Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Các định khả năng phân giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của người

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:98

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài "Các định khả năng phân giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của người" được tiến hành nhằm xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus và các đặc điểm probiotics của các chủng vi khuẩn này. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Các định khả năng phân giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của người

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lã Thị Lan Anh XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU HÓA CỦA NGƢỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lã Thị Lan Anh XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU HÓA CỦA NGƢỜI Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung Hà Nội - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài:“ Xác định khả năng phân giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của ngƣời” là do tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận hoàn toàn chính xác, trung thực. Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều đƣợc trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm và nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này! Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2020 Học viên Lã Thị Lan Anh
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu em đã đƣợc sự hƣớng dẫn và giúp đỡ rất nhiều của thầy cô và bạn bè để hoàn thành đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung - ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn nhiệt tình, giải đáp kịp thời các thắc mắc và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này. Em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới thầy giáo Đồng Văn Quyền, trƣờng phòng Vi sinh phân tử, các anh chị Vũ Thị Hiền,Trần Xuân Thạch, Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Hoa, Bùi Thị Dƣơng, Nguyễn Đình Duy trong phòng Vi sinh phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ em trong các thí nghiệm khi gặp những khó khăn và cũng truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý giá trong công tác nghiên cứu Sinh học. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất cả thầy cô giáo, giảng viên và cán bộ nhân viên Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp em có lƣợng kiến thức cơ bản nhất định để hoàn thành các môn học cũng nhƣ đề tài luận văn này. Xin cảm ơn gia đình đã động viên, là hậu phƣơng vững chắc giúp em có động lực học tập. Cuối cùng xin cảm ơn tất cả bạn bè đã bên cạnh, cùng nhau học tập và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ hoàn thành đề tài luận văn. Em xin chân thành cảm ơn! Học viên Lã Thị Lan Anh
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải thích chữ viết tắt WHO World Health Organization - Tổ chức y tế Thế giới LAB Vi khuẩn sinh axit lactic BSH Bile salts hydrolase- Enzym thủy phân muối mật S. aureus Staphylococcus aureus Realtime Polymerase Chain Reaction – phản ứng RT-PCR chuỗi polymerase thời gian thực Pox Pyruvate oxidase Lox Lactate oxidase Nox NADH oxidase SE Staphylococcal enterotoxin De novo Tổng hợp mới MRS De Man, Rogosa & Sharpe HRP Horseradish peroxidase TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbezidine SGC Sodium Glycocholate SGDC Sodium Glycodeoxycholate STC Sodium Taurocholate STDC Sodium Taurodeoxycholate
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Pha loãng H2O2 theo nồng độ khác nhau ........................................ 29 Bảng 2.2. Trình tự mồi sử dụng để khuếch đại các gen bsh ........................... 31 Bảng 3.1. Giá trị đo OD620nm và hàm lƣợng H2O2 có trong dịch nuôi ............ 42 Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót sau khi ủ trong môi trƣờng pH thấp của các chủng vi khuẩn đã chọn lọc so với đối chứng................................................................ 44 Bảng 3.3. Tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn sau 3 giờ ủ trong môi trƣờng có bổ sung muối mật ....................................................................................... 45 Bảng 3.4. Kết quả đo nồng độ DNA của các mẫu .......................................... 54 Bảng 3.5. Kết quả so sánh với các trình tự 16S đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen (NCBI) của Lac.VFE -04, Lac.VFE -08 và Lac.VFE -14............... 56
