Chlorophyll) không phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng kích thích vì ánh sáng huỳnh
quang được phát ra khi phân tử chuyển từ mức năng lượng S1→So. Khi phân tử hấp thụ
năng lượng ánh sáng để chuyển lên các mức năng lượng cao hơn S1, qua con đường thải
nhiệt để cuối cùng đều chuyển về mức S1 để sau đó phát ánh sáng huỳnh quang. Ví dụ
Chlorophyll có thể hấp thụ cả ánh sáng xanh (λ=440nm) và ánh sáng đỏ (λ=700nm) nên
khi chiếu dung dịch Chlorophyll dù là ánh sáng xanh hay ánh sáng đỏ thì phổ huỳnh
quang của Chlorophyll vẫn không thay đổi.
* Qui luật Levin: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang đối xứng quanh một bước sóng λo (xem
hình 8.5). Qui luật đúng với phân tử có cấu trúc đơn giản.
1
2
λ1
λ
o
λ
2
λ
D
Hình 8.5: Phổ hấp thụ (1) và phổ huỳnh quang (2) đối xứng qua λo
2. Sự phát lân quang
Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển từ mức năng lượng cơ bản So lên
mức kích thích S1 và khi trở về trạng thái ban đầu có thể bằng sự thải nhiệt (đường 2,
hình 8.3) hoặc phát huỳnh quang (đường b, hình 8.3), hoặc thải nhiệt để chuyển về mức
triplet (đường 3, hình 8.3), sau đó phân tử chuyển từ mức triplet về mức So và phát ra ánh
sáng lân quang (đường c, hình 8.3). Sự phát lân quang có thể biểu diễn dưới dạng:
T→So+hγ*
γ*: Tần số ánh sáng lân quang ⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
λ
=γ *
*v.
Lân quang cũng được đặc trưng bởi phổ lân quang. Phổ lân quang là đường cong phụ
thuộc của cường độ ánh sáng lân quang vào bước sóng ánh sáng lân quang (λ*). Phổ lân
quang luôn dịch chuyển về phía ánh sáng có bước sóng dài hơn so với phổ hấp thụ và phổ
huỳnh quang. Nguyên do vì *
lq
'
hqht
v
.hE
'
v
.hE
v
.hE λ
=>
λ
=>
λ
= suy ra bước sóng ánh
sáng hấp thụ (λ) nhỏ hơn bước sóng ánh sáng huỳnh quang và bước sóng ánh sáng huỳnh
quang (λ') lại nhỏ hơn bước sóng ánh sáng lân quang (λ*) (xem hình 8.6). Sự phát lân
quang kéo dài từ 10-4 đến 10-2 giây, tức là lâu hơn so với sự phát huỳnh quang. Do vậy
khi đã tắt ánh sáng chiếu nhưng sự phát lân quang vẫn có thể xảy ra.
1
2
λ
λ
'
λ
D
3
λ
*
Hình 8.6: Phổ hấp thụ (1), phổ huỳnh quang (2) và phổ lân quang (3) (λ<λ'<λ*).
3. Sự vận chuyển năng lượng
Phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng đã chuyển từ mức năng lượng thấp là So lên mức
năng lượng cao là S1. Khi phân tử chuyển từ mức năng lượng S1→So, nó có thể qua con
đường thải nhiệt, phát huỳnh quang hay lân quang, hoặc nó có thể chuyền năng lượng
cho phân tử khác. Giả sử phân tử ở trạng thái kích thích là chất cho năng lượng (ký hiệu
là ) còn chất nhận năng lượng là phân tử ở trạng thái cơ bản (ký hiệu là M
*
1
Mo) thì quá
trình chuyền năng lượng có thể viết dưới dạng:
+M
*
1
Mo→M1+
*
0
M
*
0
M là phân tử ở trạng thái kích thích và có mức năng lượng cao hơn so với năng lượng
của phân tử Mo.
Quá trình chuyền năng lượng là một quá trình vật lý, không kèm theo sự biến đổi hoá học
và không cần M1 va chạm với Mo. Sự chuyền năng lượng có thể xảy ra theo nhiều cơ chế
nhưng ở đây chỉ xét cơ chế chuyền năng lượng theo cộng hưởng cảm ứng. Để có sự
chuyền năng lượng theo cơ chế này cần có một số điều kiện sau:
- Chất cho năng lượng phải có khả năng phát huỳnh quang, đặc trưng bởi cường độ
phát quang là J.
*
1
M
- Phổ huỳnh quang của chất cho phải có vùng chung với phổ hấp thụ của chất nhận
M
*
1
M
o (xem hình 8.7), đặc trưng bởi mật độ quang học là D.
