Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của Virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật Real Time PCR

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:99

Thêm vào BST

Báo xấu

127
lượt xem 22
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của Virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật Real Time PCR xây dựng quy trình xác định các đột biến kháng thuốc Adefovir của HBV tại rtA181V/T và rtN236T bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan probe, chi phí thấp để phát triển thành kit phục vụ quá trình điều trị viêm gan siêu vi B trong tương lai.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của Virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật Real Time PCR

THƯ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ‫ ٭٭٭٭‬   ‫٭٭٭٭‬ LÊ THỊ DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN rtA181V/T VÀ rtN236T KHÁNG ADEFOVIR CỦA VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B Virus) BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 60 40 60 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. CAO MINH NGA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010
MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài: Viêm gan (VG) còn gọi là sưng gan, là một tình trạng bệnh lý phổ biến do thương tổn ở tế bào gan. Có nhiều nguyên nhân gây ra VG như: vi khuẩn, rượu, hóa chất và một vài loại thuốc cũng như vô số loại virus, trong đó có virus viêm gan B (VRVGB) [20]. VRVGB hay Hepatitis B virus (HBV) là một trong những virus tiêu biểu của họ Hepadnaviridae, một họ gây VG cho nhiều loài động vật. HBV lây truyền qua đường máu, đường tình dục, từ mẹ sang con, qua tiếp xúc,… Quá trình nhiễm bệnh của HBV kéo dài, diễn tiến nặng, tỷ lệ tử vong cao. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) có hơn 2 tỷ người trên thế giới nhiễm HBV trong thời điểm nào đó của cuộc đời, hơn 350 triệu người mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ung thư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan [6]. Đến năm 2004, số người nhiễm HBV trên toàn cầu đã tăng lên 400 triệu người [28]. Vì vậy, nhiễm VRVGB mạn tính được xem như một vấn đề y tế mang tính chất toàn cầu. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng nội dịch của bệnh với tỷ lệ nhiễm VRVGB mạn tính vào khoảng 15-20% dân số, nghĩa là có trên 10 triệu trong tổng số khoảng 80 triệu người bị nhiễm VRVGB [8]. Các thuốc đặc hiệu dùng để điều trị cho người mang HBV mạn tính gồm hai loại là thuốc uống và thuốc tiêm. Thuốc tiêm gồm Interferon alfa-2b và PEG Interferon alfa-2a, đây là loại thuốc vừa ức chế siêu vi vừa tăng cường miễn dịch nhưng đắt tiền và nhiều tác dụng phụ. Còn thuốc uống gồm Lamivudine (LAM), Adefovir dipivoxil (ADV), Entecavir (ETV) và Tenofovir (TDF)... được Cơ quan Quản lý Thực – Dược Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận cho sử dụng. Ở Việt Nam hiện nay, ADV và LAM được sử dụng chủ yếu trong điều trị cho bệnh nhân viêm gan B mãn tính. ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song vẫn hiệu quả với siêu vi đã kháng LAM. Do vậy, trong điều trị người ta thường kết hợp ADV khi bắt đầu có hiện tượng virus kháng LAM. Hiện tượng kháng ADV, mặc dù xuất hiện muộn và ít thường xuyên hơn nhưng cũng có thể tìm thấy khoảng trên 28% ở những bệnh nhân được điều trị sau 5 năm [26,29,39]. Asparagine (N) được thay bởi Threonine (T) tại codon 236 trên vùng RT (rtN236T) và alanine (A) được thay bằng Valine (V) hoặc Threonine (T) tại codon 181 trên vùng RT (rtA181V/T) được nhận biết là kháng ADV [38]. Trên thực tế, có nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện đột biến như phương pháp dựa vào kiểu hình, phương pháp dựa vào kiểu gen. Phương pháp dựa vào kiểu gen bao gồm phương pháp lai mẫu dò Southern blot (Southern, 1975), giải trình tự trực tiếp, tạo dòng, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - Tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), Oligonucleotide Microarrays,
PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi bằng polymerase; Karl Mullis và cộng sự, 1985), phương pháp real-time PCR,… và mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng. Tuy nhiên, do tính ưu việt của phương pháp real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác, không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá thành rẻ hơn,… nên chúng tôi chọn real- time PCR để phát hiện các đột biến kháng ADV ở HBV trong huyết thanh của những bệnh nhân viêm gan B mãn. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi chọn đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật real- time PCR”, nhằm phát hiện nhanh các đột biến kháng thuốc, với giá thành thấp sẽ có ý nghĩa trong công tác theo dõi và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B. Mục đích của đề tài: Xây dựng quy trình xác định các đột biến kháng thuốc Adefovir của HBV tại rtA181V/T và rtN236T bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan probe, chi phí thấp để phát triển thành kit phục vụ quá trình điều trị viêm gan siêu vi B trong tương lai. Đối tượng nghiên cứu: Những bệnh nhân VGB mạn đã và đang được điều trị bằng ADV. Phạm vi nghiên cứu: Các phòng thí nghiệm, các trung tâm xét nghiệm và các bệnh viện thuộc địa bàn thành phố Hồ Chí Minh (Bệnh viện Đại học Y Dược, Trung tâm Y khoa Medic, Phòng thí nghiệm Công ty Việt Á...). Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn của đề tài: Trong những năm gần đây, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu của các bệnh viện và cơ sở y tế ứng dụng phương pháp giải trình tự và PCR để phát hiện các đột biến kháng thuốc của HBV ở những bệnh nhân viêm gan B mãn đã và đang được điều trị, trong đó có đột biến kháng ADV tại vị trí rtA181T/V và rtN236T. Tuy nhiên, giá thành cho mỗi mẫu xét nghiệm bằng giải trình tự là khá cao. Do vậy, có một quy trình xác định kháng Adefovir tại rtA181T/V và rtN236T đơn giản, chính xác, giá thành thấp là rất cần thiết. Để đáp ứng nhu cầu đó, chúng tôi xây dựng kỹ thuật real-time PCR nhằm phát hiện đột biến kháng Adefovir và đây là công trình chưa từng được công bố trước đây tại Việt Nam. Bố cục của đề tài: Mở đầu Chương 1 – Tổng quan tài liệu
Chương 2 – Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu Chương 3 – Kết quả và thảo luận Chương 4 – Kết luận và kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục.
