Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo nước hoạt hoá plasma và ứng dụng nâng cao tỷ lệ nảy mầm hạt và tăng trưởng của xà lách xoăn (Lactuca capitata)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:65

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là tối ưu hóa điều kiện chế tạo nước hoạt hóa plasma và đánh giá hoạt tính của nước hoạt hóa plasma đối với sự nâng cao tỷ lệ nảy mầm hạt và tăng trưởng trong giai đoạn sớm của xà lách xoăn (Lactuca capitata).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo nước hoạt hoá plasma và ứng dụng nâng cao tỷ lệ nảy mầm hạt và tăng trưởng của xà lách xoăn (Lactuca capitata)

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Võ Kỳ Duyên NGHIÊN CỨU TẠO NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA VÀ ỨNG DỤNG NÂNG CAO TỶ LỆ NẢY MẦM HẠT VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA XÀ LÁCH XOĂN (LACTUCA CAPITATA) LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM TP. Hồ Chí Minh - 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Võ Kỳ Duyên NGHIÊN CỨU TẠO NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA VÀ ỨNG DỤNG NÂNG CAO TỶ LỆ NẢY MẦM HẠT VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA XÀ LÁCH XOĂN (LACTUCA CAPITATA) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: TS. Phạm Hữu Thiện Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Hoàng Dũng TP. Hồ Chí Minh - 2020
i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sĩ: “Nghiên cứu tạo nước hoạt hóa plasma và ứng dụng nâng cao tỷ lệ nảy mầm hạt và tăng trưởng của xà lách xoăn (Lactuca capitata)” là do tôi thực hiện với sự đồng ý và hướng dẫn nhiệt tình của thầy TS. Phạm Hữu Thiện và thầy TS. Nguyễn Hoàng Dũng. Đây không phải là bản sao chép của bất kì một cá nhân, tổ chức nào. Các kết quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh giá. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình bày ở luận văn này. TP. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 10 năm 2020 Người cam đoan Nguyễn Võ Kỳ Duyên
ii Lời cảm ơn Em chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Thầy TS. Phạm Hữu Thiện đã tận tình hướng dẫn, bồi dưỡng kiến thức và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn. Thầy TS. Nguyễn Hoàng Dũng đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và luôn động viên giúp đỡ em trong quá trình học tập, làm luận văn. Giáo sư Ahmed KHACEF - Đại học Orleans và Th.S Thân Quốc An Hạ - Phó phòng Kỹ thuật Vật lý thuộc Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đã hỗ trợ rất nhiều về mặt chuyên môn và các thiết bị thí nghiệm cho em hoàn thành luận văn. Học viện Khoa học và Công nghệ, đặc biệt là Phòng Đào tạo, Khoa Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và làm luận văn. Các Thầy, Cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến hữu ích cho luận văn của em. Ban lãnh đạo Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng và Viện Sinh học Nhiệt đới đã giúp em có điều kiện về cơ sở vật chất cũng như thời gian để thực hiện các thí nghiệm trong luận văn. Các anh chị và các bạn chuyên ngành Sinh học thực nghiệm khóa 2018B, các anh chị em đồng nghiệp trong nhóm nghiên cứu plasma nông nghiệp tại phòng Kỹ thuật Vật Lý - Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập, làm luận văn. Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn ba mẹ và em Hạnh Duyên đã luôn yêu thương, tạo mọi điều kiện cho con học tập. Nguyễn Võ Kỳ Duyên