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Lactobacillus sp. ............................................................................... 7 Hình 1.2. Đồng phân quang học của axit lactic ................................................ 9 Hình 1.3. Cấu trúc của axit mật ...................................................................... 14 Hình 1.4. Sự tổng hợp axit mật ....................................................................... 15 Hình 1.5. Hoạt động thủy phân muối mật của hệ vi khuẩn đƣờng tiêu hóa ... 19 Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc từ mẫu phân ngƣời ......................................................................................................................... 38 Hình 3.2. Khuẩn lạc Lactobacillus thuần khiết sau 24 giờ nuôi cấy .............. 38 Hình 3.3. Lactobacillus quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. A. ảnh soi tƣơi. B. ảnh nhuộm Gram. ............................................................................................ 39 Hình 3.4. Kết quả thử hoạt tính Catalase ........................................................ 40 Hình 3.5. Khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus so với đối chứng ......................................................................................................... 41 Hình 3.6. Đƣờng chuẩn thể hiện mối tƣơng quan giữa nồng độ H2O2 và mật độ quang của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB. .................................... 41 Hình 3.7. Khả năng phân giải muối mật của 5 chủng Lactobacillus .............. 48 Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR các gen bsh1, bsh2, bsh3 và bsh4 (lần lƣợt từ trái sang phải) của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14. .................................................................................................... 50 Hình 3.9. Khả năng ức chế sự sinh trƣởng trên S. aureus của các chủng Lactobacillus ................................................................................................... 52
Hình 3.10. Kết quả điện di các mẫu DNA của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14. .......................................................................... 54 Hình 3.11. Kết quả sản phẩm PCR của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14. ............................................................................................... 55 Hình 3.12. Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự gene 16S các chủng phân lập Lac. VFE-04, Lac. VFE-08, Lac. VFE-14 phân tích bằng phần mềm MEGA7 Neighbor-Joining Tree. ................................................................................... 57
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỤC LỤC ......................................................................................................... 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 7 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS ........................ 7 1.1.1. Vị trí, đặc điểm chung .................................................................... 7 1.1.2. Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic của vi khuẩn Lactobacillus ............................................................................................. 8 1.1.3. Ứng dụng của Lactobacillus ......................................................... 12 1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME THỦY PHÂN MUỐI MẬT – BILE SALT HYDROLASE (BSH) ...................................................................... 13 1.2.1. Sự hình thành và chuyển hóa của mật trong đƣờng tiêu hóa ........ 13 1.2.2. Enzyme thủy phân muối mật Bile salt hydrolase ......................... 18 1.3. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT HIỆN NAY............................................................................................................. 19 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 20 1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam .............................................. 21 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 1
