Phát hiện một số trường hợp đột biến lặp đoạn Exon 2 xảy ra trong quá trình sao chép gen Dystrophin ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne

Chia sẻ: Sunshine_3 Sunshine_3 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

66
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) và bệnh loạn dưỡng cơ Becker (BMD) là bệnh di truyền thần kinh cơ phổ biến nhất, với xuất độ khoảng 1/3.500 trẻ trai sinh sống(7). Bệnh do đột biến gen dystrophin (gen DMD) gây ra. Đây là gen lớn nhất ở người nằm dài 2400kb ở vị trí Xp21.2, gồm 79 exon mã hóa 14 kb mRNA(1,8,15). Thông tin chi tiết về gen được phổ biến tại www.dmd.nl. Bệnh nhân DMD thường bị nhược cơ xuất hiện sớm từ 2 – 3 tuổi, tiến triển nhanh, mất khả năng đi lại và chết ở...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phát hiện một số trường hợp đột biến lặp đoạn Exon 2 xảy ra trong quá trình sao chép gen Dystrophin ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne

TCNCYH 34 (2) - 2005 Ph¸t hiÖn mét tr−êng hîp ®ét biÕn lÆp ®o¹n exon 2 x¶y ra trong qu¸ tr×nh sao chÐp gen dystrophin ë bÖnh nh©n lo¹n d−ìng c¬ Duchenne. TrÇn V©n Kh¸nh 1 Vµ T¹ Thµnh V¨n 2 1 , ViÖn C«ng nghÖ sinh häc, Trung t©m Khoa häc tù nhiªn vµ C«ng nghÖ Quèc gia 2 , Bé m«n Hãa-Hãa sinh, Tr−êng §¹i häc Y khoa Hµ néi. Gen dystrophin lµ mét gen cã cÊu tróc rÊt dµi, ®iÒu nµy ®· lµm cho qu¸ tr×nh phiªn m· cña gen trë nªn phøc t¹p h¬n, ®Æc biÖt lµ ë ®Çu gen 5’. Trong nghiªn cøu nµy chóng t«i c«ng bè mét bÖnh nh©n lo¹n d−ìng c¬ Duchenne cã ®ét biÕn lÆp ®o¹n exon 2. §iÒu rÊt ®¸ng chó ý lµ ®ét biÕn nµy kh«ng xuÊt hiÖn ë ADN (genome). ChÝnh v× vËy, chóng t«i gi¶ thiÕt r»ng ®©y lµ kÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh trans-splicing x¶y ra trong qu¸ tr×nh sao chÐp cña gen dystrophin. Nguyªn nh©n vµ c¬ chÕ cña hiÖn t−îng nµy ch−a ®−îc biÕt râ rµng vµ hiÖn ®ang ®−îc tiÕp tôc nghiªn cøu. I. §Æt vÊn ®Ò sequence). GÇn ®©y ng−êi ta chøng minh r»ng mét sè nhãm c¸c protein tham gia Duchenne lµ mét lo¹i bÖnh g©y nªn do vµo qu¸ tr×nh nhËn biÕt SES gãp phÇn ®ét biÕn gen dystrophin. §©y lµ mét gen quan träng trong qu¸ tr×nh hoµn thiÖn c¸c lín cã chiÒu dµi kho¶ng 3000 kb, n»m tiÒn mARN. Mét sè nghiªn cøu ®· chøng trªn nhiÔm s¾c thÓ X, m· hãa 14 kb minh r»ng trong qu¸ tr×nh nµy, ®ét biÕn mARN lµ hîp phÇn cña 79 exon [1, 2]. thªm ®o¹n th−êng gÆp h¬n c¶ so víi mét H¬n 90% tr×nh tù gen lµ tæ hîp c¸c intron, sè ®ét biÕn kh¸c. Cho ®Õn nay