PHÂN TÍCH PROTEIN

Chia sẻ: Nguyễn Văn Quân | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

241
lượt xem 68
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Việc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng rẽ có ý nghĩa quyết định đến khả năng tìm hiểu được chức năng của chúng. Mặc dù trong một số trường hợp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng hỗn hợp phức tạp, nhưng phần lớn những nghiên cứu này thường dẫn đến những kết luận “mù mờ”.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: PHÂN TÍCH PROTEIN

1. Chuẩn bị dịch chiết tế bào để tinh sạch protein Việc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng r ẽ có ý nghĩa quy ết đ ịnh đến khả năng tìm hiểu được chức năng của chúng. Mặc dù trong m ột s ố tr ường hợp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng h ỗn h ợp ph ức tạp, nhưng phần lớn những nghiên cứu này th ường dẫn đ ến nh ững k ết lu ận “mù mờ”. Chẳng hạn như khi chúng ta nghiên cứu về ho ạt tính c ủa m ột enzym ADN polymerase trong một hỗn hợp protein thô (chẳng hạn t ừ d ịch phân gi ải t ế bào), các enzym ADN polymerase và protein thành phần khác cũng có th ể ảnh h ưởng đến hiệu suất tổng hợp ADN quan sát được trong thực nghi ệm. Vì v ậy, vi ệc tinh sạch các protein là một bước quan trong trong quá trình tìm hi ểu v ề ch ức năng của chúng. Mỗi một protein thường có một số đặc tính riêng làm vi ệc tinh s ạch chúng thường có tính đặc thù. Điều này thì trái ng ược v ới ADN, v ốn c ơ b ản gi ống nhau về cấu trúc và thành phần, chỉ khác nhau về trình t ự c ủa các nucleotit. Các bước tinh sạch từng loại protein thường dựa trên các đặc tính đ ặc thù c ủa nó v ề kích thước, hình dạng, điện tích và nhiều khi là ch ức năng c ủa chúng. Vật liệu khởi đầu cho hầu hết các quá trình tinh sạch protein t ừ sinh v ật là các dịch chiết tế bào. Không giống ADN vốn có tính ph ục h ồi cao trong các đi ều kiện nhiệt độ sống khác nhau, thì protein r ất dễ b ị bi ến tính và phá h ủy sau khi bị giải phóng ra khỏi tế bào. Vì lý do này, h ầu h ết quá trình chu ẩn b ị các d ịch chiết và tinh sạch protein được tiến hành ở nhiệt đ ộ lạnh (4oC). Có m ột s ố cách chuẩn bị dịch chiết tế bào. Các tế bào có thể phân gi ải bằng s ử d ụng chất t ẩy, các lực làm vỡ thành tế bào, xử lý với dung dịch nh ược tr ương (làm t ế bào trương lên do nước đi vào và vỡ ra), hoặc thay đ ổi đ ột ng ột áp su ất. Đi ểm chung của tất cả các phương pháp là làm thành t ế bào v ỡ ra và các protein đ ược gi ải phóng. Trong một số trường hợp, các tế bào đ ược chuy ển v ề tr ạng thái đông lạnh trước khi được nghiền bằng những máy nghiền mẫu trong phòng thí nghiệm. 