MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:58

Thêm vào BST

Báo xấu

95
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Xã hội ngày càng phát triển, mức sống nhân dân tăng dần thì đời sống tinh thần đƣợc chú trọng hơn. Mỗi ngƣời đều cần đƣợc giải trí, bầu bạn, tâm sự và hơn hết là cần đƣợc bảo vệ tính mạng cũng nhƣ tài sản. Để đáp ứng nhu cầu này, chó là loài vật đƣợc ƣa chuộng hàng đầu do bởi tính trung thành, sự thông minh, lòng can đảm… Cho nên chó ngày càng gắn bó và giữ một vị trí nhất định trong mỗi gia đình. Khi cuộc sống gia đình đƣợc sung túc, mức tiêu khiển...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ĐỖ HOÀNG KHIÊM MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN ĐỖ HOÀNG KHIÊM BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH Khóa: 2002-2006 KS. NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** FACTORS EFFECT ON THE RESULT OF CULTURE OF OVIDUCTAL EPITHELIAL CELLS AND DOG SPERM CAPACITATION Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: A.Professor. Dr. TRAN THI DAN DO HOANG KHIEM Veterinarian. QUACH TUYET ANH Term: 2002 - 2006 Engineer. NGUYEN VAN UT Ho Chi Minh City 09/2006
LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Cô Trần Thị Dân đã hết lòng hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, một tấm gƣơng lao động, một phong cách làm việc cần đƣợc noi theo. Thầy Đinh Xuân Phát, cô Quách Tuyết Anh và thầy Nguyễn Văn Út đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm sống và làm việc, tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Thầy Trần Ngọc Hùng đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm về quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Nguyễn Văn Thuận và thầy Nguyễn Thanh Bình đã truyền đạt những kinh nghiệm nghiên cứu thực tế cho tôi. Gia đình Bác Sáu, gia đình chị Hạnh và gia đình anh Phƣớc đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài này. Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 và những ngƣời bạn thân đã chia sẽ những vui buồn cũng nhƣ hỗ trợ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp. Thủ Đức, ngày 15-08-06 Đỗ Hoàng Khiêm iv
TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đỗ Hoàng Khiêm, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ” Hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN 2. BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH 3. KSCNSH. NGUYỄN VĂN ÚT Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 06/02/2006 đến 06/07/06 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Ngày nay, kỹ thuật thụ tinh in vitro ngày càng đƣợc hoàn thiện và có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng nhân giống nhanh ở những thú cao sản hoặc thú quý hiếm. Để tiếp cận kỹ thuật này chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản đến phản ứng hoạt hóa tinh trùng nhằm hoàn thiện dần các công đoạn trong việc nâng cao tỉ lệ chó quý hiếm đƣợc tạo ra từ kỹ thuật thụ tinh in vitro. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1. Thu nhận tế bào biểu mô ống dẫn trứng nhanh hơn với phƣơng pháp vuốt và nuôi cấy ít bị nhiễm hơn phƣơng pháp cạo. 2. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính (lamelle) cho tỉ lệ thành công 28,6% (tỉ lệ đĩa xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc”) trong khi phƣơng pháp không sử dụng lá kính cho kết quả thất bại. 3. Thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa có ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng. Chất lƣợng của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa ở mốc thời gian bảo quản 0 giờ là tốt nhất, với hoạt lực trung bình cao nhất (0,78 ± 0,08) và cƣờng độ hoạt động trung bình cũng cao nhất (6,33 ± 1,03). v
MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa 1 .................................................................................................................................i Bìa 2 ............................................................................................................................... ii Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iii Tóm tắt khóa luận ..........................................................................................................iv Mục lục ...........................................................................................................................v Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... vii Danh sách các bảng .................................................................................................... viii Danh sách các hình ........................................................................................................ix PHẦN I. MỞ ĐẦU .........................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................1 1.2. Mục tiêu ...................................................................................................................1 1.3. Yêu cầu ....................................................................................................................2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................3 2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng .......................................................................3 2.1.1. Cấu tạo ............................................................................................................3 2.1.2. Chức năng .......................................................................................................4 2.1.2.1. Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng .............................................4 2.1.2.2. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng .............4 2.2. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể ....................................4 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào ..............................................................6 2.3.1. Bề mặt chai cấy ...............................................................................................6 2.3.2. Các đặt tính vật lý ...........................................................................................6 2.3.2.1. pH ..........................................................................................................6 2.3.2.2. Dung dịch đệm ......................................................................................7 2.3.2.3. Áp suất thẩm thấu ..................................................................................7 2.3.2.4. Nhiệt độ .................................................................................................7 2.3.2.5. Áp lực bề mặt và bọt khí ........................................................................7 2.3.2.6. Độ nhớt ...................................................................................................8 2.3.3. Tủ cấy ..............................................................................................................8 2.3.4. Kháng sinh ......................................................................................................8 2.4. Vấn đề nhiễm trong nuôi cấy tế bào ........................................................................8 2.4.1. Nguồn nhiễm ...................................................................................................8 2.4.2. Hình ảnh đặc trƣng của nhiễm vi sinh vật ......................................................8 2.4.3. Yêu cầu đối với ngƣời thao tác .......................................................................9 2.5. Thành phần chính của môi trƣờng nuôi cấy tế bào .................................................9 2.6. Các quy trình nuôi cấy tế bào thông dụng .............................................................10 2.6.1. Nuôi cấy sơ cấp .............................................................................................10 2.6.2. Nuôi cấy thứ cấp ...........................................................................................11 2.7. Xác định tế bào sống và chết bằng phƣơng pháp nhuộm trypan blue ..................11 2.8. Một số công trình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng....................11 2.8.1. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò và đồng nuôi cấy với phôi ........11 2.8.2. Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó ........................12 2.9. Tinh trùng ..............................................................................................................13 2.9.1. Sơ lƣợc quá trình sản sinh tinh trùng ............................................................13 vi
2.9.2. Cấu tạo của tinh trùng ...................................................................................14 2.9.3. Đặc tính của tinh trùng ..................................................................................15 2.9.4. Sự vận chuyển tinh trùng trong dƣờng sinh dục cái .....................................16 2.10. Môi trƣờng pha loãng – bảo quản tinh trùng chó ................................................17 2.10.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự tồn tại của tinh trùng ..........................................17 2.10.2. Một số môi trƣờng bảo quản tinh trùng chó ...............................................19 2.11. Hoạt hóa tinh trùng ..............................................................................................20 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................23 3.1. Nội dung ................................................................................................................23 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................................23 3.3. Vật liệu ..................................................................................................................23 3.3.1. Nguồn mẫu ....................................................................................................23 3.3.2. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................23 3.3.3. Hoá chất ........................................................................................................24 3.4. Phƣơng pháp ..........................................................................................................25 3.4.1. Nuôi cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng ..................................................25 3.4.1.1. Thu thập ống dẫn trứng tại lò mổ .........................................................25 3.4.1.2. Xử lí ống dẫn trứng tại phòng thí nghiệm ............................................25 3.4.1.3. Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng................................................26 3.4.1.4. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng ...............................................28 3.4.1.5. Nhuộm tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng trypan blue ......................29 3.4.2. Chuẩn bị tinh trùng cho quá trình thụ tinh in vitro ......................................30 3.4.2.1. Thu nhận và vận chuyển mẫu tinh trùng về phòng thí nghiệm ............30 3.4.2.2. Hoạt hóa tinh trùng ...............................................................................30 3.5. Xử lí số liệu ...........................................................................................................34 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................35 4.1. Thí nghiệm 1: thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng ........................................ ..35 4.2. Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng ................ ..35 4.3. Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa .............37 4.3.1. Hoạt lực của tinh trùng..................................................................................37 4.3.2. Nồng độ của tinh trùng .................................................................................38 4.3.3. Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình .................................................................................39 4.3.4. Tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome ..........................................40 4.3.5. Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ..............................................................41 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................44 5.1. Kết luận..................................................................................................................44 5.2. Đề nghị ..................................................................................................................44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................45 PHỤ LỤC .....................................................................................................................47 vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AR: acrosome reaction BOEC: bovine oviductal epithelial cells BSA: bovine serum albumin DNA: deoxyribonucleic acid DNP: deoxyribonucleoprotein ECS: estrous cow serum EGF: epidermal growth factor ELISA: enzyme linked immunosorbent assay ET: embryo stransfer FBS: phosphate buffered saline FCS: fetal calf serum FGF: fibroblast growth factor HSA: human serum albumin IGF: insulin – like growth factor IVC: in vitro culture IVF: in vitro fertilization IVM: in vitro maturation M II: metaphase II PCR: polymerase chain reaction PDGF: platelet – derived growth factor RNA: ribonucleic acid viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giá trị pH.........................................................................................................7 Bảng 2.2 Mối quan hệ giữa HCO3-, CO2 và HEPES ......................................................9 Bảng 2.3 Công thức môi trƣờng bảo quản tinh chó của Iguer và Verstegen ...............19 Bảng 2.4 Công thức pha chế 4 môi trƣờng ...................................................................20 Bảng 4.1 Sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” của 2 phƣơng pháp nuôi cấy.................35 Bảng 4.2 Thay đổi hoạt lực của tinh trùng ...................................................................37 Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ tinh trùng ..........................................................................38 Bảng 4.4 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ......................................................39 Bảng 4.5 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome ...............40 Bảng 4.6 Sự thay đổi cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ............................................42 ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 4.1 Cấu trúc “bóng nƣớc” (mũi tên) sau 3 ngày nuôi cấy ...................................36 Hình 4.2 Tế bào sống (mũi tên) và tế bào chết (trong vòng tròn) ............................... 36 Hình 4.3 Tinh trùng đƣợc nhuộm trƣớc phản ứng hoạt hóa .........................................41 Hình 4.4 Tinh trùng đƣợc nhuộm sau phản ứng hoạt hóa ............................................41 Hình 4.5 Hiện tƣợng tụ dính tinh trùng ........................................................................43 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 So sánh hoạt lực của tinh trùng .................................................................37 Biểu đồ 4.2 So sánh nồng độ của tinh trùng ................................................................ 38 Biểu đồ 4.3 So sánh tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ................................................................ 39 Biểu đồ 4.4 So sánh tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome ............................ 40 Biểu đồ 4.5 So sánh cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ............................................. 42 x
1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Xã hội ngày càng phát triển, mức sống nhân dân tăng dần thì đời sống tinh thần đƣợc chú trọng hơn. Mỗi ngƣời đều cần đƣợc giải trí, bầu bạn, tâm sự và hơn hết là cần đƣợc bảo vệ tính mạng cũng nhƣ tài sản. Để đáp ứng nhu cầu này, chó là loài vật đƣợc ƣa chuộng hàng đầu do bởi tính trung thành, sự thông minh, lòng can đảm… Cho nên chó ngày càng gắn bó và giữ một vị trí nhất định trong mỗi gia đình. Khi cuộc sống gia đình đƣợc sung túc, mức tiêu khiển giải trí của con ngƣời đòi hỏi sâu sắc hơn. Từ đó, chó đƣợc ƣa thích trong nhà phải là chó đẹp, quý, lạ mắt, thƣờng là chó nhập và có giá thành cao. Do đó, tiềm năng của thị trƣờng này ở nƣớc ta còn rất lớn. Tuy nhiên, những loại chó này thƣờng bị giới hạn về mặt sinh sản hay nhân giống. Để giải quyết tốt những vấn đề này, tiềm năng của kĩ thuật thụ tinh in vitro tỏ ra tối ƣu bởi vì kĩ thuật này có những ƣu điểm sau (Hoàng Kim Giao, 2003): - Khai thác đƣợc nhiều nhất tiềm năng sinh sản của con cái, nhất là ở những động vật quý hiếm có nguy cơ bị tiêu diệt và những gia súc cái cao sản. - Góp phần tham gia vào quá trình chọn lọc, nhân giống và lai tạo giống nhanh để đạt đƣợc những tính trạng mong muốn và năng suất cao. - Đánh giá nhanh khả năng thụ tinh của những con đực giống. - Cung cấp số lƣợng lớn phôi với giá thành hạ cho các nhà nghiên cứu và khai thác tế bào mầm. Hiện nay tỉ lệ phôi thai chó đƣợc tạo ra từ quá trình nuôi trứng chín in vitro (IVM), thụ tinh in vitro (IVF), nuôi cấy phôi (IVC) và chuyển cấy phôi (ET) vẫn còn khá thấp (Farstad, 2000). Vì vậy, để tiếp cận kĩ thuật thụ tinh in vitro và đáp ứng nhu cầu của xã hội về những giống chó đƣợc ƣa chuộng, đề tài “Một số yếu tố ảnh hƣởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó” đƣợc thực hiện. 1.2. Mục tiêu Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy phôi và hoàn thiện khả năng thụ tinh của tinh trùng, góp phần tăng khả năng thành công trong thụ tinh in vitro trên loài chó.
2 1.3. Yêu cầu - Thiết lập quy trình nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng. - Bố trí thí nghiệm để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian bảo quản tinh pha chế lên khả năng hoạt hóa tinh trùng.
3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng 2.1.1. Cấu tạo Ống dẫn trứng đƣợc chia thành 4 đoạn (Trịnh Bình và ctv, 2004): đoạn tiếp giáp sừng tử cung; đoạn eo; đoạn bóng phình to và đoạn loa có hình phễu, mở vào khoang bụng, có những tua ít nhiều chụp lên mặt buồng trứng. Thành ống dẫn trứng, từ trong ra ngoài, gồm ba tầng mô (Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004): tầng niêm mạc, tầng cơ và tầng vỏ ngoài. - Tầng niêm mạc gồm biểu mô và lớp đệm. Biểu mô đƣợc cấu tạo bởi bốn loại tế bào: tế bào có lông, tế bào không có lông, tế bào đáy và tế bào trung gian. Tế bào có lông: hình trụ, bào tƣơng sáng, đôi khi có hạt ở vùng chung quanh nhân. Nhân hình trứng, kém bắt màu. Mặt tự do của tế bào có những lông dài cắm vào thể đáy và chuyển động một chiều về phía tử cung. Bào tƣơng chứa ty thể, bộ Golgi, lƣới nội bào và những hạt glycogen. Tế bào không có lông: hình trụ, ít bào tƣơng. Nhân hình cầu hay hình trứng, bắt màu đậm. Mặt tự do của tế bào có những vi nhung mao và những chỗ lõm siêu vi. Bào tƣơng chứa bộ Golgi, ty thể, lƣới nội bào và những hạt chế tiết. Những tế bào không lông là những tế bào chế tiết. Sản phẩm chế tiết của chúng rất cần thiết cho noãn và tinh trùng đã lọt vào trong ống dẫn trứng. Tế bào đáy: nhỏ, nằm rải rác, có bào tƣơng sáng, ít bào quan, nhân bắt màu mạnh. Chức năng còn chƣa rõ ràng. Tế bào trung gian: nằm chen vào giữa những tế bào có lông và tế bào chế tiết. Nhân cũng bắt màu mạnh. Lớp đệm ngăn cách với biểu mô ở màng đáy, có những chỗ lồi, đẩy biểu mô lên và tạo thành những nếp nhăn của niêm mạc. Lớp đệm là một mô liên kết chứa nhiều mạch máu và mạch bạch huyết. Trong lớp đệm có những tế bào hình thoi nhƣ những nguyên bào sợi, một số tế bào lympho và bạch cầu đơn nhân nằm trong một lƣới sợi. Những tế bào hình thoi có tiềm năng phát triển giống nhƣ những tế bào ở lớp đệm của nội mạc tử cung.
4 - Tầng cơ gồm hai lớp cơ trơn: lớp trong có các bó sợi cơ xếp theo hƣớng vòng; ở lớp ngoài, các bó sợi xếp theo hƣớng dọc. - Tầng vỏ ngoài: là một mô liên kết chứa mạch máu, dây thần kinh. 2.1.2. Chức năng 2.1.2.1. Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng - Ống dẫn trứng là cơ quan tiếp nhận noãn đã đƣợc phóng thích từ buồng trứng rồi vận chuyển về phía tử cung. Sự vận chuyển noãn trong lòng ống dẫn trứng đƣợc tiến hành nhờ ba yếu tố: + Sự co bóp tầng cơ ống dẫn trứng là chủ yếu (Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004). + Nhu động của các lông nhung theo hƣớng về phía tử. Estrogen có tác dụng gây ra sự biệt hóa của tế bào có lông, còn progesterone có tác dụng tăng cƣờng sự chuyển động của các lông. + Sự lôi cuốn noãn theo dòng nƣớc màng bụng. Nhờ hệ thống mạch bạch huyết phong phú trong lớp đệm nên ống dẫn trứng là cơ quan hấp thụ nƣớc màng bụng (Trịnh Bình và ctv, 2004). - Sự vận chuyển tinh trùng trong ống dẫn trứng theo hƣớng ngƣợc lại sự vận chuyển noãn, chủ yếu là nhờ sự co bóp của tầng cơ ống dẫn trứng. 2.1.2.2. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng Những sản phẩm của các tế bào chế tiết nằm trong biểu mô ống dẫn trứng đóng vai trò quan trọng. Chúng tạo ra một môi trƣờng thuận lợi cho sự sống và sự chuyển động của tinh trùng, làm cho tinh trùng đạt đƣợc khả năng gây thụ tinh cho noãn. Chúng còn chứa những chất dinh dƣỡng rất cần thiết cho sự sống và phát triển của noãn đã thụ tinh tới giai đoạn phôi nang, khiến cho phôi nang có thể làm tổ trong nội mạc tử cung. 2.2. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể - Nhiều phòng thí nghiệm sử dụng những loại tế bào bình thƣờng khác nhau để nuôi cấy duy trì. Kết quả cho thấy mối liên quan nghịch giữa tuổi của mô cấy và vòng đời sinh sản của tế bào. Ví dụ, tế bào gốc có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào biệt hóa, tế bào gốc phôi có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào gốc cơ thể trƣởng thành (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005).
5 - Tế bào đƣợc xem nhƣ đạt đến điểm cuối của vòng đời tái sản nếu mật độ tế bào giảm còn phân nửa mật độ nuôi cấy ban đầu. Vòng đời tái sản có liên quan nghịch với áp lực oxy xung quanh và có liên quan trực tiếp với mật độ nuôi cấy ban đầu (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). - Nhiều nghiên cứu gần đây đã đặt ra câu hỏi: khả năng tái sản có giới hạn của tế bào trong nuôi cấy gắn liền với đặc tính của tế bào hay điều kiện nhân tạo do môi trƣờng nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấy có gây ra sự bất tử của tế bào hay không thì vẫn chƣa đƣợc xác minh (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Tuy nhiên, ngƣời ta đã tạo nên các dòng tế bào “bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trƣởng liên tục trong môi trƣờng nuôi cấy chuyền. Đó là những tế bào ung thƣ của cơ thể hoặc tế bào đƣợc làm chuyển dạng “ung thƣ hóa” với những biến đổi di truyền. Ví dụ, tế bào HeLa đƣợc thu nhận từ mô ung thƣ cổ dạ con, tế bào Namalwa là tế bào ung thƣ limphoma của chị Namalwa (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005). Có hai kiểu chết tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005): + Chết chƣơng trình: tế bào chết do thay đổi môi trƣờng sống, là quá trình phụ thuộc ATP. Hình dạng tế bào nhăn nhúm, nhân vỡ, xuất hiện các thể tự hủy. Trong cơ thể tế bào chết chƣơng trình sẽ đƣợc thực bào. Trong hệ thống nuôi cấy tế bào, tế bào chết chƣơng trình thƣờng xảy ra dƣới những điều kiện khác nhau: Những dòng tế bào phụ thuộc yếu tố tăng trƣởng, tế bào chết chƣơng trình do mất đi yếu tố tăng trƣởng. Những dòng tế bào kết thúc sự biệt hóa khi nuôi cấy ngoài cơ thể, kết thúc vòng đời tái sản. Điều kiện nuôi cấy thay đổi hoặc nuôi cấy tế bào đã đạt mật độ cao. Tế bào tiếp xúc với tác nhân gây độc tế bào. + Hoại tử tế bào: tế bào phồng to, nhiễm sắc thể “lên bông”, gây ly giải tế bào trực tiếp, hoại tử tế bào nhanh chóng. Tế bào nuôi cấy ngoài cơ thể chết do quá trình hoại tử, khi nhuộm trypan tế bào bắt màu xanh. Sự sinh trƣởng của tế bào in vitro thƣờng trải qua 3 pha (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005): + Pha chậm (lag phase): là giai đoạn từ khi tế bào đƣợc cho vào môi trƣờng đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Đây là khoảng thời gian tế bào thích nghi với môi
6 trƣờng mới (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô đƣợc trích tế bào. + Pha tiến triển (exponential growth): là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng nhanh số lƣợng tế bào trong khoảng thời gian 15-25 giờ với số lƣợng tế bào đạt 1- 2.106/cm3, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ. Độ dài của pha này phụ thuộc dinh dƣỡng, tốc độ phát triển, mật độ mà sự tái sản tế bào bị ức chế. Ở pha này, tốc độ phát triển tế bào cao nhất (90% – 100%), tế bào đồng nhất và khả năng tái sản cao (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). + Pha dừng (stationary phase): là giai đoạn sau pha tiến triển, trong đó số lƣợng tế bào không thay đổi, tức là giai đoạn mà môi trƣờng dinh dƣỡng nghèo dần và bắt đầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại. Bắt đầu xuất hiện sự tự hoại tế bào: nhân bị đứt chẻ, trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối (blebs). 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào 2.3.1. Bề mặt chai cấy Sự bám dính và phát triển tế bào có thể cải thiện bằng nhiều cách: dùng chai cấy tái sử dụng tráng phủ một lớp collagen, fibronectin, gelatin… Gelatin thƣờng đƣợc phủ lên bề mặt đĩa nhựa vì có lợi cho sự nuôi cấy tế bào cơ và tế bào biểu mô màng trong (Freshney, 1987). Độ sâu của môi trƣờng: tốt nhất từ 2 – 5 mm ( 0,2 – 0,5 ml/cm2), độ sâu của môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng thấm nhập của oxy xuyên qua môi trƣờng đến tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). 2.3.2. Các đặc tính vật lý 2.3.2.1. pH Hầu hết các dòng tế bào phát triển ở pH 7,4. pH tối ƣu để phát triển thay đổi rất ít ở những dòng tế bào khác nhau. Phenol red đƣợc bổ sung vào môi trƣờng làm chất chỉ thị pH (Freshney, 1987). Nếu môi trƣờng chuyển dần từ đỏ sang vàng cam là tế bào phát triển tốt, nếu từ đỏ chuyển sang vàng nhạt là môi trƣờng bị nhiễm khuẩn (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005).
7 Bảng 2.1. Giá trị pH và màu sắc môi trƣờng (nguồn: Freshney, 1987) pH Màu* 6,5 Vàng 7,0 Cam 7,4 Đỏ 7,6 Hồng nhạt 7,8 Tím * dùng phenol red 2.3.2.2. Dung dịch đệm Đệm bicarbonate vẫn đƣợc sử dụng nhiều hơn các dung dịch đệm khác bởi vì ít độc, giá rẻ và thuận lợi cho quá trình trao đổi chất mặc dù khả năng đệm kém ở pH sinh lý. Hepes có khả năng đệm hiệu quả hơn ở pH từ 7,2 – 7,6 và thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 10 hoặc 20 mM (Freshney, 1987). 2.3.2.3. Áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu của môi trƣờng ảnh hƣởng đến tế bào nuôi cấy. Ở những loài khác nhau thì áp suất thẩm thấu của huyết tƣơng khác nhau. Ví dụ: ở ngƣời khoảng 290 mOsm/kg, ở chuột khoảng 310 mOsm/kg. Trong thực nghiệm, thƣờng điều chỉnh trong khoảng từ 260 – 320 mOsm/kg (Freshney, 1987). 2.3.2.4. Nhiệt độ (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005) - Nhiệt độ giảm sẽ làm giảm sự phát triển nhƣng không làm giảm khả năng sống của tế bào, trừ khi thời gian hạ nhiệt độ kéo dài hơn 3 ngày. - Nhiệt độ gia tăng sẽ làm tăng sự phát triển nhƣng sẽ làm giảm khả năng sống của tế bào. - Nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến pH. Ở nhiệt độ thấp, CO2 hòa tan tăng nên làm thay đổi sự ion hóa. 2.3.2.5. Áp lực bề mặt và bọt khí Áp lực bề mặt của môi trƣờng hỗ trợ sự bám dính của tế bào vào đáy bình nuôi cấy nhƣng ít đƣợc ứng dụng. Nuôi cấy ở điều kiện 5% CO2 sẽ tạo bọt khí mà bọt khí có liên quan đến lƣợng protein thoái hóa và nguy cơ nhiễm khuẩn (Freshney, 1987).
8 2.3.2.6. Độ nhớt Độ nhớt của môi trƣờng đƣợc quyết định chủ yếu bởi huyết thanh và một phần do sự phát triển của tế bào. Tăng độ nhớt của môi trƣờng với carboxy methyl cellulose hoặc polyvinyl pyrolidone sẽ làm giảm sự hƣ hại của tế bào trong lúc khuấy và xử lí trypsin (Freshney, 1987). 2.3.3. Tủ cấy Số lần mở, sự rung lắc của tủ cấy ảnh hƣởng đến sự phát triển và sự phân bố của tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). 2.3.4. Kháng sinh - Kháng sinh đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để làm giảm khả năng nhiễm khuẩn. Tuy nhiên với kỹ thuật thao tác vô trùng có thể không cần sử dụng kháng sinh vì có một số bất lợi nhƣ sau (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005): + Tạo điều kiện thuận lợi cho sự đề kháng kháng sinh của vi sinh vật. + Che dấu sự nhiễm khuẩn tiềm ẩn ở mức độ thấp và nhiễm Mycoplasma. + Ảnh hƣởng tế bào động vật hữu nhũ. + Tạo tâm lý chủ quan trong việc thực hiện kỹ thuật vô trùng. + Nhiễm nấm khó đƣợc kiểm soát. - Nồng độ kháng sinh thƣờng sử dụng (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005): + Streptomycine: 100 µg/ml + Penicilline: 100 UI/ml + Gentamycine S: 250 µg/ml 2.4. Vấn đề nhiễm trong nuôi cấy tế bào 2.4.1. Nguồn nhiễm (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005) Không khí ẩm của tủ nuôi cấy là nguồn nhiễm chính và nhiễm có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn nào, thao tác nào. Tác nhân gây nhiễm: vi trùng, nấm men, nấm mốc, Mycoplasma, protozoa… Theo dõi nhiễm: bằng mắt dƣới kính hiển vi. 2.4.2. Hình ảnh đặc trƣng của nhiễm vi sinh vật (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005) - Thay đổi pH đột ngột dẫn đến thay đổi màu sắc của chỉ thị màu trong môi trƣờng. pH giảm rõ trong trƣờng hợp nhiễm trùng. Khi nhiễm nấm men, pH thay đổi ít, trừ khi nhiễm nấm men nhiều. Tăng pH khi nhiễm nấm sợi.
9 - Đục môi trƣờng hoặc cặn ở đáy. - Dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần, giữa những tế bào có những hạt lấp lánh là môi trƣờng đã bị nhiễm khuẩn, hình tròn có những nụ nhỏ là nấm men. - Nấm sợi: nhiều sợi mảnh, có thể thấy đám đậm độ của bào tử. - Nhiễm Mycoplasma: có những dấu hiệu hủy hoại tế bào. Xác định Mycoplasma bằng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang, PCR, ELISA… 2.4.3. Yêu cầu đối với ngƣời thao tác (trích dẫn từ Phan Kim Ngọc, 2002) - Mang găng tay khi thao tác. - Sử dụng áo blouse, khẩu trang và nón che kín tóc. - Hạn chế việc mang vật dụng cá nhân khi thao tác vô trùng. - Trƣớc khi vào phòng thí nghiệm: vệ sinh cá nhân tốt, rửa sạch tay bằng xà phòng, sát trùng bằng javel và cồn, chuẩn bị đầy đủ các dụng cụ, môi trƣờng cần sử dụng trong suốt thời gian làm việc, khử trùng phòng và tủ cấy bằng tia UV. - Sau khi làm việc trong phòng thí nghiệm: dọn vệ sinh tủ cấy và phòng, sắp xếp các dụng cụ và thiết bị gọn gàng đúng qui định, các dụng cụ đã sử dụng cần đƣợc rửa sạch và sấy khô tại khu vực rửa dụng cụ, tắt các thiết bị không cần sử dụng, rửa sạch tay bằng xà phòng và sát trùng bằng javel và cồn. - Tất cả các mẫu vật, hóa chất dƣ thừa phải đƣợc mang ra khỏi khu vực thao tác và đƣợc xử lý cẩn thận. 2.5. Thành phần chính của môi trƣờng nuôi cấy tế bào (Freshney, 1987) - Dung dịch đệm: sự lựa chọn dung dịch đệm phụ thuộc vào nồng độ CO2 (bảng 2.2), dung dịch tách mô, lớp đơn tế bào. Bảng 2.2. Mối quan hệ giữa HCO3-, CO2 và HEPES (nguồn: Freshney, 1987) Pha khí Pha lỏng CO2 HCO3- HEPES Không khí 4 mM 10 mM 2% 8 mM 20 mM 5% 24 mM 50 mM - Acid amin: nồng độ acid amin quyết định khả năng duy trì nồng độ tế bào tối đa, ảnh hƣởng đến sự sống còn và tỉ lệ phát triển của tế bào.
