Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (ipt) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:83

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm 3 mục tiêu: biến nạp thành công gen Isopentenyl transferase vào một số dòng ngô chọn lọc, kiểm tra sự có mặt của gen ipt bằng kỹ thuật sinh học phân tử, bước đầu đánh giá khả năng chịu hạn ở cây con thế hệ T1.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (ipt) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ------------ LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 NGHIÊN C U TẠO CÁC NG NG MANG G N ISOPENTENYL TRANSFERASE (IPT NG PH NG PHÁP I N NẠP NH VI KHU N AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng H vi n : Tr n uy H ng Hà Nội – 2015
L i cảm n Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới guy n ăn Đ ng tận t nh, d u dắt, h ớng dẫn, truy n t nh ng inh nghi qu b u c ng nh ng vi n và t o mọi i u ki n giúp ỡ tôi trong qu tr nh học tập và nghi n cứu. Tôi xin g i l i cả ơn ến phòng ào t o t o i u i n và tận t nh h ớng dẫn ọi th t c ể tôi c thể hoàn thành luận văn này ôi xin g i l i cả ơn tới tập thể c n b hòng thí nghi m Trọng iể Công ngh tế bào hực vật - Vi n Di truy n ông nghi p giúp ỡ nhi t t nh trong suốt th i gian tôi thực hi n h a luận. Cuối c ng nh ng hông ph n quan trọng, tôi xin g i tới bố mẹ, anh chị c ng b n bè, nh ng ng i luôn quan tâ , ng h và là chỗ dựa cho tôi trong suốt th i gian là h a luận này, c ng nh trong cu c sống. ôi luôn ghi nhớ và hông bao gi qu n sự giúp ỡ vô c ng to lớn ôi xin g i ến tất cả qu th y cô, gia nh, b n bè lòng biết ơn vô tận Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2015 Học viên n y H ng i
M c c L i cảm n ......................................................................................................................................... i M c c .............................................................................................................................................. ii nh m c h nh v ........................................................................................................................... iv nh m c ảng................................................................................................................................. v nh m c c c ch vi t t t .............................................................................................................. vi M Đ U ........................................................................................................................................... 1 Ch ng –T NG QUAN ............................................................................................................... 3 1.1 Nguồn gốc cây ngô............................................................................................................ 3 1.2 T nh h nh nghiên cứu ngô trên th giới .......................................................................... 5 1.3 T nh h nh nghiên cứu ngô ở Việt Nam: .......................................................................... 9 1.4 C sở ho học v nghiên cứu nạp gen vào thực vật bằng ph ng ph p Agrobacterium tumefaciens ........................................................................................................ 13 1.4.1 Ti-Plasmid ............................................................................................................... 14 1.4.2 Chức năng c T-DNA .......................................................................................... 16 1.4.3 C ch chuy n gen ằng A. tumefaciens ............................................................... 16 1.4.4 Gen ch th - gen chọn ọc và c ch hoạt động chọn lọc c a hygromycin ........ 18 1.5 C ch ch u hạn hiện t ng già h và gen IPT ......................................................... 19 1.5.1 C ch ch u hạn c thực vật ................................................................................ 19 1.5.2 Hiện t ng già h và c c y u tố ảnh h ởng ....................................................... 20 1.5.3 Đi u hò sự già h và v i trò c Cyto inin ...................................................... 20 1.5.4 Gen ipt và promoter pSARK12 ............................................................................. 