2. Sử dụng sắc ký cột trong tinh chế protein Phương pháp chiết xuất và tinh sạch protein ph ổ bi ến nhất là sắc ký c ột. Trong trường hợp này, các phân đoạn protein đ ược cho ch ạy qua c ột nh ồi b ằng các hạt agarose hoặc polyacrylamit nhỏ được cải biến cho phù h ợp. Có m ột s ố phương án khác nhau trong việc sử dụng cột tách chi ết và tinh s ạch protein. Các quy trình khác nhau được thiết lập có thể khác nhau do đ ặc tính khác nhau của các loại protein. Ở đây mô tả ba phương pháp. Trong hai ph ương pháp đ ầu, protein được phân lập dựa vào kích thước và tính tích đi ện c ủa chúng. Tóm t ắt về các phương pháp này được nêu trên hình 14. Sắc ký trao đổi ion: Trong phương pháp này, các phân t ử protein đ ược phân l ập dựa trên điện tích ion hóa bề mặt của chúng b ằng vi ệc s ử dụng các v ật li ệu làm
cột là các hạt mang các nhóm chức tích đi ện âm ho ặc d ương (đây còn đ ược g ọi là pha tĩnh). Các phân tử protein tương tác yếu v ới các h ạt (ch ẳng h ạn nh ư m ột phân tử protein tích điện dương được cho chạy qua c ột mang các h ạt tích đi ện âm) sẽ được hồi lưu khi sử dụng một dung dịch muỗi loãng ch ảy qua c ột sau đó (dung dịch chạy mẫu được gọi là pha động). Các phân t ử t ương tác v ới pha động càng mạnh, càng cần dung dịch hàm l ượng mu ối cao đ ể h ồi l ưu m ẫu (b ởi muối làm "trung hòa" các vùng mang điện tích và vì vậy cho phép các phân t ử protein được giải phóng khỏi cột. Bằng việc tăng d ần n ồng đ ộ mu ối trong các dung dịch đệm thu hồi mẫu, các phân t ử protein khác nhau, k ể c ả các phân t ử có đặc tính tích điện gần giống nhau cũng được phân tách thành các phân đo ạn khác nhau khi chúng được hồi lưu từ cột. Sắc ký lọc gel: Kỹ thuật này cho phép phân tách các lo ại protein trên c ở s ở đ ặc điểm khác nhau của các loại protein về hình dạng và kích thước. Khác v ới trong kỹ thuật sắc ký trao đổi ion, các hạt được sử dụng để nh ồi c ột trong k ỹ thu ật này không mang các nhóm tích điện mà thay vào đó là mang các l ỗ có kích thước khác nhau. Các phân tử protein càng nh ỏ càng có nhi ều kh ả năng thâm nhập vào tất cả các lỗ; vì vậy, thời gian chạy qua cột dài h ơn và th ời gian h ồi
lưu muộn hơn. Ngược lại, các phân tử protein kích th ước càng l ớn càng có th ời gian hồi lưu (chạy qua toàn bộ cột) sớm hơn. Đối với mỗi loại cột, các phân đoạn sắc ký đ ược thu ở các n ồng đ ộ mu ối khác nhau hoặc ở các thời gian hồi lưu khác nhau để thu đ ược t ừng lo ại protein đ ược quan tâm nghiên cứu. Các phân đoạn có hoạt tính protein đ ược quan tâm cao nhất sẽ được tích lũy và tiến hành tinh sạch bổ sung. Độ tinh sạch của sản phẩm protein sẽ tăng lên khi các phân đo ạn protein đ ược chạy qua nhiều cột sắc ký khác nhau. Thông th ường m ột c ột sắc ký đ ơn l ẻ không đủ để tinh sạch được một loại phân tử protein mong mu ốn nào đó dù quá trình sắc ký được lặp đi lặp lại nhiều lần, thay vào đó ng ười ta th ường ph ải áp dụng một chuỗi các bước kỹ thuật để có thể thu được một phân đo ạn ch ứa m ột lượng lớn loại protein cần quan tâm nghiên cứu. Ch ẳng hạn nh ư, dù có r ất nhi ều phân tử protein được hồi lưu trong dung d ịch mu ối đậm đặc t ừ c ột tích đi ện