mét vµi mét vµi intron cã chiÒu dµi rÊt lín ®iÓn exon ®−îc sao chÐp l¹i tõ intron cña gen h×nh lµ intron 2 (kho¶ng 157 kb). T¹i ®©y dystrophin ®· ®−îc c«ng bè nh− exon X, th−êng x¶y ra mét sè lçi trong qu¸ tr×nh exon 2a vµ exon 3a. C¸c exon nµy lÇn hoµn thiÖn c¸c tiÒn mARN. Mét trong c¸c l−ît ®−îc sao chÐp tõ intron 1, 2, 3 vµ kh©u cña qu¸ tr×nh hoµn thiÖn tiÒn mARN hîp nhÊt ®Ó t¹o ra cÊu tróc mARN cña lµ c¾t bá c¸c intron vµ ghÐp nèi c¸c exon dystrophin [3, 7]. Trans- splicing lµ mét l¹i víi nhau. Qu¸ tr×nh nµy ®ßi hái mét sè hiÖn t−îng Ýt ®−îc biÕt ®Õn h¬n trong qu¸ tr×nh tù quan träng n»m ë ®Çu 5’ tËn tr×nh hoµn thiÖn c¸c tiÒn mARN. Trong (acceptor splicing site), 3’ (donor splicing nghiªn cøu nµy chóng t«i c«ng bè mét site) vµ t¹i vÞ trÝ nh¸nh cña intron (branch bÖnh nh©n lo¹n d−ìng c¬ Duchenne cã consensus site). Ngoµi ra qu¸ tr×nh nµy ®ét biÕn lÆp ®o¹n exon 2. §iÒu rÊt ®¸ng cßn cÇn mét sè vïng tr×nh tù kh¸c n»m chó ý lµ ®ét biÕn nµy kh«ng xuÊt hiÖn ë trong exon bao gåm vïng giµu base ADN. ChÝnh v× vËy, chóng t«i gi¶ thiÕt purine (purine-rich region), vïng t¨ng r»ng ®©y lµ kÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh trans- c−êng qu¸ tr×nh ghÐp nèi (splicing splicing x¶y ra trong qu¸ tr×nh sao chÐp enhancer sequence- SES) vµ vïng tr×nh cña gen dystrophin. tù nhËn biÕt exon (exon recognition 12
II. §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p ®Þnh tr×nh tù, s¶n phÈm ph¶n øng PCR ®· nghiªn cøu ®−îc c¾t ra vµ tinh chÕ tõ gel sau ®ã ®−îc ®−a vµo vector t¹o dßng PT7-blue 2.1. §èi t−îng (Novagen). Tr×nh tù gen ®−îc x¸c ®Þnh BÖnh nh©n DMD ®−îc chÈn ®o¸n dùa b»ng m¸y ®äc tr×nh tù tù ®éng (model vµo nh÷ng triÖu chøng l©m sµng vµ cËn 373A, Applied Biosystems, Foster City, l©m sµng ®iÓn h×nh: yÕu c¬ cã tÝnh chÊt California, USA). tiÕn triÓn, ph× ®¹i c¬ c¼ng ch©n, mÊt kh¶ III. KÕt qu¶ n¨ng ®i l¹i ë tuæi 12, nång ®é CK t¨ng cao trong m¸u ngo¹i vi vµ sinh thiÕt c¬ cã 3.1. Ph¶n øng khuÕch ®¹i cADN tõ h×nh ¶nh ®iÓn h×nh cña bÖnh. exon 1 ®Õn exon 4 2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu Sö dông kü thuËt PCR víi 20 cÆp måi kh¸c nhau chóng t«i ®· khuyÕch ®¹i toµn ADN ®−îc t¸ch chiÕt tõ m¸u ngo¹i bé chiÒu dµi cADN cña gen dystrophin. biªn theo qui tr×nh phenol/chloroform KÕt qu¶ cña ph¶n øng PCR ®· cho thÊy: chuÈn. §Ó x¸c ®Þnh ®ét biÕn xãa ®o¹n, ë vïng 5’ cña gen nµy cã 2 v¹ch t−¬ng lÆp ®o¹n hay thªm ®o¹n ë møc ®é ADN, øng víi 2 s¶n phÈm PCR cã kÝch