên sau chiết tách đạt 0,68 mg/ml (kháng nguyên F4) và 0,46 mg/ml (kháng nguyên F18). Điện di sản phẩm trên thạch SDS - polyacrylamide cho thấy chỉ có 1 vạch với trọng lượng phân tử 26 kDa đối với kháng nguyên F4 và 1 vạch với 15 kDa đối với kháng nguyên F18. 1.2. CÁC YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA E. COLI Các nhân tố gây bệnh ở vi khuẩn họ này gồm có tính kết bám (adhesiveness) hay bám dính vào niêm mạc ký chủ, khả năng xâm nhập (invasiveness), khả năng sản sinh các độc tố ruột, độc tố gây chết, khả năng dung huyết, khả năng kháng khuẩn. Những đặc tính này hoặc bị chi phối bởi các gene trên nhiễm sắc thể vi khuẩn hoặc bởi các plasmid và thực khuẩn thể (bacteriophage). Các chủng vi khuẩn E. coli không có các yếu tố trên thì không có khả năng gây bệnh. Dựa vào các yếu tố gây bệnh nói trên, người ta đã phân loại vi khuẩn E. coli thành các loại sau (Phạm Hồng Sơn, 2005). E. coli gây bệnh nguyên đường ruột (enteropathogenic E. coli - EPEC) thuộc vào một nhóm huyết thanh học riêng biệt, có tính kết bám (bám dính). E. coli xâm lấn đường ruột (enteroinvasive E. coli - EIEC) có khả năng xâm nhập đường ruột, do plasmid chi phối. E. coli độc tố nguyên đường ruột (enterotoxigenic E. coli - ETEC) có năng lực hình thành các kháng nguyên lông F2 (tên cũ CFA/I), F3 (CFA/II), F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) và các độc tố ruột (enterotoxin) do plasmid chi phối. E. coli sinh độc tố tế bào vero (verocytotoxin - producing E. coli - VTEC) hay E. coli xuất huyết ruột (enterohemorrhagic E. coli - EHEC) có năng lực sản sinh độc tố vero gây độc tế bào do bacteriophage chi phối. Tất cả các vi khuẩn trên đều gây bệnh cục bộ. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
8 Ngoài ra, đôi khi E. coli xâm nhập kết bám và phát bệnh ở các cơ quan khác nhau ngoài đường ruột (Phạm Hồng Sơn, 2005). Trong đó, các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC và VTEC thường gây bệnh tiêu chảy cho lợn con sơ sinh và lợn sau cai sữa (Fairbrother J. M, 1992). 1.2.1. Yếu tố bám dính của E. coli Là một trong những yếu tố quan trọng của vi khuẩn đường ruột, giúp vi khuẩn bám được vào tế bào vật chủ, yếu tố bám dính còn gọi là kháng nguyên bám dính. Khi vi khuẩn cư trú trong đường tiêu hóa, trong quá trình di động xảy ra hiện tượng tiếp xúc giữa vi khuẩn và tế bào nhung mao ruột. Sự tiếp xúc này là tình cờ và ngẫu nhiên, nếu gặp điều kiện thuận lợi trên bề mặt tế bào niêm mạc ruột thì sự tiếp xúc này sẽ tăng tính bền vững và vi khuẩn sẽ ở lại lâu trong lớp nhày. Tiếp theo là sự tiếp xúc và sự hấp phụ của vi khuẩn lên bề mặt niêm mạc ruột và yếu tố bám dính (Fimbriae typ I) của vi khuẩn sẽ bám vào điểm tiếp nhận của tế bào nhung mao. Quá trình bám dính của vi khuẩn lên tế bào nhung mao được thực hiện có sự phù hợp giữa cấu trúc phân tử điểm tiếp cận (Nagy B và cs, 1999). Trong trường hợp không thể bám dính vi khuẩn sẽ bị bài khứ khỏi tổ chức bởi lớp dày niêm dịch và thể dịch. Sau khi bám dính, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc nhỏ và bắt đầu giai đoạn tiếp theo của quá trình cảm nhiễm. Trên bề mặt của tế bào cũng như bề mặt vi khuẩn có những phân tử bề mặt phản ứng tương bổ một cách đặc hiệu (Phạm Hồng Sơn, 2005). Chủng ETEC đều có mang 1 hoặc nhiều yếu tố bám dính như F4(K88), F5(K99), F6(K987p), F17, F18, F41, F42 và F165. Ở lợn, thường mang các yếu tố bám dính sau: Kháng nguyên bám dính F4: (K88) là một kháng nguyên không chịu nhiệt, bằng việc sử dụng các kháng huyết thanh đặc hiệu, Orskov và cs (1964) đã phân biệt được hai loại khác nhau của F4 là F4ab và F4ac. Loại thứ ba được Guinee và cs (1979) phát hiện và đặt tên là F4ad. Sợi F4 giúp cho vi khuẩn bám được vào receptor tương ứng của nó trên tế bào biểu mô của lông nhung ruột non, từ đó vi khuẩn có thể xâm nhập cố định và phát triển được ở thành ruột non. Yếu tố bám dính F4 thường gây bệnh tiêu chảy ở lợn trước và sau cai sửa (Nagy và cs, 1999). Kháng nguyên bám dính F5: (K99) cũng là kháng nguyên không chịu nhiệt, số lượng phân lập từ lợn bị tiêu chảy tỷ lệ rất thấp (Links và cs, 1985). Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như tốc độ sinh trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt độ và alanine trong môi trường. Các gene mã hóa cho sự tổng hợp F5 nằm trên DNA của plasmid (Isaacson, 1977). PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