dương (đối với protein tích điện âm) hoặc được hồi lưu trong s ắc ký l ọc gel (đ ối với các protein kích thước tương đối nhỏ), các kỹ thuật này đ ơn l ẻ th ường không đủ để thu được một sản phẩm protein được tinh sạch hoàn toàn. 3. Sắc ký ái lực hỗ trợ quá trình tinh chế protein Các đặc tính đặc trưng của từng loại protein có th ể được t ận d ụng đ ể giúp tinh sạch loại protein tương ứng được thuận tiện và hi ệu quả h ơn. Gi ả s ử, n ếu chúng ta biết một loại protein khi hoạt động liên k ết đ ặc hi ệu v ới ATP, thì có th ể dùng cột sắc ký mang vật liệu gắn kết ATP để phân tách protein đó. Ch ỉ có protein liên kết với ATP mới được cột giữ lại, và cho phép hầu h ết các lo ại protein không liên kết với ATP được chảy trôi qua c ột. K ỹ thu ật tinh s ạch này được gọi là sắc ký ái lực. Có nhiều hợp chất khác nhau có thể đ ược s ử d ụng đ ể gắn kết với cột và giúp quá trình tinh sạch protein d ễ dàng và hi ệu qu ả h ơn. Các hợp chất này bao gồm cả các trình tự ADN (để tinh sạch protein liên k ết ADN) hoặc thậm trí là một loại protein để tinh sạch một loại protein khác đ ược bi ết hoặc được mong đợi có tương tác phân tử với loại protein trên. Nh ư v ậy, đ ể b ắt đầu tinh sạch một loại protein nào đó, cần ph ải có nh ững hi ểu bi ết c ơ b ản v ề loại protein đó và tìm cách khai thác, ứng dụng các đ ặc tính có nó cho quá trình tách chiết và tinh sạch. Một dạng rất phổ biến của sắc ký ái lực là sắc ký ái l ực mi ễn d ịch. Trong phương pháp này, người ta gắn kháng thể đ ặc hiệu v ới protein đích lên v ật li ệu làm cột sắc ký. Trong trường hợp lý t ưởng, loại kháng th ể này ch ỉ liên k ết đúng với loại protein cần quan tâm còn cho phép tất cả các lo ại protein khác ch ảy trôi qua cột. Loại protein liên kết sau đó s ẽ đ ược thu h ồi (h ồi l ưu) b ằng cách s ử dụng dung dịch muối hoặc đôi khi là các dung d ịch chất t ẩy nh ẹ ch ảy qua c ột. Khó khăn cơ bản gặp phải đối với phương pháp này là đôi khi liên k ết gi ữa kháng thể và protein khá bền vững đến mức phải gây bi ến tính protein m ới thu hồi được sản phẩm. Trong khi khác với ADN, protein sau khi bi ến tính th ường không có khả năng hồi tính, vì vậy protein thu được theo cách này nhi ều khi ở dạng không hoạt động chức năng và mất đi giá trị sử dụng trong nghiên c ứu.
Để tăng hiệu quả tinh sạch, các protein cũng có th ể đ ược cải biến. Nh ững c ải biến này có thể là sự bổ sung các trình tự axit amin ngắn ho ặc là vào đ ầu C hoặc vào đầu N của phân tử protein cần phân tích. Nh ững b ổ sung này, hay còn gọi là Ptrình tự đánh dấu có thể tạo ra được bằng công nghệ ADN tái t ổ h ợp. Các trình tự peptit đánh dấu giúp thay đổi thu ộc tính c ủa m ột phân t ử protein mong muốn và giúp tinh chế protein này dễ dàng h ơn. Ví d ụ nh ư, đ ối v ới m ột s ố protein người ta tiến hành bổ sung một chu ỗi g ồm 6 histidin giúp nh ững protein này liên kết với Ni2+ gắn trên cột chặt hơn và dễ phân