Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------------

Lại Hợp Hiếu

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ CÂY GIÁ (Excoecaria agallocha L.) VÀ CÂY ĐƠN LÁ ĐỎ (Excoecaria cochinchinensis Lour.) Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2021

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công

nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. Ngô Đại Quang

Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Văn Thanh

Phản biện 1: ……………………………………………………

Phản biện 2: …………………………………………………….

Phản biện 3: …………………………………………………….

Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp

Học viện họp tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam

Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam

- Thư viện Quốc gia

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của luận án

Trải suốt lịch sử nhân loại, nguồn sinh vật biển và nguồn thực vật đã trở thành nguồn nguyên liệu tiềm năng cho nghiên cứu phát hiện các biệt dược phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Hơn 70% thuốc chống ung thư trên thị trường hiện nay có nguồn gốc thiên nhiên hoặc được tổng hợp theo mẫu hình cấu trúc của hợp chất thiên nhiên. Song song bệnh ung thư hiện đang là vấn đề đau đầu của các nhà khoa học, các căn bệnh liên quan đến kháng sinh trước đây được điều trị bằng cách dùng các thuốc kháng sinh như penicillin, cephalosporin... Tuy nhiên, hiện nay đã xuất hiện tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh không những ở Việt Nam và cả trên thế giới, ngoài các nguyên nhân thường gặp như ở các quốc gia khác, còn có nguyên nhân từ thói quen tự chữa trị và “bắt chước” đơn thuốc của người dân. Chính những nguyên nhân này làm xuất hiện hiện tượng gọi là kháng kháng sinh. Kháng kháng sinh là tình trạng các vi sinh vật như vi khuẩn, vi rút, nấm và ký sinh trùng thay đổi cách thức hoạt động, làm cho các thuốc trị bệnh do chúng gây ra trở nên vô hiệu.

Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại. Giá trị của chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà vì còn có thể dùng làm nguyên mẫu hoặc cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát triển nhiều dược phẩm mới. Trong việc nỗ lực điều tra, nghiên cứu và tìm kiếm nguồn dược liệu phục vụ cho các chương trình chăm sóc sức khỏe cộng đồng, việc thực hiện các nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên có hoạt tính gây độc tế bào, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, các nguồn kháng sinh thế hệ mới… để ứng dụng trong phòng ngừa, chữa trị các bệnh ung thư, kháng sinh, kháng lao… là một trong những nhiệm vụ đặc biệt quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm. Bên cạnh các nguồn tài nguyên thực vật có mạch trên đất liền, nguồn tài nguyên sinh vật biển, nguồn tài nguyên thực vật rừng ngập mặn và thực vật tham gia ngập mặn đã và đang trở thành đối tượng thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trong lĩnh vực y sinh-dược học. Nhiệm vụ điều tra, tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học trong các loài thực vật thuộc rừng ngập mặn đã và đang được triển khai, đang được nhiều cơ sở nghiên cứu quan tâm và theo đuổi nghiên cứu.

Vì vậy đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.)” được thực hiện nhằm mục tiêu phát hiện được các hoạt chất có tiềm năng từ cây Giá và Đơn lá đỏ góp phần làm

rõ hơn những công dụng chữa bệnh trong y học cổ truyền đồng thời làm tăng giá trị khoa học của các cây này ở Việt Nam. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án

 Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cây Giá (Excoecaria agallocha) và Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis).

 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cặn chiết tổng và các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

 Phân lập các hợp chất từ cây Giá và cây Đơn lá đỏ bằng các phương pháp sắc ký kết hợp. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học.

 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. CHƢƠNG I. TỔNG QUAN

Những nghiên cứu trên thế giới và trong nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Giá (E. agallocha) và cây Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis).

CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Hình II.1. Tiêu bản cây Giá Hình II.2. Tiêu bản cây Đơn lá đỏ

Mẫu thực vật được TS. Nguyễn Thế Cường (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học, tiêu bản lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật và Viện Hóa sinh biển. II.2. Phƣơng pháp nghiên cứu II.2.1. Phương pháp ngâm chiết

Mẫu thực vật được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm sau đó được xay nhỏ, chiết siêu âm/hoặc ngâm ở nhiệt độ phòng với methanol. Dịch chiết gom lại và cô cạn dưới áp suất giảm thu được cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hoà với nước rồi chiết lỏng lỏng với chloroform thu được cặn chiết CHCl3 và phần dịch nước. II.2.2. Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất

Việc ngâm chiết, phân lập, tinh chế các phần dịch chiết của cây Giá và Đơn lá đỏ được thực hiện bằng các phương pháp: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) silica gel với các cỡ hạt khác nhau, sắc ký cột pha đảo RP-18 và sephadex LH-20... II.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc của hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại: điểm nóng chảy (Mp), độ quay cực ([α]D), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối phun mù điện tử (ESI- MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân: phổ một chiều (1H NMR, 13C NMR và DEPT) và phổ 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC và NOESY/ROESY). II.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

 Hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư vú ở người (MCF-7), ung thư phổi người (LU-1) và ung thư biểu mô người (KB) sử dụng phương pháp MTT và SBR.

 Hoạt tính tính ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào

RAW264.7 kích thích bởi LPS.

