SÁNG KIẾN KINH NGHIỆM "XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ BỨA BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP"

Chia sẻ: Hoàng Hiệp | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

362
lượt xem 142
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa khô được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Lá tươi và vỏ quả bứa khô được chiết với nước ở nhiệt độ 127 0C thời gian 30-60 phút dưới áp suất 0,15 MPa. Đồng thời, vỏ quả bứa khô được chiết bằng dung môi (axeton và metanol) trong bộ chiết soxhlet ở nhiệt độ 75 0C trong thời gian 8 giờ. Mẫu được bơm vào máy sắc kí lỏng cao áp cùng với axit photphoric 0,01 M và metanol với tốc độ dòng là 0,7 ml/phút sử dụng đetectơ 210 nm. ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: SÁNG KIẾN KINH NGHIỆM "XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ BỨA BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP"

XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ BỨA BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP DETERMINATION OF ORGANIC ACIDS FROM LEAVES, RIND FRUITS OF GARCINIA OBLONGIFOLIA CHAMP. EX BENTH. BY HIGH- PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ĐÀO HÙNG CƯỜNG Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng ĐẶNG QUANG VINH HV Cao học khoá 2004-2007 TÓM TẮT Axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa khô được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Lá tươi và vỏ quả bứa khô được chiết với nước ở nhiệt độ 127 0C thời gian 30-60 phút dưới áp suất 0,15 MPa. Đồng thời, vỏ quả bứa khô được chiết bằng dung môi (axeton và metanol) trong bộ chiết soxhlet ở nhiệt độ 75 0C trong thời gian 8 giờ. Mẫu được bơm vào máy sắc kí lỏng cao áp cùng với axit photphoric 0,01 M và metanol với tốc độ dòng là 0,7 ml/phút sử dụng đetectơ 210 nm. Axit hữu cơ chủ yếu trong lá, vỏ quả bứa khô được tìm thấy là axit (-) hyđroxy xitric hàm lượng lần lượt là 2,863 và 15,221 %. Phần axit còn lại trong lá, vỏ quả bứa là lượng nhỏ axit xitric. Đây là kết quả đầu tiên xác định thành phần các axit hữu cơ từ bứa (Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.). ABSTRACT Organic acids in fresh leaves and dried rinds fruits of Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth were determined by high-performance liquid chromatography. Fresh leaves and dried rinds fruits were extracted with water at 127 °C for 30-60 min under 0,15 MPa pressure. Also, dried rinds were extracted with solvents (acetone and methanol) using a Soxhlet extractor at 75 °C for 8 h each. The samples were injected to HPLC under gradient elution with 0.01 M phosphoric acid and methanol with a flow rate of 0.7 mL/min using UV detection at 210 nm. The major organic acid was found to be (-)-hydroxycitric acid present in leaves and rinds fruits to the extent of 2.863 and 15.221%, respectively. Citric acids is present in leaves and rinds fruits in minor quantities. This is the first report on the composition of organic acids from Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth. 1. Mở đầu Trong một vài năm gần đây, các cấu tử có khối lượng nhỏ và phức tạp được chiết từ nhiều loài bứa (Garcinia Cowa, Garcinia cambogia, Garcinia indica, Garcinia antroViridis) trong đó có axit (-)-hyđroxy xitric (HCA; 1,2-di hydroxy propan-1,2,3 tri cacboxylic axit; hình 