tách h ơn, trong khi thu ộc tính này thường không có ở phần lớn các loại protein khác. Ngoài ra vi ệc s ử dụng các epitop đặc hiệu (thường là một trình tự peptit có 5 - 7 axit amin đ ặc hiệu xác định kháng nguyên) cũng có thể được gắn vào phân t ử protein c ần tinh chế. Các cải biến này cho phép tinh sạch các loại protein trên c ơ s ở nguyên t ắc sắc ký ái lực miễn dịch và sử dụng dị kháng nguyên mang các epitop đ ược b ổ sung. Điều đặc biệt là, các kháng thể và epitop này có th ể thay đ ổi tính liên k ết kháng thể tùy thuộc vào điều kiện khác nhau của môi trường (ch ẳng hạn, ái l ực tăng khi không có Ca2+, và ái lực gi ảm khi có Ca2+). Đi ều này cũng giúp làm giảm ảnh hưởng của các yếu tố gây biến tính khác. Nguyên tắc sắc ký ái lực miễn dịch cũng có thể được dùng để làm k ết t ủa nhanh một loại protein đặc hiệu nào đó (và mọi loại protein liên k ết ch ặt v ới nó) từ một dịch chiết thô. Trong trường hợp này, phản ứng kết t ủa thu đ ược do kháng thể được gắn vào cùng loại hạt được sử dụng trong sắc ký cột. Do các hạt này có kích thước lớn, nên chúng lắng rất nhanh xu ống đáy ống nghi ệm mang theo các kháng thể và protein liên k ết v ới chúng. K ỹthu ật này đ ược g ọi là kỹ thuật kết tủa miễn dịch, cũng là một kỹ thuật ngày càng s ử dụng ph ổ bi ến để tinh sạch nhanh protein hoặc phức hệ protein t ừ các d ịch chi ết thô. M ặc dù nếu chỉ sử dụng phương pháp này riêng rẽ, hiếm khi thu đ ược sản ph ẩm protein được tinh sạch hoàn toàn, song phương pháp này th ường rất hi ệu qu ả đ ể xác định các loại phân tử protein và các hợp chất khác (ví dụ như ADN) có t ương tác với một loại protein đích nào đó. 4. Phân tích protein trên gel polyacrylamid Các loại protein thường không mang điện tích âm đ ồng đều hay có c ấu trúc b ậc hai đồng nhất. Thay vào đó, chúng được tạo ra từ 20 loại axit amin khác nhau, một số chúng không mang điện tích, một số mang đi ện tích âm, còn m ột s ố mang điện tích dương. Ngoài cấu trúc bậc hai, protein ho ạt đ ộng còn có các c ấu trúc bậc ba, bậc bốn điển hình. Tuy vậy, nếu các protein đ ược x ử lý v ới các ch ất tẩy ion hóa mạnh như SDS (sodium dodecyl sulphat) và m ột h ợp ch ất kh ử, ví d ụ như mercapthoethanol, thì các cấu trúc bậc 2, và 4 c ủa phân t ử protein s ẽ b ị phá vỡ. Nghĩa là, sau khi xử lý với SDS, protein tr ở thành d ạng phân t ử polymer không có cấu trúc. Đồng thời, SDS tạo thành lớp vỏ ion và làm phân t ử protein trở nên tích điện âm đồng đều hơn. Mecarptoethanol thì làm gi ảm các liên k ết disulphit hình thành giữa các tiểu phần cystein. Kết qu ả là, n ếu các phân t ử ADN và ARN được gây biến tính bởi SDS và mercaptoethanol, thì s ự phân tách của các loại phân tử protein trong điện di chủ yếu là do s ự khác bi ệt v ề tr ọng lượng và kích thước phân tử. Sau khi điện di, các phân tử protein đ ược nhu ộm
