Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 9

Chia sẻ: Asdfadf Adgsg | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

109
lượt xem 22
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan trong 1 ml nƣớc khử ion, sau đó lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,2μm Dung dịch kháng sinh Ampicillyn 100mg/ml Cân 100mg ampicillyn dạng bột, hoà tan trong 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,45μm. Các loại buffer  PCR buffer 10X Tris-HCl pH 8.4 (NH4)2SO4 MgCl2 DTT NP 40 Tween-20 200mM 166mM 67mM 100mM 0,1% 0,1%

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 9

Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan trong 1 ml nƣớc khử ion, sau đó lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,2μm Dung dịch kháng sinh Ampicillyn 100mg/ml Cân 100mg ampicillyn dạng bột, hoà tan trong 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,45μm. Các loại buffer  PCR buffer 10X Tris-HCl pH 8.4 200mM (NH4)2SO4 166mM MgCl2 67mM DTT 100mM NP 40 0,1% Tween-20 0,1%  Buffer SuRE 10X pH 8.0(buffer enzym cắt) Tris-HCl 100mM NaCl 1M MgCl2 50mM 2-Mercaptoethanol 10mM  NEBuffer 1X pH 7.9 (buffer của enzym DNA polymerase I large fragment) NaCl 50mM Tris-HCl 10mM MgCl2 10mM DTT 1mM  Lygation buffer 10X Tris-HCl pH 7.6 660mM MgCl2 66mM DTT 100mM 660μM ATP 65
Hình 1: Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) 66
Hình 2 : Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) 67
MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn ................................................................................................................ i Tóm tắt .........................................................................................................................ii Mục lục ........................................................................................................................iii Danh sách các chữ viết tắt ...........................................................................................vii Danh sách các hình ......................................................................................................viii Danh sách các bảng, biểu đồ và sơ đồ .........................................................................x PHẦN 1. MỞ ĐẦU .........................................................................................................1 1.1 Đặt Vấn Đề ............................................................................................................1 1.2 Mục tiêu của đề tài .................................................................................................2 1.3 Nội dung thực hiện ................................................................................................2 1.3.1 Phần 1 ..............................................................................................................2 1.3.2 Phần 2 ..............................................................................................................2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU ..............................................................................3 2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn.............................................................................3 2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp ........................................................................................3 2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen ............................................................3 2.1.2.1 Vai trò .......................................................................................................3 2.1.2.2 Ứng dụng ..................................................................................................3 2.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tƣợng biến nạp ..........................................4 2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly .................................................................5 2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo. .....................................................................5 2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly .......................................................5 2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp ..................................................................................7 2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý ...................................................................................7 2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học ...............................................................................7 2.3.4 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp .............................8 2.3.5 Chiết tách DNA plasmid .................................................................................9 2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................10 68ii i
2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR ..................................................................10 2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR .................................................10 2.3.7 Điện di DNA .................................................................................................14 2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA ............................................................................14 2.4.1 Plasmid ..........................................................................................................15 2.4.2 Nhiễm sắc thể virút .......................................................................................16 2.5 Các enzym đƣợc sử dụng cho biến nạp DNA......................................................16 2.5.1 Các enzym cắt giới hạn .................................................................................16 2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA ............................................................................19 2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) .............................................................19 2.5.2.2 Terminal transferase ...............................................................................19 2.5.2.3 Các DNase ..............................................................................................20 2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá. ....................................................................20 2.5.4 Các enzym nối DNA .....................................................................................20 2.5.3.1 E.coly DNA lygase .................................................................................20 2.5.3.2 T4 DNA lygase .......................................................................................21 2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội ...................................................................21 2.6.1 Với plasmid ...................................................................................................21 2.6.2 Với DNA phage ............................................................................................21 2.7 Các nghiên cứu lyên quan đến khóa luận ............................................................21 PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................23 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp ........................................23 3.2 Vật lyệu và phƣơng pháp dùng trong thí nghiệm ................................................23 3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm ................................................................................23 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α ...........................................................................23 3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-) ............................................................................23 3.2.1.3 Đoạn DNA ..............................................................................................24 3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm .......................................................................................24 3.2.3 Các thiết bị máy móc ....................................................................................24 3.2.4 Các loại môi trƣơng nuôi cấy vi khuẩn .........................................................24 3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm ......................................................25 69iv
