Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang trong phát hiện đồng thời nhiều cytokine

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm phát hiện đồng thời nhiều cytokine và đánh giá độ xác thực của phương pháp xét nghiệm hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang (fluorescence covalent microbead immunosorbent assay - FCMIA).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang trong phát hiện đồng thời nhiều cytokine

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HẤP PHỤ MIỄN DỊCH VI HẠT ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG TRONG PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI NHIỀU CYTOKINE Đỗ Khắc Đại*; Nguyễn Đặng Dũng* Nguyễn Ngọc Tuấn*; Hoàng Trung Kiên* TÓM TẮT Mục tiêu: phát hiện đồng thời nhiều cytokine và đánh giá độ xác thực của phương pháp xét nghiệm hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang (fluorescence covalent microbead immunosorbent assay - FCMIA). Đối tượng và phương pháp: 2 lọ cytokine chuẩn dạng đông khô với nồng độ đã biết được phân tích bằng FCMIA trên hệ thống Luminex 200 tại Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y. Kết quả: xây dựng được đường chuẩn phát hiện đồng thời 3 cytokine và 9 cytokine trong cùng một mẫu xét nghiệm, trong đó tỷ lệ % khôi phục dao động từ 95,68 - 107,26% với tổ hợp 3 cytokine và từ 92,86 - 109,61% với tổ hợp 9 cytokine. Kết luận: đã nghiên cứu thành công ứng dụng kỹ thuật FCMIA trong xét nghiệm đồng thời nhiều cytokine, đó là 3 cytokine: IL-6, IL-17, TNF-α và 9 cytokine: IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α với kết quả định lượng có độ xác thực cao. * Từ khoá: Xét nghiệm cytokine; Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang. Application of Fluorescence Covalent Microbead Immunosorbent Assay in Simultaneous Detection of Cytokines Summary Objectives: To detect simultanly cytokines and evaluate the accuracy of fluorescence covalent microbead immunosorbent assay (FCMIA) method. Subjects and methods: Lyophilization of 2 cytokine standards with known concentration was analysed by FCMIA with Luminex-200 system at Department of Immunology, Vietnam Military Medical University. Results: Created the standard curve for simultaneous detection of three cytokines and nine cytokines in one assay sample and the percentage of recovery in 3 cytokines ranged from 95.68% to 107.26% and 92.86% to 109.61% in 9 cytokines. Conclusion: We have succeeded in application of FCMIA in simultaneous detection of cytokines as 3-plex (IL-6, IL-17, TNF-α) and 9-plex (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α) with high accuracy of quantitative result. * Key words: Cytokine detection; Fluorescence covalent microbead immunosorbent assay. ĐẶT VẤN ĐỀ Cytokine là những protein có trọng lượng phân tử thấp, đóng vai trò trung gian trong trao đổi tín hiệu giữa các tế bào của hệ thống miễn dịch. Các cytokine phát huy tác dụng bằng cách gắn vào thụ thể đặc hiệu trên tế bào đích, qua đó kích hoạt con đường dẫn truyền tín hiệu bên trong tế bào, làm thay đổi hình thức biểu hiện của gen, dẫn đến việc tổng hợp protein mới quyết định các tác dụng sinh học [3]. * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Khắc Đại (dokhacdai@vmmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 29/12/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 14/02/2017 Ngày bài báo được đăng: 20/02/2017 17 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 Cho tới nay, tại Việt Nam đã có một số cơ sở nghiên cứu xét nghiệm được đồng thời nhiều cytokine dựa trên hệ thống “kín” Bio-plex của Bio-Rad [1, 2]. Tuy nhiên, việc Bio-Rad ngừng cung cấp hóa chất xét nghiệm tại Việt Nam dẫn đến các xét nghiệm phát hiện đồng thời nhiều cytokine phải dừng lại. Những kỹ thuật truyền thống như RIA và ELISA có hạn chế, đó là mỗi xét nghiệm chỉ phát hiện được đơn lẻ một cytokine. Xét nghiệm đồng thời nhiều cytokine bằng các phương pháp RIA và ELISA không những cần số lượng lớn trang thiết bị và công lao động mà còn khó có thể đạt độ đồng nhất về kết quả xét nghiệm giữa các nhân viên xét nghiệm khác nhau. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, triển khai phương pháp xét nghiệm kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang có khả năng phát hiện đồng thời nhiều cytokine trong cùng một mẫu xét nghiệm, nhằm khắc phục hạn chế của các kỹ thuật trước đây. Dựa trên hệ thống Luminex-200 được trang bị, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này nhằm: Phát hiện đồng thời nhiều cytokine trong các mẫu chất chuẩn khác nhau và đánh giá độ xác thực của phương pháp xét nghiệm FCMIA. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu. * Đối tượng nghiên cứu: 2 lọ cytokine chuẩn dạng đông khô do Hãng R & D (Mỹ) cung cấp bao gồm: Lọ 1: chứa 3 cytokine IL-6; IL-17 và TNF-α với nồng độ đã biết, đơn vị đo là pg/ml. 18 Lọ 2: chứa 9 cytokine IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α với nồng độ đã biết, đơn vị đo là pg/ml. * Vật liệu nghiên cứu: Hoá chất và sinh phẩm xét nghiệm do Hãng R & D (Mỹ) sản xuất theo yêu cầu của nhóm nghiên cứu bao gồm: - Hỗn hợp với số lượng bằng nhau các loại hạt từ khác nhau, mỗi loại hạt từ huỳnh quang được gắn lên bề mặt một loại kháng thể đơn clon đặc hiệu với 1 cytokine của người: interleukin (IL) 2, 4, 5, 6, 10, 12, 13, 17; yếu tố kích thích tạo dòng clon các tế bào đơn nhân và tế bào hạt (GM-CSF); interferon gamma (IFN-γ) và yếu tố hoại tử u alpha (TNF-α). Chia làm 2 tổ hợp tương ứng 3-plex (IL-6; IL-17 và TNF-α) và 9-plex (IL-2, IL-4, IL-5, IL10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α). - Hỗn hợp kháng thể phát hiện (detecting antibody) đã gắn biotin tương ứng 2 tổ hợp nói trên. - Phức hợp chất huỳnh quang PE gắn streptavidin. - Các dung dịch pha mẫu, dung dịch pha sinh phẩm, dung dịch rửa (Hãng R & D, Mỹ sản xuất và cung cấp). - Hệ thống Luminex - 200 và phần mềm điều khiển đi kèm (Hãng Luminex, Mỹ chế tạo và cài đặt). Các vật liệu và thiết bị labo phụ trợ khác như: máy lắc, máy hút chân không, các loại pipét, đầu pipét, giấy bạc, giấy thấm, nước cất, ống nghiệm đều đạt tiêu chuẩn quốc tế được cung cấp từ chính hãng sản xuất. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 2. Phương pháp nghiên cứu. * Nguyên lý phản ứng phát hiện cytokine: Cytokine được phát hiện bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang kiểu sandwich trên bề mặt các vi hạt từ (hình 1). Bề mặt của vi hạt được gắn sẵn các phân tử kháng thể đơn clon đặc hiệu với một quyết định kháng nguyên trên phân tử cytokine. Khi ủ mẫu xét nghiệm với hạt phủ kháng thể, các phân tử cytokine sẽ bị kháng thể đặc hiệu bắt giữ và bám vào bề mặt hạt. Sau đó, thêm kháng thể đơn clon thứ hai đặc hiệu với một quyết định kháng nguyên khác của cytokine đã gắn biotin, tạo thành phức hợp miễn dịch gồm phân tử cytokine kẹp giữa hai kháng thể đơn clon. Cuối cùng, phức hợp streptavidin-PE được thêm vào sẽ gắn vào kháng thể đơn clon thứ hai qua tương tác streptavidin-biotin. Dước tác động của tia laser bước sóng tử ngoại PE sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang, chứng tỏ cytokine có mặt trong mẫu xét nghiệm. Lượng PE gắn vào tỷ lệ thuận với lượng kháng thể thứ hai, hay lượng cytokine có trên bề mặt hạt từ. Dựa vào mật độ huỳnh quang phát ra từ các hạt được ủ với nồng độ cytokine cho phép định lượng được cytokine. Hình 1: Nguyên lý phản ứng phát hiện cytokine. * Kỹ thuật: Kỹ thuật FCMIA sử dụng các hạt từ huỳnh quang có kích thước bằng nhau (tương tự như tế bào), nhưng phát ra tín hiệu huỳnh quang khác nhau làm giá đỡ để gắn các phân tử sinh học như kháng thể đặc hiệu lên bề mặt. Các hạt này được phân tích bằng phương pháp đếm tế bào/hạt theo dòng chảy (flowcytometry) với hai nguồn laser và detector khác nhau để kích thích và nhận hai loại tín hiệu huỳnh quang độc lập do hạt từ huỳnh quang phát ra (tín hiệu định tính) và từ phản ứng đặc hiệu trên bề mặt hạt từ phát ra (tín hiệu định lượng). Nhờ phần mềm máy tính có khả năng phân biệt được nhiều loại hạt từ huỳnh quang khác nhau, cho phép gắn mỗi loại hạt với một kháng thể đặc hiệu khác nhau, rồi trộn lại để phát hiện đồng thời nhiều kháng nguyên khác nhau trong cùng một mẫu xét nghiệm. * Quy trình xét nghiệm: Bước 1: chia đều 50 µl hỗn hợp hạt từ đã gắn kháng thể vào các giếng của một microplate 96 giếng. Bước 2: cho 50 µl mẫu cytokine chuẩn đã pha loãng bậc ba với 2 lọ chất chuẩn nồng độ khác nhau vào các giếng và ủ trong điều kiện lắc nhẹ bằng máy lắc với thời gian 120 phút tại nhiệt độ phòng. Rửa 3 lần để loại bỏ các thành phần không bám vào hạt bằng phương pháp lọc qua màng lọc với máy hút chân không. 