21 1.6 C c ph ng ph p i m tra sự c mặt và i u hiện c a gen bi n nạp ....................... 21 1.6.1 Ph ng ph p Southern ot .................................................................................. 21 1.6.2 Ki m tr hả năng ch u hạn ở t i cây con ...................................................... 22 Ch ng – VẬT LIỆU VÀ PH NG PHÁP ............................................................................ 24 2.1 Vật liệu ............................................................................................................................ 24 2.1.1 Vật liệu thực vật ..................................................................................................... 24 2.1.2 Ch ng vi khuẩn và vector dùng trong chuy n gen ............................................. 24 2.1.3 H chất và thi t b sử d ng.................................................................................. 24 2.2 Ph ng ph p nghiên cứu............................................................................................... 25 2.2.1 Quy tr nh chuy n gen vào phôi non thông qu vi huẩn Agrobacterium tumefaciens .............................................................................................................................. 25 ii
2.2.2 Phân tích cây chuy n gen bằng ph ng ph p sinh học phân tử. ....................... 27 2.2.3 Đ nh gi hả năng ch u hạn c c c dòng ngô chuy n gen ở th i cây con 30 2.2.4 Đ nh gi sự h già c trong đi u iện c t h i cành .............................. 31 2.3 Đ đi m, th i gi n và ph ng ph p xử ý số liệu ....................................................... 31 Ch ng - K T QUẢ .................................................................................................................... 32 3.1 K t quả c qu tr nh chuy n gen,chọn ọc và t i sinh c giống ngô................. 32 3.2 Ki m tr ằng ph ng ph p sinh học phân tử............................................................ 35 3.2.1 K t quả t ch chi t NA t ng số ............................................................................ 35 3.2.2 K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph ng ph p PCR gen hpt ................ 36 3.2.3 K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph ng ph p PCR gen ipt ................. 37 3.2.4 K t quả phân tích Southern ot c c dòng ngô chuy n gen th hệ T .............. 38 3.3 K t quả đ nh gi hả năng ch u hạn c c c dòng ngô chuy n gen ở th i cây con 40 3.4 K t quả đ nh gi qu tr nh h già c hi c t ............................................ 45 Ch ng – THẢO LUẬN ............................................................................................................. 46 4.1 Chuy n gen thông qu vi huẩn ................................................................................... 46 4.2 Phân tích ằng ph ng ph p sinh học phân tử........................................................... 47 4.3 Đ nh gi s ộ i u hiện ch u hạn c cây con ở đi u iện phòng thí nghiệm......... 49 Ch ng – K T LUẬN VÀ KI N NGH .................................................................................. 52 5.1 K t uận ........................................................................................................................... 52 5.2 Ki n ngh ......................................................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 53 PH L C ........................................................................................................................................ 59 iii
nh m c h nh v H nh 1: ấu trú Ti-plasmid ............................................................................................................ 14 H nh 2 : Hệ thống ve tor li n hợp .................................................................................................... 15 H nh 3 : Hệ thống vector nhị thể (kép) ............................................................................................ 15 H nh 4: ấu trú T-DNA ................................................................................................................. 16 H nh 5 : S ấu trú ve tor pSI hyg-2 ....................................................................................... 