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Bệnh VGB (VG huyết thanh) là một bệnh nhiễm trùng phổ biến trên toàn thế giới với nhiều con đường lây truyền khác nhau. Châu Á và châu Phi là những khu vực có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất (khoảng 180 triệu dân châu Á và châu Phi đang mang mầm bệnh, chiếm 80% trong tổng số 220 triệu người mang mầm bệnh trên toàn thế giới) [20]. Một số bệnh nhân đã nhiễm HBV sau khi lành bệnh vẫn còn mang mầm bệnh trong một thời gian dài, một số khác trở thành VG mạn tính kéo dài nhiều năm hay suốt đời, dẫn đến xơ gan, ung thư tế bào gan. Do vậy, nhiễm HBV được xem là một vấn đề sức khỏe toàn cầu. Theo Dieter Glebe và cộng sự [26,44], HBV được xếp vào 8 kiểu gen A, B, C, D, E, F, G, H phân bố tùy theo vùng địa dư. Kiểu gen B và C chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Theo Perrillo và cộng sự [34], ADV là chất tương tự nucleoside/tide, được FDA chấp thuận sử dụng trong điều trị những bệnh nhân mang HBV mạn tính từ năm 2005. Nó đóng vai trò như chất ức chế lên vùng reverse transcriptase (RT) của gen HBV polymerase, và trong tất cả các trường hợp đã hoàn toàn làm giảm nồng độ của virus. Tuy nhiên, chất ức chế này chủ yếu tác động vào sự nhân lên của virus làm cho virus không thể tăng lên được chứ không tiêu diệt virus bằng cách phá hủy cấu trúc của virus đã được hình thành theo Pawlotsky và cộng sự [33]. Đây là nguyên nhân của sự xuất hiện các đột biến kháng thuốc của HBV dẫn đến điều trị thất bại và diễn tiến xấu của bệnh. Hiện tượng kháng ADV, mặc dù xuất hiện muộn và ít thường xuyên hơn nhưng cũng có thể tìm thấy khoảng trên 28% ở những bệnh nhân được điều trị sau 5 năm trong các nghiên cứu của Hadziyannis và cộng sự (2005) [27], Lok và cộng sự (2007) [30], Westland và cộng sự (2003) [40]. Theo Villet và cộng sự (2008) [39], Lok và cộng sự (2007) [30], Pawlotsky và cộng sự (2008) [33], các đột biến chính dẫn đến hiện tượng kháng ADV của HBV trong điều trị tại vị trí rt181 và rt236 thuộc dạng đột biến điểm thay thế nucleotide này thành nucleotide khác, làm biến đổi acide amine này thành acide amine khác. Hiện nay, có nhiều phương pháp phát hiện đột biến kháng ADV của HBV như giải trình tự, lai mẫu dò (line probe assay – LiPA), PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – Tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), PCR (có thể kết hợp với giải trình tự), real-time PCR (PCR định lượng)… Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng.
PCR kết hợp với giải trình tự có công trình của Yan J. và cộng sự (2006) [39] với độ nhạy là 103 bản sao/l. Chen J.J. và cộng sự (2008) [25] sử dụng phương pháp PCR-RFLP phát hiện được virus mang đột biến rtN236T trong thời gian điều trị bằng ADV từ 0-8 tháng. Bộ kit INNO-LiPA HBV DR v2 (Innogenetics, 2006) sử dụng mẫu dò đặc hiệu với nhiều vị trí đột biến kháng ADV và LAM. Theo Carla Osiowy và cộng sự (2006) [24], Munira Hussain và cộng sự (2006) [31], bộ kit này có độ đặc hiệu cao, phát hiện sớm các đột biến và có độ nhạy cao hơn so với phương pháp giải trình tự chuỗi. Ưu điểm là cùng lúc có thể phát hiện được nhiều đột biến, thao tác kỹ thuật dễ thực hiện nhưng giá thành quá đắt không phù hợp trong phát hiện và chẩn đoán, phục vụ cho quá trình theo dõi và điều trị nhiễm HBV mạn tính ở Việt Nam. Trong công trình nghiên cứu của mình, Julien Lupo và cộng sự (2009) [28] đã chứng tỏ rằng việc phát hiện đột biến kháng ADV và LAM bằng phương pháp real-time PCR có độ nhạy cao hơn cả so với phản ứng lai mẫu dò (sử dụng bộ kit INNO-LiPA DR v2, Innogenetics) và giải trình tự. Bằng cách pha trộn chủng đột biến và chủng hoang dại, real-time PCR với mẫu dò phát huỳnh quang có khả năng phát hiện 0,1% bản sao mang đột biến trong tổng số 105 bản sao. Phương pháp này có ưu điểm là định lượng được nồng độ virus mang đột biến trong quần thể nên giúp hiểu rõ hơn sự phát triển tự nhiên của các dạng virus kháng thuốc trong suốt quá trình điều trị. 1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Việt Nam nằm trong vùng dịch lưu hành cao với tỷ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng từ 10-20% dân số [6,20]. Trong một số nghiên cứu y học [1,9], ở Việt Nam, HBV có 3 kiểu gen A, B và C. Trong đó, hai kiểu gen B và C là chủ yếu. Hiện nay, ở Việt Nam, ADV và LAM được sử dụng chủ yếu trong điều trị cho bệnh nhân viêm gan B mãn tính. ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song vẫn hiệu quả với siêu vi đã kháng LAM. Do vậy, trong điều trị người ta thường kết hợp ADV khi bắt đầu có hiện tượng virus kháng LAM. Hiệu quả điều trị bằng ADV là không thay đổi với các kiểu gen (genotype) của HBV. Hiện tượng kháng ADV của HBV ở những bệnh nhân mạn tính trong thời gian điều trị thường xuất hiện chậm với tỷ lệ thấp. Thế nhưng một khi đột biến mới xuất hiện, nó sẽ nhân lên trong quần thể và ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình chẩn đoán và chi phí điều trị. Các phương pháp áp dụng phát hiện các dạng đột biến kháng thuốc của HBV hiện nay là PCR, giải trình tự, PCR-RFLP, real-time PCR… Một số cơ sở y tế hiện đang sử dụng một số bộ kit của nước ngoài kết hợp với giải trình tự bằng hệ thống máy tự động. LAM (1998) được FDA chấp thuận đưa vào sử dụng điều trị sớm hơn so với ADV (2002), do vậy ở Việt Nam có nhiều công trình nghiên cứu và phát hiện tính kháng LAM của HBV trong điều trị.