th−íc ph−¬ng ph¸p Southern blot ®· ®−îc tiÕn lín h¬n b×nh th−êng. Sù thay ®æi nµy gîi hµnh dùa theo quy tr×nh cña mét b¸o c¸o ý cã sù ®ét biÕn thªm ®o¹n t¹i vïng gen tr−íc ®©y [2]. mARN tæng sè ®−îc t¸c t¹i ®Çu 5’. Víi môc ®Ých ®Þnh vÞ chÝnh x¸c chiÕt tõ m¸u ngo¹i biªn vµ tæng hîp vïng ®ét biÕn, chóng t«i ®· sö dông thªm cADN theo kü thuËt cña Chomczynsky mét cÆp måi kh¸c khuyÕch ®¹i vïng gen [4]. §Ó x¸c ®Þnh mét sè ®ét biÕn bÊt nhá h¬n kÐo dµi tõ exon 1 ®Õn exon 4, th−êng x¶y ra trong qu¸ tr×nh phiªn m·, sau ®ã ch¹y ®iÖn di trªn gel víi nång ®é 20 cÆp måi kh¸c nhau ®· ®−îc sö dông. agarose cao (3%) nh»m môc ®Ých ph©n Toµn bé chiÒu dµi gen dystrophin ®−îc t¸ch c¸c s¶n phÈm PCR. Hai s¶n phÈm khuyÕch ®¹i tõ cADN b»ng ph¶n øng PCR ®−îc x¸c ®Þnh cã kÝch th−íc lµ 387 polymerase chain reaction (PCR). Thªm bp vµ 287 bp (h×nh 1a). Tr×nh tù cña c¸c vµo ®ã mét cÆp måi víi chiÒu xu«i bæ nucleotide cña s¶n phÈm PCR nµy ®· xung víi exon 1 (1C: 5’- kh¼ng ®Þnh r»ng ®Çu 3’ cña exon 2 g¾n ATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAG-3’) vµ trùc tiÕp víi ®Çu 5’ cña mét exon 2 kh¸c chiÒu ng−îc bæ xung víi exon 4 (c4r: 5’- g©y ra hiÖn t−îng lÆp mét ®o¹n cña exon GTTCAGGGCAGAAGTCTTG-3’) ®· nµy, bªn c¹nh ®ã 162 bp cña exon X ®−îc sö dông ®Ó ®Þnh vÞ râ rµng h¬n ®ét còng ®−îc x¸c ®Þnh. §o¹n nµy n»m gi÷a biÕn lÆp ®o¹n ë vïng 5’ tËn. S¶n phÈm exon 1 vµ exon 2 (h×nh 1b). cña ph¶n øng PCR ®−îc ®iÖn di trªn gel agarose víi nång ®é tõ 2-3%. §Ó x¸c 13
A 1c-c4r C P Mk 1 X 2 2 3 4 387bp 1 2 2 3 4 287 bp } 2 s¶n phÈm PCR cña bÖnh nh©n. S¶n phÈm PCR 1 2 3 4 225 bp } b×nh th−êng t−¬ng øng víi B mÉu ®èi chøng. Exon 1 Exon X Exon 2 Exon 2 H×nh 1: A, S¶n phÈm khuyÕch ®¹i cña cADN kÐo dµi tõ exon 1 ®Õn exon 4. Hai s¶n phÈm (387 vµ 287 bp) ®−îc khuyÕch ®¹i tõ mÉu cADN cña bÖnh nh©n (dßng P), c¶ 2 s¶n phÈm nµy ®Òu cã kÝch th−íc lín h¬n so víi mÉu ®èi chøng ( 225 bp - dßng C); C, mÉu ®èi chøng cña ng−êi b×nh th−êng; P, bÖnh nh©n. Mk: Marker Hae III-digested ¤ 174 phage ADN. B, Tr×nh tù cña vïng ®ét biÕn lÆp ®o¹n exon 2 (gi:M18533) vµ exon X (gi: 306722) ë ®Çu 5’ tËn cña gen dystrophin. H×nh bªn tr¸i: Tr×nh tù ®Çu 3’ cña exon 1 g¾n trùc tiÕp víi ®Çu 5’ cña exon X; H×nh bªn ph¶i: Tr×nh tù ®Çu 3’ cña exon 2 g¾n trùc tiÕp víi ®Çu 5’ cña mét exon 2 kh¸c. 3.2. KÕt qu¶ ph¶n Southern blot x¸c Southern blot mµ chØ x¸c ®Þnh ®−îc ë ®Þnh ®ét biÕn trªn ADN sö dông ®o¹n møc ®é mARN (transcript). KÕt qu¶ dß Bgl II Southern