24 H nh 6 : S quy tr nh huyển gen ............................................................................................... 27 H nh 7: Kh n ng ph h i- ti p nh n- t i sinh giống ng ................................................. 32 H nh 8: T n số huyển gen gi ịnh................................................................................................. 33 H nh 9: M t số h nh nh gi i o n huyển gen ......................................................................... 33 H nh 10: K t qu iện i N t ng số ............................................................................................ 36 H nh 11: K t qu ph n t h P R gen hpt th hệ T0 ......................................................................... 37 H nh 12: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T0 .......................................................................... 37 H nh 13: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T1 .......................................................................... 38 H nh 14: K t qu Southern lot ng huyển gen ở th hệ T1 .................................................. 39 H nh 15: nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on ở nh lưới số 1 r yx l h n .................................................................................................................................................... 40 H nh 16: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v hi u i r i nhất t i nh lưới số 1............................................................................................... 41 H nh 17: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng tư i t i nh lưới số 1............................................................................................................................................ 41 H nh 18: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh lưới số 1............................................................................................................................................ 41 H nh 19: nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on ở nh lưới số 2 r yx l h n .................................................................................................................................................... 43 H nh 20: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v hi u i r i nhất t i nh lưới số 2.............................................................................................. 43 H nh 21: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v tr ng lượng tư i t i nh lưới số 2............................................................................................................................................ 44 H nh 22: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh lưới số 2............................................................................................................................................ 44 H nh 23: nh gi qu tr nh h gi l H9 ............................................................................. 45 H nh 24: nh gi qu tr nh h gi l M8............................................................................. 45 iv
nh m c ảng ng 1: Ph n lo i thực v t ................................................................................................................. 3 ng 2: T nh h nh s n xuất ng tr n th giới những n m g n y ................................................... 5 ng 3: T nh h nh s n xuất ng ở Việt Nam những n m g n y .................................................. 10 ng 4: Th nh ph n inh ư ng trong 100g h t ............................................................................. 11 ng 5: Tr nh tự m i ........................................................................................................................ 29 ng 6: K t qu t ng hợp th nghiệm huyển gen chịu h n ............................................................ 32 ng 7: Số opy gen huyển ............................................................................................................ 39 v
nh m c c c ch vi t t t WW i u kiện tưới nướ y WS i u kiện x l h n SH hi u o th n l LRL hi u ir i nhất FWS Tr ng lượng tư i th n l FWR Tr ng lượng tư i r DWS Tr ng lượng kh th n l DWR Tr ng lượng kh r IM M i trường l y nhi m CCM M i trường ng nu i ấy REM M i trường nu i ph h i ECM M i trường h n l m s o SeM M i trường ph t sinh h i RM M i trường r r vi