Công ty Nam Khoa (Tp. Hồ Chí Minh) sử dụng phương pháp giải trình tự trên máy CEQ8000 (Beckman Coulter) để phát hiện kiểu gen và các đột biến kháng LAM, ADV của HBV. Phát hiện đột biến tại rt180 và rt204 kháng LAM của HBV sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP có đề tài nghiên cứu của Nguyễn Chí Vinh [22]; sử dụng phương pháp real-time PCR có công trình nghiên cứu của Nguyễn Sử Minh Tuyết và cộng sự [19], Nguyễn Thành Khôi và Hồ Huỳnh Thùy Dương [10]. Sử dụng phương pháp PCR và đọc kết quả qua điện di trên gel agarose 3% trong đề tài của Trần Thiện Toàn (Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) [18]. Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng mồi ngược bắt cặp với bản mẫu hoang dại tại vị trí rt181, bản mẫu mang đột biến sẽ cho kết quả âm tính (không xuất hiện vạch) trên gel dưới tia UV. Trong khóa luận tốt nghiệp, Huỳnh Trường An (Đại học Mở, Tp. Hồ Chí Minh) [2], sử dụng mồi ngược bắt cặp với bản mẫu đột biến tại rt236 và mẫu dò phát huỳnh quang đọc tín hiệu qua mỗi chu kỳ khuếch đại. Trên thực tế, việc lựa chọn phương pháp nào cho đúng đắn để đưa vào chẩn đoán thường quy là không dễ. PCR kết hợp với giải trình tự hay PCR-RFLP đều là những phương pháp đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ tay nghề cao, thao tác khéo léo, thời gian cho kết quả lâu, thiên về nghiên cứu nhiều hơn là áp dụng vào thực tiễn và nhược điểm lớn nhất là độ nhạy không cao bằng real-time PCR. Với ưu điểm trên và có thể phát hiện chính xác nồng độ virus đột biến trong quần thể, real-time PCR được xem là công cụ hữu hiệu nhất với giá thành thấp, dùng để phát hiện các đột biến kháng ADV tại rt181 và rt236 của HBV ở những bệnh nhân mạn tính. 1.2 Đại cương về virus gây bệnh viêm gan siêu vi B 1.2.1 Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan siêu vi B [6,7] Lịch sử của các loại VGVR thực ra là lịch sử của các bệnh vàng da (hoàng đảm), vì hội chứng này đã được ghi nhận rất lâu trong lịch sử loài người với nhiều bệnh khác nhau có thể gây nên vàng da. Vàng da có thể chỉ là một dấu hiệu của một bệnh toàn thân, hay là một bệnh chủ yếu ở lá gan. Bệnh ở gan gây nên vàng da cũng có nhiều nguyên nhân, trong đó tác nhân virus là chủ yếu. Sau đây là lịch sử của VG được ghi nhận theo kinh biểu niên. Vàng da nhiễm khuẩn được biết từ thời Hippocrates. Tuy người ta không biết rõ nơi nào và khi nào trận dịch VGVR đầu tiên xảy ra. Luerman (1883) mô tả một trận dịch tại xưởng đóng tàu Bremen ở những người được chủng ngừa vaxcin đậu mùa có bạch cầu người. Cùng năm này, một trận vàng da sau chủng ngừa khác xảy ra ở Merzig. Do vậy, sự hiện diện của một thể VGVR lây nhiễm trực tiếp từ máu người hoặc các dẫn xuất từ máu đã được nghĩ đến.
Virchow (1885) đã mô tả bệnh gan là bệnh “vàng da xuất tiết” (catarrhal). Ông cho rằng vàng da xuất tiết có nguyên nhân là viêm đường mật do chất nhầy dính làm tắc đường mật, từ đó gây viêm ở chỗ nối đường mật – tá tràng và bệnh do vi khuẩn gây ra. Quan niệm này của Virchow gây ảnh hưởng lâu dài và đã cản trở quan điểm tiến bộ về nguyên nhân và sinh bệnh học VGVR cho mãi đến nửa đầu thế kỷ XX (Thế chiến thứ II). McDonald (1908) cho rằng tác nhân của vàng da xuất tiết là do virus. Lindstedl (Thụy Điển, 1919) đã tiên phong trong việc đặt ra thuật ngữ VG cho bệnh vàng da xuất tiết và đã chẩn đoán phân biệt hai dạng VG dịch tễ và VG huyết thanh. Năm 1943 – 1946, các nghiên cứu ở Anh và Quân Y Mỹ cho rằng VRVGB hiện diện trong huyết thanh gây vàng da và thường được mang bởi những người khỏe mạnh bình thường và không vàng da. Nhưng chỉ đến các trận dịch VG trên toàn thế giới trong Thế chiến thứ II mới đưa đến nhận thức tổng quát về bản chất lây nhiễm của bệnh vàng da xuất tiết của Virchow. Năm 1947, MacCallum đề nghị gọi tên bệnh VG nhiễm huyết thanh là VGB. Cuối cùng, các thuật ngữ này được Ủy Ban của Tổ chức Y tế Thế Giới về VGVR chấp thuận. Năm 1963, Blumberg, trong một nghiên cứu các protein huyết thanh đa hình (polymorphic), đã phát hiện một protein trong máu của một thổ dân Australia trước đó chưa từng biết. Năm 1965, protein Australia được gọi là kháng nguyên Australia (hiện nay được gọi là kháng nguyên bề mặt hoặc HBsAg). Vào lúc này, xét nghiệm miễn dịch men (EIA) đối với các dấu ấn miễn dịch của các loại VGVR trong huyết thanh vẫn còn là cơ sở chính trong chẩn đoán lâm sàng. Sau khi khám phá ra kháng nguyên Australia trong huyết thanh, Blumberg và cộng sự nhận xét rằng kháng nguyên này hiện diện với nồng độ cao ở bệnh nhân ung thư máu và ở các trẻ bị bệnh Down. Năm 1968, các nhà nghiên cứu khác, nhất là Prince, Okochi và Murakami, đã xác định kháng nguyên Australia chỉ được tìm thấy trong huyết thanh người nhiễm VRVGB, từ đó VRVGB mới được nhận biết và được xác lập đặc điểm. Blumberg nhận giải Nobel Y học vào năm 1976 nhờ phát hiện này. Từ năm 1942-1967, các nghiên cứu thực nghiệm viêm gan được thực hiện trên chính con người (Đức và Mỹ) đã bị nhiều người phê phán do vấn đề y đức. Nhưng cũng nhờ đó mà các đặc điểm dịch tễ, bệnh sử và phòng ngừa của hai loại VG A và B được hiểu biết rõ hơn. Năm 1970, hạt tương tự virus được phát hiện (gọi là hạt Dane) mang trên bề mặt của nó kháng nguyên Australia trong huyết thanh của bệnh nhân VGB và những hạt này được cho là VRVGB. Kaplan (1973) phát hiện DNA polymerase nội sinh bên trong vỏ ngoài của các hạt Dane.