blot cña s¶n phÈm lai t¹o exon 2 ®· cho thÊy: mét v¹ch lai t¹o duy nhÊt Exon 2 lÆp ®o¹n ë ®Çu 5’ cña gen cã kÝch th−íc t−¬ng øng víi kÝch th−íc dystrophin ®· ®−îc x¸c ®Þnh trªn mét cña s¶n phÈm b×nh th−êng (h×nh 2A). KÕt bÖnh nh©n DMD. HiÖn t−îng lÆp ®o¹n qu¶ m« t¶ vÞ trÝ x¸c ®Þnh bëi ®Çu dß Bgl II nµy kh«ng x¸c ®Þnh ®−îc ë ADN ®−îc diÔn d¶i ë h×nh 2B. (genome) cña tÕ bµo b»ng kü thuËt 13
A B 1 2 1 X 2 3 4 Ex 4 (12.8 kb) 2 Ex 2 (6 kb) 1 2 3 4 Ex 3 (3 kb) 1 X 2 2 3 4 1 X 2 2 3 4 1 2 2 3 4 1 2 3 4 H×nh 2. A, KÕt qu¶ lai t¹o cña ph¶n øng Southern blot sö dông ®o¹n dß Bgl II. Dßng 1: s¶n phÈm lai t¹o cña bÖnh nh©n; Dßng 2: s¶n phÈm lai t¹o cña mÉu ®èi chøng. B, Qu¸ tr×nh trans-splicing. Ba m« h×nh trans-splicing cña gen dystrophin ®−îc chØ dÉn b»ng c¸c dßng kÎ kh¸c nhau. IV. Bµn luËn ®· cã thÓ x¶y ra ë vïng 5’ . §Ó ®Þnh vÞ râ h¬n vïng ®ét biÕn, chóng t«i sö dông ViÖc ph©n tÝch khëi ®Çu b»ng kü thuËt thªm mét cÆp måi kh¸c nh»m môc ®Ých Southern blot. Tuy nhiªn ®ét biÕn vÉn khuyÕch ®¹i vïng gen nhá h¬n kÐo dµi tõ ch−a ®−îc x¸c ®Þnh cô thÓ do kü thuËt exon 1 ®Õn exon 4, sau ®ã ch¹y ®iÖn di nµy chØ dõng ë møc ®é ph©n tÝch ADN. trªn gel víi nång ®é agarose cao ®Ó cã Theo nhiÒu b¸o c¸o ®−îc tæng kÕt tõ thÓ ph©n tÝch mét c¸ch chÝnh x¸c c¸c s¶n tr−íc ®Õn nay th× nhiÒu tr−êng hîp ®ét phÈm PCR. KÕt qu¶ cho thÊy hai s¶n biÕn kh«ng x¶y ra ë ADN mµ ph¸t sinh phÈm PCR ®−îc x¸c ®Þnh cã kÝch th−íc lµ trong qu¸ tr×nh sao chÐp do nhiÒu nguyªn 387 bp vµ 287 bp. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh nh©n kh¸c nhau [3, 6, 7]. §Ó nghiªn cøu tù nucleotide cña c¸c s¶n phÈm PCR nµy s©u h¬n ë møc ®é mARN, b»ng ph¶n øng ®· chØ ra r»ng ®Çu 3’ cña exon 2 g¾n trùc PCR chóng t«i ®· dïng 20 cÆp måi kh¸c tiÕp víi ®Çu 5’ cña mét exon 2 kh¸c g©y nhau khuyÕch ®¹i toµn bé chiÒu dµi cña ra hiÖn t−îng lÆp mét ®o¹n cña exon nµy, gen dystrophin tõ cADN. KÕt qu¶ PCR ®· bªn c¹nh ®ã 162 bp cña exon X còng cho thÊy mét ®o¹n gen ë vïng 5’ tËn cã 2 ®−îc x¸c ®Þnh. §o¹n nµy n»m gi÷a exon v¹ch t−¬ng øng víi 2 s¶n phÈm PCR cã 1 vµ exon 2. Tr×nh tù cña exon X ®· ®−îc kÝch th−íc lín h¬n b×nh th−êng. §iÒu nµy b¸o c¸o tr−íc ®©y bëi Roberts 1993 [6]. cho phÐp chóng t«i ®−a ra gi¶ thuyÕt r»ng §©y lµ mét pseudoexon vµ ®−îc coi nh− ®ét biÕn thªm ®o¹n hoÆc lÆp l¹i ®o¹n gen lµ mét hiÖn t−îng b×nh th−êng trong qu¸ 13