 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ. Tám chủng vi sinh vật kiểm định thử nghiệm là: hai chủng vi khuẩn Gram (–) (Escherichia coli ATCC 25922 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853), hai chủng Gram (+) (Bacillus subtillis ATCC 11774 và Staphylococcus aureus ATCC 11632), hai chủng nấm sợi (Aspergillus niger 439 và Fusarium oxysporum M42) và hai chủng nấm men (Candida albicans ATCC 7754 và Saccharomyces cerevisiae SH 20).

Chƣơng III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

II.1. Phân lập các hợp chất II.1.1. Phân lập các hợp chất từ cây Giá

Hình III.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết CHCl3 cây Giá

Hình III.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết EtOAc cây Giá

Hình III.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ dịch chiết nước cây Giá

II.3.2. Phân lập các hợp chất từ cây Đơn lá đỏ

Hình III.4. Sơ đồ phân bố các phân đoạn từ cặn MeOH cây Đơn lá đỏ

Hình III.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phần nước của cây Đơn lá đỏ III.1.3. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất

Phần này trình bày thông số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp

chất phân lập từ cây Giá và cây Đơn lá đỏ. III.2. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập đƣợc III.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Giá Bảng III.1. Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết MeOH cây Giá

KB

Dòng tế bào thử nghiệm LU-1

MCF7

Mẫu

% ức chế 81,90

IC50 (µg/mL) 19,77

% ức chế 85,03

IC50 (µg/mL) 15,23

% ức chế 65,38

IC50 (µg/mL) 57,57

97,18

0,39

96,35

0,50

95,73

0,48

Cặn chiết MeOH Đối chứng dương (Ellipticine 10 µg/mL)

Kết quả sàng lọc cặn chiết MeOH cho thấy cặn chiết MeOH của cây Giá có khả năng ức chế lớn hơn 50% sự phát triển tế bào sống trên cả ba dòng tế bào ung thủ thử nghiệm là KB, LU-1 và MCF7. Chất đối chứng dương ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Các kết quả trên là chính xác với r2 ≥ 0,99.

III.2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cây Giá

Bảng III.3. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất và cặn chiết từ cây Giá

Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (g/mL)

Ký hiệu mẫu

Gram (-)

Gram (+)

Nấm mốc

Nấm men

Ec*

Pa*

Bc*

Sa*

An*

Fo*

Sc*

Ca*

7.188

14.375

-

23.125

11.563

5.781

11.563

5.5

-

>50 - - - - - - - >50

- >50 >50 - - - - - >50

- - - - - - - - >50

- - - - >50 - - - -

- >50 - >50 - - - - -

- - - - 50 - - - -

>50 - - - - - - - -

- - - - - - - - -

200

-

Streptomycin (57,5 g/mL) Nystatin (92,5 g/mL) Tetracyclin (44 g/mL) EA-1 EA-2 EA-3 EA-4 EA-5 EA-6 EA-7 EA-8 EA-9 Cặn chiết MeOH

#Nồng độ mẫu đầu tương đương với 0,1 mM; Streptomycin, nystatin và tetracyclin được sử dụng như những kháng sinh chuẩn. *Ec (Escherichia coli), Pa (Pseudomonas aeruginosa), Bc (Bacillus subtillis), Sa (Staphylococcus aureus), An (Aspergillus niger), Fo (Fusarium oxysporum), Sc (Saccharomyces cerevisiae) và Ca (Candida albicans). (-) Không xác định.

III.2.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của cây Đơn lá đỏ Bảng III.4. Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế quá trình sản sinh nitric oxide (NO) trên đại tế bào RAW264.7 của các hợp chất

Hợp chất Ức chế (%) Tế bào sống (%) Nồng độ (µM)

38,72 ± 0,56 76,12 ± 1,36 EC-1 46,78 ± 0,35 78,89 ±1,32 EC-2 75,83 ± 0,77 86,65 ±1,54 EC-3 31,09 ± 1,60 56,49 ±0,97 EC-4 42,02 ± 1,01 75,51 ±1,52 EC-5 68,18 ± 0,67 73,59 ±0,67 EC-6 39,22 ± 1,07 78,60 ±2,18 100 EC-7 94,96 ± 0,26 80,41 ±1,66 EC-8 82,91 ± 1,03 83,19 ±2,37 EC-9 27,87 ± 0,81 84,55 ±0,98 EC-10 30,47 ± 0,69 82,91 ±1,43 EC-11 38,38 ± 0,19 70,16 ±1,77 EC-12 35,01 ± 0,76 55,50 ±2,54 33,89 ± 0,51 95,35 ±0,75 0,3

Cardamonin được sử dụng như chất chuẩn chứng. Các thí nghiệm được lặp lại

3 lần.