Chính DNA polymerase này giúp Robinson (1979) nhân dòng HBV DNA và xác định chuỗi mã nucleotide DNA toàn phần, cho rằng HBV là một tác nhân gây bệnh theo đường máu nhưng không sao chép trong môi trường nuôi cấy mô. Từ đó, bộ gen HBV là bộ gen độc đáo trong thế giới virus do bản chất đậm đặc của chúng, các khung đọc gối lên nhau và do phụ thuộc vào bước phiên mã ngược, dù rằng virion chứa chủ yếu DNA. Do phát hiện này, VRVGB người trở thành kiểu nguyên sinh của họ hepadnavirus, Hepadnaviridae. Năm 1972, Magnus phát hiện ra HBeAg. Mullis K.B. (1983) đã tìm ra phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Đây là một phương pháp nhân dòng in vitro nhằm tạo ra một số lượng lớn bản sao của một chuỗi mã nhất định. Nhờ phát minh này, Mullis nhận giải Nobel (1993) và sinh học phân tử có những bước tiến bộ mới. Sự khuếch đại virus bằng PCR giúp phát hiện trực tiếp và rất nhạy HBV DNA trong huyết thanh, tế bào và các mô, hơn là phát hiện nhiễm HBV gián tiếp qua đáp ứng miễn dịch ký chủ đối với kháng nguyên virus. Nhờ đó trong thập kỷ vừa qua, nhiều tiến bộ đã đạt được về sinh học phân tử, dịch tễ học, sinh bệnh học, chẩn đoán, điều trị và dự phòng của HBV. 1.2.2 Phân loại và các kiểu gen HBV 1.2.2.1 Phân loại HBV Hiện nay, virus có tính hướng gan được xếp vào một danh sách ngày càng dài, thường xếp theo thứ tự mẫu la tinh từ A (HAV), B (HBV), C (HCV), D (HDV) , E (HEV), G, TTV (đến nay đã có 16 kiểu huyết thanh TTV), virus SENV (phát hiện năm 1999, đến nay đã có 9 kiểu gen), virus SANBAN, virus nhỏ giống TTV, virus YONBAN, virus Sentinel… [6,7] Trong đó, chỉ có virus A và E là truyền theo đường tiêu hóa (thường gặp trong các vụ dịch ở Châu Á, Bắc Phi và Mexico); các virus khác (B, C, D) truyền theo đường máu; còn VRVG G cũng được cho là có thể truyền qua đường máu, là tác nhân gây bệnh nhưng hiếm, nếu có thì thường gây VG rõ rệt. Năm 1994, VRVG F được báo cáo, nhưng hiện nay, VRVG F được xem là thể biến dị của HBV gặp ở Nhật Bản [6,16]. Dựa theo sự xuất hiện ngoài tự nhiên: HBV thuộc virus động vật có xương sống. Dựa theo các nhóm acide nucleic của virus động vật, HBV nằm trong nhóm 1, chứa 2 sợi DNA có cấu trúc xoắn vòng, chỉ một mạch phiên mã tạo mRNA (dịch mã tạo protein vỏ capsid). HBV có cấu trúc 20 mặt, 42 capsomer, có vỏ ngoài, trọng lượng phân tử là 1,6kD, sợi thứ hai chưa hoàn chỉnh và có khác về chiều dài. Dựa theo khả năng gây bệnh: HBV là virus gây viêm gan (viêm nhiễm các tuyến) [4]. Hệ thống phân loại HBV: Họ Hepadnaviridae
Chi Orthohepadnavirus Hepatitis B virus [20]. 1.2.2.2 Các kiểu gen HBV Dựa vào mức độ tương đồng về trình tự các nucleotide, hiện nay người ta chia HBV thành 8 kiểu gen (genotype) được gọi theo thứ tự mẫu la tinh: A, B, C, D, E, F, G, H [44]. Các kiểu gen HBV này khác nhau ít nhất 8%. Bên cạnh đó, chúng còn rất đa dạng, trong mỗi kiểu gen lại được chia ra thành nhiều phân týp (subgenotype) và các phân týp này khác nhau ít nhất 4% [26]. Các kiểu gen HBV khác nhau phân bố ở các vùng địa lí đặc trưng khác nhau: kiểu gen A phổ biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi, và Ấn Độ; kiểu gen B và C thì phổ biến ở Châu Á; kiểu gen D phổ biến ở Châu Âu (vùng Địa Trung Hải), Trung Đông, Ấn Độ và Nam Phi; kiểu gen E phổ biến ở Tây Phi; kiểu gen F phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Alaska; kiểu gen G phổ biến ở Châu Âu, Mexico, Mỹ; kiểu gen H thường thấy ở Trung Mỹ, Mỹ và Nhật Bản [37]. Hình 1.1: Sự phân bố các kiểu gen của HBV trên thế giới Nguồn: Marion Peters MD (2008), Hepatitis B - Diagnosis, Serology, Virology, UCSF. 1.2.3 Tình hình nhiễm virus HBV trên thế giới và Việt Nam Nhiễm HBV là một bệnh thường gặp nhất trên thế giới gây VG mạn ở người. VGB mạn tính có thể dẫn đến xơ gan và chết do suy gan; đây là nguyên nhân chính yếu của ung thư tế bào gan trên thế giới.