iii Mục lục Trang Lời cam đoan ...................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................. iii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ............................................................... v Danh mục các hình vẽ, đồ thị ........................................................................... vi MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ XÀ LÁCH XOĂN VÀ SỰ NẢY MẦM VÀ TĂNG TRƯỞNG HẠT ................................................................................................. 3 1.1.1. Xà lách xoăn ............................................................................................ 3 1.1.2. Sự nảy mầm hạt ....................................................................................... 6 1.1.3. Sự tăng trưởng trong giai đoạn đầu của hạt .......................................... 10 1.2. TỔNG QUAN VỀ NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA.............................. 11 1.2.1. Giới thiệu chung về plasma và nước hoạt hóa plasma ....................... 11 1.2.2. Chế tạo nước hoạt hóa plasma ............................................................ 11 1.2.3. Sự tạo thành của các các chất có chứa gốc oxy tự do (ROS) và các chất có chứa gốc nitơ tự do (RNS) có trong nước hoạt hóa plasma ....................... 12 1.2.4. Vai trò của nước hoạt hóa plasma đối với sự nảy mầm hạt .................. 14 1.2.5. Vai trò của nước hoạt hóa plasma đối với sự tăng trưởng trong giai đoạn đầu của hạt ....................................................................................................... 19 1.2.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ........................................... 19 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................ 22 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ......................................... 22
iv 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU.............................................................................. 22 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 23 2.3.1. Điều chế và xác định tính chất lý hóa của nước hoạt hóa plasma ........ 23 2.3.2. Sự ảnh hưởng của nước hoạt hóa plasma đến quá trình nảy mầm hạt . 24 2.3.3. Sự ảnh hưởng của nước hoạt hóa plasma đến quá trình tăng trưởng sớm của hạt ............................................................................................................. 26 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 27 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 28 3.1. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA ............... 28 3.2. SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA ĐẾN QUÁ TRÌNH NẢY MẦM HẠT ............................................................................... 33 3.2.1. Kết quả chụp SEM ................................................................................ 33 3.2.2. Trọng lượng nghìn hạt........................................................................... 35 3.2.3. Tỷ lệ nảy mầm hạt ................................................................................. 36 3.3. SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA ĐẾN QUÁ TRÌNH TĂNG TRƯỞNG TRONG GIAI ĐOẠN SỚM CỦA HẠT ............. 39 3.3.1. Chiều cao thân, chiều dài rễ .................................................................. 39 3.3.2. Trọng lượng khô/ trọng lượng tươi ....................................................... 43 3.3.3. Diện tích lá ............................................................................................ 44 3.3.4. Nồng độ chlorophyll trong lá ................................................................ 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 48
v Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ABA: Abscisic acid Axit abxixic DBD: Dielectric barrier discharge Phóng điện qua lớp điện môi DNA: Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic GA: Gibberellic acid Axit gibberellic PAW: Plasma activated water Nước hoạt hóa plasma RNA: Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNS : Reactive nitrogen species Các chất chứa ni-tơ có hoạt tính ROS : Reactive oxygen species Các chất chứa oxy có hoạt tính SEM: Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét
vi Danh mục các hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1. Hình ảnh minh họa hình dáng rễ (s), thân (b), lá (c) và hoa (d) của xà lách xoăn ........................................................................................................... 4 Hình 1.2. Sự hình thành và phân giải của NO trong thực vật ....................... 14 Hình 1.3. Quá trình đồng hóa Nitơ trong thực vật ........................................ 16 Hình 2.1: Hoa chứa hạt xà lách xoăn ………………………………….........21 Hình 2.2: Sơ đồ chế tạo PAW (trái) và hình vẽ minh họa sơ đồ (phải)...............................................................................................................22 Hình 2.3: Các bước tiến hành theo dõi sự ảnh hưởng của PAW đối với sự nảy mầm và tăng trưởng hạt xà lách xoăn ............................................................. 27 Hình 3.1: Sự thay đổi nồng độ của NO3-, H2O2, O3- trong nước khi thay đổi thời gian hoạt hóa plasma ……………………..…………………………………27 Hình 3.2: Sự thay đổi độ dẫn điện của nước khi tăng thời gian hoạt hóa plasma ......................................................................................................................... 31 Hình 3.3: Sự thay đổi pH trong nước khi tăng thời gian hoạt hóa plasma .... 32 Hình 3.4: pH của PAW trong 60 phút hoạt hóa plasma……………..………32 Hình 3.5: Ảnh SEM bề mặt hạt sau 2 giờ ngâm với các mẫu nước khác nhau ................................................................................................................. 34 Hình 3.6: Trọng lượng nghìn hạt của các mẫu sau 2 giờ ngâm với nước cất và các mẫu nước hoạt hóa plasma ở thời gian khác nhau.................................... 35 Hình 3.7: Tỷ lệ nảy mầm hạt (Rg) trong 3 ngày đầu…………………………36 Hình 3.8: Các chỉ số nảy mầm hạt vào ngày thứ 3......................................... 38 Hình 3.9: Sự hình thành cây con từ hạt ngâm với P15 sau 0 giờ (a) 3 giờ (b), 6 giờ (c) và 24 giờ (d)…………………………………………………………..39 Hình 3.10: Chiều dài phôi sau 24 giờ theo dõi ............................................... 40 Hình 3.11: Chiều chiều cao thân và chiều dài rễ sau 3 ngày theo dõi ........... 41
vii Hình 3.12: Hình ảnh các mẫu cây sau 7 ngày theo dõi .................................. 42 Hình 3.13 : Hình dạng rễ ở của cây P5 (trái) và P30 (phải) sau 3 ngày theo dõi ......................................................................................................................... 42 Hình 3.14: Tỷ lệ trọng lượng khô và trọng lượng tươi sau 7 ngày theo dõi …………………………………………………………………………….....43 Hình 3.15: Diện tích sau 7 ngày theo dõi ....................................................... 44 Hình 3.16: Ảnh chụp các mẫu lá sau 7 ngày theo dõi ……………………....44 Hình 3.17: Nồng độ chlorophyll trong lá được đo sau 7 ngày theo dõi ........ .45
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay, các nhà khoa học đã nghiên cứu được rất nhiều cách để kích thích hạt nảy mầm nhanh như sử dụng từ trường [1], xử lý siêu âm [2] và sử dụng ô-zôn, tia UV hay plasma nguội hay nước hoạt hóa plasma (Plasma activated water – PAW) [3]. Ở mỗi phương pháp đều có các ưu, nhược điểm khác nhau. Tuy nhiên, nước hoạt hóa plasma (PAW) có nhiều ưu điểm hơn như thân thiện với môi trường, thời gian xử lí ngắn, tiết kiệm năng lượng, không gây hại cho hạt, thực vật cũng như sức khỏe con người. Chính vì thế mà trong những năm gần đây việc áp dụng PAW trong nông nghiệp, cụ thể là kích thích nảy mầm vầ tăng trưởng đang trở thành xu hướng nghiên cứu mới của các nhà khoa học trên thể giới. Mặt khác, hiệu quả kích thích nảy mầm và tăng trưởng thực vật của PAW phụ thuộc vào thành phần và nồng độ các chất có trong PAW, vì thế việc nghiên cứu chế tạo PAW để ứng dụng trong tăng trưởng