10 - Vitamin: thông thƣờng chỉ bổ sung vitamin nhóm B vào môi trƣờng nuôi cấy vì những vitamin khác đã có đủ trong huyết thanh. Việc thêm vitamin vào môi trƣờng nuôi cấy chứa nồng độ huyết thanh thấp là cần thiết. - Muối: K+, Na+, Mg2+, Ca2+, SO42-, Cl-, PO43-, HCO3-… là thành phần chính tạo áp lực thẩm thấu môi trƣờng. Nồng độ muối NaHCO3 phụ thuộc vào nồng độ CO2 trong pha khí. - Glucose: đƣợc bổ sung vào trong hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy tế bào, đóng vai trò là nguồn năng lƣợng chính. - Chất hữu cơ: gồm nucleosides, những chất trung gian trong chu trình acid citric, pyruvate và lipid. Sự bổ sung những chất này cần thiết cho quá trình tạo dòng hoặc duy trì dòng tế bào đặc biệt. - Hormon và các yếu tố tăng trƣởng: gồm insulin, hydrocortisone, PDGF, EGF, FGF, IGF… Insulin giúp hấp thu glucose, acid amin và ảnh hƣởng đến sự phân bào. IGF gắn đặc hiệu với thụ thể của insulin trên bề mặt của tế bào và có tác dụng tƣơng tự insulin. Hydrocortisone làm tăng sự bám dính, thúc đẩy tăng sinh tế bào (Guner và ctv, 1977; McLean và ctv, 1986), ngăn cản sự phân bào (Freshney và ctv, 1980) và tăng sự biệt hóa tế bào. - Huyết thanh: đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để cung cấp hormon, yếu tố tăng trƣởng, protein vận chuyển, acid amin, vitamin, chất khoáng, chất ức chế, ketoacid, glucose và một số chất dinh dƣỡng khác. 2.6. Các quy trình nuôi cấy tế bào thông dụng 2.6.1. Nuôi cấy sơ cấp Theo Phan Kim Ngọc (2002), nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào đƣợc tách ra từ mô hay cơ quan. Các tế bào thu đƣợc trong lần nuôi cấy này gọi là tế bào sơ cấp. Các tế bào sơ cấp thƣờng không thuần nhất vì là hậu duệ của nhiều tế bào ban đầu khác nhau. Nuôi cấy sơ cấp gồm 2 phƣơng pháp: nuôi cấy tế bào từ mảnh mô và nuôi cấy tế bào sau tách mô bằng enzyme (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). - Nuôi cấy tế bào từ mảnh mô là phƣơng pháp nuôi cấy những mảnh mô đã đƣợc cắt nhỏ (1 mm3), trên môi trƣờng thể tích nhỏ với nồng độ huyết thanh cao. Áp lực bề mặt giúp mảnh mô tƣơng đối cố định, tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào bám dính vào bề mặt đáy đĩa và phát triển. Phƣơng pháp này không sử dụng enzyme