Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát tần suất các alen trong các locus gen (ADN) hệ Identifiler của dân tộc H’Mông phục vụ cho công tác giám định gen ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:80

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là khảo sát tần suất các alen trong các locus gen (ADN) hệ Identifiler của dân tộc H’Mông phục vụ công tác giám định gen ở Việt Nam; trên cơ sở đó, tính tần suất xuất hiện của mỗi alen trong từng locus của dân tộc H’Mông, làm cơ sở khoa học để phân tích, đánh giá và đưa ra kết luận giám định truy nguyên huyết thống hoặc truy nguyên cá thể.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát tần suất các alen trong các locus gen (ADN) hệ Identifiler của dân tộc H’Mông phục vụ cho công tác giám định gen ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN NHƢ GIANG KHẢO SÁT TẦN SUẤT CÁC ALEN TRONG CÁC LOCUS GEN (ADN) HỆ IDENTIFILER CỦA DÂN TỘC H’MÔNG PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH GEN Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - NĂM 2014 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Đề tài: KHẢO SÁT TẦN SUẤT CÁC ALEN TRONG CÁC LOCUS GEN (ADN) HỆ IDENTIFILER CỦA DÂN TỘC H’MÔNG PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH GEN Ở VIỆT NAM Học viên : Nguyễn Nhƣ Giang Chuyên ngành : Hóa Sinh Mã số : 60 42 01 14 Ngƣời hƣớng dẫn : PGS. TS Nguyễn Văn Hà NĂM 2014 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới các Thầy, cô đã giảng dạy tại Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật - Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã truyền đạt cho tôi những kiến thức cơ bản và chuyên sâu về lĩnh vực Công nghệ sinh học, làm tiền đề cho tôi hoàn thành Luận văn tốt nghiệp. Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Nguyễn Văn Hà - Phó giám đốc Trung tâm giám định sinh học pháp lý - Viện Khoa học hình sự đã tận tình hướng dẫn trong thời gian tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện khoa học hình sự, Lãnh đạo Trung tâm giám định sinh học pháp lý, toàn bộ tập thể cán bộ Trung tâm đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học cũng như hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Nhƣ Giang Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT ADN Axit Deoxyribonucleic STR Short Tandem Repeats PCR Polymerase chain Reaction D8 D8S1179 D21 D21S11 D7 D7S820 CSF CSF1PO D3 D3 S1358 THO1 HUMTHO1 D13 D13S317 D16 D16S539 D2 D2 S1338 D19 D19S433 D18 D18S51 D5 D5 S818 χ² Khi bình phương thành phần thí nghiệm χα Khi bình phương tiêu chuẩn Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 5 1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen của các locus gen sử dụng trong giám định ADN. ................................. 5 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới..................................................... 5 1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt nam .................................................... 5 2. Giám định gen (ADN) ....................................................................................... 6 2.1. Cơ sở khoa học của giám định gen .................................................... 6 2.1.1. Cấu trúc, chức năng của phân tử ADN ........................................... 6 2.1.2. Cơ chế phân ly độc lập và tổ hợp tự do trong sinh sản hữu tính .... 7 2.2. Lịch sử phát triển giám định ADN ................................................... 8 2.3. Khái niệm giám định gen (ADN)..................................................... 10 2.4. Khái niệm về locus và alen .............................................................. 12 2.5. Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN ............ 13 2.6. Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus STR............ 14 CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 16 1. Nội dung nghiên cứu:....................................................................................... 16 2. Phương pháp nghiên cứu: ............................................................................... 16 2.1. Thu mẫu: ......................................................................................... 16 2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ: .......................................................... 17 2.2.1. Hóa chất và thiết bị cho tách chiết ADN ...................................... 17 2.2.2. Hóa chất và thiết bị cho định lượng ADN .................................... 18 2.2.3. Hóa chất và thiết bị cho nhân bội và điện di ................................. 18 2.3. Phân tích mẫu ................................................................................................. 18 2.3.1. Tách chiết mẫu bằng chelex ......................................................... 18 2.3.2. Định lượng ADN bằng Realtime PCR......................................... 19 2.3.3. Nhân bội ADN (PCR) .................................................................. 20 2.3.4. Điện di trên máy điện di mao dẫn (Capillary Electrophoresis- CE) ................................................................................................................. 22 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2.4. Xử lý thống kê số liệu và tính tần suất các locus gen .......................... 25 2.4.1. Cơ sở lý thuyết .............................................................................. 25 2.4.2. Phương pháp xử lý thống kê ........................................................ 25 2.4.3. Các bước tính toán thống kê và kiểm định tiến hành trên phần mềm Excel:.............................................................................................. 26 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ....................... 27 1. Kết quả ................................................................................................................. 27 1.1. Thu mẫu ........................................................................................... 27 1.2. Phân tích mẫu thu được kiểu gen theo yêu cầu và lập được bảng kiểu gen của 120 cá thể. (Xem bảng 3 - phụ lục) .......................................... 27 1.3. Xử lý số liệu thống kê (Xem bảng 3.1 đến 3.15); tính được bảng tần suất của các mẫu nghiên cứu (Xem bảng 3.16 đến 3.30); và so sánh với một số quần thể người Việt và người nước ngoài (Xem bảng 3.31 đến 3.45). ......................................................................................................................... 27 1.3.1. Xử lý số liệu thống kê ................................................................... 27 1.3.2. Bảng tần suất của các mẫu nghiên cứu ......................................... 49 Bảng kết quả và thảo luận cơ sở dữ liệu tần suất phân bố các alen của 15 locus gen (gồm bảng 3.16 đến bảng 3.30) .............................................. 49 1.3.3. Kết quả so sánh tần suất alen của người H’Mông với một số người tộc người (xem Bảng từ 3.31 đến 3.45) và biện luận : ........................... 56 2. Bàn luận ............................................................................................................. 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 69 1. Kết luận ............................................................................................................... 69 2. Kiến nghị ............................................................................................................. 