M Đ U y ng l y lư ng thực quan tr ng cho n n kinh t to n u, l m t trong n m y lư ng thự h nh a th giới. S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i sống on người ũng như ng v t r thể ược ng d ng trong nhi u ng nh như ược phẩm .Ở nước Trung Mỹ, N m Á v h u Phi, người ta s d ng ng l m lư ng thự h nh ho người với phư ng th c rất ng theo vùng ị l v t p qu n mỗi n i. Ng l y lư ng thự giúp nhi u n i gi i quy t n n i trong Việt N m. S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i sống on người ũng như ng v t r thể ược ng d ng trong ng nh kh như ược phẩm. G n y th n ng ngo i việc s d ng l m hất ốt n l nguy n liệu ti m n ng ể ch t o x ng sinh h c. S n lượng ng h ng n m ị gi m sút ng kể bởi rất nhi u nh n tố sinh v t (biotic) ũng như phi sinh (abiotic). Trong h n h n l nguy n nh n phi sinh quan tr ng nhất khi n s n lượng ng mất m t l n n h n 70%. ất kh ằn c ng với lượng nướ mư ph n ố kh ng u dẫn tới k t qu thu ho ch chỉ n 1,3 tấn/ha gi m ng kể so với ti m n ng thu ượ h n 10 tấn/ ha [64]. Ch nh sự kh ằn ã l t ng tố qu tr nh lão h l , suy gi m kh n ng qu ng hợp dẫn n gi m sút s n lượng [84]. ytokinin v i tr thi t y u n nhi u qu tr nh t ng trưởng v ph t triển c a thực v t ặc biệt trong sự ph n hi t o [68]. Trong ng nghệ nu i ấy m t o in vitro, ytokinin v i tr rõ r ng trong việ giúp m l t h rời ch m tho i h iệp l c tố. Ngay c trong thực ti n th việc x l ytokinin ũng m ng nghĩ thư ng m i rất lớn v ytokinin giúp uy tr sự xanh tư i l u h n a rau sau thu ho h v kéo i tu i th c a hoa sau khi cắt khỏi y [45]. Trong khi những phư ng ph p nh t truy n thống ã những th nh ng nhất ịnh trong việc t o ra những giống y hịu h n, th việc b sung v kỹ thu t ng nghệ sinh h v o việc t o y huyển gen th h ng ược với h n h n ũng ã ướ u ch ng minh ược k t qu c m nh. ã những nghi n u v bi n n p gen ipt- mã h enzyme isopentenyl tr nsfer se li n qu n n sinh t ng hợp 1
cytokinin isopentenyl adenine, ze tin v ihy roze tin v o m t số y tr ng. K t qu cho thấy trường hợp như: lú - Oryza sativa [41], súp l - Brassica oleracea [72] v x l h- Lactuca sativa L. cv Evola [65], thuố l [84], ng [58], l c[78] v ng [85] u t những th nh ng nhất ịnh. Nhằm ướ u t o ra giống ng kh n ng hịu h n, húng t i ti n h nh t i “Nghiên cứu tạo c c dòng ngô mang gen isopentenyl transferase (ipt) ằng ph ng ph p i n nạp nh vi huẩn Agrobacterium tumefaciens” với m ti u:  Bi n n p th nh ng gen ipt v o m t số ng ng h nl c  Kiểm tra sự mặt c a gen ipt bằng kỹ thu t sinh h ph n t  ướ u nh gi kh n ng hịu h n ở y on th hệ T1 2
Ch ng –T NG QUAN 1.1 Nguồn gốc cây ngô Ng hay bắp t n kho h l Zea mays L. Trong ti ng Anh từ “m ize” ắt ngu n từ ti ng T y n Nh (m z) (“M ize”- Oxford English Dictionary online edition). Từ “ orn” thường hay s d ng hiện n y l h g i rút g n c “In i n orn” nghĩ l “ y lư ng thực c người nh i ng” (“M ize”-Oxford English Dictionary online edition.). ảng 1: Phân oại thực vật Giới (kingdom): Plantae (kh ng ph n h ng): Angiosperms (kh ng ph n h ng): Monocots (kh ng ph n h ng): Commelinids B (order): Poales H (family): Poaceae Chi (genus): Zea Lo i (species): Z. mays nhi u gi thuy t ượ ư r v ngu n gốc c ng trong n i l n 4 nh n ịnh: 1.Sự thu n h trực ti p từ cỏ teosinte 2.Ngu n gốc từ y l i giữ ng thu n h v ỏ teosinte 3.Tr i qua hai hay nhi u qu tr nh thu n h a c ng ho ng d i v teosinte 4.Ti n h từ y l i c a Z. diploperennis thu lo i Trips um [73, 102]. Những nghi n uv i truy n h g n y ho rằng qu tr nh thu n h ng i n r v o kho ng n m 7000 T N t i mi n trung Mexi o v t ti n n l lo i ỏ teosinte ho ng i g n giống nhất với ng ng y n y vẫn nm trong lưu vự s ng ls s [36]. George Beadle v o n m 1939 ã hi sẻ qu n iểm n y trong nghi n uc m nh v ngu n gố y ng [27]. Trướ v o n m 1926 Vavilop ũng ã h ng minh mi n trung n m Mehi o l trung t m ph t sinh th nhất v 3