JD
λ
- Khoảng cách giữa chất cho và chất nhận năng
lượng M
*
1
M
o phải nhỏ hơn giá trị tới hạn cho phép. Ở một
số điều kiện khi khoảng cách trung bình giữa chất cho
và chất nhận năng lượng đạt khoảng cách từ 20 đến
100 thì có thể chuyền toàn bộ năng lượng cho
M
o
A*
1
M
o, tức là hiệu suất chuyển năng lượng bằng một
(ϕ=1). Với hệ có chứa nhiều phân tử có khả năng hấp
thụ ánh sáng để chuyển lên trạng thái kích thích thì khả
năng xảy ra sự chuyền năng lượng đối với phân tử
protein đạt chỉ vài phần trăm còn axit nucleic đạt 30%
J D
Hình 8.7: Phổ phát quang của chất
*
1
M
là J và phổ hấp thụ của chất Mo là D
có vùng chung (phần gạch ngang)
và ở hệ có nhiều phân tử hấp thụ ánh sáng thì có thể đạt
tới 100%.
V. Phản ứng quang hóa
Phản ứng quang hóa là những phản ứng xảy ra trong hệ dưới tác dụng của ánh sáng. Phản
ứng quang hóa nào cũng đều trải qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu là giai đoạn được chiếu
sáng đã xảy ra sự hấp thụ năng lượng ánh sáng để tạo nên những phân tử bị kích thích,
các ion và các gốc tự do. Giai đoạn thứ hai là giai đoạn tối (không cần sự chiếu sáng) tiếp
tục xảy ra các phản ứng với sự tham gia của các sản phẩm quang hóa được hình thành từ
giai đoạn sáng để tạo nên sản phẩm quang hóa bền vững. Tốc độ phản ứng quang hóa
được xác định bằng nồng độ phân tử chất tham gia vào phản ứng trong một đơn vị thời
gian (ký hiệu là dt
dC ). Phân tử chỉ có thể tham gia vào phản ứng khi đã hấp thụ lượng tử
ánh sáng để chuyển lên trạng thái kích thích (tức đã được hoạt hóa). Do vậy, tốc độ phản
ứng quang hóa phải bằng số lượng tử ánh sáng được hấp thụ trong một đơn vị thời gian
(ký hiệu là dt
dN ). Từ đó có phương trình:
dt
dN
dt
dC = (8.15)
Số lượng tử ánh sáng được hấp thụ trong một đơn vị thời gian tỉ lệ thuận với số lượng tử
ánh sáng chiếu vào hệ (ký hiệu là I), nồng độ phân tử chất hấp thụ (C) và tiết diện bề mặt
bị chiếu sáng (S). Từ đó có phương trình:
dt
dN = S.C.I (8.16)
Từ (8.15) suy ra:
dt
dC = S.C.I (8.17)
Tuy nhiên, không phải tất cả năng lượng photon đều được các phân tử hấp thụ để chuyển
lên trạng thái kích thích và sau đó phân tử kích thích tiếp tục tham gia vào phản ứng mà
có một số phân tử kích thích không tham gia vào phản ứng mà trở về trạng thái ban đầu
bằng cách thải nhiệt ra môi trường hay phát quang. Vì thế có khái niệm hiệu suất quang
hóa (hay suất lượng tử, ký hiệu là ϕ) được xác định theo công thức:
Số photon được phân tử hấp thụ để tham gia vào phản ứng (N2)
ϕ = Số photon được hệ hấp thụ (N1)
Hay:
1
2
N
N
=ϕ (8.18)
Trên thực tế giá trị ϕ bao giờ cũng nhỏ hơn 1 và chỉ đạt vài phần trăm đến vài chục phần
trăm. Ví dụ như hiệu suất quang hóa của phản ứng khử hoạt tính của men khi bị chiếu
sáng chỉ đạt từ 10-3 đến 10-2 (tức từ 1 00
0→1%), nghĩa là một phân tử men phải hấp thụ từ
100 đến 1000 photon mới bị mất hoạt tính xúc tác. Sở dĩ hiệu suất quang hóa có giá trị
thấp như vậy là do chỉ có một số ít phân tử sau khi hấp thụ photon đã tham gia vào phản
ứng. Từ đó dẫn tới khái niệm tiết diện quang sinh (δ) và được cho rằng chỉ khi photon
đập trúng tiết diện quang sinh của phân tử mới dẫn tới phân tử tham gia vào phản ứng.
Bây giờ hiệu suất quang hóa được tính theo công thức:
S
δ
=ϕ (8.19)
δ < S → ϕ < 1
Phương trình (8.17), thay khái niệm tiết diện bề mặt bị chiếu sáng bằng tiết diện quang
sinh sẽ được viết dưới dạng:
dt
dC = - δ.C.I (8.20)
Dấu trừ biểu hiện nồng độ phân tử kích thích khi tham gia vào phản ứng quang hóa sẽ
giảm dần theo thời gian. Phương trình (8.20) có thể viết dưới dạng:
C
dC = - δ.I.dt (8.21)
Nếu lấy thời gian bắt đầu xảy ra phản ứng quang hóa là không giây, ứng với nồng độ ban
đầu của các phân tử tham gia vào phản ứng quang hóa là Co thì sau thời gian là t, số phân
tử kích thích chưa tham gia vào phản ứng là C. Lấy tích phân hai vế (8.21) ta có:
∫
δ−=
C
C
t
O
o
dtI.