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ỨNG DỤNG ĐỀ TÀI Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG BIỂU Hình 1. Cấu trúc ADN trong nhân tế bào (trang 7) Hình 2. Các locus gen hệ Identifiler (trang 24) Bảng 2.1. Thành phần phản ứng Realtime PCR (trang 20) Bảng 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR trên máy realtime 7500 (trang 20) Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR (trang 22) Bảng 2.4. Chu trình nhiệt trên máy PCR 9700 (trang 22) Bảng 2.5. Thành phần của hỗn hợp điện di (trang 24) Bảng 3.1 đến 3.15. Xử lý số liệu thống kê (trang 27 đến trang 46) Bảng 3.16 đến 3.30 Bảng tần suất alen của 120 mẫu nghiên cứu (trang 49 đến trang 55) Bảng 3.31 đến 3.45. So sánh tần suất alen với một số quần thể (trang 56 đến trang 67) Bảng 1: Danh sách người H’ Mông được thu mẫu (Phần phụ lục) Bảng 2: Kết quả định lượng 120 mẫu ADN của 120 cá thể người H’Mông (Phần phụ lục) Bảng 3: Kết quả kiểu gen 120 cá thể người H’ Mông (kí hiệu HM1 đến HM120) (Phần phụ lục) Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU Cơ sở khoa học, thực tiễn và tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài: Người đầu tiên đặt nền móng cho ngành di truyền học là Mendel. Ông là người đầu tiên phát hiện ra các quy luật di truyền. Mendel đã gọi những đặc điểm được truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác là “nhân tố di truyền”, mà sau này được gọi là gen. Trong nhân tế bào, các nhiễm sắc thể sắp xếp thành 23 cặp, trong đó 22 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính. Các cặp nhiễm sắc thể này quy định các tính trạng khác nhau của cơ thể, được bảo tồn duy trì trong thế hệ và được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Con cái được thừa hưởng các đặc tính di truyền thông qua 23 nhiễm sắc thể từ tinh trùng của bố và 23 nhiễm sắc thể từ tế bào trứng của mẹ. Xét nghiệm truy nguyên cá thể người cũng như xác định huyết thống trực hệ cha - con, mẹ - con chủ yếu được thực hiện bằng cách sử dụng các marker ADN nằm trên các NST trong nhân tế bào. Ngoài ra phân tích các marker trên nhiễm sắc thể Y còn có thể xác định quan hệ huyết thống theo dòng cha. ADN thường được coi là vật liệu di truyền ở cấp độ phân tử tham gia quyết định các tính trạng. Trong quá trình sinh sản, phân tử ADN được nhân đôi và truyền cho thế hệ sau. Năm 1953, Watson và Crick đã xây dựng mô hình cấu trúc không gian của phân tử ADN. Theo hai ông, ADN có cấu trúc từ hai sợi xoắn kép có phân tử lượng rất lớn, mỗi sợi ADN là một chuỗi xoắn nucleotid gồm 4 loại bazơ nitơ: Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) và Thymin (T) sắp xếp kế tiếp nhau, xoắn đều quanh một trục theo chiều từ trái sang phải như một thang dây xoắn, mà 2 tay thang là các phân tử đường (C5H10O4) và axit phôtphoric sắp xếp xen kẽ nhau, còn mỗi bậc thang là một cặp bazơ nitric đứng đối diện và liên kết với nhau bằng các liên kết hiđrô theo nguyên tắc bổ sung, nghĩa là một bazơ lớn (A hoặc G) được bù bằng một 1
bazơ bé (T hoặc C) hay ngược lại. Do đặc điểm cấu trúc, Adenin chỉ liên kết với Thymin bằng 2 liên kết hiđrô và Guanin chỉ liên kết với Cytosin bằng 3 liên kết hiđrô. Do các cặp nuclêôtit liên kết với nhau theo nguyên tắc bổ sung, chiều rộng của chuỗi xoắn kép bằng 20Å , khoảng cách giữa các bậc thang trên chuỗi xoắn bằng 3,4Å, phân tử ADN xoắn theo chu kỳ xoắn, mỗi chu kỳ xoắn có 10 cặp nucleotit có chiều cao 34Å. Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ ADN vào công tác đấu tranh phòng chống tội phạm là một mũi nhọn đã được thực hiện ở nhiều quốc gia từ những năm 80 của thế kỷ XX. Cùng với sự tiến bộ của khoa học công nghệ, giám định ADN ngày càng phát triển, hoàn thiện cả về công nghệ, phương pháp và khả năng đáp ứng nhu cầu chung của pháp luật và của cả xã hội. Kết luận của giám định ADN mang tính quyết định đối với các vụ việc mang tính hình sự, dân sự như truy nguyên cá thể, xác định quan hệ huyết thống, xác định tung tích nạn nhân trong các vụ thảm họa, chiến tranh… là rất cần thiết và cấp bách. Tuy