vùng núi Andet thu Peru l trung t m ph t sinh th hai c y ng [98]. ng qu n iểm với ng l Galinat v K to l n lượt v o n m 1977 v 1988 [42, 55]. Theo những nghi n u v kh o c h người t t m thấy những h th ch bắp ng t i h ng Guil N quitz trong thung lũng O x ni n i kho ng n m 4250 T N, v nhất l t i h ng ng Tehu n, Pue l ni n i 3450 TCN [86]. n nh những nghi n u v o n m 2009 hỉ ra rằng ã những ng bằng ược ho l ùng ể nghi n ng ở lớp tr m t h 8700 n m tu i [77, 80]. Từ ngu n gố ng ã l n r ng h t vùng thu h u Mỹ. L n ph ắc, s ng ph T y N m Ho kỳ v n ũng như xuống ph N m hile, E u or, olum i v nhi u vùng thu r zin. Qu qu tr nh thự nh h u Mỹ c a người h u Âu m khởi ul huy n th m hiểm c olom us n m 1493 v ặc biệt l huy n th m hiểm th h i n m 1494, Ng ã ượ ư v o u ti n t i T y n Nh v l n truy n khắp vùng nl ic h u Âu [21]. Người t nh nh h ng nh n bi t ượ gi trị c y ng v ph bi n húng ng y ng r ng rãi. V o những n m u th kỷ XVI, ằng ường th y t u o Nh , T y n Nh , It li ã ư y ng r h u h t l ị th giới ũ. N m 1517, ng xuất hiện ở i p, Th Nhĩ Kỳ, Ph p, ,s u l n m h u Âu v ắ Phi. N m 1521, ng n ng Ấn v qu n o In onesi . V o kho ng n m 1575 ng ượ ư n Trung Quố [37]. Theo nh h L Qu n trong “V n i lo i ngữ”, ng ượ ư v Việt N m qu huy n i s Trung Quố (thời Kh ng Hy) ng Tr n Th Vinh (người huyện Ti n Phong, S n T y) v o uối th kỷ XVII. Với ặ t nh qu ul kh n ng th h ng r ng tr n nhi u ị h nh t i Việt N m , ng ã ượ nh n r ng u ti n t i S n T y v vùng kh , ặ iệt l những vùng o kh ng kh n ng tưới nướ thường xuy n. Ng sớm ượ hấp nh n v ã trở th nh y lư ng thự ng th h i hỉ s u lú nướ t i Việt N m. 4
1.2 T nh h nh nghiên cứu ngô trên th giới y ng ược tr ng r ng rãi khắp n i tr n th giới, v s n lượng ng h ng n m nhi u h n ất c lo i ngũ ố n o. Theo số liệu n m 2009, t ng s n lượng ng s n xuất ượ tr n th giới l 817 triệu tấn nhi u h n lú nước (678 triệu tấn) hay lú m (682 triệu tấn). Trong s n lượng c a Mỹ l o nhất chi m n 40%, ti p n l Trung Quốc, Brazil, Mexico, Indonesia, Ấn , Ph p, rgentin , N m Phi, Ukraine (theo FAOSTAT 2009). Trong n m 2009, h n 159 triệu h ng ược tr ng khắp n i tr n th giới với s n lượng trung nh l 5 tấn/ha. ảng 2: T nh h nh sản xuất ngô trên th giới nh ng năm g n đây (FAOSTAT 04/08/2014) Năm Diện tích Năng suất Sản ng (Triệu ha) (Tấn/ha) (Triệu tấn/ha) 2003 144,7 4,5 645,2 2004 147,5 4,9 728,9 2005 148 4,8 713,7 2006 146,7 4,8 706,8 2007 158,4 4,98 790,1 2008 162,7 5,1 830,6 2009 158,7 5,17 820,2 2010 164 5,19 851,3 2011 172,3 5,15 887,9 2012 178,6 4,89 872,8 2013 184,2 5,52 1016,7 Theo thống k uối n m 2014 u n m 2015 th t ng s n lượng ng s n xuất ượ tr n th giới l n tới tr n 1 tỷ tấn (vượt tr i so với lú nước 740 triệu tấn v lú mỳ 715 triệu tấn). H i nướ ng u v s n lượng vẫn l Mỹ (35%) v Trung Quốc (21%), ti p nl r zil, rgentin , Ukr ine (theo F OST T 2015). Diện t h tr ng v n ng suất u t ng so với n m 2012 trở v trước. 5
Như v y trong nhưng n m g n y, n ng suất v iện t h tr ng ng t ng nhưng kh ng th y i ng kể kéo theo t ng s n lượng ng ũng hỉ t ng nh . Theo dự o thực hiện n m 2003 c a viện nghi n u hư ng tr nh lư ng thực th giới IPRI nhu c u v ng sẽ n t ng cao h n nữa v o n m 2020 [76]. Tuy nhi n, rất nhi u y u tố nh hưởng n n ng suất ũng như s n lượng ng . og m y u tố ngu n gốc từ sinh v t ( ioti ) như ỏ d i, s u ệnh… v y u tố phi sinh ( ioti ) như nhiệt , nh s ng, ngu n nướ … Những ti n b v khoa h n i hung h y huyển gen n i ri ng u nhằm m c h khắc ph c những vấn v ũng t ược m t số th nh tựu kh quan. ng thời ng huyển gen ũng ượ ưu ti n theo hướng rõ r ng h n. Quy tr nh ể ph t triển y ng t i sinh từ m t t o i nn p ể ược t n suất cao với m c ti u ặt ra: tố , u ra, kiểu gen c l p v v t ch ph t triển b n vững l ưu ti n quan tr ng h ng u trong ng nghệ sinh h c thực v t. ể t m r quy tr nh lo i m kh nh u l n lượt ược th nghiệm ể kiểm tra kh n ng t i sinh o g m: ch i ỉnh, l , th n, tr tr n v ưới l m m, ph i non v h t [96]. Sự ph t triển nu i ấy m thực v t ặc biệt l ngũ ố ược thực hiện c l p với những nỗ lực chuyển n p gen li n qu n. ho n khi kỹ thu t bi n n p ược ph t triển tr n y thuố l th người ta mới t nh n việc ng d ng ho y ngũ cố . V v y, qu tr nh ph t triển nu i ấy m v i n n p hư ượ ph t triển m t h song song. Nỗ lực bi n n p u ti n oe v S rk r v o n m 1966 l tr n phấn c y ng [34]. G n y noãn ã th phấn ã ượ th nghiệm th nh ng như l m t ối tượng i n n p ởi nh kho h Trung Quố [33]. Ph i non ược s d ng r ng rãi trong việ t i sinh v i n n p ng từ khi o o u ti n v m s o to n n ng ng kh n ng t i sinh [47]. V o n m 2006 l- e ã nh n r kiểu gen ng v i tr qu n tr ng trong việ ph t triển ph i non th nh m s o, h y n i h kh việ t m r ng ng kh n ng k h ng th nh m s o l ti n qu n tr ng trong việ huyển gen s u n y [17]. hai lo i m s o: m s o lo i I ng rắn ặ h n v kh n ng ph t sinh qu n, m s o lo i II ở h n v kh n ng ph t triển ph i. M s o lo i II xuất hiện với t ng số thấp h n nhưng l i kh n ng t i sinh o h n lo i I [22]. n nh 6