Bảng II.5. Kết quả IC50 của các hợp chất thể hiện hoạt tính

3 88,80 ± 0,51 86,00 ±1,55 EC-13 Đối chứng dương (Cardamonin)

Giá trị IC50 (µM) 13,80 ± 1,23 58,10 ± 2,04 6,17 ± 0,25 12,02 ± 0,73

1,57 ± 0,24 Hợp chất EC-3 EC-6 EC-8 EC-9 Đối chứng dương (Cardamonin)

Cardamonin được sử dụng làm chất chuẩn dương. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

CHƢƠNG IV. THẢO LUẬN KẾT QUẢ

IV.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Giá IV.1.1. Hợp chất excoecarin L (EA-1, Chất mới)

Hình IV.2. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất EA-1

Hợp chất EA-1 phân lập từ phân đoạn chloroform, có dạng bột màu trắng. Phổ HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M + Na]+ tại m/z +, 343,1880), phù hợp với 343,1897 (tính toán theo lý thuyết C19H28NaO4 công thức phân tử C19H28O4. Trên phổ 13C NMR và phổ HSQC cho tín hiệu cộng hưởng của 19 carbon, gồm bốn carbon không liên kết với hydro, sáu nhóm methine, tám nhóm methylene và một nhóm methyl. Trong đó, các tín hiệu của hai carbon methine olefin [δC 135,5 (C-15) và 135,2 (C-16)], hai nhóm oxymethylene [δC 68,6 (C-17) và 69,4 (C-20)], một nhóm oxymethine [δC 71,1 (C-6)] và một carbon hemiketal [δC 98,6 (C-3)] cũng được nhận dạng. Phổ 1H NMR xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của một nhóm methyl bậc hai tại δH 1,12 (3H, d, J = 7,0 Hz, H- 18), một proton oxymethine tại δH 3,75 (1H, ddd, J = 4,0, 11,0, 11,5 Hz, H-6), hai nhóm oxymethylene tại δH 3,40 (1H, d, J = 11,0 Hz, H- 17a)/3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-17b) và δH 3,80 (1H, dd, J = 5,0, 9,5 Hz, H-20a)/3,89 (1H, dd, J = 3,5, 9,5 Hz, H-20b), hai proton olefin thuộc một liên kết đôi hai lần thế tại δH 5,73 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-15) và δH 5,66 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-16) (Bảng IV.1).

Hình IV.1. Cấu trúc của EA-1, tương tác COSY, HMBC chính và chất tham khảo

Hình IV.3. Phổ 1H NMR của hợp chất EA-1

Hình IV.4. Phổ 13C NMR của hợp chất EA-1

Hình IV.5. Phổ HSQC của hợp chất EA-1

Hình IV.6. Phổ HMBC của hợp chất EA-1

Hình IV.7. Phổ COSY của hợp chất EA-1

Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HSQC, HMBC và COSY cho thấy hợp chất EA-1 có cấu trúc phẳng tương tự như hợp chất agallochin I (trước đó cũng được phân lập từ cây này), ngoại trừ sự có mặt thêm tín hiệu của một nhóm hydroxy tại vị trí C-17. Các tương tác xa HMBC giữa δH 3,40/3,45 (H-17) với δC 28,0 (C-12), 51,1 (C-13), 56,6 (C-14) và 135,2 (C- 16) cho thấy nhóm OH liên kết với C-17, trong khi đó các tương tác hai chiều trên phổ COSY giữa proton H-18/H-4/H-5/H6/H-7 một lần nữa khẳng định nhóm methyl liên kết với C-4 và nhóm hydroxy liên kết với C-6. Ngoài ra, sự dịch chuyển hóa học về phía trường yếu của carbon hemiketal tại δC 98,69 (C-3) kết hợp với các tương tác HMBC giữa δH 3,80/3,89 (H- 20) với δC 32,7 (C-1), 98,6 (C-3), 57,9 (C-5) và 37,5 (C-10) cho phép khẳng định liên kết cầu eter giữa C-20 với C-3 và nhóm hydroxy còn lại trong phân tử liên kết tại C-3 (Hình IV.5-IV.6).

c,e (dạng pic, J = Hz)

HMBC NOESY

Vị trí #δC

a,b [35] δC 31,2

c,d 32,7

5, 10

20a

26,9

28,2

Bảng IV.1. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của EA-1 và hợp chất tham khảo

δC 1,27 (1H, m) 2,09 (1H, ddd, 3,5, 12,5, 12,5) 1,71 (1H, m) 2,02 (1H, ddd, 3,5, 12,0, 13,5)

18, 20a

98,3 41,5

98,6 42,7

- 1,96 (1H, m)

3 4

56,9

57,9

1,03 (1H, dd, 5,0, 11,0)

7a, 9

2, 3, 5, 6, 18 1, 4, 6, 10, 18, 19

69,5

71,1

3,75 (1H, ddd, 4,0, 11,0, 11,5)

44,7

46,2

1,43 (1H, dd, 11,5, 13,0) 1,85 (1H, dd, 4,0, 13,0)

5, 6, 8, 9, 14, 15

4, 7b, 15, 20b 5, 6, 9, 14a, 14b

49,4 44,5

50,2 46,4

- 1,20 (1H, dd, 4,5, 12,5)

8 9

5, 7a

36,3 20,7 31,9

37,5 21,4 28,0

- 1,08 (1H, m)/1,72 (1H, m) 1,28 (1H, m)/1,36 (1H, m)

20a

10 11 12

43,7 60,4

51,1 56,6

13 14

- 1,09 (1H, m) 1,67 (1H, dd, 2,5, 9,5)

7a, 7b 17

133,3

135,5

5,73 (1H, d, 6,0)

6, 16, 20b

137,9

135,2

5,66 (1H, d, 6,0)