2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................................................. 23 2.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................... 23 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................... 23 2.2.2. Mẫu vật nghiên cứu ...................................................................... 23 2.2.3. Máy móc thiết bị ........................................................................... 23 2.2.4. Hóa chất và môi trƣờng ................................................................ 23 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 25 2.3.1. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Lactobacillus ............................. 25 2.3.2. Phƣơng pháp làm sạch và giữ chủng vi khuẩn Lactobacillus ...... 25 2.3.3. Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh học và đặc điểm probiotic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus ........................................................... 26 2.3.4. Xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus ........................................................................................... 30 2.3.5. Xác định khả năng ức chế sinh trƣởng trên vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus ........................................................................................ 31 2.3.6. Định danh vi khuẩn ....................................................................... 32 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 37 3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTOBACILLUS ................. 37 3.2. KẾT QUẢ LÀM SẠCH VI KHUẨN LACTOBACILLUS .................. 38 3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS ......... 39 3.3.1. Kết quả xác định hình thái tế bào vi khuẩn .................................. 39 3.3.2. Kết quả xác định khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus ........................................................................................... 40 2
3.3.3. Kết quả xác định khả năng chịu pH axit và muối mật của các chủng đƣợc chọn lọc ............................................................................... 43 3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS ......................................... 47 3.4.1. Khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong môi trƣờng nuôi cấy................................................ 47 3.4.2. Kết quả xác định sự có mặt của các gen bsh ............................... 49 3.5. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TRƢỞNG TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH S. AUREUS ...................................................................................... 51 3.6. ĐỊNH DANH VI KHUẨN ................................................................... 53 3.6.1. Kết quả tách DNA tổng số ............................................................ 53 3.6.2. Kết quả PCR.................................................................................. 55 3.6.3. Kết quả giải trình tự ...................................................................... 55 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 59 4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................... 59 4.2. KIẾN NGHỊ.......................................................................................... 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 60 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ....................... 71 3
MỞ ĐẦU Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới WHO, tính đến hết năm 2015 trên thế giới có khoảng 2,1 tỉ ngƣời thừa cân và béo phì. Đây là một con số báo động đối với xã hội. Béo phì đƣợc đặc trƣng bởi một nhóm các rối loạn chuyển hóa mãn tính quan trọng, bao gồm tiểu đƣờng type 2, gan nhiễm mỡ, tăng huyết áp, ung thƣ... và đặc biệt là bệnh tim mạch. Trong số các bệnh về tim thì bệnh về mạch vành gây tỷ lệ tử vong cao nhất. Tình trạng cao cholesterol trong máu làm tích tụ cholesterol trong động mạch vành, dẫn đến sự hình thành các mảng bám, gây xơ vữa động mạch, thúc đẩy sự phát triển của bệnh mạch vành. Số liệu cho thấy, nếu nồng độ cholesterol trong máu giảm 1% thì nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến mạch vành giảm tới 3%. Những nghiên cứu gần đây cho thấy hệ vi sinh vật là một yếu tố môi trƣờng liên quan đến việc kiểm soát trọng lƣợng cơ thể. Ở ngƣời, hệ vi sinh đƣờng ruột chứa khoảng 1014 tế bào vi