, việ tối ưu h th nh ph n m i trường ũng rất qu n tr ng, th nh ph n ã ượ nghi n u h nl kỹ ng [28, 38, 106]. Tuy nhi n, những h hất ặ iệt hỉ th h hợp với m t v i ối tượng thể [46]. V v y việ h nh th nh hệ thống m i trường th h hợp ho m t v t liệu mới rất ấp thi t, ặ iệt trong huyển gen [75]. Việ tối ưu h i u kiện ể h nh th nh m s o to n n ng kh n ng t i sinh từ ph i non ti p t ượ nghi n uv ã t ượ k t qu . J ku ekov v ng sự ã t i sinh th nh ng từ ph i non h i ng ng 18 v 19 ể r ượ y ho n hỉnh [54]. n n m 2014, Lee v Zh ng ã ng ố quy tr nh ho n thiện v huyển gen v o ng từ v t liệu n u l ph i non th ng qu vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [60]. Những th nh ng u ti n v ng huyển gen thu v ng huyển gen kh ng s u v thuố trừ ỏ. Tuy nhi n, m t mối nguy hiểm ặt r l t n t i sự trao i v t chất di truy n giữ y huyển gen v ỏ d i khi n thuốc diệt cỏ mất t d ng. m t gi i ph p ược Tilney- ssett ư r l huyển gen kh ng v o l c l p. DNA l c l p sẽ di truy n theo ng m v kh ng l n truy n qua h t phấn [97]. ặc biệt g n y gen chịu h n rất ượ qu n t m. Tuy nhi n, kh n ng chịu h n l m t t nh tr ng ph c t p, nghi n u ã hỉ ra rằng m t chi n lược ch n t o y ng hịu h n bi n i gen hiệu qu l hi n lược s d ng ùng m t lú nhi u gen chịu h n hiệu qu hoặc s d ng hỉ m t gen i u khiển t ng i u khiển nhi u gen th m gi qu tr nh hịu h n. n nh gen i u khiển n gen mã h ho protein h n ng th m gi v o những ph n ng uối ( ownstre m) trong huỗi p ng, giúp k h ho t những ph n ng ặ iệt p l i sự thi u h t nướ o h n h n. Theo nghi n uc Nelson v ng sự v o n m 2007 th gen ZmNF- YB2 giúp t ng n ng suất giống ng i n i gen l n h n gấp hai l n so với y ối ch ng. y huyển gen iểu hiện chịu h n tốt với kh n ng uy tr qu ng hợp, h m lượng diệp l c tố n ịnh, gi m héo rũ. Gen ZmNF-YB2 l gen ược x ịnh từ b gen c y m h nh Arabidopsis v ngu n gốc từ lo i h 7
h ng y ng ượ ng ty Mons nto u tư v thư ng m i h s n phẩm ng chuyển gen chịu h n [71]. N m 2009, ssem ã nghi n c u chuyển gen NPK1 (Nicotiana Protein Kin se) v o giống ng i p th ng qu vi khuẩn A. tumefaciens. Gen NPK1 li n qu n n kh n ng hịu p suất thẩm thấu giúp ng hống chịu ượ t nh tr ng thi u nướ ũng như sống trong m i trường n ng muối cao. ssem nk t hợp chuyển gen bar- gen kh ng thuốc trừ cỏ như l m t nh n tố ch n l c thực v t. K t qu chuyển gen th nh ng với hai lo i ng i p (Gz 639 v Gz 649) v ng ng Mỹ A188 với sự trợ giúp a promoter 35S C4 PPDK [23]. Gen DREB ( ehy r tion-responsive element- in ing) l nh n tố phi n mã th m gi t h ự v o qu tr nh hống hịu với i u kiện ất lợi m i trường ằng h k h ho t sự ho t ng gen th m gi trự ti p hống l i i u kiện ất lợi m i trường như h n h n, mặn, l nh. Gen DREB ã ượ i nn p v o ng g m DREB1A/CBF3 t h từ r i opsis [16] hay ZmDREB ượ t h từ h nh gen giống ng 73 [62]. Gen ipt mã h enzyme isopentenyl tr nsfer se, enzyme n y t ng t ng n ng ytokinin th ng qu việ t ng hợp ti n hất trong qu tr nh t ng hợp. Khi qu tr nh h gi l ượ nh n i t ởi promoter, n ng ytokinin trong m sẽ ượ t ng l n giúp tr hoãn qu tr nh . Qu tr nh n y l m t ng n ng h - m n hệ thống nhưng l i kh ng l m th y i lớn v kiểu h nh. V o n m 2004, Ro son v ng sự ã nghi n u chuyển gen ipt từ vi khuẩn Argrobacterium s d ng promoter PSEE1 từ ng ể l m h m qu tr nh lão suy ở l . ng ng biểu hiện gen chuyển ã ượ ph n t h hi ti t ở ấp biểu hiện kh nh u tr n kiểu h nh. M t trong ng ng ã những biểu hiện rõ r ng. Nghi n u n y ã h ng minh ược việc chuyển gen kh n ng l m h m qu tr nh lão h thực hiện ượ tr n y m t l m m n i hung h y ng n i ri ng [85] n nh n hướng nghi n u nhằm t ng o những ặ t nh lợi cho thực v t như huyển gen t o y s n xuất protein ng v t [88, 89]. Chuyển gen th y i h m lượng v hất lượng hất inh ư ng c y [59]. 8