3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm .........................................................25 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................................26 3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ..........................................26 3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra .......27 3.3.3 Xác định mật số vi khuẩn bằng cách đo OD600nm kết hợp với phƣơng pháp đếm khuẩn lạc ........................................................................................................28 3.3.3.1 Nguyên tắc ..............................................................................................28 3.3.3.2 Cách tiến hành ........................................................................................28 3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp ...............................................................................29 3.3.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ...........................................................................................30 3.3.6 Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn và tính hiệu suất biến nạp .........................31 3.3.7 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra ..................................31 3.3.7.1 Chiết tách plasmid ..................................................................................31 3.3.7.2 Phản ứng cắt DNA Plasmid....................................................................33 3.3.7.3 Quy trình điện di trên gel agarose ..........................................................34 3.3.8 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR .....................................34 3.3.9 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR ..................................35 3.3.10 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) ...............................................................................................................36 3.3.11 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp ..............37 3.3.12 Kiểm tra kết quả chiết tách plasmid sử dụng enzym BamHI và Hind III, thực hiện phản ứng PCR plasmid với cặp primers (T3, T7) và (ITS4, ITS5) .......38 PHẦN 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .............................................................................39 4.1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính ..............................................................39 4.2 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ...........................................43 4.2.1 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 60µg/ ml ....................43 4.2.2 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml ..................45 4.3 Tách chiết DNA plasmid .....................................................................................47 4.4 Phản ứng cắt plasmid bằng enzym cắt giới hạn EcoRV ......................................50 4.5 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid đã cắt bằng enzym EcoRV .............................50 70v
4.5.1 Tinh sạch đoạn DNA .....................................................................................50 4.5.2 Tinh sạch plasmid .........................................................................................52 4.6 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp ....................................................................52 4.7 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp ..................................................................54 4.8 Kết quả phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp ............................................................55 4.9 Kết quả kiểm tra bằng kĩ thuật PCR ....................................................................56 PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................58 5.1 Kết luận ................................................................................................................58 5.2 Đề nghị .................................................................................................................59 TÀI LYỆU THAM KHẢO ...........................................................................................61 PHỤ LỤC ......................................................................................................................63 71 i v
DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly. .....................................................6 Hình 2.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR. ......................................................................10 Hình 2.3 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning .........................................................15 Hình 2.4 : Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn ....................................................................18 Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA. .....................................36 Hình 4.1 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 5, 6 giờ nuôi cấy. .................................................................................................................................39 Hình 4.2 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 7, 8 giờ nuôi cấy. .................................................................................................................................39 Hình 4.3 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 90 giây. ....................................43 Hình 4.4 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 60 giây. ...................................44 Hình 4.5 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp đối chứng. .....................................................45 Hình 4.6 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 30 : 3. ................................46 Hình 4.7 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 10 : 1. ................................46 Hình 4.8 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 3 : 0.5. ...............................46 Hình 4.9 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% (lần 1). ..........................48 Hình 4.10 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 2). .......................49 Hình 4.11 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 3). .......................49 Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel agarose 0.8%. 50 Hình 4.13 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch trực tiếp đoạn DNA bằng cột GFX. ...51 Hình 4.14 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX. .........................................................................................51 Hình 4.15 Kết qủa điện di sản phẩm plasmid tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX. .........52 Hình 4.16 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629 bp trên môi trƣờng LB/amp(100μg/ml)/ X-gal/IPTG. .......................................................53 7viii 2