24,4

68,6

14b

1, 5, 8, 10, 14, 15, 19 8, 9, 13 9, 11, 13, 14, 16 7, 8, 9, 12, 13, 15, 16, 17 8, 13, 14, 16 15, 14, 13, 8 12, 13, 14, 16 3, 4, 5

19,3 68,5

19,6 69,4

18 20

3,40 (1H, d, 11,0) 3,45 (1H, d, 11,0) 1,12 (3H, d, 7,0) 3,80 (1H, dd, 5,0, 9,5) 3,89 (1H, dd, 3,5, 9,5)

1, 3, 5, 10

2b 1b, 2a, 6, 11a, 15

aĐo trong CDCl3, b75MHz; cđo trong CD3OD, d125MHz, e500MHz. #δC số liệu phổ của

agallochin I tham khảo tài liệu sô [35].

Cấu hình tương đối của hợp chất EA-1 được xác định dựa vào giá trị hằng số tương tác (JH-H) và các tương tác trên phổ NOESY. Các vị trí H- 5, H-6, H-7a và H-9 được xác định là axial do giá trị JH-H lớn (J = 11,0 -

Hình IV.8. Các tương tác NOESY của hợp chất EA-1

Hình IV.9. Phổ NOESY của hợp chất EA-1

12,5 Hz). Thêm nữa, các tương tác NOESY giữa proton H-5/H-9, H-1a, H- 7a; H-7a/H-14a, H-9; H-20b/H-15; H-15/H-16 và H-20a/H-11a, H-1b, H-2a xác nhận cấu hình khung beyer-15-ene diterpenoid. Cuối cùng, các tương tác giữa H-6/H-20b, H-15, H-4 và giữa H3-18/H-2b cho phép khẳng định cấu hình β của H-6 và H-4 (Hình IV.8-IV.9). Từ các phân tích phổ nêu trên, hợp chất EA-1 được xác định là 3β,20-epoxy-3,6α,17-trihydroxy-19-nor-beyer- 15-ene, đây là một chất mới và cũng là hợp chất dạng 19-nor-beyerene diterpenoid đầu tiên phân lập được từ cây E. agallocha và được đặt tên là excoecarin L. Chi tiết xác định cấu trúc 8 hợp chất còn lại trong Luận án và được tóm tắt Hình IV.26 dưới đây:

Hình IV.26. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ cây Giá

IV.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Đơn lá đỏ

Hợp chất EC-1 phân lập được có dạng bột, màu trắng. Phổ HR- ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M - H]- tại m/z 541,2297 (tính toán theo -, 541,2291), 577,2063 [M + Cl]- (tính toán theo lý lý thuyết C26H37O12 -, 577,2057) và 587,2346 [M + HCOO]- (tính toán theo lý thuyết C26H38ClO12 -, 587,2345), phù hợp với công thức phân tử C26H38O12 thuyết C27H39O14 (Hình IV.28).

IV.2.1. Hợp chất 6α,7α-epoxy-4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-rhamnofola-1,15- dien-3-one 20-O-β-D-glucopyranoside (EC-1, Chất mới)

Hình IV.27. Cấu trúc của EC-1 và hợp chất tham khảo

Hình IV.28. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất EC-1

Hình IV.29. Phổ 1H NMR của hợp chất EC-1

Phổ 13C NMR và phổ HSQC cho tín hiệu cộng hưởng của 26 carbon, bao gồm sáu carbon không liên kết với hydro, 13 nhóm methine, bốn nhóm methylene và ba nhóm methyl. Phân tích độ chuyển dịch hóa học của các tín hiệu cho phép nhận dạng một nhóm carbonyl [δC 209,9 (C-3)], bốn carbon olefin [δC 163,0 (C-1), 134,7 (C-2), 145,9 (C-15) và 117,2 (C-16)], sáu carbon thuộc một gốc đường glucose [δC 104,8 (carbon anome, H-1'), 75,2 (C-2'), 78,0 (C-3'), 71,6 (C-4'), 78,0 (C-5') và 62,8 (C-6')], ba carbon không

Hình IV.30. Phổ 13C NMR của hợp chất EC-1

mang hydro liên kết với oxy [δC 74,7 (C-4), 64,6 (C-6) và 77,3 (C-9)], ba nhóm oxymethine [δC 68,1 (C-5) và 62,3 (C-7) và 71,4 (C-13)], cùng với một nhóm oxymethylen [δC 74,2 (C-20)]. Phổ 1H NMR cho tín hiệu của hai nhóm methyl [δH 1,70 (3H, s, H-17) và 1,76 (3H, d, J = 2,0 Hz, H-19)], một nhóm methyl bậc hai [δH 0,96 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-18)], một proton olefin thuộc một liên kết đôi ba vị trí thế [δH 7,66 (1H, br s, H-1)], hai proton olefin khác thuộc một liên kết đôi dạng >C=CH2 [δH 4,98 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-16a)/5,04 (1H, br s, H-16b), một proton anome của gốc đường glucose có cấu hình β [δH 4,33 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1') và các tín hiệu của các nhóm oxymethine/oxymethylene trong vùng dịch chuyển hóa học từ δH 3,20 – 4,20 ppm (Hình IV.28-IV.29).