với các thuốc nhuộm liên kết protein như Coomassie brilliant blue và quan sát. Khi không có SDS, điện di vẫn có thể phân tách được các loại protein, nh ưng lúc này còn có các yếu tố khác nhau của các lo ại protein là tr ọng l ượng phân t ử, tổng điện tích và điểm đẳng điện (xem dưới đây). 5. Định tính protein dựa trên phương pháp th ẩm tách miễn d ịch (immunoblotting) Mặc dù có bản chất khác ADN và ARN, việc xác định sự có m ặt c ủa m ột loại protein trong số các protein có trong mẫu sinh h ọc theo nguyên t ắc g ần gi ống với các phương pháp thẩm tách (còn gọi là lai) Southern và Northern (t ương ứng với trường hợp của ADN và ARN). Tuy vậy, đối với protein, ph ương này đ ịnh tính này dựa trên dựa trên nguyên tắc mi ễn d ịch đ ặc thù c ủa protein nên còn được gọi là phương pháp thẩm tách miễn dịch (immunoblotting) hay ph ương pháp thẩm tách (lai) Western. Trong phương pháp th ẩm tách mi ễn d ịch, các phân tử protein sau khi được phân tách trên đi ện di đ ược chuy ển và g ắn lên màng. Màng này sau đó được ủ trong một dung d ịch ch ứa kháng th ể đ ặc hi ệu với loại protein tinh sạch được quan tâm nghiên cứu. Kháng th ể s ẽ tìm th ấy lo ại protein tương ứng ở trên màng lọc và gắn vào. Cu ối cùng, b ằng vi ệc s ử d ụng phản ứng enzym hiện màu, người ta có thể quan sát đ ược v ị trí kháng th ể liên kết trên màng. Như vậy, tất cả các phương pháp lai Southern, Northern và Western đều có điểm chung là sử dụng các hợp chất chọn lọc đ ể quan sát s ự có mặt của một hoặc một số loại phân tử đặc thù trong các hỗn hợp phức t ạp. 6. Giai trình tự trực tiếp protein Mặc dù có cấu tạo phức tạp hơn so với ADN và ARN, các phân t ử protein cũng có thể giải trình tự trực tiếp, tức là việc xác định thành ph ần và th ứ t ự c ủa các axit amin trên chuỗi polypeptit. Có hai ph ương pháp đ ược s ử d ụng ph ổ bi ến h ơn cả là: 1) phương pháp biến tính dman và 2) phương pháp kh ối ph ổ k ế ti ếp. Kh ả năng xác định được trình tự protein có ý nghĩa quan trong trong trong nhi ều nghiên cứu về hệ protein học (proteomics) và hệ gen h ọc (genomics). B ởi vì v ới việc xác định được dù chỉ là một trình tự ngắn của các axit amin c ủa m ột phân tử protein nào đó, chúng ta có thể xác đ ịnh đ ược gen mã hóa cho protein đó trên cơ sở đối chiếu với khung đọc mở có trong hệ gen c ủa nhi ều loài v ốn đã đ ược giải mã hoàn toàn hoặc gần như hoàn toàn nhưng nh ưng ch ưa bi ết đ ầy đ ủ v ề chức năng của nhiều gen. Phương pháp biến tính dman là một phản ứng hóa học trong đó các ti ểu ph ần axit amin được giải phóng lần lượt từ đầu N c ủa chu ỗi polypeptit. Đi ểm m ấu chốt của phương pháp này là axit amin ở t ận cùng đ ầu N c ủa m ột chu ỗi polypeptit có thể được cải biến khi xử lý với phenylisothyocyanate (PTC) d ẫn đến sự thay đổi ở gốc a-amino. Axit amin đ ược cải biến này sau đó đ ược c ắt r ời khỏi chuỗi polypeptit khi xử lý với axit trong đi ều ki ện không làm phá h ủy ph ần còn lại của chuỗi polypeptit. Việc xác định trình tự các axit amin đ ược ti ến hành dựa trên thứ tự hồi lưu của từng axit amin đ ược cắt kh ỏi chu ỗi b ằng k ỹ thu ật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (high performance liquid chromatography), nh ờ đặc điểm từng loại axit amin có thời gian hồi lưu đặc trưng. M ỗi m ột vòng gây