thực vật là một hướng nghiên cứu theo kịp xu hướng thế giới. Xà lách xoăn (Lactuca capitata) được chọn đối tượng nghiên cứu vì đây là loại thực vật có: độ nhạy của hạt giống cao, tốc độ mầm nhanh, sự tăng trưởng tuyến tính, không nhạy cảm với sự khác biệt pH trong phạm vi rộng [4]. Ngoài ra, xà lách xoăn còn là một loại rau ăn sống có giá trị kinh tế cao. Chính vì những luận điểm trên mà đề tài “Nghiên cứu tạo nước hoạt hoá plasma và ứng dụng nâng cao tỷ lệ nảy mầm hạt và tăng trưởng của xà lách xoăn (Lactuca capitata)” hứa hẹn sẽ có hiệu quả kinh tế mà vẫn đảm bảo an toàn cho cây trồng, con người, vật nuôi, môi trường và có thể áp dụng vào thực tiễn với quy mô lớn. 2. Mục tiêu đề tài Tối ưu hóa điều kiện chế tạo nước hoạt hóa plasma và đánh giá hoạt tính của nước hoạt hóa plasma đối với sự nâng cao tỷ lệ nảy mầm hạt và tăng trưởng trong giai đoạn sớm của xà lách xoăn (Lactuca capitata). 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Nước hoạt hóa plasma
2 Phạm vi nghiên cứu: Các mẫu nước plasma chế tạo bằng phương pháp plasma nguội tại phòng thí nghiệm về Plasma nông nghiệp thuộc phòng Kỹ thuật Vật lý - Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học: Xác định được vai trò của nước hoạt hóa plasma đối với sự nảy mầm và tăng trưởng xà lách xoăn (Lactuca capitata). Ý nghĩa thực tiễn: Tìm ra một kỹ thuật mới để ứng dụng kích thích nảy mầm và tăng trưởng các giống thực vật có hạt khó nảy mầm.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ XÀ LÁCH XOĂN VÀ SỰ NẢY MẦM VÀ TĂNG TRƯỞNG HẠT 1.1.1. Xà lách xoăn Xà lách xoăn (Lactuca savita var capitata L.) thuộc họ hoa cúc, loài Lactuca, có loài mang 8 hoặc 9 cặp nhiễm sắc thể, có loài mang 17 cặp nhiễm sắc thể, tên khoa học là Lactuca sativa, thực vật bậc cao, lớp 2 lá mầm, có loài là cây 1 năm, có loài là cây 2 năm. Xà lách là thực vật thượng đẳng có đơn vị phân loại như sau: Ngành hạt kín : Angiospermatophyta Lớp hai lá mầm : Dicotyledoneae Bộ cúc : Alerales Họ cúc : Compositae Chi : Lactuca Giống xà lách : Lactuca sativa L Đặc điểm thực vật Rễ: rễ xà lách thuộc loại rễ chùm, phân bố chủ yếu ở tầng đất 0 – 20cm. Tuy nhiên bộ rễ có thể nhìn rõ thấy 2 phần: rễ chính là rễ thẳng phát triển làm nhiệm vụ giữ cây, bám vào đất chắc hơn, ngoài ra còn làm nhiệm vụ hút nước và dinh dưỡng cho cây. Từ rễ chính mọc ra rất nhiều rễ phụ để hỗ trợ cây bám đất, hút nước và khoáng chất [5]. Thân: thuộc loại thân thảo, mềm, rất ngắn, không phân nhánh, phát sinh các lá mọc sít nhau. Thân là nơi kết nối bộ rễ và lá, vận chuyển chất khoáng, chất hữu cơ do bộ rễ hút lên đến lá tổng hợp nuôi cây [5]. Lá: lá cây mọc dày lên trên trục thân với số lượng lá rất lớn, lá sắp xếp theo hình xoắn ốc, lúc đầu mật độ lá rất dày, giai đoạn sau thưa dần. Lá ngoài có màu xanh đậm, xanh hoặc xanh nhạt; Lá trong có màu xanh nhạt, xanh trắng
4 hoặc trắng ngà. Các lá phía trong mềm, chứa nhiều chất dinh dưỡng hơn các lá phía ngoài. Bề mặt lá lồi lõm, gấp khúc [5]. Hoa: Chùm hoa dạng đầu, chứa số lượng lớn các hoa nhỏ kết chặt với nhau trên một đế hoa. Hoa có 5 đài, 5 nhị cái và 2 lá noãn, hoa tự thụ, hạt phấn và lá noãn có độ hữu thụ cao. Hoa nở từ lúc có ánh sáng mặt trời đến trưa, thụ phấn tốt nhất lúc 9- 10 giờ sáng [5]. Quả: Loại quả bế, hạt không có nội nhũ [5]. Hình 1.1. Hình ảnh minh họa hình dáng rễ (s), thân (b), lá (c) và hoa (d) của xà lách xoăn Thành phần hóa học: Thành phần hóa học của xà lách xoăn (Lactuca capitata): trong 100 gam (g) lá của cây bao gồm 96% nước, 1,4 g protein, 2,9 g carbohydrate, 1,3 g chất xơ, 0,2 g chất béo và 1,2 g tro. Xà lách xoăn chứa hầu hết các loại vitamin và đặc biệt giàu vitamin A, C, K, niacin và folate và nhiều khoáng chất như canxi, sắt, phốt pho, natri và kali (Cơ sở dữ liệu dinh dưỡng USDA, 2016). Số liệu về thành phần hóa học của xà lách xoăn được thể hiện trong bảng 2.