19 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 Bước 3: cho 50 µl hỗn hợp kháng thể đơn clon đặc hiệu cytokine đã gắn biotin vào và ủ tiếp trong điều kiện như trên trong 60 phút để hình thành phức hợp miễn dịch kiểu sanhdwich. Rửa 3 lần theo như mô tả ở bước 2. Bước 4: cho 50 µl dung dịch streptavidin-PE vào, ủ trong 30 phút cho gắn vào phức hợp miễn dịch thông qua tương tác biotin-treptavidin. Rửa 3 lần theo như mô tả ở bước 2 để loại bỏ các phức hợp streptavidin-PE tự do. Bước 5: cho 100 µl dung dịch rửa vào mỗi giếng, sau đó đọc và phân tích kết quả bằng hệ thống Luminex - 200 ở chế độ chọn tốc độ dòng chảy (60 µl/phút) và thể tích mẫu đọc là 50 µl. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN (a) (b) Hình 2: Biểu đồ phân bố các hạt từ theo tín hiệu huỳnh quang định tính của 3 cytokine (a) và 9 cytokine (b). Hình 2a và 2b biểu thị sự phân bố của 3 loại hạt từ và 9 loại hạt từ khác nhau tương ứng với các loại cytokine cần phát hiện, nhận biết thông qua tín hiệu huỳnh quang quang định tính do hạt từ phát ra. Kết quả cho thấy 3 nhóm hạt từ và 9 nhóm hạt từ khác nhau được phân bố độc lập không có sự giao thoa, chứng tỏ không có ảnh hưởng chéo giữa các loại cytokine cần phát hiện. Hình 3: Đường cong biểu thị nồng độ chuẩn của 3 cytokine theo tín hiệu huỳnh quang định lượng (a) và đường chuẩn phát hiện đồng thời 3 cytokine trên hệ thống Luminex - 200 (b). Hình 3a biểu thị nồng độ chuẩn của 3 loại cytokine theo tín hiệu huỳnh quang định lượng, khi nồng độ cytokine giảm theo bậc 3, mật độ huỳnh quang đo được giảm tương ứng. Hình 3b biểu thị đường chuẩn phát hiện đồng thời 3 cytokine trên hệ thống 20 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 Luminex - 200. Kết quả cho thấy có tương quan thuận giữa nồng độ cytokine và mật độ huỳnh quang trung bình đo được do phức hợp huỳnh quang trên hạt từ phát ra, cho phép sử dụng các đường chuẩn này vào xét nghiệm định lượng đồng thời 3 cytokine là IL-6; IL-17 và TNF-α. Hình 4: Đường cong biểu thị nồng độ chuẩn của 9 cytokine theo tín hiệu huỳnh quang định lượng (a) và đường chuẩn phát hiện đồng thời 9 cytokine trên hệ thống Luminex - 200 (b). Hình 4a biểu thị nồng độ chuẩn của 9 loại cytokine theo tín hiệu huỳnh quang định lượng, khi nồng độ cytokine giảm theo bậc 3, mật độ huỳnh quang đo được cũng giảm tương ứng. Hình 4b biểu thị đường chuẩn phát hiện đồng thời 9 cytokine trên hệ thống Luminex - 200. Kết quả cho thấy có tương quan thuận giữa nồng độ cytokine và mật độ huỳnh quang trung bình đo được do phức hợp huỳnh quang trên hạt từ phát ra, cho phép sử dụng các đường chuẩn này trong xét nghiệm định lượng đồng thời 9 cytokine là IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ và TNF-α. Bảng 1: Đánh giá độ xác thực của xét nghiệm phát hiện đồng thời 3 cytokine (IL-6; IL-17 và TNF-α) bằng chỉ số % khôi phục. Loại cytokine Chất chuẩn IL-6 IL-17 Nồng độ Nồng độ % khôi Nồng độ Nồng độ chuẩn đo được phục chuẩn đo được (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) TNF-a % khôi Nồng độ Nồng độ % khôi phục chuẩn đo được phục (pg/ml) (pg/ml) Std1 3.420 3.430,14 100,30 4.840 4.851,03 100,23 3.620 3.632,68 100,35 Std2 1.140 1.123,57 98,56 1.613 1.587,35 98,41 1.207 1.183,64 98,06 Std3 380 396,78 104,42 538 567,28 105,44 402 431,20 107,26 Std4 127 123,89 97,55 179 167,47 93,56 134 128,22 95,68 Std5 42 40,75 97,03 60 63,99 106,65 45 43,27 96,15 Std6 14 14,50 103,57 20 19,51 97,56 15 15,88 105,83 Std7 5 4,98 99,49 7 7,04 100,54 5 4,95 99,08 Việc phát hiện đồng thời 3 cytokine (IL-6; IL-17 và TNF-α) có độ xác thực cao. Tỷ lệ % khôi phục giữa nồng độ đo được và nồng độ chuẩn đã biết dao động từ 95,6 - 107,26%. 21