Giống ng huyển gen u ti n ượ hấp nh n l SYN-EV176-9 t i Ho Kỳ o ng ty Syngent ng k v o n m 1995. y l giống ng huyển gen hống thuố trừ ỏ glufosin te v kh ng s u nh v y Lepi opter . V s u g n 20 n m, TM n m 2013 giống ng huyển gen hịu h n roughtG r l n u ti n ượ tr ng ũng t i Ho kỳ. ho nn y 4 sự kiện ng huyển gen chịu h n ã ượ thư ng m ih t i Mỹ, trong 01 sự kiện n t nh tr ng l MON87460 m ng gen cspB (gen ph n l p từ Bacillus subtilis)-t n thư ng m i: Genuity® roughtG r ™ v 03 sự kiện t nh tr ng ượ l i t o từ sự kiện tr n: (1). MON87460 x MON89034 x MON88017: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps), kh ng s u nh ng (cry3Bb1), nh v y (cry1A.105, cry2Ab2), chịu h n (cspB); (2). MON87460 x MON89034 x NK603: t nh tr ng: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps), kh ng s u nh v y (cry1A.105, cry2Ab2), chịu h n (cspB); (3). MON87460 x NK603: t nh tr ng: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps), chịu h n (cspB) (ISAAA,2015). 1.3 T nh h nh nghiên cứu ngô ở Việt Nam: Ở Việt N m, ng l y lư ng thự ng h ng th h i s u lú nước. Ph n ố r ng khắp c nước ở h u h t vùng sinh th i với 8 vùng h nh: vùng ng ng bằng Bắc b , vùng ng Việt Bắ v ng ắc b , vùng ng T y ắc b , Vùng ng Bắc Trung b , vùng ng uy n h i Nam Trung b , vùng ng T y Nguy n, vùng ng ng N m v vùng ng ng bằng s ng u Long. Diện t h gieo tr ng v n ng suất, s n lượng ng ũng t ng m nh, từ h n 200 ng n h với n ng suất 1 tấn/ha (n m 1960) nhờ mở r ng giống ng lai s n xuất v i thiện iện ph p nh t , n n m 2009 ã vượt ngư ng 1 triệu ha với n ng suất 4,3 tấn/ha. So với nước tr n th giới th n ng suất ng ở ta vẫn thu c lo i kh thấp, ưới m n ng suất trung nh t i thời iểm l 5tấn/ha (theo FAOSTAT, 2009). ặc biệt t i m t số ị phư ng mi n núi vùng s u, vùng x tỉnh L i h u, S n L , Th nh H , Qu ng N m, L m ng… m t số ng o nt t người s d ng ng l ngu n lư ng thực, thực phẩm h nh, s d ng giống ng ị phư ng v t p qu n nh t l c h u n n n ng suất ng ở y hỉ t tr n ưới 1 tấn/ha. Theo số liệu 9
thống k mới nhất từ FAOSTAT-2015, s n lư ng ng a Việt Nam n m 2013 l 5,2 triệu tấn với diện t h gieo tr ng t ng nh so với n m 2010 n 1170 ngh n h t n ng suất 4,44 tấn/h t ng h n 3% so với n m 2012. M t ng trưởng n y kh ng thể p ng nhu u trong nước, h ng n m húng t n ph i nh p khẩu kh nhi u ng h t (trị gi tr n 500 triệu US ) ể s n xuất th n gi sú . ảng 3: T nh h nh sản xuất ngô ở Việt Nam nh ng năm g n đây (FAOSTAT 04/08/2014) Năm Diện tích Năng suất Sản ng (Ngh n h (Tấn/ha) (Triệu tấn/ha) 2003 912,7 3,44 3,1363 2004 991,1 3,46 3,4309 2005 1.052,6 3,60 3,7871 2006 1.033,1 3,73 3,8545 2007 1.096,1 3,93 4,3032 2008 1.440,2 3,18 4,5731 2009 1.089,2 4,01 4,3717 2010 1.126,3 4,09 4,6068 2011 1.121,2 4,31 4,8357 2012 1.118,2 4,30 4,8032 2013 1.170,3 4,44 5,1909 Hiện n y v trong những n m tới, ng vẫn l y ngũ ố v i tr qu n tr ng ở nước ta. Gi trị inh ư ng c ng kh o với 10,6% protein (zein), 4-5% lipit (50% l xit linolei , 31% l xit olei , 13% l xit p nmiti v 3% l Ste ri ), 69% gluxit (ch y u l tinh t v m t số ường n v kép), hất kho ng (gi u photpho, nghèo nxi) v vit min ( 1, rotene- ti n vitamin A). Ng rất nhi u ng d ng, tất c ph n c y ng từ h t, n th n, l u thể s d ng ượ ể l m lư ng thực, thực phẩm ho người, th n ho gi sú , l m nguy n liệu cho ng nghiệp như rượu ng , s n xuất eth nol ể ch bi n x ng sinh h c, th m h n n h bi n t o ra m t số v t d ng ùng, trang s c c a ph nữ . H u h t ph n c ng h a m t số chất v i tr như m t lo i thuốc chữa bệnh 10
nhờ ch h m lượng kali cao. H t ng v m m ng giúp t ng ường kh n ng hấp th inh ư ng, trị i ngo i ph n sống, l ng r u ng ru t bấ th n ng un nước uống t ng lợi tiểu, lõi ng un nướ l vị thuốc chữa ch ng bệnh ra m h i [1]. Ngo i r ph n bỏ i thể l m hất ốt. ảng 4: Thành ph n dinh d ng trong g hạt - nguồn: en.wikipedia.org ũng như nướ kh tr n th giới Việt N m ũng ối mặt với những i u kiện bất lợi n s n lượng ng như ỏ d i, s u bệnh bao g m những lo i s u ệnh h nh s u. S u h i ng : s u x m, s u x nh, s u th n, s u ắn l , s u g i, rệp h i ng , h u hấu h i ng , m t h i ng g y r lo i bệnh ho ng . M t số lo i bệnh thường thấy ở ng như ệnh h i h t, bệnh thối th n o nấm hay vi khuẩn, bệnh kh vằn, bệnh b ch t ng, bệnh phấn en, ệnh sợi en, ệnh ốm l v ệnh rỉ sắt. Nhưng tr n h t h n h n mới l nguy n nh n qu n tr ng nhất nh hưởng n qu tr nh sinh trưởng ng l m gi m n ng suất [40]. Hệ thống tưới ti u th s n n việc tr ng ng ở Việt Nam ph thu c ch y u từ “nước trời” chi m tr n 70%, diện t h h ng tưới chỉ kho ng 30%. Ngu n nước cung cấp ho ng ượ hi r l m h i ngu n h nh g m nướ mư v từ ao h s ng suối. Tuy lượng mư trung nh h ng n m nướ t v o kho ng 1700-2000 mm cho nhu c u sinh trưởng v ph t triển c y ng nhưng lượng mư l i t p trung theo mù n n v o mù kh y ng thường bị thi u nước. Với những hiện tượng i n i kh h u g n y, h n h n nguy x y thường xuy n h n [87]. M g n 11
y nhất l ợt h n h n từ uối n m 2014 n t n giữ n m 2015 ở tỉnh N m Trung ặ i t l Ninh Thu n khi n t nh h nh s n xuất h n 6.100 h ất ph i t m ngừng s n xuất. Nhu u t o r giống y tr ng hịu h n n i hung h y ng hịu h n n i ri ng l ấp thi t h n o giờ h t. Ng chuyển gen chịu h n l th h th c lớn ngay c ối với huy n gia h ng u tr n th giới bởi v n ph thu v o nhi u gen kh nh u h kh ng ph i n gen. nh kho h c Việt N m ã s d ng phư ng ph p truy n thống k ross (l i ngượ ) ể l i t o t nh tr ng chịu h n v o m t số ng ng thư ng m i. Hay ng ng sinh h ph n t v o h n giống ể t n ng giống s n ở Việt N m. ng hú nhất g n yl “ t i nghi n u huyển gen n ng cao t nh hịu h n v o m t số ng ng ốm ng ượ p ng trong s n xuất”, m t t i cấp nh nướ , mang mã số KC.04.02/11-15 do TS ùi M nh ường- Viện ph Viện nghi n u Ng l h nhiệm t i. V o u n m 2014 Viện Nghi n u Ng ũng ã th ng o ã huyển th nh ng 3 gen hịu h n og m DREB2A, HVA1 v CspB v o 3 ngu n v t liệu ng Việt N m ằng phư ng ph p huyển gen th ng qu vi khuẩn A. tumefaciens. ùng với phư ng ph p h n t o giống truy n thống ng y ng hiệu qu h n th việc ng d ng ng nghệ sinh h ểt or giống ng i n i gen kh n ng chống chịu với i u kiện bất thu n sinh h v phi sinh h c ũng ã ược triển khai t i Viện Di Truy n N ng Nghiệp. Từ n m 2003, l n u ti n ở Việt N m, Ph m Thị L Thu ã nghi n u x y ựng hệ thống t i sinh ở ng ph v ho huyển gen ằng Agrobacterium v súng ắn gen t o y huyển gen b n vững bằng phư ng ph p n y tr n ng ng ngu n gố n ới như 188, H99. Viện ã t o ượ ng ng huyển gen b n vững m ng gen: kh ng thuốc diệt cỏ, gen GFP, gen kh ng kh ng sinh, gen t ng ường hấp th nit v gen hịu l nh [8-10]. V v o n m 2007 ã ti n h nh i n n p gen gus/p t v o ng ng m h nh (HR8 HR9) [7] . N m 2009, Nguy n V n ng v ng sự ã những th nh ng ướ u trong nghi n u kh n ng ph t sinh m s o ph i h v m t i sinh y ho n chỉnh từ ph i non a m t số ng ng Việt Nam [3]. Nghi n u n y ũng l ước 12
ệm c hư ng tr nh ng Nghệ Sinh H N ng Nghiệp t o i u kiện cho những th nh ng s u n y. Ph i kể nl i n n p th nh ng gen Cry 1Ac v o 2 ng ng m h nh HR8 v HR9 [4]. H n th nữa l n u ti n t i Việt N m, gen kh ng s u Cry 1Ac ã ược bi n n p th nh ng v o ng ng h n l c [5]. Nghi n c u v bi n n p gen kh ng h n v o m t số ng ng h nl th ng qu vi khuẩn A. tumefaciens ũng ng ướ u ược triển kh i nghi n uv t ược m t số k t qu nhất ịnh [6]. Ph n l p v thi t k ve tor m ng gen i u khiển t nh hịu h n ph c v ng t t o giống y tr ng chuyển gen ũng ng thực hiện ở Viện Di Truy n N ng Nghiệp [13]. ước ti p c n với vấn chuyển gen chịu h n v o ng ng ở Việt N m ũng ng thời ược triển khai t i ph ng th nghiệm tr ng iểm ng Nghệ T o Thực V t – Viện Di Truy n N ng Nghiệp. Việ tr ng th nghiệm y tr ng i n i gen mặ ù vẫn ng tr nh ãi, nhưng từ n m 2011, N ng nghiệp v Ph t triển n ng th n ã ấp phép kh o nghiệm nh gi nh hưởng n m i trường v ng sinh h m t số giống ng huyển gen ã ượ thư ng m i h như: (1) ng ty Syngent kh o nghiệm ng huyển gen G 21 kh ng s u th n v ng t11 kh ng thuố trừ ỏ. (2) ng ty eK l kh o nghiệm ng MON89034 kh ng s u nh v y v ng NK603 kh ng thuố trừ ỏ. (3) ng ty Pioneer Hi- re kh o nghiệm ng EVENT T 1507 kh ng s u nh phấn. ướ kh o nghiệm n n y (n m 2015) ã k t thú v mới y ã ấp h ng nh n ho h i ng ty eK l v Syngent ượ n r ng rãi ng i n i gen tr n thị trường Việt N m. H i ng ty n y ng triển kh i m h nh iểm tr ng th nghiệm giống ng i n i gen n y t i tất vùng tr ng ng tr ng iểm tr n to n quố . 1.4 C sở ho học v nghiên cứu nạp gen vào thực vật bằng ph ng ph p Agrobacterium tumefaciens Hiện n y rất nhi u kỹ thu t chuyển gen kh nh u v o t o song kỹ thu t chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens vẫn ược ng d ng r ng rãi l nhờ những ưu iểm sau:  Kh ng i hỏi d ng c ặc biệt  Số lượng b n copy thấp v n ịnh ở th hệ on h u 13