5 Bảng 1: Giá trị dinh dưỡng trong 100g xà lách xoăn Thành phần Lượng Đơn vị Thành phần Lượng Đơn vị Calo(kcal) 14 K.cal Protein 1.4 g Lipid 0,2 g Vitamin A 7.405 IU Cholesterol 0 mg Canxi 36 mg Natri 28 mg Vitamin D 0 IU Kali 194 mg Vitamin C 0 mg Cacbohydrat 2.9 g Sắt 0.9 mg Chất xơ 1.3 g Vitamin B6 0.1 mg Đường thực phẩm 0.8 g Magie 13 mg Nguồn: Từ USDA (U.S Department of Agriculture) Dược tính Chống oxy hóa: Hoạt tính chống oxy hóa của xà lách xoăn đã được kiểm chứng trong cả điều kiện in vitro và in vivo. Trong điều kiện in vitro cho thấy hoạt tính chống lại gốc tự do DPPH với tỷ lệ phần trăm ức chế 40–80% ở nồng độ dịch chiết xà lách xoăn khác nhau [6,7]; hoạt động chống oxy hóa của chiết xuất của cây chống lại quá trình peroxy hóa axit linoleic [8] và ức chế tổn thương oxy hóa do bức xạ UV gây ra ở Salmonella typhi [18]. Với in vivo trên mô hình chuột thì chiết xuất methanol của lá làm tăng mức độ biểu hiện hai enzym chống oxy hóa, catalase và superoxide dismutase (SOD) trong máu và não của chuột bạch tạng đực và làm giảm sự hình thành malondialdehyde (MDA) trong máu và não của chuột [9]. Kháng khuẩn, kháng nấm, kháng vi-rút: Chiết xuất methanol của xà lách xoăn có khả năng kháng các loại khuẩn như S. aureus, Streptococcus pyogenes, B. subtillis, P. aeruginosa, E. coli, S. aureus, S. pyogenes [6]. Các hợp chất xà lách xoăn có hoạt tính làm thay đổi thành phần tế bào chất của nấm men, và gây tổn thương đến thành tế bào của chúng. Các hoạt động kháng vi-rút của chiết xuất L. capitata cũng chứng minh trên vi-rút cytomegalovirus ở người [10].
6 Chống ung thư: chiết xuất xà lách xoăn ức chế sự phát triển của tế bào bệnh bạch cầu HL-60 và tế bào ung thư vú MCF-7 bằng cách kích hoạt kinase điểm kiểm tra 2, tạo ra chất ức chế khối u p21 và điều hòa giảm proto-oncogene cyclin D1; ức chế sự chết của tế bào HL-60 bằng cách acetyl hóa alpha-tubulin [11]. Xà lách xoăn còn có một số hoạt tính sinh học khác như: giảm đau và chống viêm của L. sativa [12,13]; Chống đông máu mạnh ngang với aspirin [12]; Chống độc của chúng [14],… Ngoài ra, xà lách xoăn còn là loại rau sạch có thể ăn sống quan trọng và phổ biến. Xà lách xoăn thường thường được sử dụng trong các món ăn như salat, bánh mì kẹp, hăm-bơ-gơ,… 1.1.2. Sự nảy mầm hạt 1.1.2.1. Nguyên lý của sự nảy mầm hạt Hạt là sản phẩm hình thành sau sự thụ tinh kép, gồm các thành phần: Phôi; Chất dinh dưỡng dự trữ; Vỏ hạt: phát triển từ vỏ của noãn Sự nảy mầm của hạt có thể xem là bắt đầu của quá trình sinh trưởng, phát triển của cây. Từ hạt đang ngủ nghỉ chuyển sang trạng thái nảy mầm là cả một quá trình biến đổi sâu sắc và nhanh chóng về hoá sinh và sinh lí xảy ra trong hạt. Sự biến đổi hóa sinh Đặc trưng nhất của các biến đổi hóa sinh trong khi nảy mầm là sự tăng đột ngột hoạt động thủy phân xảy ra trong hạt. Các hợp chất dự trữ dưới dạng các polymer như tinh bột, protein, lipit… bị phân giải thành các chất monomer như các đường đơn, axit amin, axit béo,… phục vụ cho sự nảy mầm. Chính vì vậy mà các enzym thủy phân được hoạt hóa rất nhanh. Mức độ hoạt hóa của các enzym thủy phân trong hạt phụ thuộc vào tính chất đặc trưng và thành phần hóa học của hạt. Với các loại hạt dự trữ chủ yếu là tinh bột, hoạt tính của enzym α-amylase được tăng lên nhanh khi hạt phát động sinh trưởng. Lúc này tinh bột bị thủy