nhiên, để bảo đảm tính khoa học và tính pháp lý thì các phòng thí nghiệm giám định ADN cần phải có tần suất các alen của các locus gen để sử dụng khi dùng phân tích, kết luận giám định ADN cho mỗi một quần thể người (dân tộc). Việc nghiên cứu, khảo sát tần suất alen của các locus gen dùng trong giám định ADN của các dân tộc trên thế giới đã được tiến hành ở mức cơ bản. Tuy nhiên tùy thuộc vào số dân tộc ở mỗi quốc gia cũng như phụ thuộc vào năng lực giám định ADN của mỗi nước, các công bố về tần suất alen của các locus gen dùng trong giám định ADN ở mỗi nước khác nhau đối với mỗi dân tộc khác nhau là khác nhau. Trong các điều kiện cần phải có khi kết luận giám định ADN thì có một điều kiện bắt buộc đó là phải có cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus gen dùng cho giám định gen đối mỗi quần thể người (dân tộc) cụ thể. Hiện nay, trên thế giới, các đơn vị giám định ADN đang sử dụng phổ biến các bộ Kit với 16 locus gen như bộ kit Identifiler, Identifiler Plus và Identifiler Direct 2
(hãng AB, Mỹ) hoặc bộ kit Powerplex (hãng Promega, Mỹ)… để tính toán tần suất xuất hiện của các alen. Trên cơ sở đó tính toán xác suất trùng nhau giữa các mẫu khi phải truy nguyên đồng nhất hoặc xác suất quan hệ huyết thống giữa các mẫu khi phải xác định quan hệ huyết thống trong giám định ADN. Ở Việt Nam hiện nay, Viện Khoa học hình sự và đa số các cơ quan, tổ chức giám định đang sử dụng các bộ kit Identifiler, Identifiler Plus, và Identifiler Direct cho giám định ADN. Năm 2011, bảng tần suất các alen của các locus gen của hệ Identifiler trong quần thể người Việt (Kinh) được công bố trên tạp chí ForensicAsia. Cho đến nay, chưa có một nghiên cứu nào được công bố về khảo sát sự phân bố tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler (gồm 15 gen) trong quần thể người H’Mông. Với dân số khoảng 80.000 người (đứng thứ 8 trong tổng số 54 các dân tộc Việt Nam), dân tộc H’Mông phân bố khắp trên các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc Cạn, Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Yên Bái, Lào Cai, Lai Châu, Điện Biên, Sơn La, Hoà Bình, Thanh Hoá, Nghệ An và số ít ở Phú Thọ, cũng như các tỉnh Tây Nguyên, đây là những điểm nóng về tình hình an ninh và trật tự xã hội, số vụ án trong cộng đồng người H’Mông có diễn biến phức tạp với xu hướng ngày càng gia tăng. Vì vậy, việc tiến hành triển khai đề tài nghiên cứu: “Khảo sát tần suất các alen trong các locus gen (ADN) hệ Identifiler của dân tộc H’Mông phục vụ cho công tác giám định gen ở Việt Nam” là một yêu cầu cấp thiết. Mục đích của đề tài : 1. Khảo sát tần suất các alen trong các locus gen (ADN) hệ Identifiler của dân tộc H’Mông phục vụ công tác giám định gen ở Việt Nam. 2. Trên cơ sở đó, tính tần suất xuất hiện của mỗi alen trong từng locus của dân tộc H’Mông, làm cơ sở khoa học để phân tích, đánh giá và đưa ra kết luận giám định truy nguyên huyết thống hoặc truy nguyên cá thể. 3
Nội dung của đề tài, các vấn đề cần giải quyết Đề tài sẽ bao gồm một số nội dung chính với các vấn đề cần giải quyết sau: - Thu thập 120 mẫu tế bào niêm mạc miệng của cá thể người H’Mông không có quan hệ họ hàng ở các tỉnh khác nhau (có thông tin cá nhân). - Tách chiết ADN bằng phương pháp tách chiết vô cơ, sử dụng chelex 100 (hãng Bio - Rad, Mỹ). - Định lượng ADN bằng phương pháp Real-time PCR sử dụng bộ Kit Quantifiler® Human DNA Quantification (hãng ABI, Mỹ). - Nhân bội ADN trên máy tạo chu trình nhiệt ABI – 9700 bằng bộ Kit Identifiler (hãng ABI, Mỹ). - Điện di và phân tích kết quả trên máy Phân tích gen ABI – 3130 với phần mềm GeneMapper ID của hàng ABI (Mỹ). - Phân tích kiểu gen (ADN) của các locus gen hệ Identifiler (15 locus gen) của 120 cá thể người H’Mông. Từ cơ sở đó, tính tần suất xuất hiện của mỗi alen của từng locus trong quần thể, kiểm định tính chính xác của số lượng mẫu trong khảo sát với độ tin cậy p = 0,05. Kết quả là bảng tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler quần thể người H’Mông làm cơ sở khoa học để các cơ quan giám định, các cơ quan tố tụng hình sự, dân sự sử dụng phân tích và đưa ra kết luận trong giám định gen. Đề tài này khi được hoàn thành sẽ đáp ứng yêu cầu của giám định gen ở Việt Nam nói chung và đóng góp vào nhiệm vụ giám định ADN cho các lực lượng thực thi pháp luật trên toàn cầu, nhất là trong bối cảnh toàn cầu hóa giữa cảnh sát các nước thông qua Interpol. 