9 Kháng nguyên bám dính F6: (K987p) giúp vi khuẩn bám vào các receptor cấu tạo bới glycoprotein và glycolipid trên riểm trải của các tế bào biểu mô ruột để phân phối độc tố đường ruột tối đa đến vật chủ (Dean và cs, 1994). Kháng nguyên bám dính F18: là tên đặt cho nhân tố bám dính 8813, bởi vậy một fimbriae mới đã được đề nghị công nhận là F18ab và F18ac (Rippinger và cs, 1995). Một nghiên cứu của Nagy và cs (1996) thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh học. F18ab ít thấy thể hiện ở cả trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm. Chúng thường thấy cùng với việc sản xuất SLT-2e ở các chủng VTEC, trong khi F18ac thể hiện rất rõ ở cả trong thực tế và trong phòng thí nghiệm, chúng mang đặc tính của chủng ETEC. Một đặc điểm đáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào tế bào vi nhung niêm mạc ruột của lợn sơ sinh trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm (Nagy và cs, 1992), cũng không tập trung ở lớp màng nhầy của ruột ở lợn con mới sinh (Casey và cs, 1992). Điều này ngược với F5, F6, chúng bám vào tế bào biểu mô niêm mạc ruột. Khả năng bám dính này ở lợn sau cai sửa nhiều hơn so với lợn sơ sinh. Lý do xác đáng để giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với khả năng bám dính của F18ab và F18ac theo tuổi của lợn vẫn chưa được làm rõ, nhưng có thể là do sự tăng dần các receptor đặc hiệu ở lông nhung của ruột lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Sự thiếu hụt các receptor của F18ab và F18ac ở lợn sơ sinh có thể giải thích cho lý do vì sao chỉ thấy ở các chủng VTEC và ETEC ở lợn sau cai sửa (Nagy và cs, 1999). 1.2.2. Yếu tố xâm nhập của E. coli Là một khái niệm dùng để chỉ quá trình chưa được xác định một cách rõ ràng, mà nhờ đó vi khuẩn E. coli qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy (mucosa) trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô (Epithel), đồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này. Trong khi đó, những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua được hàng rào này, sẽ bị giữ lại bởi tế bào đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc (Giannella R. A, 1976). Tính xâm nhập được chi phối bởi một gen duy nhất của nhiễm sắc thể và độc lập với những gen cần thiết cho việc phát huy tính gây bệnh của vi khuẩn do plasmid chi phối (Phạm Hồng Sơn, 2005). 1.2.3. Yếu tố dung huyết (Hly) của E. coli Vi khuẩn đường ruột phát triển trong tổ chức cơ quan, sắt được cung cấp cho sự dinh dưỡng phụ thuộc vào chất Siderophore do vi khuẩn sản sinh ra, chất này có khả năng phân huỷ sắt liên kết trong tổ chức vật chủ thông qua sự phá vỡ hồng cầu PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
10 giải phóng sắt dưới dạng hợp chất HEM để vi khuẩn sử dụng. Sự phân huỷ hồng cầu chủ yếu vẫn là do haemolysin của vi khuẩn đảm nhiệm, vì vậy việc sản sinh ra haemolysin gây dung huyết của vi khuẩn có thể coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn. Có bốn kiểu dung huyết của E. coli (α- haemolysin, β- haemolysin, γ- haemolysin và €- haemolysin ) nhưng quan trọng nhất là kiểu α và β. Kiểu β phá vỡ hồng cầu hoàn toàn do vậy hình thành một vòng sáng xung quanh khuẩn lạc trong suốt và rộng. Kiểu α phá vỡ hồng cầu không hoàn toàn do đó vòng dung huyết mờ nhạt hơn (Quinn P. J và cs, 1994 ). Một số tài liệu đã chứng minh được rằng mức độ gây chết của Heamolyzin trên chuột, trên phôi trứng, gây hoại tử trên da thỏ, trên tế bào sơ phôi gà, tế bào thận chuột. Khối lượng phân tử của heamolyzin khoảng 300.000 Dalton, được cấu tạo chủ yếu là protein và còn có cả hydratcacbon (Cavalieri S. J., Snyde I. S., 1982). Quá trình tổng hợp và giải phóng heamolyzin phải tiến hành đồng thời hai quá trình: Quá trình thứ nhất: Giải phóng Heamolyzin đã tổng hợp qua màng rồi tập hợp thành những túi nhỏ trong khoảng trống của màng cytoplasma ngoại vi, quá trình này cần năng lượng. Quá trình thứ hai: Xảy ra không cần năng lượng nhưng phụ thuộc vào nhiệt độ là quá trình giải phóng Heamolyzin qua màng. Theo Smith H. W., Halls S. (1967), các serotype E. coli gây bệnh cho lợn thường có khả năng sản sinh Heamolyzin, chủ yếu là các serotype kháng nguyên O như: O8, O138, O139, O141, O147. Tóm lại, đa số vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột cho lợn con theo mẹ đều có khả năng gây dung huyết, đặc tính này không bền vững khi nuôi cấy nhiều đời qua môi trường nhân tạo. 1.2.4. Yếu tố kháng khuẩn Colicin V của E. coli (ColV) Nhiều chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, gọi là ColicinV. Vì vậy, yếu tố này cũng được coi là một trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli (Smith H và cs, 1967). 1.2.5. Tính kháng thuốc kháng sinh của E. coli Sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh là một trong những biện pháp quan trọng nhất để làm giảm tỷ lệ chết ở gia súc. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, vi khuẩn có khả năng kháng lại với một hoặc nhiều loại kháng sinh, đặc biệt là đối PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
11 với những loại kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi và thú y (Pritchard M. N và cs, 2003). Việc sử dụng nhiều kháng sinh không những tạo áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn gây bệnh mà còn ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa, làm cho vi khuẩn trở nên đề kháng với kháng sinh. Cơ chế tác động của kháng sinh: Theo Phạm Hồng Sơn (2005), kháng sinh là những loại thuốc có khả năng ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật. Kháng sinh tác động vào các enzyme (bản chất là protein) làm nhiệm vụ xúc tác quá trình trao đổi chất của vi khuẩn, làm gián đoạn quá trình đó của vi khuẩn. Nói chung, mỗi loại kháng sinh tác động vào một hay vài loại vi khuẩn khác nhau và tác động một trong các cơ chế sau: Ngừng tổng hợp màng vi khuẩn: Các kháng sinh có tác dụng ngăn trở sự hình thành Murein (một thành phần cấu tạo của vi khuẩn) nên màng ngoài của vi khuẩn không được tổng hợp, điển hình gồm có kháng sinh: Penicilline, Cycloserin, Bacitrocin,... Tác động vào màng vi khuẩn làm rối loạn tính thấm hoặc phá vỡ màng tế bào: Các chất kháng sinh tác động làm thay đổi cấu trúc của màng tế bào vi khuẩn do đó quá trình trao đổi chất của vi khuẩn bị ức chế, điển hình gồm có: Polimycine, Nystatine... Làm rối loạn, ức chế quá trình tổng hợp protein: Một số kháng sinh trong nhóm này như tetracyclin phân bố các men tổng hợp protein hay ngăn trở sự dẫn truyền thông tin của DNA đến ribosome, làm ngăn trở quá trình tổng hợp protein. Đa số các loại kháng sinh còn lại đều gây rối loạn cơ chế hô hấp ở mức phân tử, tạo phức không tan với DNA làm tổn thương màng và các loại nucleotide, có khi làm rối loạn protein. Làm ức chế tổng hợp axit nucleic của nhân vi khuẩn: Kháng sinh tác động trực tiếp vào quá trình tổng hợp axit nucleic của nhân, tạo phức bền vững với ADN của vi khuẩn. Những kháng sinh này rất độc đối với cơ thể sống, chỉ sử dụng khi cần thiết. Phạm Khắc Hiếu và cs (1999) đã tìm thấy chủng E. coli kháng lại 11 loại kháng sinh, đồng thời chứng minh khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa E. coli và Salmonella qua plasmid. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma