Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều, gây nên bởi những đột biến trên gen MT-TK của DNA ty thể. Đề tài nghiên cứu nhằm sàng lọc phát hiện đột biến MERRF trên bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ não ty thể ờ Việt Nam, xây dựng phương pháp định lượng một đột biến MERRF.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam

KẾT LUẬN 3. Đỗ Thị Nậuyệt Quế (2013), "Nghiên cứu tác dụng - Trên chuộí cống ĐTĐ typ 2 thực nghiệm, thân cây hạ glucose huyễt cua rễ cay choc mau Nam bộ (salasia chuối tiêu có tác dụng làm giam nồng độ glucose máu, cochinchinensis L., Celasíraceae) trên thực nghiệm", cholesterol toàn phần, ỉriglycerid huyết thanh, ức chế Luận án ỉiến sĩ dược học, Trung tâm Thư viện Quốc gia, hoạt độ G6Pase ờ gan nhưng không làm thay đổl Viện Dược iiệu, tr.7, 28 -32. đáng kề nồng độ insulin huyết thanh. Lô chuột điều trị 4. Enechi 0. c. Odo c. E. Agosi p. o. (2014), "Anti- bằng hỗn dịch thử có những dấu hiệu hồi phục ờ tiểu oxidant vitamins, phytochemicals and proximate đảo tụy. composition of the ethanol extract of the leaves of Musa - Dự đoán cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu paradisiaca", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 8(18), pp. 464-468. có thể là: ức chế tân tạo đường thông qua ức chế 5. IDF (2013), Diabes Aiias, International diabetes G6Pase và có thề làm tăng nhạy cảm của mô đích với federation, pp. 7-15, 27. insulin, cải thiện tinh trạng kháng insulin trong ĐTĐ typ 6. Latha M. Pari L (2003), "Antihyperglycemic effect of 2. Cassia auricuiata in experimental diabetes and its effect TÀI LIỆU THAM KHẢO on key metabolic enzymes invoved in cacrbohydraie 1. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt nam, metabolism", Clinical and Experimental Pharmacology Nhà xuất bản Y học, Tr.467,468. and Physiology 30, pp. 38-43. 2. Nguyễn Thị Đông (2013), "Nghiên cứu tác dụng hạ 7. Virginia D, Kappei !, H. Luisa (2013), "Beneficial glucose huyết của địch chiết phân đoạn chloroform thâii effects of banana leaves (Musa xparadisiaca) on glucose cây Ý dĩ trên động vật thực nghiệm", Luận văn tốt nghiệp homeostasis: multiple sites of action", Revista Brasileira thạc sĩ, Trung ỉâm thông íin thư viện trường Đại học dược de Farmacognosia, 23(4), pp. 706-715. Hà Nội, Tr.20-40. NGHIÊN c ứ u PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘJ CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẠT c ơ VỚI SỢI c ơ KHÔNG ĐỀU - MERRF Ở NGỮỜI VIỆT NAM Người ỉhực hiên: Bùi Thị Khánh Khoa Y học cơ s ờ - Trường Cao đắng Y tế Thái Bình Người hướng dẫn: GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa Phòng thí nghiệm trọng điểm Protein - Enzyme, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Ha Nội TÓM TÁT Đặt vẩn đề: MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều, gây nên bởi những đột biến trên gen MT-TK của DNA ty thề. Mục tiêu: Sàng lọc phát hiện đột biến MERRF trên bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ não ty thể ờ Việt Nam, xây dựng phương pháp định lượng một đột biến MERRF. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc 3 đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng mẫu máu ngoại vi cùa 312 bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ não ty the, được lấy từ bệnh viện Nhi Trvng ương với phương pháp PCR- RFLP, real-time PCR và giải trình tự các đoạn gen nghi ngờ mang đột biến nghiên cứu. Kết quả: Không phát hiện trường hợp nào mang đột biến trong 312 bệnh nhân lấy mẫu nghiên cứu, thiết kế thành cồng mẫu dò Taqman mang nucleotide dạng khóa cầu methyl và thiết lập được điều kiện đề phân tích định lượng đột biến A8344G cửa hội chứng MERRF bằng real-time PCR. Kết quả nghiên cứu được tái khẳng định bằng ỹiài trình tự vùng gert quan tâm đều cho kết quả âm tính cho về đột biến A8344G, T8356C, G8363A. Kết luận: Tuy không phát hiện được đột biển, nhưng chúng tồi hy vọng với phương pháp sàng lọc và định lượng được thiết lập sẽ là cồng cụ hữu ích cho các nghiên cứu sau về 3 đọt biến này. Từ khóa: MERRF, động kính giật cơ, sợi cơ không đều. SUMMARY Background: MERRF - syndrome myoclonic epilepsy with ragged-red fibres, affecting the nervous system and skeletal muscles as well as other systems o f the body, caused by mutations in (he genes MT-TK o f mitochondrial DNA. Screening and quantitative some mutations o f myoclonic epilepsy with ragged-red fibers - MERRF in Việt Nam patients. Materials and method: We conduct 3 mutation screening o f MERRF syndrome peripheral blood form o f 312 patients with suspected brain mitochondrial myopathy, was taken from the Central Pediatrics Hospital by PCR- RFLP, real-time PCR and sequencing nucleic acid fragments suspected mutated gene research. Results: Do not detected any cases o f mutation A8344G, T8356C, G8363A under MERRF syndrome in 312 patients studied, by PCR-RFLP. Designing successful Taqman probes by bridge methyl nucleotides to detect and quantify the degree o f heterogeneity o f mutations A8344G under syndrome by real-time PCR MERRF. Develop 521
successful baseline mutation A8344G MERRF syndrome, baseline is established, can bs applied to quantitative analysis A8344G mutation in patients with the mutation pattern with a detection limit to 0.1%, R2 = 0.997 confidence. Conclusion: still undetected mutations, but we hope with the screening methods and quantitative tool set will be useful for future research on those mutations. Keywords: MERRF, myoclonic epilepsy, ragged-red fibres. ĐẶT VẮN ĐỀ Các cặp mồi và mẫu dò (Integrated DNA MERRF (myoclonic epilepsy with ragged - red Technologies); Thang chuẩn DNA, hỗn hợp dNTP fibres) là hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không (Enzynomics); Enzyme giới hạn (Thermoscientitics); đều, anh hưởng đển hệ thần kinh và cơ xương cũng Kapa probe fast qPCR, Master Mix (Kapabiosystems). như các hệ thống khác của cơ thể, gây nên bời những Các hóa chất còn lậi đều được mua từ các hãng tin đột biến trên gen MT-TK của DNA ty thể. Ngoài ra, cậy (Sigma, Merk) và đạt độ tinh khiếỉ cằn thiết cho người mang hội chứng MERRF cỏ thê kèm theo động nghiên cứu sinh học phân tử; kinh, mất điều hòa vận động, suy nhược và mất trí 2. Mảy móc và trang thiết bị nhớ. Triệu chứng thường khởi phát ờ trẻ em sau một Các máy móc chính dừng trong nghiên cứu bao giai đoạn phát triển bỉnh thường, kết quả hay gặp íà gồm: máy NanoDropTM 8000, máy PCR gradient điếc, thấp bé, thoái hóa thần kinh thị giác, đôi khi quan (Eppendorf), máy real-time PCR ỈQTM 5 cycler sát được các u mỡ khu trú dưới da. Tế bào cơ bát (Biorad), máy ly tâm iạnh 5417 R (Eppendorf), thiết bị thường và xuất hiện sợi cơ màu đỏ bị xé rách nham điện di ngang, điện di đứng (Biorad) vả hệ thong chụp nhở khi nhuộm với Gomori trichrome và quan sát dưới ảnh điện di Geldoc (Biorad). kính hiển vi. 3. Phương pháp nghiên cứu Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trinh 3.1. Tách chiết DNA tổng số: DNA tổng số được nghiên cứu về hội chứng MERRF để xác đính nguyên tách và tinh sạch từ máu ngoại vi của các bệnh nhân nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyền theo QIAamp DNA Mini Kit của Qiagen. của bệnh. Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động 3.2. Kiểm tra và định lượng DNA tách chiểt: Sự có !âm sàng, mô bệnh học, cơ chể phát sinh và biểu hiện mặt của DNA được kiểm tra bằng điện di trên gei bệnh nên việc chẩn đoán bằng phương pháp thăm agarose 1%. Nồng độ của DNA tách chiết được định khám lâm sàng hay bằng các xét nghiệm thường quy lượng bằng cách đo mật độ háp thụ ánh sáng tư ngoại là rất khó khăn, vì thế nhiều bệnh nhân MERRF vẫn của các acid nucleic ở bước sóng 260 nm (A260) trên chưa được phát hiện và không có phương pháp điều máy Nano-Drop. trị hiệu quả. 3.3. Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR: • ở Việt Nam, gần như chưa có công trinh nào đi Đoạn gen ty thề mang đột bien MERRF được khuếch sâu nghiên cứu phát hiện và định lượng đột biến đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với các MERRF ờ người Việt Nam. cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế và chế độ nhiệt Nhằm góp phần vào việc chẩn đoán, điều trị và tư thích hợp. vấn di truyền đối với các bệnh nhân, gia đình bệnh 3.4. Kỹ thuậí PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình nhân mang hội chứng MERRF chúng tôỉ tiến hành đề chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP): tài: “Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột Sản phẩm PCR sau khi đã kiểm tra trên gel agarose biến cua hội chưng động kinh, giật cơ với sợi cơ 2 % được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn trong không đều - MERRF ở người Việt Nam". đệm tương ứng (reaction buffer). Phản ứng cắt được NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯỚNG PHÁP NGHIÊN thực hiện với thành phần như sau: 1 ụì đẹm enzyme cứu giới hạn 10X; 0,5 pi enzyme giới hạn (50 đơn ví/Ịji); 1. Nguyên liệu 7,5 ụị sản phẩm PCR và 6,25 Mi ddH20 cho tồng ihe 1.1. Mấu bệnh phẩm tích 15 ụl, hỗn hợp phản ứng được giữ ờ 37°c, tư 12- Mâu máu ngoại vi cùa 312 bệnh nhân người Việt 16 giờ. Sau đó, sản phầm cắt được điện di trên geí Nam nghi bị bệnh ty thể được lẩy từ Bệnh viện Nhi polyacrylamide 12 % và đột biến được phát hiện dựa Trung ương, các bệnh nhân được nghi ngờ mắc hội vào tính đa hình của các đoạn cắt khi quan sát dưới chứng MERRF dựa trên sự có mặt cùa ít nhất hai ánh sáng tử ngoại. trong ba đặc điểm sau: 2.5. Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh Tác động lâm sàng liên quan đến 3 hoặc nhiều hơn quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA - locked 3 cơ quan: hệ thần kỉnh trung ương, cơ xương và cơ nucleic acid): Trong thí nghiệm này, đột biến A8344G tỉm, tuyến nội tiết, mắt và hệ tiêu hóa. được định ỉứợng bang phương pháp real-time PCR sừ Tăng acid lactic trong máu hoặc dịch não tủy. dụng mẫu dò huỳnh quang có trình tự bồ sung với Hình ảnh chụp cộng hưởng từ não không bình trinh tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5' của mẫu dò có thường. gắn chất phát huỳnh quang (reporter) FAM (495/520 1.2. Các hóa chắt, nguyên liệu khác: nm) cho mẫu dò đặc hiệu VỚ! trinh tự không đột biến Plasmid chèn đoạn gen 8155 - 8366 có và không và HEX (535/556 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự mang đột biến A8344G íà sản phẩm cùa đề tài đột biến, còn đầu 3’của mẫu dò có gắn chất hấp phụ KC.04.10/11-15. Kit tách chiết DNA tổng số (Qiagen); tương ứng (quencher) là IBFQ (Iowa black 522
fluorescence quencher). cả các mẫu sản phẩm PCR của bệnh nhân đều bị cắt 2.6. Giải trình íự đoạn gen chứa đột biến: Trình tự thành 2 đoạn DNA 220 bp và 21 bp, chứng íỏ các mẫu đoạn gen được xác định dựa theo phương pháp bệnh nhân nghiên cứu không mang đột bien G8363A. Sanger (kết thúc bằng đầu tận cùng chứa Hiện nay có rất nhiều phương pháp có thể áp dụng dideoxynucleotide - ddNTP). để phát hiện ra sự có mặt của đọt biến gen ty thể như KẾT QUẢ VÀ TH AO LUẬN PCR-RFLP, SSCP, xác định írỉnh tự gen, DGGE, real 1. Tách chiết DNA tổng số của các mẫu time PCR. Tuy nhiên, PCR-RFLP vẫn là một kỹ thuật Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu phân tử đơn giản, hiệu quả, phù hợp cho việc sang lọc máu của các bệnh nhân cho thấy các che phẩm DNA thông dụng một iượng mẫu lớn. Trương Thị Huệ và tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một tập thể đã nghiên cứu trên 106 bệnh nhân Việt Nam, băng DNA rõ nét, chứng tỏ DNA tổng số tách được nhưng cũng không phát hiện được bệnh nhân nào đều nguyên vẹn. mang đột biến A8344G và T8356C. Trên íhế giới đã có Kết quả đo mậí độ hấp ìhụ ốnh sáng tử ngoại ở nhiều công bố về sàng lọc đột biến A8344G trên bệnh 260 nm của chế phẫm DNA tổng số đều có tỷ số nhân cơ não ty thể với kết quà đáng chú ý như nahiên A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0; chứng tỏ chế cứu của Qi và cộng sự điều tra đột biến gen ty the trên phẩm DNA ít íẫn protein hay RNA. Như vậy, chúng tôi 552 bệnh nhân Trung Quốc, phát hiện 4 bệnh nhân đã thu được các sản phẩm DNA tổng số đạt yêu cẩu mang đột biến A8344G (chiềm 0,72%); Cũng một đề tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo. nghiên cứu khác trên 124 bệnh nhân Trung Quốc, 2. Sàng lọc các đột biên gen thuộc hội chứng Zhang và cộng sự đã phát hiện ra 2 bệnh nhân mang MERRF ờ người V ỉẹt Nam bằng phương pháp đột biến A8344G (1,61%); Kwon và tập thể, khi nghiên PCR-RFLP cứu đột biến gen ty thể trên 65 bệnh nhân Hàn Quốc, 2.1. Sàng lọc đột biến A8344G đã phát hiện được 3 trường hợp mang đột biến Để xác định sự thay đổi nucleotide G thành A tại vị A8344G (4,6%). Như vậy, có thể thấy tần suầt phát trí 8344 trên míDNA chúng tôi đã tiến hành nhân bàn hiện đột biến A8344G trong các nghiên cứu ỉà rất khác đoạn gen có kích thước 212 bp bằng kỹ thuật PCR với nhau. Theo chúng tôi, sự khác nhau này có thể Hên cặp mồi đặc hiệu. Kết quả điển đi kiểm tra sản phẩm quan nhiều đến cách lấy mẫu điều tra ban đầu và có PCR trên gel agarose 2% cho thấy sản pham DNA thể còn những nguyên nhân khác nữa cần được íàm khuếch đại cùa đoạn gen có kích thước như tính toán rỗ. lý thuyết (212 bp), điều này chứng tò chúng íôi đã 3. Xây dựng đường chuẩn để định lượng đột nhân bản thành cong đoạn gen 8155 - 8366 từ mâu biến A8344G bẫng kỹ th u ậ t real-time PCR DNA ĩổng sổ của các bệnh nhân. Sản phẩm PCR 3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA được cắí trực tiếp bằng enzyme giới hạn Banll, điện di Việc íhiếí kế mồi cho real-time PCR dùng Taqmarì sản phẩm cắỉ trên gel polyacrylamide 12 % và phát probe về cơ bản được thực hiện theo các nguyên tắc hiện độí biến dựa vào sự khác nhau về kích thước của ihiết kế mồi chung cho PCR. Đột biến điểm A8344G phổ băng DNA dưới ánh sáng tử ngoại. Kết quả điện (MERRF) được chúng tôi nghiên cứu định lượng bằng di sản phầm PCR-RFLP cho thấy cac mẫu DNA nhân kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dổ Taqman khóa bản của bệnh nhân đều xuát hiện 3 băng có kích câu methyl. thước tương ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp, giống với Bảng: Trình tự cùa mẫu dò dùng cho real-time sản phẩm cắt cùa plasmid không mang đột biến. PCR Chứng iỏ các mẫu bệnh nhân được sàng lọc không Vị trí trên DNA mang độỉ biến A8344G. Mẩu dò/Mồi Trỉnh tự ty thể 2.2. Sàng lọc đột biến T8356C RT8344-FW 5' AGC CCA CTG TAA AGC TAAC3’ 8291 -8309 Đoạn gen chưa đột biến T8356C phải được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp moi đặc hiệu, RT8344-RV 5’ GGC ATT TCA CTG TAA AGA GGT 3’ 8370-8350 Sản phẩm PCR ơ trên được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn Drai. Điện di sản phảm cắt trên gel Wt-8344A- 6 FAM-AGA T+TA +A+GA FAM +GA+A +CC-IBFQ 8332 - 8346 polyacrylamide 12 % đều xuất hiện 2 băng có kích MÍ-8344G- HEX-GAT +TA+A +GAG thước khoảng 192 và 28 bp, chứng tỏ các mẫu bệnh HEX +A+GC C-IBFQ 8333 - 8346 nhân nghiên cứu không mang đột bien T8356C. Ghi chú: dau + ch? nucleotide LNA 2.3. Sàng lọc đột biến G8363A 3.2. Đánh giâ tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến ^ Chủng tôi dùng kỹ thuật PCR với cặp mồi bắt cặp A8344G đặc hiệu với sợi XUÔI và sợi ngược của đoạn mtDNA Kết quả phân tích real-time PCR cho thấy khi chạy nghiên cứu. Kiểm tra sản pham PCR bằng phương real-time PCR với píasmid mang đột biến 8344G thì tín pháp điện di trên gel agarose 2 % cho kết quả ỉà một hiệu huỳnh auang chỉ lên vởi kênh HEX trong khi phản băng DNA duy n h lt có kích thước 220 bp được nhân ứng chứa đồng thời cả 2 mẫu dò MỈ-8344G-HEX và lên. Sản phẩm PCR ờ trên được cắt trực tiểp bằng Wt-8344A-FAM. Tương tự, với plasmid không mang enzyme giới hạn Niallỉ. Sản phẩm cắt được điện di đột biến (tức chỉ là A8344), thì chỉ có tín hiệu FAM. Kết trên gel polyacrylamide 12 % và phát hiện đột biến dựa quả này khẳng định mẫu dò mà chúng tôi thiết kế có vào sự khác nhau về kích thước của phổ băng DNA khả năng phân biệt đặc hiệu mẫu đột biến và mẫu dưới ánh sáng tử ngoại. Phổ băng điện di cho thấy tất không đột biến. 523
3.3. Xây dụng đường chuẩn và đánh giá độ tin quang LNA. cậy của phường pháp real-time PCR để đĩnh lừợng 4. Sàng lọc đột biến gen thuộc hội chứng đột biến A8344G MERRF bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp Để xây dựng đường chuẩn của đoạn gen mang đột Đề một lan nữa khằng đỉnh kết qua nghiên cứu biến A8344G thuộc hội chứng MERRF bang real-time bằng PCR-RFLP íà chính xác chúng tôi đã lựa chọn 29 PCR, píasmid mang DNA đột biến và không đột biến mẫu bệnh nhân nghi ngờ mắc hội chửng MERRF với A8344G được pha loãng về cùng một nòng độ ià 1 X triệu chứng rõ nhat ổể giải trình tự đoạn gen 8155 - 1010 bản sao/ụi và sau đó pha loãng theo hẹ số 10 9292 thuộc vùng các đột biến này. dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Sử dụng khuôn ià Đoạn gen ty thể 8155 - 9292 dài 1137 bp cùa 29 hỗn hợp plasmid đột biến và không đột biến theo tỷ íệ bệnh nhân nghi bị MERRF được chúng tôi nhân gen 1:1 có nồng độ 5x107 - 5x102 bản sao/ịil. từ phản ứng PCR với khuôn là mẫu DNA bệnh phẩm Kết qua phân tích real-time PCR cho thấy đường được nhân lên bằng PCR và giải trình tự nucleotide sử chuẩn của DNA không mang đột biến và DNA mang dụng mồi theo cồ hai chiều. Kết quả phân tích trình tự đột biến, tạo ra bằng việc sư dụng các tỷ lệ nồng độ thu được cho thấy không có trường hợp nào mang đột khác nhau giữa plasmid chứa đoạn gen ty thể mang biến Ấ8344G, T8356C và G8363A cùa hội chứng đột biến A8344G và không mang đột biến có độ tuyến MERRF. Như vậy, kết quả xác định trinh tự rnột lần tính cao, giá trị cùa hệ số tương quan R2 giữa sổ bản nữa khẳng định kết quả phân tích bằng PCR-RFLP íà sao DNA ty thề và số chu kỳ ngưỡng với mẫu dò w t- chính xác và đáng tin cậy. 8344A-FAM (không mang đột biến) ià 0,999 và Mt- KẾT LUẬN 8344G-HEX (mang đột biên) íà 0,999, hiệu quả PCR Đã sàng lọc 3 đột biến thuộc hội chứng MERRF, nằm trong khoảng 94-100%. Slope của probe w t- írên bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể (312 bệnh nhân 8344A-FAM là -3,458, probe MÍ-8344G-HEX là -3,317. đối với đột biến A8344G và 182 bệnh nhân đối với đột Nhằm kiểm tra độ nhạy và độ tin cậy của phương biển T8356C và G8363A) bằng phương pháp PCR- pháp chủng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn ty RFLP nhưnp không phát hiện được trường hợp nào lệ đột biến bằng cách pha mẫu chuẩn có tỷ lệ đột biến mang đột bien. iả 0,01 % - 100% đột biến bằng cách trộn piasmid Đã thiết kể thành công mẫu dò Taqman mang mang đột biến và khổng đột biến với các thể tích nồng nucleotide dạng khỏa cầu methyi và thiết lập được độ tương ứng. Sau đó chúng tôi tiến hành định lượng điều kiện để phân tích định lượng đột biến A8344G mẫu chuẩn và xây dựng đồ thị sự tương quan tuyến cùa hội chứng MERRF bằng real-time PCR vởi giới tính giữa phần trăm ty lẹ độ biền thực te và lỉ thuyết. hạn phát hiện đến 0,1% với độ tin cậy cao (hệ số R2 = Kểt quả cho thấy giới hạn phát hiện ổộí biến của 0,997) phương pháp thiết iập được !à 0,1 % sự tương quan Đã giải trình tự trực tiếp đoạn gen ty thể 8155 - tuyến tĩnh gíưa tỷ iệ đột biến thực tế và lý thuyết có độ 9292 (1137 bp) của 29 mẫu bệnh nhân trong số các tin cậy cao (R2 - 0,997). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần bệnh nhân có biểu hiện bệnh íhần kinh cơ và cho kết cho kết quả giống nhau. Như vậy đường chuẩn chúng quả âm tính về đột biến A8344G, T8356C, G8363A tôi thiết lập được có độ tin cậy và độ nhạy tương bằng PCR-RFLP và tái khẳng định íất cả các bệnh đương với nghiên cứu cua Trương Thị Huệ và tập th i nhân này đều không mang 1 trong 3 các đột biến vừa (2012 ) trong việc xây dựng đường chuẩn định lượng nêu đột biến A3243G bằng phương pháp real-time PCR sư KIẾN NGHỊ đụng mẫu dò Taq man LNA (độ nhạy đạt 0,1%, R2 = Tiếp tục sàng lọc để phát hiện các đột biến MERRF 0,997). trên bệnh nhân nghi mac bệnh thần kinh, cơ não ở 3.4. Thử nghiệm khả năng phát hiện và định Việt Nam. lượng đột biến A8344G Xâỵ dựng phương pháp phát hiện, định lượng các Trong 312 mẫu bệnh phẫm đã sàng lọc bằng đột biến gen ty thể khác nham hỗ trợ việc chần đoán phương pháp PCR-RFLP, chúng tôi không phát hiện lâm sàng và nghiên cứu mối liên quan giữa mức độ được trường hợp nào mang đột biến A8344G. Để biểu hiện bệnh với tỷ !