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về khảo sát tần suất các alen của các locus gen sử dụng trong giám định ADN. 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới, ở các nước có phòng giám định gen đều đã nghiên cứu, khảo sát và công bố kết quả của mình về sự phân bố tần suất các alen của các gen hình sự. Ví dụ như tập đoàn Applied Biosystem (Mỹ) khảo sát 15 gen của người Mỹ - Phi, người Mỹ - Tây Ban Nha ... Kết quả khảo sát 15 gen của người Malaixia, Philipin, Hàn quốc, Guatemala, Sudan, Thái lan, Vênêzuela, Bănglađet, Inđônêsia... đã được công bố. Đây là những số liệu rất có giá trị không chỉ đối với lĩnh vực giám định gen của các nước đó mà còn có giá trị về mặt khoa học đối với các giám định viên và các nhà khoa học nghiên cứu về gen sử dụng trong giám định ADN trên thế giới [15, 26, 27]. Trong giám định ADN, bên cạnh việc sử dụng rộng rãi bộ kít của hãng Applied Biosystem, bộ kít của hãng Promega cũng được nhiều nơi sử dụng [14]. Ví dụ tại Mỹ, mỗi bang có từ 1 đến nhiều phòng thí nghiệm giám định ADN và có thể dùng kit hệ Identifiler hoặc kit PowerPlex. Để thống nhất trên toàn nước Mỹ, cảnh sát liên bang Mỹ (FBI) hiện dùng cơ sở dữ liệu tần suất của 13 locus gen (trùng nhau trong hệ Identifiler và hệ PowerPlex) trong phần mềm CODIS (Combined DNA index system) - một phần mềm nổi tiếng để truy xuất, tìm kiếm, so sánh dữ liệu trong giám định ADN. Phần mềm này đang được triển khai ở 49 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới. 1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt nam Giám định gen ở Việt Nam bắt đầu triển khai chính thức từ tháng 4 năm 1999 tại Viện Khoa học hình sự, toàn bộ quy trình giám định gen được chuyển giao từ Viện Khoa học hình sự - Bang Victoria - c cùng đội ngũ giám định viên được đào tạo cơ bản tại c. Năm 2000, đề tài cấp Bộ nghiên 5
cứu khảo sát và xây dựng tần suất của các gen trong hệ Nineplex (10 locus gen, trong đó có 1 locus gen xác định giới tính) được triển khai và năm 2002 đã được nghiệm thu đưa vào sử dụng làm cơ sở tính toán kết quả giám định ADN [4] tại Viện Khoa học hình sự. Năm 2006, Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an được trang bị và triển khai sử dụng kit phân tích ADN hệ Identifiler (gồm 15 locus gen và 1 locus gen xác định giới tính) để tăng hiệu quả phân tích gen (ADN) phục vụ cho công tác điều tra, phá án, tìm kiếm nạn nhân trong các vụ việc cũng như trong các vụ giám định ngoài tố tụng .... Do tần suất xuất hiện của mỗi alen của các locus gen trong hệ Identifiler ở mỗi quần thể dân tộc khác nhau là có sự phân bố alen khác nhau. Yêu cầu cấp thiết đặt ra là phải xây dựng được tần suất phân bố các alen của các locus gen hệ Identifiler trong quần thể của mỗi dân tộc sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam [28, 29]. Đến năm 2011, một đề tài cấp bộ do Viện Khoa học hình sự chủ trì đã hoàn thành việc khảo sát tần suất alen các locus gen hệ Identifiler trong quần thể người Việt (Kinh) với 170 cá thể. Ở Việt Nam, cho đến nay chưa có một nghiên cứu hoàn chỉnh nào được công bố về khảo sát sự phân bố tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler trong quần thể người H’Mông được công bố. 2. Giám định gen (ADN) 2.1. Cơ sở khoa học của giám định gen 2.1.1. Cấu trúc, chức năng của phân tử ADN Năm 1953, hai nhà nghiên cứu khoa học James D.Watson (Mỹ) và Francis H.C Crick (Anh) đã công bố mô hình cấu trúc chuỗi xoắn kép phân tử ADN. Đây là dấu mốc chính thức đánh dấu sự ra đời của Sinh học phân tử. Các nhà khoa học đã phát hiện ra bản chất di truyền nằm trên cấu trúc nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể được cấu trúc từ phân tử ADN kết hợp với các 6
protein kiềm (histon). Phân tử ADN là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide. Mỗi nucleotide gồm nhóm phosphate, đường deoxyribose và một trong bốn base (adenine, cytosine, guanine và thymine). Hai mạch đơn kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro hình thành giữa các base bổ xung nằm trên hai mạch: base adenine (A) liên kết với base thymine (T) bằng hai liên kết hydro (A=T); base cytosine (C) liên kết với base guanine (G) bằng ba liên kềt hydro (CG). Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hướng với một đầu là đầu 5'phosphate tự do và một đầu là 3'hydroxyl tự do (hướng quy ước là 5’3'). Hướng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau và là hai mạch đối song song. Hình 1. Cấu trúc ADN 2.1.2. Cơ chế phân ly độc lập và tổ hợp tự do trong sinh sản hữu tính Năm 1956, Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người, trong nhân tế bào thể (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắc thể (NST) được xếp thành 23 cặp đồng dạng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp 7
nhiễm sắc thể giới tính. Riêng tế bào trứng và tế bào tinh trùng chỉ có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn bội). Thế hệ con cái nhận từ mẹ 23 nhiễm sắc thể thông qua tế bào trứng và 23 nhiễm sắc thể từ cha thông qua tế bào tinh trùng. Bộ nhiễm sắc thể được bảo tồn và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác và mang tính đặc trưng cho loài người [19, 20,]. Theo định luật 1 và 2 của Mendel, các nhiễm sắc thể phân ly độc lập, tổ hợp tự do đã góp phần tạo ra sự đa dạng của các cá thể của mỗi loài thông qua sinh sản hữu tính. Đó là cơ sở khoa học góp phần tạo nên sự khác biệt của mỗi cá thể trong quần thể, điều mà chúng ta sử dụng để truy nguyên cá thể, xác định quan hệ huyết thống … trong giám định gen. 2.2. Lịch sử phát triển giám định ADN Năm 1985, Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester nước Anh khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hóa cho myoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự của các bazơnitơ được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp từ 10 - 15 bp (base pair) hoặc vài chục bp, các đoạn lặp này được gọi là tiểu vệ tinh (minisatellite) hay VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì khác nhau. Alec Jeffreys coi đây là đặc điểm rất quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể và có thể sử dụng để truy nguyên cá thể. Cũng vào thời điểm năm 1985, tác giả Karry Mullis và cộng sự đã công bố kết quả thử nghiệm thành công phản ứng chuỗi nhân gen PCR (Polymerase Chain Reaction). Thành công này là một chìa khóa để mở ra tất cả những hướng nghiên cứu trong sinh học phân tử [13, 16]. Năm 1991, một phương pháp mới trong giám định ADN được giới thiệu, đó là phương pháp phân tích sử dụng các đoạn lặp lại ngắn STR (Short Tandem Repeats), các STR có đoạn lặp từ 2 - 6 bp. 8