1.2.3.1 Thế giới Theo WHO (1997), có khoảng trên 2 tỷ người nhiễm HBV trên thế giới, hơn 350 triệu người mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ung thư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan. Ngày nay, dù đã có các vacxin hiệu quả chống lại VGB, HBV cũng gây ra khoảng 1,2 triệu cái chết hàng năm trên toàn thế giới. Đến năm 2000, số người nhiễm HBV trên toàn cầu đã tăng lên 400 triệu người [1]. Tỷ lệ người mang HBsAg thay đổi khác nhau trên thế giới từ 0,1% đến 0,2% ở Anh, Mỹ và Scandinavia, đến hơn 3% ở Hy Lạp và miền Nam nước Ý và có thể lên đến 10% - 11% hoặc hơn nữa ở Châu Phi và Viễn Đông trong đó có Đông Nam Á. Người mang HBsAg có thể có tỷ lệ rất cao trong vài cộng đồng sống biệt lập như người Eskimo Alaska và người dân bản xứ Australia. HBV lưu hành trên toàn thế giới. Người ta ước tính trên thế giới có hơn 50 triệu người nhiễm HBV mới xảy ra hàng năm [1]. 1.2.3.2 Việt Nam Trên bản đồ dịch tễ của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ dân số Việt Nam mang kháng nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới. Nhận định này cũng được một số công trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài nước xác nhận. Ở Việt Nam, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về VGB. Mức nhiễm HBV của Việt Nam tương đối cao, tỷ lệ có HBsAg trong cộng đồng nói chung vào khoảng 10-20% (Hoàng Thủy Nguyên, Nguyễn Thu Vân, 1992; Phạm Song và cs, 1996…) cho thấy nước ta là nước có dịch HBV địa phương cao [1]. 1.2.4 Dịch tễ học của bệnh viêm gan siêu vi B Căn cứ vào tần suất nhiễm HBV, tỷ lệ nhiễm virus toàn bộ, độ tuổi nhiễm virus và cách truyền bệnh chủ yếu, người ta chia thành 3 khu vực với 3 mức độ lưu hành rõ rệt: vùng nội dịch lưu hành cao, vùng nội dịch lưu hành trung bình và vùng nội dịch lưu hành thấp. Hơn phân nữa dân cư trên thế giới đã từng nhiễm HBV, dù tần suất chính xác khó dự đoán và rất khác nhau giữa các khu vực. Người ta đã tính có 45% dân số sống trong vùng dịch lưu hành cao, 43% trong vùng dịch trung bình và 12% trong vùng dịch lưu hành thấp [1]. 1.2.4.1 Vùng nội dịch lưu hành cao (high endemic area)
Trong vùng dịch lưu hành cao có ≥ 8% người nhiễm HBV mạn và trong huyết thanh của đa số người lớn (> 70%) đã chứng tỏ có nhiễm virus trước đó. Những vùng này gồm đa số các nước châu Á, trong đó có Việt Nam (trừ Nhật và Ấn Độ), châu Phi, hầu hết vùng Trung Đông, vùng châu thổ Amazon Nam Mỹ, hầu hết các nhóm quần đảo Thái Bình Dương và một số dân địa phương khác như người Eskimo, thổ dân châu Úc và dân Maori. Trong các vùng dịch lưu hành như Đông Á, vùng Sahara Hạ ở châu Phi và lưu vực sông Amazon, tỷ lệ người mang HBV từ 8% đến 25% và tần suất anti-HBs từ 60-85%. Vì thế, phơi nhiễm HBV trong các vùng dịch lưu hành cao có thể đạt đến 100% [1]. 1.2.4.2 Vùng nội dịch lưu hành trung bình (intermediate endemic area) Trong vùng dịch lưu hành trung bình, tần suất của người nhiễm HBV mạn từ 2-7% và 20-50% người lớn đã từng nhiễm HBV. Những vùng này gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, miền Tây Á, Nhật, Đông Nam châu Âu và hầu hết miền Trung và Nam Mỹ. Trong các vùng này, nguy cơ cuộc sống trung bình của những người nhiễm HBV được ước tính từ 20-60%. Tần suất anti-HBs hoặc anti-HBc ở những người HBsAg(-) có nguy cơ trung bình hơi thấp và hầu hết các phơi nhiễm xảy ra ở trẻ con. Những vùng này bao gồm 43% dân số toàn cầu [1]. Hình 1.2: Sự phân bố HBV trên thế giới Nguồn: http://uscis.gov/graphics/shared/aboutus/statistics/yearbook/2002.pdf 1.2.4.3 Vùng nội dịch lưu hành thấp (low endemic area) Tần suất người mang HBV mạn dưới 2% và tần suất người lớn đã từng nhiễm virus dưới 20%. Những vùng này bao gồm Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc, New Zealand. Tần suất của HBsAg từ dưới 0,1% ở Bắc Âu và 1% đến 5% ở Nam châu Âu. Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật và Dự phòng Mỹ (CDC) ước tính ở Mỹ có 140000 đến 320000 người mới nhiễm HBV mỗi năm. Nhiễm HBV mới gây ra 8400 đến 19000 trường hợp nhập viện hàng
năm và 140 đến 320 người chết vì viêm gan kịch phát. Ở Mỹ, có từ 1 đến 1,25 triệu người mang HBV mạn tính, nhiều người trong số họ di cư từ các vùng có tần suất cao và trung bình [6]. 1.2.5 Một số đặc điểm sinh học của HBV HBV thuộc họ Hepadnaviridae, một họ gây viêm gan cho nhiều loài động vật. HBV là một virus DNA nhỏ với các đặc điểm về siêu cấu trúc, phân tử, kháng nguyên và sinh học độc đáo, khác biệt với các thành viên của tất cả các họ virus đã được biết. DNA khá nhỏ, tròn, một phần mạch đơn (do cơ chế sao chép của chúng và do có men phiên mã ngược). Các đặc điểm sinh học đáng chú ý là tính hướng cơ quan (tropism) nổi bật đối với tế bào gan và có khuynh hướng gây nhiễm virus tồn tại (tình trạng người mang mạn tính), với nồng độ cao của kháng nguyên virus gồm các thể virus toàn vẹn hay không toàn vẹn chứa trong máu tồn tại trong nhiều tháng hoặc nhiều năm [6]. HBV là một virus bền vững, nó có thể sống và gây nhiễm trùng trong vòng 6 tháng ở diều kiện nhiệt độ phòng [3]. 1.2.5.1 Hình thái học và cấu trúc của HBV HBV là VRVG người đầu tiên mà đặc điểm cấu trúc protein và bộ gen được nhận dạng và xác định một cách cơ bản và đầy đủ.  Hình thái học hạt virus hoàn chỉnh HBV có 3 kiểu hạt hiện diện trong máu của người nhiễm virus. Virus hoàn chỉnh (virion, hạt Dane) có hình cầu, đường kính 42-45nm; các hạt cầu và các dạng sợi nhỏ hơn có đường kính khoảng 22nm chứa các protein và lipit vỏ ngoài HBsAg [6]. Hình 1.3: Các dạng HBV trong huyết thanh dưới kính hiển vi điện tử Nguồn: http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/hepb.html  Cấu trúc của HBV virion [6]
Dùng phương pháp nhuộm âm bản, virion hấp phụ vào các rây của kính hiển vi điện tử và một cấu trúc hai vỏ của virion hiện rõ. Hình 1.4: Cấu trúc của HBV virion Nguồn: www.yanengbio.com/en/Product_view.asp?cp_id=72 - Vỏ protein bên ngoài hoặc màng bao kích thước 7nm, được tạo thành bởi các kháng nguyên bề mặt HBsAg, glycoprotein, lipid. Các chi tiết cấu trúc bề mặt như núm hoặc gai, như ở nhiều virus có màng bao khác, không thấy có trên HBV. - Bên trong là hạt lõi hay còn gọi là capsit có đường kính 28-34nm dưới kính hiển vi điện tử lạnh. Vỏ trong bao gói HBV DNA, có thành phần kháng nguyên HBcAg và một số enzyme quan trọng như polymerase, protein kinase… 1.2.5.2 Thành phần cấu trúc kháng nguyên  Hạt Dane: Huyết thanh của người bị nhiễm trùng cũng chứa một số lượng ít hơn những hạt kích thước khoảng 42nm. Đó là những virus còn nguyên vẹn và có khả năng gây nhiễm [3].  HBsAg: Sự hiện hữu của HBsAg là bằng chứng đầu tiên của nhiễm HBV, nó xuất hiện trước các bằng chứng về sinh hóa của bệnh gan [16]. Huyết thanh của người mang virus nồng độ cao chứa một lượng khá lớn các hạt không gây nhiễm là các protein HBs dư thừa (HBsAg). Đó là các hạt hình cầu hoặc hình sợi. Các hạt hình cầu có đường kính 17-25nm, chiếm đa số; chúng có dạng như là các túi nhỏ với thành dày độ 4nm và đường kính bên trong từ 10- 15nm. Các hạt hình sợi (hoặc hình ống) ít hơn, đường kính độ 20nm có chiều dài thay đổi. Huyết thanh của người mang HBV với nồng độ virus huyết thấp thường các hạt cầu HBs và các sợi HBs rất ít hoặc không có. Hai cấu trúc virus phụ này không chứa HBV DNA và vì thế không gây nhiễm [6].
 HBcAg (các hạt lõi trong gan): Các hạt lõi HBV trống không có vỏ ngoài thường được thấy trong nhân tế bào gan là nơi chúng được tổng hợp và dự trữ (một số hạt lõi có thể được tổng hợp trong bào tương). Có hai loại hạt lõi: hạt lõi trống không chứa DNA và hạt lõi đầy có chứa DNA. Tuy nhiên, không có các hạt lõi trần nào được tìm thấy ở huyết thanh của người mang HBV dung nạp miễn dịch mà không có anti-HBc [6]. Vì vậy, HBcAg không xác định được bằng các phản ứng huyết thanh học, nó được tách ra sau khi phá vỡ hạt Dane ở các mẫu sinh thiết, sau đó xác định bằng phương pháp ELISA [20].  HBeAg: Kháng nguyên này đại diện cho dạng tiết ra của HBcAg xuất hiện trong quá trình ủ bệnh, giai đoạn tiền triệu và nhiễm trùng cấp. Xuất hiện sau HBsAg 2-4 tuần (khoảng 1,5 tháng sau khi nhiễm virus). Sự xuất hiện kháng nguyên này trong huyết thanh chỉ ra sự lây nhiễm. Sự tồn tại dai dẳng của HBeAg trong huyết thanh sau 3 tháng dẫn đến tăng khả năng viêm gan B mạn tính [6,16]. Vì hàm lượng của nó tỷ lệ thuận với lượng virus, do đó qua kháng nguyên này có thể đánh giá được mức độ nhiễm của người bệnh [20]. 1.2.5.3 Cấu trúc bộ máy di truyền  Cấu trúc của DNA virion Dưới kính hiển vi điện tử, HBV DNA hình vòng, mạch kép không hoàn chỉnh và dài khoảng 3181-3221 base. Việc đánh số bắt đầu ở một điểm phân cắt của EcoRI. Bên trong virion, mạch DNA mã hóa protein virus gọi là mạch (-), có chiều dài nguyên vẹn nhưng không đóng đồng hóa trị. Có một phần dư nhỏ từ 9 đến 10 base tại đầu tận. DNA mạch (-) mang tại đầu tận 5’ phần gắn kết đồng hóa trị của polymerase virus được gọi là protein tận cùng hoặc primase, vì cần thiết khởi động cho sự tổng hợp mạch (-). Mạch (+) giữ mạch (-) trong cấu hình vòng vì nó tạo cầu nối cho những đoạn không liên tục của mạch (-) [1]. Đầu tận 3’ của mạch (+) không ở một vị trí cố định và còn nối với HBV DNA polymerase. Đa số các bộ gen HBV chứa một lỗ hổng mạch đơn có chiều dài từ 300-2000 base do mạch (+) có chiều dài thay đổi từ 50-100% chiều dài của mạch (-) [6,20]. Mạch (-) đầy đủ có các đầu tận 5’ và 3’ xác định với một phần dư tận cùng gồm 9 base, trong vùng mà ở đó bộ gen có mạch ba. Polymerase virus nối đồng hóa trị vào tyrosin 63 qua một cầu phosphodieste vào đầu 5’ của mạch âm. Đầu tận 5’ của mạch DNA (+) được tạo bởi một oligonucleotide chiều dài 18 base, được gắn chóp theo cùng một cách như RNA thông tin (mRNA). Bộ gen chứa 2 chuỗi mã 10 hoặc 11 base được lặp lại một cách trực tiếp, được gọi là các chuỗi mã lặp lại trực tiếp, DR1 và DR2. Cấu trúc bộ gen này là điển hình cho tất cả Hepadnaviridae, nhưng trong các hepadnavirus gia cầm, sự gối lên nhau và khoảng cách giữa các đoạn lặp lại (DR) ngắn hơn [6].