khuẩn với bảy nhóm chính đó là Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia, Cyanobacteria và Actinobacteria [1]. Các mô hình thực nghiệm cho thấy ở các đối tƣợng động vật và ngƣời béo phì có sự thay đổi trong thành phần của hệ vi sinh vật đƣờng ruột so với đối tƣợng khỏe mạnh; hệ vi sinh của những đối tƣợng béo phì có số lƣợng Firmicutes lớn hơn và ít Bacteroidetes hơn, cũng nhƣ tính đa dạng vi khuẩn tổng số bị giảm [2]. Sự thay đổi các gen của vi khuẩn tiêu biểu đƣợc coi là nguyên nhân ảnh hƣởng đến các con đƣờng chuyển hóa trong cơ thể [3]. Trong số các vi khuẩn lactic có ảnh hƣởng lớn đến trao đổi chất ở ngƣời béo phì, thì chi Lactobacillus giữ một vai trò quan trọng. Lactobacillus là vi khuẩn lactic do sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrate là axit lactic. Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc cho là sở hữu những lợi ích về sức khỏe khi đƣợc sử dụng dƣới các điều kiện khác nhau. Vi khuẩn này có vai trò quan trọng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột và 4
các hội chứng sau khi dùng kháng sinh. Một số vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thƣ đại trực tràng và điều trị hội chứng ruột kích thích [5]. Chi Lactobacillus đã đƣợc tìm thấy đa dạng về loài và số lƣợng trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời, nơi có pH axit và số lƣợng đáng kể muối mật, chứng tỏ chúng có khả năng chống chịu muối mật và pH thấp. Sản xuất enzyme thủy phân muối mật- BSH có thể là một cơ chế đề kháng mật thông thƣờng của chi vi khuẩn này [6]. Nghiên cứu của Yuji Aiba và cộng sự đã phân lập đƣợc L. johnsonii số 1088 đã đƣợc tìm thấy có khả năng kháng axit mạnh > 10% tế bào sống sót ở pH 1.0 sau 2 giờ [7].Thí nghiệm của Rajesh Kumar và cộng sự cũng cho thấy sự sống sót của các chủng Lactobacilli ở pH 2.5 và 2% muối mật sau 3 giờ [6]. Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có thể làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ công dụng của hoạt tính thủy phân muối mật thông qua tác động trực tiếp vào quá trình chuyển đổi muối mật của vật chủ [6]. Enzyme thủy phân muối mât (Cholylglycine hydrolase, E.C.3.5.1.24) xúc tác quá trình thủy phân muối mật, cắt đứt liên kết peptide của axit mật tự do với gốc Glycine hoặc Taurin. Các axit mật tự do (dạng giải liên hợp) sau đó sẽ bị kết tủa ở pH thấp khiến cho chúng không thể đƣợc tái hấp thu qua ruột và sẽ đƣợc thải ra ngoài cơ thể. Cholesterol là cơ chất để tổng hợp nên axit mật, vì thế việc thủy phân muối mật sẽ làm lƣợng cholesterol trong máu giảm đi, giúp cơ thể khỏe mạnh hơn, tránh nguy cơ béo phì và các bệnh tim mạch [8]. Các chủng Lactobacillus phân lập và có những đặc điểm probiotics đặc trƣng trong nghiên cứu này có một tiềm năng rất lớn để trở thành sản phẩm probiotics, là liệu pháp khả thi cho việc giảm mức cholesterol thông qua khả năng sinh enzyme thủy phân muối mật BSH. Chính vì lí do nêu trên, tôi tiến hành thực hiện luận văn với tiêu đề: " Xác định khả năng phân giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của ngƣời." 5
 Với mục tiêu: Nhằm xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus và các đặc điểm probiotics của các chủng vi khuẩn này.  Nhiệm vụ của đề tài: - Phân lập, tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng phân giải muối mật. - Xác định các đặc điểm sinh học và đặc điểm probiotic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc. 6
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS 1.1.1. Vị trí, đặc điểm chung Lactobacillus - một thành viên chính trong nhóm vi khuẩn lactic, là một chi vi khuẩn Gram dƣơng, hình que, sống kỵ khí tùy tiện hoặc yếm khí, không sinh bào tử (Hình 1.1) [9]. Chúng đòi hỏi môi trƣờng giàu dinh dƣỡng để sinh trƣởng nhƣ carbohydrates, amino axit, peptide, các ester của axit béo, muối, dẫn xuất axit nucleic và vitamin [10]. Hình 1.1. Lactobacillus sp. Nguồn: https://www.microbiologyinpictures.com/ Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc phân bố từ dạ dày đến ruột già ở ngƣời và động vật với số lƣợng thay đổi phụ thuộc vào loài, tuổi của vật chủ, hoặc vị trí trong ruột. Trong phân ngƣời trƣởng thành, vi khuẩn Lactobacillus chiếm một tỷ lệ nhỏ, khoảng 0,01% đến 0,6% tổng số lƣợng vi khuẩn với các loài chiếm ƣu thế nhƣ L. gasseri, L. reuteri, L. crispatus, L. salivarius, và L.ruminis [11]. Ngoài ra các loài L. axitophilus, L. fermentum, L. casei, L.rhamnosus, L. johnsonii, L. plantarum, L. brevis, L.s delbrueckii, L. curvatus, và L. sakei cũng có thể đƣợc tìm thấy trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời với mức độ thay đổi thất thƣờng [12]. Vi khuẩn này đóng vai trò chính trong lên men thực phẩm có nguồn gốc từ động vật và thực vật từ thời xa xƣa. 7
Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc cho là sở hữu những lợi ích về sức khỏe khi đƣợc sử dụng dƣới các điều kiện khác nhau. Chúng có vai trò quan trọng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột và các hội chứng sau khi dùng kháng sinh. Một số vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thƣ đại trực tràng và điều trị hội chứng ruột kích thích [5]. Đƣờng tiêu hóa là nơi chính mà vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hầu hết các hoạt tính để kiểm soát sức khỏe. Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu đƣợc điều kiện khắt khe của môi trƣờng sống. Các vi khuẩn lactic có tác dụng chống lại các tác nhân gây đột biến, phá hủy các tác nhân gây ung thƣ, chống lại các bệnh liên quan đến hệ tiêu hóa và làm tăng khả năng miễn dịch [5]. 1.1.2. Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic của vi khuẩn Lactobacillus Quá trình trao đổi chất để sinh trƣởng và phát triển của các chủng Lactobacillus sống trong đƣờng tiêu hóa cũng đồng thời mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ, vì thế vi khuẩn Lactobacillus đóng góp rất nhiều vai trò trong đời sống của con ngƣời. Một số khả năng chuyển hóa của Lactobacillus đã đƣợc phát hiện bao gồm: 1.1.2.1. Phân giải protein Lactobacillus sản sinh enzyme proteinase phân giải protein thành các peptide mạch ngắn [13]. Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein đƣợc cơ thể vật chủ tiêu hoá dễ dàng. Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của Lactobacillus đƣợc đánh giá là nguồn dinh dƣỡng có giá trị cao cho các đối tƣợng nhƣ trẻ sơ sinh, ngƣời đang dƣỡng bệnh, ngƣời già hay gia súc non [14]. Ngoài ra, trong công nghệ thực phẩm, Lactobacillus còn dùng để làm tăng hƣơng vị và tham gia kết cấu sản phẩm. 8
1.1.2.2. Phân giải đường lactose Lactose đƣợc enzyme β-galactosidases của vi khuẩn Lactobacillus chuyển hóa thành glucose và galactose. Glucose và galactose lại tiếp tục đƣợc chuyển hóa thành sản phẩm chính là axit lactic cùng với các sản phẩm phụ nhƣ axit béo chuỗi ngắn acetate, propionate, butyrate,… [15]. Về mặt sinh lý học, axit lactic có những ƣu điểm nhƣ: tăng cƣờng khả năng tiêu hoá protein sữa thông qua sự đông vón; tăng cƣờng hoạt tính Ca, P, Fe; kích thích sự tiết dịch vị; tăng nhanh cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống dƣới dạ dày và là nguồn năng lƣợng cho quá trình hô hấp. Chính những ƣu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng Lactobacillus làm probiotic. Tuỳ thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, Lactobacillus sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) axit lactic (Hình 1.2). Ở ngƣời, cả hai loại đồng phân này đều đƣợc hấp thu trong đƣờng ruột [16]. Hình 1.2. Đồng phân quang học của axit lactic [16] L (+) axit lactic: đƣợc chuyển hoá hoàn toàn và nhanh chóng trong quá trình tổng hợp glycogen. D (-) axit lactic: đƣợc chuyển hoá ít hơn và phần không chuyển hoá sẽ đƣợc bài tiết dƣới dạng urine. Sự hiện diện của axit không đƣợc chuyển hoá trong ống tiêu hoá sẽ gây tình trạng nhiễm axit trong trao đổi chất ở trẻ sơ sinh. 9
1.1.2.3. Vi khuẩn Lactobacillus và cholesterol Tác dụng của vi khuẩn lactic lên tình trạng cao cholesterol trong máu đã phát hiện trong nhiều nghiên cứu trên động vật cũng nhƣ con ngƣời. Sử dụng vi khuẩn lactic theo đƣờng uống có tác dụng làm giảm đáng kể cholesterol từ 22 đến 33% hoặc làm giảm cholesterol ở chuột béo phì [6,17- 19]. Những tác dụng làm giảm cholesterol trong máu của vi khuẩn này có thể đƣợc thông qua: hoạt tính enzyme thủy phân muối mật [19], khả năng đồng hóa cholesterol [18]; hoạt tính gắn kết vào màng tế bào, và khả năng sản xuất các hợp chất nhƣ FA có tác dụng ức chế hoạt tính của các enzyme nhƣ HMG- CoA reductase. Các sản phẩm từ đậu nành đƣợc lên men bởi L. jugurti có thể làm giảm cholesterol trong máu, giảm lipid, triglyceride tổng số trong huyết thanh và gan ở chuột bị cao cholesterol trong máu [20]. L. plantarum KCTC 3928 cũng có tác dụng giảm cholesterol trong máu đạt đƣợc bằng cách tăng