7 phân thành đường làm nguyên liệu cho hô hấp và tăng áp suất thẩm thấu trong hạt. Các hạt có thành phần dữ trữ chủ yếu là protein như hạt đậu đỗ thì hoạt tính của enzym protease tăng lên mạnh mẽ hơn các enzym khác. Protein sẽ bị phân hủy thành các axit amin, rồi các axit amin này được sử dụng để tổng hợp các protein thứ cấp cấu tạo nên chất nguyên sinh của mầm non đang sinh trưởng. Với các hạt nảy mầm trong tối thì axit amin có thể kết hợp với NH3 để tạo nên các amit (asparagine, glutamin). Với các hạt chứa nhiều lipit như hạt lạc, vừng, hướng dương, cọ dầu …thì có hoạt tính của lipase là ưu thế. Lipit được phân hủy thành các axit béo phục vụ cho việc khai thác năng lượng và xây dựng tế bào của cây con. Sự tăng hoạt tính của các enzym thủy phân có lẽ chủ yếu do các enzym này được tổng hợp mới trong lớp tế bào aleuron của hạt và cũng có thể hoạt hóa các enzym đã có sẵn. Sau giai đoạn nảy mầm, cây cối xuất hiện thì hoạt động tổng hợp các chất mới cấu tạo nên tế bào mới xảy ra mạnh mẽ. Đó là sự tổng hợp protein, axit nucleic, phospholipid, pectin, xenlulose… Sự biến đổi sinh lý Hô hấp: Biến đổi sinh lý là đặc trưng nhất trong quá trình nảy mầm hô hấp. Ngay sau khi hạt hút nước thì hoạt tính của enzym hố hấp tăng lên mạnh, làm cường độ hô hấp của hạt tăng lên rất nhanh [15]. Hô hấp đã giúp các cây có đủ năng lượng và các nguyên liệu cần thiết cho sự nảy mầm. Cân bằng hooc-môn: Trong quá trình nảy mần, cân bằng hooc-môn của trạng thái ngủ nghỉ và nảy mầm bị thay đổi [16]. Sự cân bằng hooc-môn điều chỉnh quá trình nảy mầm là cân bằng GA/ABA. Khi hạt đang ngủ nghỉ thì hàm lượng ABA rất cao và GA không đáng kể. Nhưng khi ta ngâm hạt, phôi phát động sinh trưởng thì phôi tăng cường tổng hợp giberelin nên làm hàm lượng của chúng tăng nhanh, còn ngược lại, hàm lượng ABA giảm dần. Vì vậy, trong thực tiễn sản xuất, việc phát ngủ nghỉ của hạt, xử lý nảy mầm để gieo kịp thời vụ là biện pháp rất có ý nghĩa. Người ta xử lý GA hoặc
8 có thể xử lý nhiệt độ thấp cho hạt để giảm hàm lượng ABA và tăng hàm lượng GA trong phôi hạt. Khi cân bằng hooc-môn nghiêng về phía GA thì hạt sẽ nảy mầm. Ngoài ra trong giai đoạn này bên trong hạt còn có một số biến đổi sinh lý khác như: Hoạt động chống oxi hóa tăng cường [17-19]; Các gen và protein liên quan đến vận chuyển nước, biến đổi thành tế bào, tổ chức khung tế bào và phân chia tế bào, khả năng tổng hợp protein, khả năng xử lý sau dịch mã và quá trình phân giải protein mục tiêu liên quan đến nảy mầm tăng nhanh [20,21] 1.1.2.2. Diễn diến của quá trình nảy mầm Bước đầu tiên của sự nảy mầm là giai đoạn thu nước (6 - 12 giờ tùy loại hạt), giai đoạn I, hạt khô hấp thu nước nhanh chóng cho đến khi hạt hoàn toàn ngậm nước. Đến giai đoạn II sự hấp thu nước bị hạn chế, đối với hạt giống không hoạt động hoặc chết thì giai đoạn này sẽ không thay đổi. Giai đoạn nảy mầm kéo dài khoảng 12 - 48 giờ, trong giai đoạn này thì hấp thụ nước của hạt gia tăng liên tục. Sự nảy mầm khi rễ mầm lú ra khỏi vỏ hạt và bắt đầu giai đoạn tăng trưởng của cây mầm đến khi cây mầm tự dưỡng thì sự nảy mầm kết thúc [22]. Trong các giai đoạn I và II, hạt giống có sự thay đổi chuyển hóa lớn chuẩn bị cho sự phát triển kéo dài rễ mầm [23]. Trong giai đoạn nảy mầm, tế bào to lên làm trọng lượng tươi tăng dần, tế bào