tr×nh sao chÐp vµ hoµn thiÖn ®Ó t¹o ph¸t hiÖn ë tÕ bµo gan chuét bëi mARN tr−ëng thµnh cña gen dystrophin. Caudevilla [3]. T¸c gi¶ nµy ®· ph¸t hiÖn Trong nghiªn cøu nµy, exon 2 lÆp ra r»ng rÊt nhiÒu d¹ng mARN kh¸c nhau ®o¹n ë ®Çu 5’ cña gen dystrophin ®· cña gen cartidine octanoyltransferase cã ®−îc x¸c ®Þnh trªn mét bÖnh nh©n ®−îc hiÖn t−îng lÆp ®o¹n cña exon 2 hay exon chÈn ®o¸n lµ DMD. §iÒu ®¸ng chó ý lµ 2 vµ 3 mµ kh«ng x¸c ®Þnh ®−îc ë ADN. hiÖn t−îng lÆp ®o¹n nµy kh«ng x¸c ®Þnh Cho ®Õn nay hiÖn t−îng nµy còng ®· ®−îc ë ADN b»ng kü thuËt Southern blot ®−îc t×m thÊy trªn gen cña ng−êi, Fluriot mµ chØ x¸c ®Þnh ®−îc ë møc ®é mARN. ®· t×m thÊy hiÖn t−îng lÆp ®o¹n cña exon KÕt qu¶ Southern blot cho thÊy s¶n phÈm 1a ë vïng 5’ cña gen estrogen receptor-¸ lai t¹i exon 2 cã mét v¹ch duy nhÊt cã mµ hiÖn t−îng nµy còng kh«ng ®−îc x¸c kÝch th−íc t−¬ng øng víi kÝch th−íc cña ®Þnh ë ADN b»ng Southern blot [5]. Cho s¶n phÈm b×nh th−êng. Tõ ®ã, chóng t«i ®Õn hiÖn nay, trans-splicing ®· ®−îc cã thÓ kÕt luËn r»ng hiÖn t−îng lÆp ®o¹n chøng minh lµ mét hiÖn t−îng x¶y ra kh¸ cña exon 2 ë ®Çu 5’ tËn cña gen phæ biÕn. Tuy nhiªn nguyªn nh©n vµ c¬ dystrophin lµ do hiÖn t−îng trans-splicing chÕ cña hiÖn t−îng nµy vÉn ch−a ®−îc x¶y ra trong qu¸ tr×nh sao chÐp cña gen. biÕt râ rµng vµ hiÖn vÉn ®ang ®−îc c¸c Trans-splicing lµ mét hiÖn t−îng x¶y ra nhµ khoa häc tiÕp tôc quan t©m nghiªn trong qu¸ tr×nh hoµn thiÖn c¸c tiÒn cøu. mARN. S¶n phÈm cña qu¸ tr×nh nµy ph¸t Tµi liÖu tham kh¶o sinh tõ 2 s¶n phÈm tiÒn mARN cña 1. TrÇn V©n Kh¸nh vµ T¹ Thµnh dystrophin, trong ®ã 2 ®o¹n mARN lµ s¶n V¨n. BÖnh lo¹n d−ìng c¬ Duchenne vµ phÈm cña c¸c qu¸ tr×nh sao chÐp kh¸c Becker: §Æc ®iÓm l©m sµng vµ c¬ chÕ nhau ®−îc ghÐp nèi víi nhau ®Ó t¹o ra sinh häc ph©n tö. T¹p chÝ th«ng tin Y häc mét s¶n phÈm míi 2004 (®· göi ®¨ng) HiÖn t−îng trans-splicing cña gen nµy 2. Ahn, A.H., and Kunkel, L. M. The lÇn ®Çu tiªn ®· ®−îc t×m thÊy trªn loµi structural and functional diversity of khuÈn trypanosomes [8] vµ nã ®· ®−îc dystrophin. Nat. Genet. 3, 283-291, coi nh− lµ mét hiÖn t−îng kh¸c th−êng (1993). cña qu¸ tr×nh sao chÐp. TiÕp sau ®ã nã ®−îc ph¸t hiÖn trªn mét sè lo¹i giun trßn 3. Caudevilla, C., Serra, D., Miliar, (nematodes) vµ tÕ bµo thùc vËt. §iÒu nµy A., Codony, C., Asins, G., Bach, M., chøng tá r»ng ®©y lµ mét hiÖn t−îng kh¸ Hegardt, F. G. Natural trans-splicing in phæ biÕn vµ x¶y ra t¹i rÊt nhiÒu m« kh¸c carnitine octanoyltransferase pre-mARNs nhau. ë thêi ®iÓm ®ã, mét sè nhµ khoa in rat liver. Proc Natl Acad Sci U S A 95, häc ®· nghÜ r»ng qu¸ tr×nh trans-splicing 12185-12190, (1998). cã thÓ cung cÊp cho hä nh÷ng ý t−ëng ®Ó 4. Dwi Pramono, Z. A., Takeshima, nghiªn cøu mét sè liÖu ph¸p ®iÒu trÞ míi Y., Surono, A., Ishida, T., Matsuo, M. nÕu hiÖn t−îng nµy chØ x¶y ra ë mét sè tæ Novel criptic exon in intron 2 of the chøc nhÊt ®Þnh, ®Æc biÖt nÕu kh«ng x¶y ra human dystrophin gene evolved from an trªn ng−êi vµ ®éng vËt cã vó. Tuy nhiªn intron by acquiring consensus sequences trans-splicing sau ®ã l¹i tiÕp tôc ®−îc for splicing at different stages of 13
anthropoid evolution. Biochem biophys 7. Suminaga, R., Takeshima, Y., Res Commun 267, 321-328, (2000). Adachi, K., Yagi, M., Nakamura, H., 5. Fluriot, G. Natural trans-spliced Matsuo, M. A novel cryptic exon in intron mARNs are generated from the human 3 of the dystrophin gene was estrogen receptor-alpha (hER alpha) incorporated into dystrophin mARN with a gene. J Biol Chem. 277, 26244-26251, single nucleotide deletion in exon 5. J (2002). Hum Genet 47, 196-201, (2002). 6. Roberts, R. G., Bentley, D. R., 8. Sutton, R. E., Boothroyd, J. C. Bobrow, M. Infidelity in the structure of Evidence for trans-splicing in ectopic transcripts: a novel exon in trypanosomes. Cell 47, 527-535, (1986). lymphocyte dystrophin transcripts: Hum Mutat 2, 293-299, (1993). Summary Repeating exon 2 mutation caused by trans-splicing dystrophin gene in Duchenne muscular dystrophin (DMD) patient The Dystrophin gene is the largest human gene, mutations in this gene cause Duchenne muscular dystrophin (DMD) disease. This is complex genomic unit exhibiting many errors splicing during mARN process. More than 10 alternative splicing products have been identified in the 5’ region of the dystrophin gene. In this study, two dystrophin transcripts including one containing exon 2 and exon X duplications, other one containing single exon 2 duplication were identified in peripheral blood lymphocytes of DMD case. Interestingly, genomic Southern blot analysis ruled out the hypothesis of duplication of dystrophin at exon 2. Therefore, these data suggested that exon 2 duplication transcripts were likely generated by trans-splicing event that occurring during the mARN maturation in which RNA segments of two independent transcripts are spliced together to generate a new mARN species. However, the mechanisms modulating the trans-splicing activity of the dystrophin exon 2 remain to be clarified. 14