tổng hợp axit mật và bài tiết axit mật qua phân [21]. L. plantarum BBE7 với hoạt tính BSH cao đã đƣợc chọn lọc và hoạt tính giải liên hợp muối mật cũng nhƣ tác dụng loại bỏ cholesterol của nó ở quy mô phòng thí nghiệm đã đƣợc nghiên cứu. L. plantarum BBE có tác dụng làm giảm cholesterol lên đến 58% ở chuột [22]. Tác dụng làm giảm béo của vi khuẩn L. plantarum 14 thông qua hoạt động làm giảm nồng độ leptin và cholesterol tổng số. Thêm vào đó L. plantarum 14 làm giảm kích thƣớc của các tế bào mô mỡ, làm giảm trọng lƣợng của mô mỡ trắng [23]. Kết quả của RT-PCR cho thấy ở L. plantarum CGMCC 8198, tất cả gen bsh2, bsh3, và bsh4 đều tăng khi có mặt muối mật. L. plantarum CGMCC 8198 làm giảm 20% cholesterol trong huyết thanh ở chuột béo phì. Kết quả 10
này cho thấy L. plantarum CGMCC 8198 có lợi thế tiềm năng trong việc ngăn ngừa bệnh tim mạch. 1 .1.2.4. Sản xuất H2O2 và tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn Hydrogen peroxide có công thức hóa học là H2O2. Đây là một một chất oxy hóa mạnh. H2O2 chủ yếu đƣợc sinh ra trong quá trình chuyển hóa carbon và năng lƣợng bởi các enzyme oxidase, bao gồm pyruvate oxidase, lactate oxidase và NADH oxidase [24]. Ngoài ra, H2O2 cũng đƣợc tổng hợp trực tiếp từ các hợp chất xanthine (nhƣ hypoxanthine, xanthine…) có liên kết –H dễ thay thế cùng với nƣớc và oxi nhờ xúc tác của xanthine oxidase và Nox-4 [25]. Tác dụng diệt khuẩn của H2O2 là nhờ khả năng dễ dàng chuyển đổi thành gốc hydroxyl, đây là một chất oxy hóa mạnh có tác dụng gây độc cho tế bào, ức chế sự sinh trƣởng của một số loài vi khuẩn nhƣ Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus… [26]. Một số thành viên trong nhóm vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sản xuất H2O2 nhƣ: L. johnsonii, L. axitophilus, L. fermentum, L. gasseri,...[24]. Tùy thuộc vào từng chủng, khả năng sản xuất H2O2 của chúng là khác nhau với nồng độ dao động trong khoảng 0,8 – 6,4 mM [27]. Khả năng tạo H2O2 của chủng L. fermentum CS 12-1 là 3.5 mM [28], chủng L. johnsonii NCC533 là 1mM [24] hay các chủng Lactobacillus trong nghiên cứu của Zalán và cộng sự, (2005) là từ 0,059 – 0,176 mM [29]. Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng ức chế sinh trƣởng và bài tiết độc tố ở vi khuẩn S. aureus [30]. Trong nghiên cứu của Misaghi và cộng sự,(2017) cho thấy cả ba loài L. acidophilus, L. paracasei và L. fermentum đều có khả năng ức chế sinh trƣởng của S. aureus. Ngoài ra, các chủng Lactobacillus này cũng ức chế biểu hiện gen SE là yếu tố gây độc chính của S. aureus [31]. Thử nghiệm lâm sàng của Eggers và cộng sự, (2018) cho thấy những ngƣời sử dụng bổ sung đƣờng uống vi khuẩn probiotic L. 11
rhamnosus HN001 có khả năng làm giảm từ 73- 83% số lƣợng vi khuẩn S. aureus đƣờng ruột ngƣời so với những ngƣời chỉ dùng giả dƣợc [30]. Hơn nữa, dịch nuôi đã loại bỏ tế bào Lactobacillus cũng ức chế sinh trƣởng của S. aureus nhờ chủng vi khuẩn này có khả năng tiết ra môi trƣờng những phân tử kháng khuẩn nhƣ ethanol, H2O2 và các bacteriocin [32]. 1.1.2.5. Khả năng sinh trưởng trong điều kiện pH thấp và chịu muối mật Để có thể tồn tại trong môi trƣờng đƣờng tiêu hóa của vật chủ, các vi khuẩn cần phải có khả năng chịu đƣợc nồng độ muối mật cao, pH thấp [6] và có khả năng bám dính vào chất nhầy và các tế bào niêm mạc ruột [22]. Lactobacillus đã đƣợc tìm thấy đa dạng về loài và số lƣợng trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời, nơi có pH axit và số lƣợng đáng kể muối mật, chứng tỏ chúng có khả năng chống chịu muối mật và pH thấp. Sản xuất enzyme thủy phân muối mật có thể là một cơ chế đề kháng mật thông thƣờng của chi vi khuẩn này [6]. Nghiên cứu của Yuji Aiba và cộng sự đã phân lập đƣợc L. johnsonii 1088 có khả năng kháng axit mạnh, hơn 10% tế bào sống sót ở pH 1 sau 2 giờ [7]. Thí nghiệm của Rajesh Kumar và cộng sự cũng cho thấy sự sống sót của các chủng Lactobacilli ở pH 2,5 và 2% muối mật sau 3 giờ [6]. Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có thể làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ công dụng của hoạt tính enzyme BSH thông qua tác động trực tiếp vào quá trình chuyển đổi muối mật của vật chủ [6]. 1.1.3. Ứng dụng của Lactobacillus Lactobacillus cũng nhƣ nhiều loại vi khuẩn lactic khác đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau từ y tế, môi trƣờng, nông nghiệp, và trong công nghiệp chế biến, bảo quản thực phẩm. 12