C
dC ∫
→
o
C
C
ln = - δ.I.t
t.I.
o
t.I.
o
e.CCe
C
Cδ−δ− =→= (8.22)
Nồng độ phân tử kích thích tham gia vào phản ứng quang hóa sẽ giảm dần theo thời gian.
Để đánh giá tốc độ phản ứng quang hóa có phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng chiếu (λ),
người ta đo tốc độ phản ứng quang hóa ⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
dt
dC ở những bước sóng khác nhau nhưng có
cùng một cường độ ánh sáng là I (tức là cùng số lượng tử ánh sáng chiếu vào mẫu vật).
Khi đó giá trị dt
dC /I sẽ phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng chiếu được gọi là đo quang phổ
hoạt động của phản ứng quang hóa.
Quang phổ hoạt động của phản ứng quang hóa có dạng trùng với quang phổ hấp thụ của
các phân tử đã tham gia vào phản ứng quang hóa.
Ví dụ: Trong quang phổ hoạt động của quá trình quang hợp, xuất hiện đỉnh cực đại ở
vùng bước sóng 480nm - 500nm mà carotin cũng có đỉnh hấp thụ cực đại tại vùng bước
sóng này, chứng tỏ carotin có tham gia vào quá trình quang hợp. Hoặc khi chiếu ánh sáng
lên dung dịch men thể hiện phổ hoạt động của phản ứng quang hóa dẫn tới khử hoạt tính
men trùng với phổ hấp thụ của axit amin thơm. Điều này chứng tỏ axit amin thơm trong
thành phần cấu tạo của phân tử men đã tham gia vào phản ứng quang hóa nên dẫn tới làm
cho phân tử men bị mất hoạt tính xúc tác.
Nếu chất A hấp thụ năng lượng ánh sáng nhưng tham gia vào phản ứng quang hóa lại là
chất B thì phổ hoạt động và phổ hấp thụ của chất B phải trùng nhau. Như vậy có nghĩa là
chất A đã chuyền năng lượng cho chất B (A+hγ→A*→B→B*) để chất B chuyển lên
trạng thái kích thích (B*) và tham gia vào phản ứng quang hóa. Nếu trong hệ có nhiều
chất, khi chiếu sáng và nghiên cứu phổ hoạt động, sau đó so sánh với phổ hấp thụ của
những chất đã biết sẽ xác định được chất nào đã chuyền năng lượng (nên không có phổ
hoạt động) và chất nào đã tham gia vào phản ứng quang hóa (nên có phổ hoạt động).
VI. Phương pháp đo độ hấp thụ trong vùng ánh sáng trông thấy và tử ngoại
Khi đo độ hấp thụ, các nhà nghiên cứu hay dùng máy quang phổ kế (còn gọi là máy so
màu). Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ kế được mô tả trên hình 8.8.
1 2 3 4 5
0
Hình 8.8: Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ kế
1) Nguồn chiếu sáng 2) Kính lọc bước sóng ánh sáng 3) Cốc đựng mẫu (cuvét) 4) Tế bào
quang điện 5) Màn hình thiết bị đo giá trị mật độ quang học (D) hay độ truyền qua (T)
Nguyên tắc đo: Cho dung môi (chất dùng để pha dung dịch nghiên cứu) vào ống thủy
tinh số 3 và chỉnh thiết bị đo số 5, cho kim chỉ số không. Sau đó đổ dung môi ra, tráng
sạch, sấy khô, để nguội rồi đổ dung dịch nghiên cứu vào, trên màn hình thiết bị đo số 5,
kim sẽ chỉ giá trị mật độ quang học D hay độ truyền qua T. Lưu ý cả dung môi và dung
dịch nghiên cứu đều đo ở bước sóng đã được chọn trước. Ví dụ đo mật độ quang học của
dung dịch ADN thì phải chọn bước sóng λ=260nm. Mỗi chất hấp thụ cực đại ở một bước
sóng nhất định (ký hiệu là λmax) và khi chiếu ánh sáng λmax, đối với mỗi chất có một hệ số
hấp thụ xác định (ký hiệu là kmax). Song cũng có những chất hấp thụ cực đại ở một số
bước sóng khác nhau như triptophan, tirozin, phenilalanin và do vậy chúng cũng có các
hệ số hấp thụ tương ứng (xem bảng 8.1).
Bảng 8.1: Độ hấp thụ và hệ số hấp thụ ở bước sóng λmax.
Các chất
λmax (nm) kmax
Tirozin 274; 222; 193 (1,4; 8; 48).10-3
Phenilalanin 257; 206; 188 (0,2; 9,3; 60).10-3
Triptophan 280; 219 (5,6; 47).10-3
Hixtidin 211 5,9.10-3
Xistein 250 0,3.10-3
Adenin 260,5 13,4.10-3
Adenozin 259,5 14,9.10-3
Guanozin 252,5 13,6.10-3
Guanin 246 10,7.10-3
Xitozin 267 6,1.10-3
Xitidin 271 9,1.10-3