biến đổi axit amin và cắt khỏi chuỗi polypeptit nh ư vậy t ạo ra m ột chu ỗi polypeptit và một nhóm a-amino. Với việc lặp đi, lặp l ại ph ản ứng c ắt axit amin này sẽ cho phép xác định được trình tự ở đầu N của một chu ỗi polypeptit. Trong thực tế, chu kỳ gây biến tính như vậy được l ặp đi l ặp l ại t ừ 8 - 15 l ần đ ể xác định protein. Số chu kỳ như vậy thông thường là đ ủ đ ể xác đ ịnh đ ược m ột lo ại đặc protein thù nào đó. Phương pháp giải mã trình tự tự động dựa trên nguyên lý biến tính dman là một phương pháp hiệu quả và cũng đã đ ược sử d ụng r ộng rãi. Tuy v ậy kỹ thuật này gặp trở ngại khi đầu N tận cùng của phân t ử protein b ị cải bi ến v ề mặt hóa học (ví dụ như bởi các nhóm acetyl ho ặc formyl), mà hi ện t ượng này thì vốn có thể xảy ra tự nhiên trong điều kiện in vivo, hoặc trong quá trình tách chi ết và tinh sạch protein. Để khắc phục hiện tượng này, ng ười ta có thể s ử d ụng protease để cắt chuỗi polypeptit và phân tích trình t ự bên trong chu ỗi. Phương pháp khối phổ kế tiếp (MS/MS) có thể được dùng đ ể xác đ ịnh các vùng trình tự protein khác nhau. Khối phổ là phương pháp xác đ ịnh chính xác kh ối lượng của các các phân tử nhỏ. Một cách vắn tắt phương pháp này đ ược mô t ả như sau: phân tử cần phân tích được cho bay qua m ột thi ết b ị (trong đi ều ki ện chân không) trong điều kiện t ốc độ di chuy ển c ủa nó t ương quan v ới t ỉ s ố kh ối lượng / điện tích. Trên cơ sở này người ta có th ể đo đ ược th ời gian bay c ủa phân tử và xác định được khối lượng của nó. Đ ối với các phân t ử sinh h ọc có kích thước nhỏ như các chuỗi peptit và các phân t ử protein nh ỏ, thì tr ọng l ượng phân tử của nó có thể xác định chính xác đến t ừng Dalton. Để xác định khối lượng phân tử protein bằng phương pháp MS /MS, tr ước tiên phân tử protein thường được cắt thành các đoạn peptit có trình t ự ng ắn (th ường dưới 20 axit amin) nhờ sử dụng enzym đặc hiệu, ch ẳng h ạn nh ư trypsin. H ỗn hợp các đoạn peptit này sau đó được đưa vào phân tích kh ối ph ổ và chúng phân tách nhau ra dựa trên tỉ số khối lượng / điện tích. Các đoạn peptit riêng r ẽ sau đó sẽ bị bắt giữ và phân đoạn thành các chuỗi peptit thành ph ần. Kh ối l ượng của mỗi peptit thành phần được xác định b ằng ph ổ kh ối nh ư minh h ọa trên hình 15. Sự kết hợp các dữ liệu về khối lượng của các đoạn peptit thành ph ần sẽ cho biết trình tự rõ ràng của phân tử protein ban đầu. Cũng gi ống nh ư trong ph ương pháp biến tính dman, việc xác định được trình tự của của khoảng 15 axit amin là đủ để so sánh với trình tự protein được luận ra từ các trình t ự ADN đã đ ược gi ải mã.