biểu mô kéo dài và các tế bào xếp dày đặc và không có khoảng gian bào [24]. Trong giai đoạn hấp thu nước, mạng lưới nội chất bắt đầu xuất hiện trong tất cả các tế bào, số lượng ty thể, lục lạp, bộ máy Golgi… tăng lên chứng minh tế bào biểu mô của lớp vỏ đã chuyển từ trạng thái ngủ sang trạng thái hoạt động [25]. Các RNA được lưu trữ trong phôi trưởng thành sẽ hoạt động trong thời gian nảy mầm. Ở cây Arabidopsis, hoạt động tổng hợp protein thấp trong 8 giờ đầu tiên của giai đoạn hấp thu nước, sau đó tăng mạnh và đạt mức tối đa trong thời gian từ 8 đến 24 giờ [2]. Trong quá trình nảy mầm có sự thay đổi cân bằng hooc-môn. Sự cân bằng hooc-môn điều chỉnh quá trình nảy mầm là cân bằng GA/ABA. Khi hạt
9 đang ngủ nghỉ, hàm lượng ABA rất cao và GA là không đáng kể. Nhưng khi ngâm hạt, phôi phát động sinh trưởng nên tăng cường tổng hợp giberelin làm hàm lượng của chúng tăng nhanh trong hạt còn ngược lại, hàm lượng ABA giảm dần. Vì vậy, trong thực tiễn sản xuất, để phá ngủ nghỉ của hạt làm cho chúng nảy mầm để gieo thì phải xử lí GA. 1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nảy mầm hạt Sự nảy mầm hạt giống phụ thuộc vào cả điều kiện bên trong lẫn bên ngoài. Những nhân tố bên ngoài quan trọng nhất bao gồm nhiệt độ, nước, ôxy, và đôi khi là nhu cầu về ánh sáng [26]. Nhiều loài cây cần những điều kiện khác nhau để có thể nảy mầm hiệu quả. Điều này thường phụ thuộc vào sự đa dạng của hạt giống và có liên kết chặt chẽ với các điều kiện sinh thái tại nơi sống tự nhiên của cây. Nước Độ ẩm là điều kiện rất quan trọng cho sự nảy mầm. Nước làm mềm vỏ hạt nên hạt dễ thấm oxygen và carbon dioxide, đồng thời nước làm tan các chất dự trữ và giúp chúng đi vào phản ứng biến thoái. Nước lôi các chất ức chế nảy mầm ra khỏi hạt [27]. Ngoài ra, nước còn là dung môi cho các phản ứng hoá sinh trong hạt đang nảy mầm và là điều kiện cần thiết cho hô hấp của hạt. Hạt khô trong không khí có độ ẩm 10 - 14% thì ngủ nghỉ. Khi hạt hút nước đạt hàm lượng 50 - 70% thì hạt bắt đầu phát động sinh trưởng và nảy mầm. Riêng với xà lách xoăn thì đây là loại cây ưa ẩm nên độ ẩm đồng ruộng thích hợp nhất là 70 - 80% và độ ẩm không khí là 65% - 75% [27] Nhiệt độ Nhiệt độ cho hạt xà lách xoăn giống nảy mầm là 25 ± 2oC. Nhiệt độ ảnh hưởng hoạt tính của enzym. Ở nhiệt độ thấp, có sự thủy phân protein thành các axit amin và amid, thuận lợi cho việc hấp thu nước. Mặt khác, nhiệt độ còn ảnh hưởng đến tốc độ các phản ứng hoá sinh diễn ra trong quá trình nảy mầm và hô hấp của hạt. Khi mầm xuất hiện thì nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của mầm. Oxy
10 Nảy mầm là quá trình thu nhiệt tiêu thụ nhiều năng lượng. Ngoại trừ một số loài, điều kiện kị khí ức chế sự nảy mầm, oxygen là tuyệt đối cần thiết. Lượng oxygen cần thiết cho hạt nảy mầm để hạt hô hấp hiếu khí, tạo năng lượng, đồng thời oxy hóa các chất ức chế phôi tăng trưởng [28]. Yếu tố khác Ánh sáng: Với một số loài khác ánh sáng có thể kích thích sự nảy mầm hạt nhưng một số khác thì lại gây cản trở. Ví dụ với tia sáng đỏ (bước sóng 580 - 660 nm) kích thích sản xuất gibberellin trong sự nảy mầm của hạt thuốc lá và xà lách xoăn [29]. Chất dự trữ trong hạt: Chất dự trữ là nguồn dinh dưỡng để nuôi cây mầm. Nội nhũ hạt lúa đủ lớn, chứa đủ chất dinh dưỡng dự trữ thì phôi có thể chuyển thành cây