1), lacton của (-) axit hydroxy citric (hình 1)) có tính sinh học lý thú đã gây chú ý đối với các nhà hoá sinh các bác sỹ chuyên khoa sức khoẻ. Đó là khả năng điều chỉnh quá trình tổng hợp axit béo, sự hình thành lipit, sự ngon miệng, và giảm cân. Đồng phân của (-)-HCA đã góp phần lớn trong lĩnh vực dược học như tác nhân có vai trò quan trọng trong mục đích giảm cân, bảo vệ tim mạch, H H hiệu chỉnh trạng thái bất bình thường của các lipid, và khả năng chịu đựng trong luyện tập thể thao [3] [4] [5] HO C COOH C COOH [6]. Vỏ quả bứa có tính săn da và hơi đắng, mát, hơi HO C COOH HO C COOH độc, có tác dụng tiêu viêm, hạ nhiệt, làm săn da, hàn O vết thương; trị: Loét dạ dày, loét tá tràng; Viêm dạ dày H C COOH H C C=O ruột, kém tiêu hoá; Viêm miệng, bệnh cặn răng; Ho ra H H máu. Dùng ngoài trị bỏng, mụn nhọt, sâu quảng, eczema, dị ứng mẩn ngứa, rút các vết đạn đâm vào H× 1: CÊu tróc cña (-) axit hydroxy citric nh vµ lacton cña (-) axit hydroxy citric
thịt; Lá bứa có vị chua thường được dùng thái nhỏ nấu canh chua; Hạt có áo hạt chua, ăn được, cũng dùng nấu canh chua. Nhựa bứa dùng trị bỏng [1]. Các nghiên cứu chiết tách nguồn HCA chỉ thực hiện trên các loài bứa của Ấn Độ. Vì vậy, sự khám phá axit hữu cơ trong cây bứa tại Việt Nam là hết sức cần thiết, cây bứa có tên khoa học là Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth., thuộc họ Bứa (họ măng cụt) - Clusiaceae. Bài báo này trình bày phương pháp chiết tách, xác định thành phần axit hữu cơ chính có trong lá, vỏ quả bứa và các thông số vật lý khác. 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu Lá, vỏ quả của cây bứa (Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.) tại xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, TP. Đà Nẵng và từ thành phố Hồ Chí Minh. Nguyên liệu nghiên cứu lá, vỏ quả bứa được chuẩn bị theo sơ đồ ở phần 2.2.1. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu Lá bứa: loại bỏ lá già, lá sâu, rửa sạch, hong khô tiến hành đo độ ẩm và thực hiện chiết tách axit theo sơ đồ sau. Quả bứa: loại bỏ quả hư, dập, quả chưa chín, rửa sạch, hong khô, tách bỏ phần ruột quả, cắt nhỏ tiến hành xác định độ ẩm và sấy khô ở nhiệt độ 80 0C, xoay nhỏ làm nguyên liệu để chiết tách axit theo 02 phương pháp ở sơ đồ sau. Lá: Vỏ quả khô: Phương pháp 1: Phương pháp 2: 2.2.2. Phương pháp chiết tách 10 g mẫu (cắt nhỏ) + 100 mL nước 10 g mẫu + 150 mL nước 25 g mẫu+axeton hoặc etanol (150 mL) Chưng ninh trong nồi áp suất: Lá, vỏ quả bứa tươi hoặc khô được cắt nhỏ rồi cho vào cốc thuỷ tinh 500 pml, chưng ninh trong nồi áp suấặpở áp suất 0,15 MPa, nhiệt độ lặ lt Nồi áp suất 0,15 MPa, 30 phút Nồi áp suất 0,15 MPa, 60 phút 127 oC trong thời gian 30-60 phút và lặp lại 02 lần để chiếạintách hết lượng axit hữu c8 giờ lại 01 l 01 Chiết Soxhlet ở 75 C trong 0 lần t lầ ơ có trong mẫu với dung môi là nước. Chiết soxhlet: Vỏ quả bứa khô bằng vảnhỏ cho vào bộ chiết soxhlet tiến hành chiết ở Lọc bằng vải muslin Lọc xoay i muslin nhiệt độ 75 oC, trong vòng 8 giờ với dung môi là axeton hoặc methanol. ọc bằng giấy lọc và cô đặc L Trộn lẫn dịch 02 lần chiết +ương pháp trọng ộn lẫn dịch 02 lần chiết + 4g than 2.2.3. Ph 4g than Tr lượng hoạt tính: ngâm trongkhoảng 10g lá, vỏ quả tBứa tươi cho vào 30' c thuỷ tinh đã được sấy khô và biết Cân nước ấm 30' hoạ tính: ngâm trong nước ấm cố Etanol và axeton chiêt hòa tan