Hình IV.31. Các tương tác COSY, HMBC và NOESY chính của EC-1

Hình IV.31. Phổ HSQC của hợp chất EC-1

Hình IV.32. Phổ HMBC của hợp chất EC-1

Hình III.33. Phổ COSY của hợp chất EC-1

Hình III.34. Phổ NOESY của hợp chất EC-1

Phân tích chi tiết các phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC, COSY, HMBC cho thấy cấu trúc phần aglycon của EC-1 có nhiều vị trí tương đồng với hợp chất venenatin (EC-2) cũng được phân lập từ cây Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis), ngoại trừ sự khác nhau ở các vị trí C-13 và C-14 (Bảng IV.9). Ở hợp chất EC-2, vị trí C-13 là carbon không liên kết với hydro có hai nhóm thế là hydroxy và isopropenyl, vị trí C-14 có một nhóm hydroxy, còn ở hợp chất EC-1 vị trí C-13 có 1 nhóm hydroxy và vị trí C-14 có một nhóm isopropenyl. Hơn nữa, các tương tác COSY giữa proton H-7/H-8/H- 14/H-13/H-12/H-11/H-8 và các tương tác HMBC giữa H-17 với C-14, C-15, C-16, giữa H-16 với C-14, C-15, C-17, giữa H-8 với C-9, C-11, C-13, C-14, C-15 đã khẳng định nhận định trên cũng như cấu trúc vòng C. Gốc đường glucose liên kết với aglycon ở vị trí C-20 nhờ các tương tác HMBC giữa H-1' với C-20 và H-20 với C-1'. Ngoài ra, các tương tác COSY và HMBC khác trong hình dưới đã khẳng định cấu trúc phẳng của vòng A và B trong phân tử EC-1.

Với cấu hình phẳng xác định được như trên cho thấy EC-1 là một diterpenoid dạng khung rhamnofolane trong khi hợp chất EC-2 thuộc dạng khung daphnane. Trong thực tế cả ba dạng khung rhamnofolane, daphnane, tigliane đều có cấu trúc ba vòng A, B và C tương tự nhau dạng [5-7-6] tricyclic và chỉ khác nhau vị trí thế của nhóm isopropyl.

δH

HMBC

COSY NOESY

a,b

δC

Vị trí 1

Venenatin [106] 162,2

163,0

7,66 (1H, br s)

10, 18

135,5 209,9 74,6 70,5 64,0

134,7 209,9 74,7 68,1 64,6

- - - 4,30 (1H, br s) -

2 3 4 5 6

65,4

62,3

3,19 (1H, br s)

39,1

40,0

3,10 (1H, br d, 12,5)

7, 14

79,8 51,0 39,5 39,1

77,3 51,5 39,4 41,1

1 18, 12 11, 13

9 10 11 12

- 4,15 (1H, dd, 2,5, 3,0) 2,10 (1H, m) 1,60 (1H, m) 1,73 (1H, m)

2, 3, 4, 10, 19 3, 6, 7, 20 6, 8, 9, 14, 20 6, 7, 9, 11, 13, 14, 15 9 9, 11, 13, 14, 18

75,4

71,4

3,52 (1H, m)

12, 14

10 8, 17, 20a 7, 11, 13 17 1, 5 8, 12a 11, 13 8, 12a, 17

79,4

54,2

8, 13

16a

147,2 114,7

145,9 117,2

8, 13, 15, 16, 17 15, 17

14, 17

15 16

2,80 (1H, dd, 10,0, 12,5) - 4,98 (1H, d, 2,0) 5,04 (1H, br s)

19,3

18,9

14, 15, 16

1,70 (3H, s)

18,3 9,9 65,0

9, 11, 12 1, 2, 3 5, 6, 7, 1'

18 19 20

Bảng IV.9. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của EC-1 và hợp chất tham khảo a,c (dạng pic, J = Hz)

18,9 9,9 74,2

- - - - - -

20 1' 4' 3' 5'

2' 1', 3' 2', 4' 3', 5' 4', 6' 5'

(1H, dd, 5,5,

7, 8, 13, 16b 1 7

1' 2' 3' 4' 5' 6'

104,8 75,2 78,0 71,7 78,0 62,8

(1H, dd, 1,0,

0,96 (3H, d, 7,0) 1,76 (3H, d, 2,0) 3,45 (1H, d, 11,0) 4,27 (1H, d, 11,0) 4,33 (1H, d, 7,5) 3,20 (1H, *) 3,36 (1H, *) 3,27 (1H, *) 3,26 (1H, m) 3,64 12,0) 3,86 12,0)

a Đo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz. *Tín hiệu chập pic. Tham khảo số liệu phổ 13C

NMR của venenatin theo tài liệu số [106].