Cấu trúc của bộ gen HBV không theo các tiêu chuẩn xếp loại thông thường của virus trong nhiều khía cạnh: cấu trúc bộ gen có cả DNA và RNA và bộ gen chứa DNA mạch đơn, mạch kép và ngay cả mạch ba không hoàn chỉnh. Các đặc trưng bất thường này là do hậu quả trực tiếp của cơ chế sao chép của chúng [6].  Cấu trúc bộ gen của HBV Định nghĩa các khung đọc mở: Từ chuỗi mã nucleotide của một phiên bản mạch kép của bộ gen HBV, người ta có thể nhận được 6 chuỗi mã khác nhau của bộ ba mã hóa aa của nucleotide (codon). Nếu có một chuỗi mã của các codon không mã hóa protein, nó sẽ bị cắt đứt một cách ngẫu nhiên bởi một trong 3 codon kết thúc, trong khi các chuỗi mã mã hóa protein thường không có codon kết thúc trong một khoảng ít nhất 50 codon. Các quãng codon này được gọi là khung đọc mở (KĐM) [6]. Cấu trúc bộ gen của HBV: Hầu hết KĐM chức năng của tổ chức tế bào cũng như các KĐM từ các virus lớn hơn, được xếp theo kiểu đường thẳng trên bộ gen và mã hóa một protein. Hơn nữa, chúng nằm rải rác cạnh các vùng rộng không mã hóa được gọi là intron (vùng không mã hóa), bị loại bỏ sau khi phiên mã bởi hiện tượng ghép nối. Các vùng điều hòa và mã hóa protein thường khá phân tán. Tuy nhiên, bộ gen HBV có chiều dài tối thiểu gồm: KĐM mã hóa DNA polymerase virus và các chức năng phụ; KĐM S nằm hoàn toàn trong phạm vi KĐM P; KĐM C và X gối lên KĐM P một phần; KĐM S mã hóa 3 protein HBs có chung một đầu tận cùng; KĐM C mã hóa cho cả 2 protein, HBe và HBc; KĐM X cũng có thể mã hóa hơn 1 protein [6]. - Vùng S (surface): gồm 3 gen S, preS1, preS2. Gen S: Mã hóa cho protein chính. Gen S và preS2 mã hóa loại protein trung bình (M). Gen S, preS1 và preS2 mã hóa protein lớn (L) của vỏ ngoài chứa 390 acide amine, tham gia vào việc gắn virus vào tế bào gan, lắp ráp virion và giải phóng virus ra khỏi tế bào. - Vùng C (core): gồm gen C và preC. Gen C mã hóa cho protein lớn của lõi gồm 138 acide amine, có khả năng gắn kết với acide nucleic, tham gia vào quá trình lắp ráp virus.
Hình 1.5: Cấu trúc bộ gen HBV Nguồn: http://international.abbottmolecular.com/RealTimeHBV_16732.aspx - Vùng P (polymerase): Gen P chiếm ¾ bộ gen của virus, gối lên phần cuối gen C, phần đầu gen X và toàn bộ gen S. Gen P mã hóa một polypeptide chứa 832 acide amine rất giàu histidine, trọng lượng phân tử khoảng 90kD, có hoạt tính DNA polymerase và enzyme phiên mã ngược (DNA polymerase phụ thuộc RNA). - Vùng X: Là gen có kích thước nhỏ nhất. Chức năng của gen này vẫn chưa được biết chính xác nhưng có lẽ nó giữ vai trò là nhân tố hoạt hóa (transactivation) trong quá trình nhân đôi của siêu vi. Virus DHBV không có vùng X [6,20]. 1.2.5.4 Quá trình sao chép của virus viêm gan B Quá trình sao chép của HBV và có thể được chia làm nhiều bước: 1. Gắn kết virus vào tế bào ký chủ; 2. Xâm nhập của virus vào tế bào (sự nhập bào); 3. Phóng thích bộ gen virus; 4. Biểu hiện các sản phẩm gen virus; 5. Sao chép bộ gen virus; 6. Lắp ráp các hạt virion (virus hoàn chỉnh);
7. Phóng thích virus.  Gắn kết virus vào tế bào ký chủ Sự gắn kết HBV vào tế bào chủ là một trong các bước then chốt xác định tính hướng cơ quan của virus nhờ vào các điểm gắn virus và các thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào [6]. Hạt HBV hoàn chỉnh lưu thông trong máu và tìm cách gắn kết vào tế bào chủ. Nhiều bằng chứng cho thấy một vùng protein bề mặt lớn (vùng PreS1) là nơi gắn kết thụ thể. Các kháng thể đối với PreS1 có thể phong tỏa sự gắn kết của virion HBV vào màng tế bào gan. Sự gắn kết cũng có thể qua trung gian albumin huyết thanh người đã biến đổi. Vì thế, HBV có thể dùng protein huyết thanh đã biến đổi như một phương tiện chuyên chở để vào tế bào gan [6].  Xâm nhập của virus vào tế bào (sự nhập bào) Cơ chế HBV đi vào tế bào chủ chưa được hiểu biết rõ ràng: hoặc vỏ ngoài HBV có protein dung hợp, protein dung hợp này chèn một chuỗi mã kị nước vào hai lớp lipid của tế bào đích và gây dung hợp màng virus với màng tế bào, qua đó phóng thích nucleocapsit virus vào bào tương; hoặc virus nhập nội bào qua trung gian thụ thể [6].  