Kỹ thuật MS /MS thực sự là một kỹ thuật có tính cách mạng trong việc xác đ ịnh và giải trình tự protein. Trong phương pháp này, thông th ường ch ỉ c ần m ột lượng mẫu nhỏ và hơn hết là có thể phân tích h ỗn h ợp nhi ều lo ại protein đ ồng thời. 7. Hệ protein học (proteomics) Việc phát triển của các kỹ thuật giải mã trình t ự ADN, k ết h ợp v ới các ph ương pháp tách chiết, tinh sạch và phân tích trình tự protein đã m ở đ ường cho s ự hình thành một chuyên ngành mới gọi là hệ protein h ọc. H ệ protein h ọc (proteomics) là chuyên ngành nghiên cứu về toàn b ộ tập h ợp protein đ ược m ột mô, t ế bào hoặc cơ thể tạo ra trong các điều kiện đặc thù, phân tích m ức đ ộ ph ổ bi ến c ủa từng protein và sự tương tác của chúng với nhau và với các phân t ử khác (ví d ụ như ADN) trong quá trình hoạt động của tế bào. N ếu nh ư các k ỹ thu ật phân tích vi dãy phản ứng (microarray) có thể giúp nhận bi ết đ ược sự bi ểu hiện c ủa các gen trên cở sở phân tích hệ gen, thì các k ỹ thuật proteomics cho phép xác đ ịnh được hình ảnh tổng thể về toàn bộ vốn protein của một tế bào, mô hoặc c ơ thể. Hệ protein học được dựa trên ba phương pháp cơ bản: đi ện di hai chi ều trên gel polyacrylamid để tiến hành phân tách các protein, kh ối ph ổ đ ể xác đ ịnh kh ối lượng phân tử và định tính protein (hoặc các đoạn peptit t ừ phân t ử protein đó), và sinh tin học để đối chiếu các phân tử protein và các đoạn peptit v ới các trình
tự mã hóa của chúng trong hệ gen. Một tế bào riêng l ẻ th ường ít nhất t ạo ra hàng nghìn loại protein khác nhau, trong khi vi ệc s ử d ụng đ ơn l ẻ ph ương pháp điện di truyền thống trên gel polyacrylamid thường không đ ủ đ ể phân l ập và tách biệt các protein này. Vì vậy, như tên gọi của nó, ph ương pháp đi ện di hai chiều cho phép phân tách các phân tử protein trên gel đi ện di theo hai chi ều được thực hiện kế tiếp nhau. Trong bước thứ nhất, các phân tử protein được phân đo ạn d ựa trên đi ểm đ ẳng điện của chúng (theo nguyên tắc hội t ụ đ ẳng đi ện). Theo nguyên t ắc này, khi một gradient pH được tạo ra từ đầu này đến đầu kia c ủa bản đi ện di, thì t ại v ị trí pH tương ứng làm trung hòa điện tích của một phân t ử protein s ẽ làm các phân tử protein tập trung (hội tụ) tại vị trí đó. Trong b ước th ứ hai, các phân t ử protein tại điểm hội tụ được tiếp tục phân tách trên cơ sở khối lượng và kích thước c ủa chúng khi di chuyển trên trường điện di polyacrylamid đã đ ược gây bi ến tính b ởi SDS như mô tả ở trên. Do các phân t ử protein được đ ồng th ời phân tách d ựa trên hai thuộc tính (điểm đẳng điện và trọng l ượng phân t ử), nên hàng nghìn lo ại protein khác nhau có thể được phân tách khỏi nhau trong m ột thí nghi ệm duy nhất. Sau khi được phân đoạn theo phương pháp đi ện di hai chi ều, m ỗi lo ại protein riêng biệt sẽ được đưa vào phân tích khối phổ để xác đ ịnh chính xác khối lượng phân tử. Như đã nói ở trên, để tăng hi ệu qu ả phân tích, thông th ường protein được cắt thành các đoạn peptit nhỏ nhờ sử dụng protease thay cho vi ệc phân tích phân tử protein ở dạng nguyên vẹn có phân t ử l ượng l ớn và c ấu trúc phức tạp. Kỹ thuật phân tích MS /MS cho phép giải trình t ự chi ti ết c ủa các đo ạn peptit và xác định phân tử protein. Cuối cùng các dữ liệu về trình tự hệ gen hoàn ch ỉnh c ủa m ột c ơ th ể và các trình tự peptit từ các loại protein được quan tâm nghiên c ứu s ẽ đ ược đ ưa vào phân tích bằng các phần mềm sinh tin học để có thể xác đ ịnh đ ược m ột trình t ự mã hóa đặc thù trong hệ gen tương ứng với lo ại protein có ch ức năng đ ược quan tâm nghiên cứu. Như vậy, các nghiên cứu h ệ gen h ọc (genomics) và h ệ protein học (proteomics) có mối quan hệ chặt chẽ trong các nghiên c ứu di truy ền h ọc phân tử.