Cấu hình β của nhóm OH-4 và H-8, cấu hình α của H-10 và OH-9 trong hợp chất EC-1 được xác định nhờ sự phù hợp về độ chuyển dịch hóa học của các vị trí C-4, C-8, C-9, C-10 cũng như H-10 giữa hợp chất EC-1 và EC-2. Các tương tác NOESY giữa H-10 với H-5, giữa H-8 với H-7, H-11, H- 13, H-17, giữa H-7 với H-20, giữa H-17 với H-16b, giữa H-16a với H-14, giữa H-18 với H-1 đã khẳng định cấu hình tương đối của các vị trí C-6, C-7, C-11, C-13 và C-14 của hợp chất EC-1 Chi tiết xác định cấu trúc 12 hợp chất còn lại trong Luận án và được tóm tắt Hình IV.53 dưới đây:

Hình IV.53. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ cây Đơn lá đỏ

Hình IV.53. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ cây Đơn lá đỏ (tiếp)

IV.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

IV.3.1. Tác dụng gây độc đối với các dòng tế bào ung thư của cặn chiết và các hợp chất phân lập từ cây Giá

Kết quả sàng lọc cặn chiết MeOH cho thấy cặn chiết MeOH của cây Giá có khả năng ức chế >50% sự phát triển tế bào sống trên cả 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm là dòng tế bào ung thư phổi người (LU), ung thư biểu mô người (KB) và ung thư vú người (MCF7). Chất đối chứng dương ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Các kết quả trên là chính xác với r2 ≥ 0,99 (Bảng III.1). Tuy nhiên, các hợp chất phân lập được đều thể hiện yếu hoặc không thể hiện hoạt tính đối với các dòng tế bào thử nghiệm (IC50 > 100 µM). Những kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu gần đây liên quan đến khả năng ức chế các tế bào ung thư của các hợp chất này.

Với hợp chất aquillochin (EA-3) và (+)-isolariciresinol (EA-4) đã được đánh giá khả năng gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư như KB, SK-LU-1, MCF-7, HepG2, SW-480, PC-3, HT-29, A549, MDA-MB- 231, KB-VIN và HCT-116, SGC-7901. Các kết quả cho thấy, mức độ ức chế của hai hợp chất EA-3 và EA-4 trên các dòng ung thư thử nghiệm chỉ đạt ở mức độ yếu hoặc không thể hiện hoạt tính. Blumenol A (EA-6) cũng được các nhà khoa học Trung Quốc đánh giá khả năng ức chế trên hai dòng tế bào ung thư HepG2 và SMMC-7721. Tuy nhiên, EA-6 không có tác dụng ức chế rõ ràng đối với hai dòng tế bào thử nghiệm. Sử dụng phương pháp thực nghiệm MTT, khả năng gây độc trên các dòng tế bào ung thư như HeLa, HGC-27, HT-29, HCT-8 và BGC-823 của hợp chất blumenol B (EA-7) cũng thể hiện chỉ ở mức độ yếu qua các thử nghiệm của S.D. Xue và cộng sự. Ngoài khả năng chống oxi hóa tốt của EA-8, hợp chất này không chỉ là chất thúc đẩy mạnh mẽ quá trình tự chết của tế bào ung thư như A549 và MCF-7,

mà còn ngăn ngừa tổn thương DNA, có thể thúc đẩy sự biến đổi thành tế bào ung thư gây ra bởi ROS trong các tế bào thường HEK293. Venenatin (EC-2), thể hiện tác dụng ức chế tăng sinh đối với dòng tế bào bạch cầu ở người (HL- 60, IC50 = 28,1 μM). Khả năng kháng virus HIV-1 của EC-2 được đánh giá bằng cách thử nghiệm ức chế tế bào của HIV-1 (EC50) và độc tính đối với dòng tế bào C8166 (phương pháp MTT). Tuy nhiên, kết quả cho thấy khả năng ức chế virus của EC-2 không đáng kể. Khả năng kháng lại đối với dòng tế bào ung thư A549 (IC50 = 32,5 μM) và HL-60 (IC50 = 41,8 μM) của syringin (EC-8) chỉ ở mức độ vừa phải, cũng như làm giảm đáng kể khối u trên chuột S180 thực nghiệm. Cuối cùng phải kể đến hợp chất EC-13 cũng được nhóm nghiên cứu của Ning-Hua Tan và cộng sự thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư là BGC-823, Hela và A549. Tuy nhiên, các kết quả không cho thấy khả năng gây độc tế bào đối với ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm.

III.3.2. Tác dụng kháng vi sinh vật kiểm định của cây Giá

Kết quả sàng lọc cặn chiết MeOH của cây Giá cho thấy chỉ có hoạt tính kháng một VSVKĐ của vi khuẩn Gram dương B. subtillis (MIC = 200 µg/mL). Các hợp chất phân lập được đã được thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên tám chủng vi khuẩn bao gồm hai chủng vi khuẩn Gram (-): E. coli, P. aeruginosa, hai chủng vi khuẩn Gram (+): B. subtillis, S. aureus, hai chủng vi khuẩn nấm mốc: A. niger, F. oxysporum, hai chủng vi khuẩn nấm men: S. cerevisiae và C. albicans. Hợp chất blumenol A (EA-5) thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ trên chủng F. oxysporum (MIC = 50 µg/mL) (Bảng III.3). Trước đó, hợp chất EC-13 cũng được Gabriela Mazzanti đánh giá kháng VSVKĐ trên các chủng Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella thyphimurium và Candida albicans. Tuy nhiên, kết quả cho thấy hợp chất này không thể hiện khả năng kháng VSVKĐ trên các chủng đã thử nghiệm. Kết quả nghiên cứu này phần nào giải thích được công dụng dân gian đã sử dụng cây này để chữa tiêu chảy, kiết lỵ ở người. Đây là nghiên cứu đầu tiên liên quan đến hoạt tính kháng VSVKĐ đối với cây Giá và các hợp chất phân lập được từ cây này được thực hiện đến nay.