Phóng thích bộ gen virus Trước đây, người ta cho rằng toàn bộ hạt lõi được vận chuyển vào nhân. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, đường kính tối đa các lỗ nhân là 25nm quá nhỏ so với kích cỡ của các hạt lõi là 36nm. Tuy nhiên, hạt lõi có thể vận chuyển bộ gen virus đến phức hợp lỗ nhân nếu nó bị phosphoryl hóa. Vì kích cỡ của hạt lõi, sự phóng thích bộ gen sau đó phải xảy ra khi bộ gen virus vào nhân, có thể qua trung gian của polymerase virus nối đồng hóa trị [1].  Biểu hiện các sản phẩm gen virus [20] Sự biểu hiện các gen của virus thông qua ít nhất hai bản phiên mã không qua xử lí ghép nối. Không có protein nào được mã hóa bởi mạch (+). Sau khi cởi bỏ vỏ capsid, HBV DNA kép với 2 sợi không bằng nhau được chui vào nhân và chuyển thành dạng cccDNA. Dạng này được dùng làm khuôn để tổng hợp 4 loại RNA với các kích thước khác nhau 3,5; 2,4; 2,1; và 0,7kb. Trong đó, mRNA 3,5kb gọi là RNA tiền genom, dùng làm khuôn để tổng hợp genom. Các mRNA còn lại được gọi là dưới genom dùng để tổng hợp các protein khác nhau trong đó có DNA polymerase (P), protein lõi C và preC, polypeptide X, protein bề mặt S và protienkinase. Các mRNA này được gắn đuôi và di chuyển ra tế bào chất.
Protein lõi C tạo thành nucleocapsid (HBcAg). Polypeptide tiền lõi được vận chuyển đến mạng lưới nội chất, từ đó chúng được tiết ra ngoài dưới dạng kháng nguyên tiền lõi (HBeAg). RNA tiền genom được đóng gói cùng với HBV DNA polymerase và proteinkinase để tạo thành hạt lõi. Protein X tương tác với các yếu tố phiên mã trong nhân được kích thích bởi tín hiệu từ tế bào chất. Protein vỏ ngoài S gắn vào màng lipid của bộ mày golgi và mạng lưới nội chất để sau đó nucleocapsid này nảy chồi vào mạng lưới nội chất và bộ máy golgi để biến chúng thành vỏ ngoài của virus tương lai. Trong quá trình nhân lên, virus luôn tổng hợp thừa protein vỏ nên trong huyết thanh người bị nhiễm HBV, ngoài hạt virus hoàn chỉnh (hạt Dane) còn xuất hiện các dạng không hoàn chỉnh hình cầu, hình que hoặc hình sợi.  Sao chép bộ gen virus Sau khi hạt lõi được lắp ráp xong, RNA tiền genom được dùng làm khuôn để tổng hợp chuỗi DNA theo cơ chế sao chép ngược. Vùng primase của polymerase dùng như một đoạn mồi đối với men phiên mã ngược. Bởi thế, mạch DNA (-) lớn lên (ở dưới bên trái) được gắn kết vào đầu tận 5’ của primase. Sự phiên mã ngược tiến hành cho đến đầu tận 5’ của khuôn mẫu RNA được tiếp cận. Bởi thế một phần dư ngắn được sinh ra ở mạch (-). Hoạt tính RNase H kết hợp với men phiên mã ngược làm thoái hóa khuôn mẫu RNA và phân cắt một đoạn RNA có mũ chụp dài 18 base ở đầu tận 5’ của nó. Đoạn này có sự đồng dạng 6 base đối với DR1 và DR2 lặp lại trực tiếp. Sự tương tác yếu này cho phép chuyển đoạn và men phiên mã ngược /DNA polymerase từ DR1 vào DR2. Ở đây, đoạn RNA có chức năng như một đoạn mồi tổng hợp DNA mạch (+). DNA polymerase có khả năng xuyên qua tính không liên tục trong khuôn mẫu mạch (-) vì đoạn dư ngắn tận cùng của nó. Sau đó, cấu trúc của DNA virion được tái sản xuất [6].
Hình 1.6: Quá trình sao chép của HBV trong tế bào gan Nguồn: http://www1.qiagen.com/Default.aspx Một số genom trưởng thành sau khi tổng hợp lại quay về nhân để chuyển thành cccDNA nhằm duy trì một lượng khuôn ổn định cho dịch mã [20]. Các tế bào gan thường chỉ tích lũy khoảng 50 bản sao HBV cccDNA cho mỗi tế bào [6].  Lắp ráp các hạt virion Sự tổng hợp HBV DNA chưa được hoàn tất trước khi virus trưởng thành. Tại mạng lưới nội chất, các phân tử lõi trưởng thành được đóng gói vào trong các protein bề mặt [6,20].  Phóng thích virus khỏi tế bào chủ Sau khi có vỏ ngoài, virus hoàn chỉnh được tiết ra thông qua bọng vận chuyển [6,20]. 1.2.6 Đặc điểm sinh bệnh học và biện pháp phòng ngừa – điều trị HBV 1.2.6.1 Con đường lây nhiễm Nguồn hoặc ổ chứa HBV người chính là con người. Không có ổ chứa quan trọng nào khác trên động vật. Một vài bề mặt dụng cụ như kim tiêm, bàn chải đánh răng, dao cạo râu, đồ chơi, dụng cụ y