ệ đột biến. khẳng định thêm về kết quả nàỹ chủng tôi lựa chọn TÀI LIỆÙ THAM KHẢO ngẫu nhiên 5 mẫu bệnh phẩm (kí hiệu BN1, BN2, BN3, 1. Blakêly L. E., Alston L. c., Lecky B., Chakrabart B-, BN4, BN5) và thử nghiệm bằng phương pháp real Falkous G. Turnbull M. D., Taylor w . R., Gorman s. G. time PCR đã được thiet lập ở trên. (2014), “Distal weakness with respiratory insufficiency Kết quả định lượng cho thấy cả 5 mẫu bệnh phẩm caused by the m.8344A > G "MERRF" mutation”, Science được thử nghiệm chỉ thu được tín hiệu FAM, là tín Direct, 24, pp. 533-536. hiệu không đột biển trong khi đó tin hiệu HEX ià tín 2 . Kwon S. J., Park s. s., Kim J. M., Ahn T. B., Kim s. H., Kim S., Lee S. H.,Ha c. K.,Ahn M. Y., Jeon B. s. hiệu đột biến đều không phát hiện được. Đường (2004), "Investigation of common mitochondrial point chuẩn được xây dựng có độ tuyến tỉnh cao (R2 > mutations In Korea”, Genes and apoptosis to aging and 0,995). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho kết quả disease, 1011, pp. 339-344. giống nhau. Vì vậy chúng tồi một lần nữa khẳng định 5 3. Lorenzoni p. J., Scola R. H., Kay c. s. K., Silvado mẫu bệnh phẩm này đều không mang đột biến c. E. S., Werneck L. c. (2014), “When should MERRF A8344G, sự phù hợp về kết quả của hai phương pháp (myoclonus epilepsy associated with ragged-red fibers) be PCR-RFLP và real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh the diagnosis?”, Arquivos Neuro-psiquiatria, 72(10), pp. 524
803-881. V. A., Phan T. N. (2014), “Screening of common point- 4. Qi Y., Zhang Y.,W ang z., Yang Y., Yuan Y., Niu mutations and discovery of new T14727C change in S., Pei P., Wang s., Ma Y., Bu D., Zou L., Fang F., Xiao mitochondrial genome of Vietnamese encephaiomyớpaihy J.,Sun F., Zhang Y.,Wu Y.,Wang s., Xiong H.,Wu X. patients”, Mitochondrial DNA, 27, pp. 441-448. (2006), “Screening of common mitochondrial mutations in 7. Virgilio R., Ronchi D., Bordoni A., Fassone Chinese patients with mitochondria! E., Bonato s., Donadoni c Torgano G., Moggio M ., Corti encephaiomyopathies", Mitochondrion, 7, pp. 147-150. S., Bresolin N., Comi G. p. (2009), “Mitochondria! DNA 5. Szuhai K., Ouweiand J. M., Dirks R. w ., Lemaĩtre G8363A mutation in the tRNA Lys gene: clinical, M., Truffert J. c., Janssen J. M., Tanke H. J., Holme biochemical and pathological study", Journal Neurol E., Maassen J. A., Raap A. K. (2001), “Simultaneous Science, 281(1-2), pp. 85-92. A8344G heteroplasmy and mitochondrial DNA copy 8. Zhang Y., Yang Y. L , Sun F., Cai X., Qian N., Yuan number quantification in Myoclonus Epilepsy and Ragged- Y., Wang z. X.,Qị Y.,Xiao J. X.,Wang X. Y., Zhang Y. Red Fibers (MERRF) syndrome by a multiplex Molecular H., Jiang Y. w „ Qin J.,W u X. R. (2007), “Clinical and Beacon based reai-time fluorescence PCR , Nucleic Acids molecular survey in 124 