Các cấu trúc STR đều mang tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cho cá thể. Các gen này thường có tính đa hình cao, ít đột biến, tương đối bền vững và cho phép đồng thời thực hiện được phản ứng nhân gen của nhiều gen khác nhau. Dựa trên tính đa hình của các cấu trúc STR về chiều dài: Một số gốc nucleotid được lặp đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn ADN. Ví dụ: tại locus D7S820 của một cá thể, các alen phân biệt nhau bằng số đoạn lặp GATA. Alen thứ nhất: GATA GATA... ............GATA  có 8 đoạn lặp GATA Alen thứ hai: GATA GATA GATA... GATA 12 đoạn lặp GATA Locus D7S820 này là dị hợp tử với các alen là: 8 - 12. Các locus STR có ưu điểm hơn các locus VNTR vì chúng bền vững hơn (ít bị đột biến và đứt gãy), có khả năng nhân tổ hợp được nhiều gen trong cùng một phản ứng PCR và những mẫu đem phân tích ít nhiều có biến tính vẫn có thể cho kết quả. Tháng 10 năm 1990, tại Mỹ, Dự án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) chính thức khởi động. Đến ngày 12 tháng 02 năm 2001, HGP và Celera đã công bố trình tự đầy đủ của hệ gen người. Đây là một sự kiện trọng đại trong sự phát triển của sinh học phân tử nói chung và trong việc nghiên cứu gen người nói riêng. Theo công bố này, số lượng gen trong bộ gen người có khoảng 35000 gen, trong đó có hàng chục gen được nghiên cứu ứng dụng để sử dụng xác định huyết thống và truy nguyên cá thể [19]. Đến những năm cuối thế kỷ 20, các nhà khoa học hình sự mới ứng dụng công nghệ gen (DNA Technology) vào trong đấu tranh với tội phạm, xác định huyết thống và định danh cá thể. Giám định gen (ADN) là một trong 9
những phương pháp khoa học có độ chính xác rất cao, giúp cơ quan pháp luật xác định chính xác tội phạm, truy tìm tung tích nạn nhân cũng như xác định quan hệ huyết thống [23, 24]. 2.3. Khái niệm giám định gen (ADN) Trong giám định kỹ thuật hình sự có nhiều phương pháp để truy nguyên cá thể người và giám định ADN hiện nay là một trong những phương pháp đắc lực nhất để giúp các nhà điều tra hình sự xác định chính xác tội phạm, truy tìm tung tích nạn nhân cũng như xác định quan hệ huyết thống [13]. Từ năm 1987 đến nay, phương pháp giám định ADN từ các mẫu vật có nguồn gốc cơ thể người được phát triển mạnh mẽ do tính chính xác, khả năng truy nguyên cao và đa dạng về loại mẫu vật. Tính ưu việt của giám định gen là truy nguyên được cá thể người, xác định quan hệ huyết thống cha - con - mẹ, xác định danh tính hài cốt... Ban đầu, giám định gen được gọi là giám định vân tay di truyền (DNA - "fingerprinting"), về sau để tránh sự hiểu lầm giữa giám định đường vân và giám định gen, Uỷ ban nghiên cứu quốc gia Mỹ (NRC) đề nghị đổi là truy nguyên ADN (DNA - profiling) [14, 20]. Giám định gen (ADN) là nghiên cứu, phân tích ADN từ các dấu vết, vật chứng có nguồn gốc cơ thể người bằng kỹ thuật gen.Thông qua phân tích ADN để xác định truy nguyên, nhận dạng cá thể người hoặc xác định quan hệ huyết thống [19]. Trong đó, giám định gen trong nhân tế bào trên các nhiễm sắc thể thường là phổ biến để tính toán truy nguyên cá thể hoặc xác định quan hệ huyết thống. Giám định gen trên nhiễm sắc thể giới tính được quan tâm nhiều ở các locus trên nhiễm sắc thể Y nhằm truy nguyên theo dòng cha. Giám định gen ti thể để xác định quan hệ huyết thống theo dòng mẹ, đây là loại giám định truy nguyên theo nhóm … Số lượng locus gen được sử dụng phân tích càng nhiều thì khi tính toán xác suất xuất hiện để truy nguyên hoặc tính quan hệ huyết thống cho kết quả 10
có độ tin cậy càng cao. Theo tập đoàn Perkin-Elmer (Mỹ), khi phân tích tổ hợp 9 locus gen hệ Profiler Plus thì khả năng trùng hợp ngẫu nhiên tổ hợp các kiểu gen là vô cùng nhỏ, vì tần suất xuất hiện của chúng là khoảng 1/72 tỉ [29]. Trong vài năm trở lại đây, trên thế giới cũng như ở Viện Khoa học hình sự đã đưa vào sử dụng bộ kit Identifiler phân tích 16 locus gen bằng máy giải trình tự gen ABI 3130 Genetic Analyzer [6, 15]. Đây là bộ kit phức hợp dùng nhân bội, phân tích đồng thời 16 locus STR. Đặc điểm của các locus gen STR trong bộ kit này: - Locus gen D8S1179 nằm trên nhiễm sắc thể số 8, dài 128 - 168 cặp bazơ, có 12 alen - Locus gen D21S11 nằm trên nhiễm sắc thể số 21, dài 189 - 243 cặp bazơ, có 35 alen - Locus gen D7S820 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 7, dài 258 - 294 cặp bazơ, có 11 alen - Locus CSF1PO nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 5, dài 284 - 312 cặp bazơ, có 8 alen - Locus gen D3S1358 nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 3, dài 114 - 142 cặp bazơ, có 12 alen - Locus HUMTH01 nằm ở intron 1 của gen tyrosine hydroxylase người, trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 11, dài 168 - 192 cặp bazơ, có 7 alen - Locus gen D13S317 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 13, dài 206 - 234 cặp bazơ, có 9 alen - Locus gen D16S539 nằm trên nhiễm sắc thể số 16, dài 245-269 cặp bazơ, có 7 alen 11