mầm khỏe mạnh [30]. Nồng độ dung dịch đất: Khi ta gieo hạt vào đất có nồng độ muối cao thì sự nảy mầm bị ức chế vì áp suất thẩm thấu của đất có thể cao hơn áp suất thẩm thấu của hạt, hạt không hút nước được dẫn đến quá trình nảy mầm bị cản trở. 1.1.3. Sự tăng trưởng trong giai đoạn đầu của hạt Khi hạt nảy mầm thì rễ mầm (radicle) xuất hiện trước, sau đó đến thân mầm. Thân mầm được bao bọc bởi một lá bao mầm (diệp tiêu), dài khoảng 1 cm. Kế đó, lá đầu tiên xuất hiện, gọi là lá thứ nhất hay lá không hoàn toàn. Sau đó đến lá thứ hai, lá này có đầy đủ phiến lá và bẹ lá. Trong giai đoạn này cây con có các biến đổi bên trong như: hoạt tính biến dưỡng của cây mầm tăng mạnh, hoạt tính biến dưỡng của mô dự trữ giảm mạnh; Con đường glyco giải và chu trình axit citric hoạt động ở những mức độ khác nhau tùy hạt và các điều kiện bên ngoài; Chu trình glyoxilic hoạt động chuyển hóa lipid thành glucid. Sự thay đổi nồng độ của các chất liên hợp và chất chuyển hóa có nguồn gốc từ phytohoocmon (auxin, cytokinin,…) có thể được chứng minh bằng thực tế thông qua việc quan sát cây con trong 7 ngày. Trong thời gian này, sự sinh tổng hợp cũng như các hoạt động sinh học thể hiện mạnh mẽ [31]. Chính vì
11 vậy, để có kết luận toàn diện nhất về vai trò của PAW đối với sự nảy mầm hạt thì cần phải theo dõi luôn cả sự phát triển của cây con trong 7 ngày đầu. 1.2. TỔNG QUAN VỀ NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA 1.2.1. Giới thiệu chung về plasma và nước hoạt hóa plasma Plasma là trạng thái thứ tư của vật chất ngoài rắn, lỏng, khí. Khi các phân tử và nguyên tử ở thể khí sử dụng các electron chứa năng lượng từ phóng điện một chiều (DC) hoặc xoay chiều (AC) (tần số đến 100 kHz), phóng điện tần số vô tuyến (tần số dao động từ 100 kHz đến 100 MHz). Sản phẩm của quá trình phóng điện này là hỗn các điện tử tự do, ion và các hạt trung tính (nguyên tử và phân tử ở trạng thái cơ bản hoặc ở trạng thái kích thích). Plasma nguội là một phần của plasma, ở đây khí bị ion hoá ở trạng thái không cân bằng, đặc trưng bởi năng lượng electron rất cao trong khi nhiệt độ dòng khí ở nhiệt độ thấp [31]. Plasma được chia làm hai loại là plasma nóng và plasma nguội. Plasma nóng có phân tử, nguyên tử, ion và electron nhiệt độ như nhau, nhiệt độ rất cao (5 x 103 – 20 x 103 K). Plasma nguội (plasma không nhiệt, plasma lạnh) có các ion và các hạt trung hòa có nhiệt độ thấp hơn nhiều so với nhiệt độ của các electron [31]. Vì điều kiện thí nghiệm của plasma nguội là ở nhiệt độ thấp (không cao hơn nhiều so với nhiệt độ phòng – khoảng 600C) nên các thí nghiệm có thể được thiết kế thực hiện trên hạt giống. Ngoài ra, các hệ thống plasma nguội thường có phí bảo trì thấp và có chi phí năng lượng thấp. Trong môi trường không khí, plasma tồn tại các phần tử như: UV, O2-°, O°, HO2°, N°, H°, O2+, N2+ , OH°, O3, NOx… 1.2.2. Chế tạo nước hoạt hóa plasma Nước hoạt hóa plasma đang ngày càng trở thành một chủ đề được quan tâm trong lĩnh vực khoa học và công nghệ vì chúng tạo ra các chất có chứa gốc oxy tự do ROS và các chất có chứa gốc nitơ tự do RNS [32-36], đây là những chất hiệu quả để thay thế nhiều loại vật liệu sinh học và hóa học [37] nên chúng phù hợp để ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y sinh [38-41], môi trường [42], nano [43], và nông nghiệp [44].