Chinese patients with Leigh or Research, 29(3), pp. 1-6. Leigh-like syndrome", Journal of Inherited Metabolic 6. Truong T. H., Nguyen T. V. A., Nguyen V. L„ Pham Disease, 30(2), pp. 265-267. NGHIÊN CỨU CHÁN ĐOÁN DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYẺN PHÔI BỆNH TEO c ơ TỦY Ths. Nguyễn Thị Thanh Nga (Bộ môn Sinh học và Di truyền Yhọc, Học viện Quânỵ) ' sv. Trần Van Tuấn, SV. Đồng Phú cấu (Sinh viên năm thứ hai, Học viện Quân y) BS. Đào Hải Yên (Bênh viện Than khoáng sản) Hướng dắn: PGS.TS. Trần Văn Khoa (Bộ môn Sinh học và Di truyền Y học, Học viện Quân y) TÓM TẲT Đặt vấn đề: Bệnh teo cơ tủy là bệnh thần kinh cơ ơo bị mất đồng hợp exon 7 gen SMNt trên nhiễm sắc thể số 5. Trẻ bị bệnh' teo cơ tủy thường có tiên luựng rất xấu và từ vong sơm. Vì vậy, vẩn đề phòng tránh chủ động bệnh teo cơ tủy phải được ưu tiên hàng đầu. Mục tiêu: mục tiêu chính của nghiên cứu là xây dựng được quy trình chẩn đoán di truyền trước chuyền phôi bệnh teo cơ tủy. Đối tượng và phương pháp nghiên cưu: 17 bệnh nhi đã được chần đoán bị bệnh teo cơ tủy do mất đồng hợp tử exon 7 gen SMNt va bố mẹ của họ; 30 mẫu té bào phôi sính thiết từ phôi dư ngày 3; 04 gia ơình đã từng sinh con bị bệnh SMA và tự nguyện tham gia chẩn đoân di truyền trước chuyền phôi bệnh teo cơ tủy. Kỹ thuật PCR- RFLP và minisequencing đế phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy. Phương phâp nhân toàn bộ bộ gen nhằm khuếch đại bộ gen lên hàng nghìn lần. Kết quả: Kỹ thuật PCR- RFLP đã được chuẩn hóa để phát hiện đột biến gen SMNt từ mấu toàn phần với hiệu suất la 100%. Kỹ thuật này cũng có hiệu quả nhân exon 7 gen SMNt từ các tế bào phôi sinh thiết là 93,33%. Xây dựng đuực quỵ trình chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy kết hợp sử dụng hai kỹ thuật PCR-RFLP va minisequencing. Áp dụng quy trình xây dựng được đối với 04 cặp vợ chồng tự nguyện tham gia chẩn đoàn di truyền bệnh teo cơ tủy trước chuyển phôi và có 03 phôi đã được chuyển, một cặp vợ chồng đã sinh được một em bé khỏe mạnh, một cặp đang mang thai. Kết luận: Lần đầu tiên tại Việt Nam, chúng tôi đã xây dựng và áp dụng được quy trình chần ổoốn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy bằng cách sử dụng đồng thời hai kỹ thuật PCR-RFLP và minisequencing. Từ khóa: Bệnh teo cơ tủy. SUMMARY PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS OF SPINAL MUSCULAR ATROPHY Nga Nguyen Thi Thanh*, Tuan Tran Van*, Cau Dong Phu* Yen Dao Hai** (*: Military medical university; **: Coal and Mineral Hospital) Background: Spinal muscular atrophy (SMA) is a severe neurodegenerative autosomal recessive disorder. Most o f patients are caused by the homozygous absence o f exon 7 o f the telomeric copy o f the SMN gene (SMNt) on chromosome 5. Until now, no specific treatment for SMA, only to treat the complications o f the disease IS crucial. SMA usually presents severe, high mortality rate. So, the SMA prevention issues should be top priority. Denved from practical needs, we conducted the project “Preimplantation Genetic Diagnosis o f spinal muscular atrophy" with the following objective setting up a preimplantation genetic diagnosis assay o f SMA. Materials and Method: This study was earned out on 17 patients and their parents, 30 blastomeres were obtained from surplus 525