- Locus gen D2S1338 nằm trên nhiễm sắc thể số 2 - Locus gen D19S433 nằm trên nhiễm sắc thể số 19 - Locus gen vWA nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 12, dài 157 - 197 cặp bazơ, có 13 alen - Locus TPOX: Nằm ở intron 10 của gen thyroid peroxidase người, trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 2, dài 221 - 241 cặp bazơ, có 6 alen - Locus gen D18S51 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 18, dài 273 - 341cặp bazơ, có 25 alen - Locus D5S818 (D5) nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 5, dài 135 - 171cặp bazơ, có 10 alen Theo các nhà khoa học hình sự, khi phân tích bằng bộ kit Identifiler thì độ tin cậy đạt là: 1/ 4,62 x 1019, có nghĩa là trong số 4,62 x 1019 người thì mới có một người trùng ngẫu nhiên với tổ hợp kiểu gen trên [15, 20]. Cùng với sự phát triển của công nghệ tự động hóa, các công đoạn giám định ADN đã được tự động bằng các robot chuyên dụng, có khả năng phân tích tới hàng trăm mẫu mỗi ngày trên 1 hệ thống. Về cơ bản, các hệ thống phân tích tự động để xây dựng tàng thư ADN vẫn đang phân tích mẫu bằng cách sử dụng các bộ kit có tổ hợp 13 locus (hệ CODIS) hoặc 16 locus hệ Identifiler … dùng lưu trữ, tìm kiếm tội phạm và quản lý các đối tượng có nguy cơ phạm pháp cao. 2.4. Khái niệm về locus và alen Locus: là một đoạn ADN trên nhiễm sắc thể, dành cho một gen nhất định [19]. Trong giám định ADN thì locus còn có thể là những đoạn ADN không mã hóa [19]. Alen là các trạng thái khác nhau của cùng một gen. Mỗi cá thể đều có hai alen cho mỗi một locus, trong đó một alen di truyền từ bố, một alen di 12
truyền từ mẹ. Nếu hai alen của một locus hoàn toàn giống nhau thì được gọi là đồng hợp tử, còn khác nhau được gọi là dị hợp tử [14, 19]. 2.5. Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN Giám định ADN hiện nay sử dụng các locus STR là chủ yếu. Phương pháp giám định gen có độ tin cậy rất cao bởi các locus STR có tính đa alen (tính đa hình) rất cao, mỗi alen chỉ xuất hiện trong quần thể với tần số rất thấp [14, 24]. Locus STR ngắn nên có thể đồng thời phân tích được ba hoặc nhiều STR hơn trong cùng một thời điểm. Việc phân tích đa hệ rất có giá trị vì chúng có kết quả phân biệt lớn và thành công ngay cả một số trường hợp mẫu lẫn hoặc đã bị phân hủy phần nào [13]. Một locus STR được sử dụng cho mục đích nhận dạng và xác định cá thể phải đảm bảo các thông số sau: - Có tính bền vững cao (tần suất đột biến thấp) - Locus STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao. Điều này giúp các nhà phân tích chỉ sử dụng một số locus tối thiểu đã đạt được sự phân biệt cá thể một cách tốt nhất. - Các locus STR có độ dài ngắn, trung bình từ 100 - 400 bp so với các đoạn đa hình ngẫu nhiên khác. Các đoạn ADN ngắn có độ bền vững cao, ít bị đứt gãy dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh. Do vậy, khi tiến hành PCR sẽ thu được hiệu quả tốt hơn các đoạn ADN dài. - Các locus chứa đoạn STR phải đảm bảo yếu tố di truyền độc lập, do vậy nên lựa chọn tổ hợp các locus nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau là rất quan trọng. Các STR thông thường có rất nhiều alen, độ dài của các alen thông thường khác nhau số đoạn lặp. Do vậy, việc sử dụng các STR có chiều dài dưới 400 base để dễ dàng phân tích là một yêu cầu cần thiết trong quá trình lựa chọn. 13