IV.3.3. Tác dụng kháng viêm của các hợp chất phân lập từ cây Đơn lá đỏ

Quá trình sản sinh NO là một trong các phản ứng tự bảo vệ của cơ thể tuy nhiên sự sản sinh quá mức lượng NO được cho là nguyên nhân dẫn đến sự tổn thương của các tế bào và mô, thúc đẩy quá trình viêm và gây ra các bệnh viêm cấp và mãn tính. Do vậy mức độ sản sinh NO có thể phản ánh mức độ gây viêm và được coi là một trong những yếu tố chỉ thị cho quá trình viêm xảy ra. Các hợp chất ức chế quá trình sản sinh NO có thể được coi là

các tác nhân chống viêm. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh NO trong tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS của 13 hợp chất (EC-1 – EC-13) phân lập được từ cây Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis) (Bảng II.3-II.4) cho thấy ở nồng độ 100 µM, các hợp chất EC-3, EC-8 và EC-9 gây suy giảm đáng kể sự sản sinh NO trong tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS (tỷ lệ ức chế > 50%), các hợp chất còn lại có hoạt tính trung bình hoặc kém (tỷ lệ ức chế < 50%). Hoạt tính ức chế sự sản sinh NO theo nồng độ (100 µM) của ba hợp chất EC-3, EC-8 và EC-9 cho thấy, các hợp chất này gây ức chế quá trình sản sinh NO trên tế bào RAW264.7 mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 13,80 ± 1,23, 6,17 ± 0,25 và 12,02 ± 0,73 µM, so với chất đối chứng dương cardamonin (IC50 = 1,57 ± 0,24 µM). Ở nồng độ 100 µM, hợp chất EC-6 biểu hiện hoạt tính ức chế quá trình sản sinh NO ở mức độ trung bình.

Về tác dụng chống viêm, kaempferol (EA-8) trong thử nghiệm in vitro ức chế COX-1 và COX-2 và ức chế quá trình sản sinh NO do LPS gây ra trong đại tế bào J774 và RAW264.7. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng EA-9 cũng có tác dụng kháng viêm với tác dụng tiềm năng chống lại bệnh viêm khớp (làm giảm rõ rệt độ dày khớp gối) và kháng lại các cytokine trung gian gây viêm liên quan đến viêm khớp như CXCL-1/KC, IL-6, TNF-α, IL-1β, LTB4 và PGE2. Hơn nữa, EA-9 giúp giảm dần sự biệt hóa tế bào hủy xương phụ thuộc RANKL và sự sinh của tế bào xương, bao gồm cấu trúc F-actin và khả năng phục hồi xương. Thêm vào đó, tác động mạnh mẽ của glochionionol A (EC-3) đối với sự biệt hóa của các tế bào loãng xương trên đại thực bào RAW264.7 đã được báo cáo. Trong khi đó hợp chất EC-12 (IC50 = 29,23 µM) cho thấy khả năng kháng viêm trên cytokine IL-12 p40 ở mức độ vừa phải khi so sánh với chất đối chứng dương sử dụng SB203580 (IC50 = 5,00 µM). Hợp chất EC-13 thể hiện khả năng ức chế quá trình sản sinh NO với giá trị IC50 = 45,6 µM khi so sánh với chất đối chứng L-NMMA (IC50 = 25,2 µM). Các đánh giá trên hoạt tính kháng oxi hóa DPPH đối với hai hợp chất EC-12 và EC-13 chỉ thể hiện ở mức độ yếu (4%) hoặc không quan sát được hoạt tính.

Các kết quả đánh giá khả năng ức chế quá trình sản sinh NO đối với các hợp chất sạch được tinh chế từ từ cây Đơn lá đỏ một lần nữa khẳng định có sự tương đồng cao với các kết quả đã công bố liên quan đến nhóm hoạt chất công bố trước đó, đặc biệt là từ chi Excoecaria. Từ đó góp phần làm rõ hơn những công dụng chữa bệnh trong y học cổ truyền đồng thời làm tăng giá trị khoa học của cây này ở nước ta.

KẾT LUẬN

Về nghiên cứu thành phần hóa học

(EC-1) acid và Từ phần lá hai cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis Lour.) đã phân lập và xác định cấu trúc 22 hợp chất. Trong đó, bốn hợp chất mới là excoecarin L (EA-1), excoecarin O (EA-2), 6α,7α- 20-O-β-D- epoxy-4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-rhamnofola-1,15-dien-3-one glucopyranoside 3-(2-O-β-D-glucopyranosyl-3- hydroxyphenyl) propanoic (EC-9) lần đầu tiên được phân lập và xác định.

- Từ lá của cây Giá (E. agallocha) phân lập và xác định cấu trúc 9 hợp chất. Trong đó, có hai hợp chất mới là excoecarin L (EA-1) và excoecarin O (EA-2), cùng với bảy hợp chất đã biết khác là aquillochin (EA- 3), (+)-isolariciresinol (EA-4), (+)-epipinoresinol (EA-5), blumenol A (EA- 6), blumenol B (EA-7), kaempferol (EA-8) và methyl gallate (EA-9).

và (EC-1) acid

rhamnocitrin 3-glucoside (EC-10), 2,3-dihydroxypropyl-benzoate

- Từ lá của cây Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis) phân lập và xác định cấu trúc 13 hợp chất. Trong đó, có hai hợp chất mới là 6α,7α-epoxy- 4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-rhamnofola-1,15-dien-3-one 20-O-β-D- glucopyranoside 3-(2-O-β-D-glucopyranosyl-3- hydroxyphenyl) propanoic (EC-9), cùng với mười một hợp chất đã biết khác là venenatin (EC-2), glochionionol A (EC-3), (6R,9S)-roseoside (EC-4), isofraxoside (EC-5), pinoresinol-4'-O-β-D-glucoside (EC-6), liriodendrin (EC-8), sinapyl alcohol 4-O-β-D- (EC-7), 3-O-α-(4''- glucopyranoside methoxyglucuronide) (EC-11), phenethyl rutinoside (EC-12) và benzyl-O-α- L-rhamnopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranoside (EC-13).

Về nghiên cứu hoạt tính sinh học

- Đã sàng lọc cặn chiết MeOH của cây Giá cho thấy cặn chiết này có khả năng ức chế lớn hơn 50% sự phát triển tế bào sống trên cả ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm là KB, LU-1 và MCF7. Mặc dù các hợp chất phân lập được chưa thể hiện rõ ràng độ chọn lọc trên ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm, tuy nhiên, các kết quả thu được trên đây có thể góp phần hoạt tính này chưa được xác định từ cặn chiết MeOH.

- Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ đối với cặn chiết MeOH của cây Giá cho thấy chỉ thể hiện trên một chủng vi khuẩn Gram dương B. subtillis (với giá trị MIC = 200 µg/mL). Hợp chất blumenol A (EA-6) thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ chủng Fusarium oxysporum với giá trị MIC = 50 µg/mL. Đây là lần đầu tiên kết quả nghiên cứu liên quan đến hoạt tính kháng VSVKĐ của các hợp chất phân lập được từ cây Giá được báo cáo.

- Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vitro thông qua ức chế quá trình sản sinh NO trong tế bào RAW264.7 của mười ba hợp chất (EC-1 – EC-13) phân lập được từ cây E. cochinchinensis. Kết quả cho thấy ba hợp chất EC-3, EC-8 và EC-9 thể hiện hoạt tính khá tốt với giá trị IC50 lần lượt là 13,80 ± 1,23, 6,17 ± 0,25 và 12,02 ± 0,73 µM.

KIẾN NGHỊ

Từ các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của phần lá hai cây E. agallocha và E. cochinchinensis tác giả nhận thấy: Hợp chất EC-8 có hoạt tính kháng viêm khá tốt ức chế quá trình sản sinh NO trong tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS. Vì vậy, cần nghiên cứu thêm sâu hơn các thí nghiệm kháng viêm của hợp chất này để định hướng cho thực nghiệm in vivo. Ngoài ra, trên cơ sở các chất đã được phân lập được từ cây Giá và Đơn lá đỏ, tiếp tục đánh giá thử nghiệm các hoạt tính khác nhằm tìm ra các hoạt chất tiềm năng.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Từ hai cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis Lour.) đã phân lập và xác định cấu trúc 04 hợp chất, bao gồm:

- Từ cây Giá (E. agallocha) phân lập và xác định cấu trúc 9 hợp chất. Trong đó, có hai hợp chất mới là excoecarin L (EA-1) và excoecarin O (EA-2)

- Từ cây Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis) phân lập và xác định cấu trúc 13 hợp chất. Trong đó, có hai hợp chất mới là 6α,7α-epoxy- 4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-rhamnofola-1,15-dien-3-one 20-O-β-D- (EC-1) và 2-hydroxyphenyl 3-O-β-D-glucopyranosyl- glucopyranoside propynic acid (EC-9).

- Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế quá trình sản sinh NO trong tế bào RAW264.7 của mười ba hợp chất (EC-1 – EC-13) phân lập được từ cây E. cochinchinensis. Kết quả cho thấy ba hợp chất EC-3, EC-8 và EC-9 thể hiện hoạt tính khá tốt với giá trị IC50 lần lượt là 13,80 ± 1,23, 6,17 ± 0,25 và 12,02 ± 0,73 µM, so với chất đối chứng dương cardamonin (IC50 = 1,57 ± 0,24 µM).

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

from Nguyen Van Thanh, Lai Hop Hieu, Phan Thi Thanh Huong, Le Thi Vien, Tran My Linh, Nguyen The Cuong, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Ngo Dai Quang, Chau Van Minh. Excoecarins L the mangrove plant Excoecaria agallocha L. and O Phytochemistry Letters, 25, 52-55, 2018.

Lai Hop Hieu, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Van Thanh, Do Hoang Anh, Tran Thi Hong Hanh, Nguyen Duy Cong, Nguyen The Cuong, Nguyen Van Thanh, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Ngo Dai Quang, and Chau Van Minh. Metabolites of Excoecaria cochinchinensis Lour. Phytochemistry Letters, 37, 116-120, 2020.