trong khối lượng chính xác. Cho cốc thuỷ tinh có chứa lá, vỏ quả Bứa vào tủ sấnước + sấthan hoạt oC. 20mL y và 4g y ở 80tính Sau khi sấy khoảng 3 giờọctaằng giấy ốc than cho tính bình hút ẩm cho đến khi cốc thuỷ Lọc bằng giấy lọc, than hoạt tính L, b lấy c lọc, ra hoạt vào được rửa ngun vớh15n thì tiến hành cân ược rửa 02ốin lvới 15 mL nước cân phân tích. Sau đó, cứ khoảng 30 tinh 02 lầ ội i ẳ mL nước đ tính kh lầ ượng trên và lọc lại nước rửa và lọc lại nước rửa phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lượng giữa hai lnầnc cân liên vàếp Ngâm trong ướ ấm 30 phút ti lọc bằng giấy lọc, than hoạt tính được rửa là không đổi hay có sai số khoảng 0.005g thì dừng quá trình sấy. 02 lần với 10 mL nước. Trộn lẫn dịch lọc a vàocô đặt kết quả thu đượlẫn tach lọc và rửa, cô đặt ối lượng lá, vỏ quả Bứa trước và sau Dự và100mLcác rửa, Trộn c, dị tính được kh đến 20mL, xử lý với etanol đến 50mL, xử lý với 100mL etanol đểkhi sấy.kTtừ a hết pectin. 15 phút để ế tủ đó, ta tính được độ ẩm15 phút đa kết tủa hết pectin. c sau: để lá dự ể vào công thứ m0 − m1 Dịch chiết góp chung thành 50 mL H= .100 (chuẩn độ, chạy HPLC, IR) Ly tâm 10 phút, tách phần dịch nổi và kết tủa riêng. Phần kết tủa rửa m Phần kết tủa rửa Ly tâm 10 phút, tách phần dịch nổi và kết tủa riêng. 02 lần với 20mL etanol và ly tâm để ộ ẩm (%); m 0:với 20mL ượng látâm đểc Trong đó: H: đ 02 lần khối l etanol và ly hoặ vỏ quả tươi trước khi sấy (g); m 1: khối lthuượng axit.hoặc vỏ quả sau khi sấy (g).i hết axit. hồi hết lá thu hồ 2.2.4. Phương pháp chuẩn độ [2] Trộn các dịch Xác địnhếhàm lượng axit Trộn các ố ch nổi, côlá,cvỏ quả bứa theo tiêu chuẩn TCVN 4589- nổi, cô đặc đ n thể tổng s dị trong đặ đến thể tích 50 mL và lưu giữ ở 40C đến khi 88. (chuẩn độ, chạy HPLC, sử dụng tích 50 mL và lưu giữ ở 40C đến khi sử dụng (chuẩn độ, chạy HPLC, Nhỏ NaOH 0,1N từ buret xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững. IR). IR).
Tính kết quả: Độ axit toàn phần theo phần trăm (X1) tính bằng công thức: Vcd 100 X 1 = K.n. . V P trong đó: n: số ml NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ V ml dịch thử; Vcd: thể tích mẫu cô đặc; P: trọng lượng mẫu thử, tính bằng gam; K: hệ số của loại axit, K = 0,006904. 2.2.5. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học bằng quang phổ (IR) Các phân tử luôn dao động không ngừng. Tần số dao động của các phân tử phụ thuộc vào hằng số lực của liên kết và khối lượng của chúng, do đó các nhóm chức khác nhau sẽ có tần số hấp thụ khác nhau nằm trong vùng từ 5000 – 200 cm-1. Mỗi nhóm nguyên tử (nhóm chức) xác định có tần số xác định và không đổi trong bất kỳ hợp chất nào có chứa nhóm nguyên tử đó. Vì vậy, khi phân tích trên quang phổ hồng ngoại ta có thể xác định được các nhóm nguyên tử mà chất đem phân tích có được. 2.2.6. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) [3] [4] Chất chuẩn là (-)-Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate, cung cấp bởi hãng Sigma-Aldrich, công thức C12H10Ca3O16.xH2O. Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate (50 mg) cho vào cốc 50-mL chứa 5.0 mL nước, và xử lý với 500 mg Dowex 50 [H+]. Hỗn hợp được khuấy trong thời gian 10 phút sử dụng khấy từ. Tách lấy phần dung dịch, và nhựa được rửa với nước có pH trung tính. Nước rửa và dung dịch dược trộn lẫn và làm thành 25 mL, khuấy trộn, và lọc sử dụng giấy lọc. Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10 ppm đến 320 ppm. Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit xitric cho HPLC: Dung dịch chuẩn axit xitric được chuẩn bị riêng biệt có nồng độ từ 2 đến 30 ppm sử dụng nước cất 3 lần cất. HPLC phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp được sử dụng để nghiên cứu gồm máy sắc kí lỏng cao áp hãng Knauer trang bị với bơm loại low pressure hãng Knauer, và lắp cột sắc kí Knauer C18: 250 mm x 4,6 ID x 5µm. Bộ tổng hợp dung môi: quaternary LP Gradient, hãng Knauer. Quá trình dò được thực hiện bằng đetectơ Knauer UV: khoảng bước sóng 190-740 nm. Pha động gồm (A) metanol MeOH và (B) là axit photphoric 0,01 M với tốc độ dòng 1,5 ml/m. Quá trình tách các pic tốt khi chất A trong B thay đổi từ 10-30% trong thời gian 0-25 phút, 90% A trong B trong thời gian 30 phút, sau 5 phút cân bằng với 90% A. Chất chuẩn và mẫu được lọc qua Millipore lọc 0,45 µm và tiêm vào HPLC. Xây dựng đường chuẩn: Phương pháp xây dựng đường chuẩn được thực hiện bằng cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 10-320 ppm HCA tự do được tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải được thực hiện như phần thảo luận ở trên, và kết quả thu được các diện tích pic. Đường cong HCA được vẽ dựa trên biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện tích pic (trung bình của 03 lần chạy). Tương tự, đường chuẩn của axit xitric được tiêm vào HPLC, được thực hiện như cách thảo luận trên, và kết quả thu được các diện tích pic. Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đường chuẩn được xác định dựa vào nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này tính từ giá trị giới hạn dưới (LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ). Xác định giá trị giới hạn: Giá trị giới hạn (LOQ) được định nghĩa như nồng độ thấp nhất của HCA mà có thể xác định với độ tin cậy và chính xác
chiết bằng methanol tỉ lệ 1:50. Thể tích của mỗi mẫu được tiêm vào HPLC là 20 µL, HCA, axit xitric thu được trực tiếp dựa vào diện tích pic, bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng đường chuẩn. Nồng độ của HCA và axit xitric trong mẫu được trình bày bằng g/100 g mẫu. Phương pháp chuẩn độ axit-bazơ có thể sử dụng để xác định axit hữu cơ trong dịch chiết, phương pháp này giúp ta xác định được tổng lượng axit có trong dịch chiết. Tuy nhiên, trong phương pháp này không thể định lượng axit (-) hyđroxy xitric và axit xitric một cách riêng biệt. Ta cũng có thể xác định các axit bằng phương pháp sắc kí khí, trong phương pháp sắc kí khí ta phải sấy mẫu. Nhưng axit HCA sẽ bị lacton hoá khi có tác nhân nhiệt. Trong phương pháp sắc kí lỏng cao áp, ta có thể định lượng HCA và các axit hữu cơ khác mà không cần phải cô đặc, sấy, hoá hơi dung dịch chiết. Đây là điểm thuận lợi để có thể định lượng (-)-HCA và các axit hữu cơ một cách riêng biệt. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả xác định độ ẩm trong lá vỏ quả bứa Kết quả xác định độ ẩm trong lá, vỏ quả bứa được trình bày trong bảng 1 sau đây: Bảng 1. Kết quả xác định độ ẩm trong lá, vỏ quả Bứa Mẫu Stt Khối lượng lá Khối lượng lá sau Khối lượng nước Độ ẩm mẫu trước khi sấy (g) khi sấy (g) trong lá (g) (%) 1 9.726 2.789 6.937 71.32 Lá bứa 2 9.96 2.898 7.062 70.9 3 10.172 3.022 4.17 70.49 Vỏ 1 10.6012 1.6767 8.9245 84.18 quả 2 9.7521 1.547 8.2051 84.14 bứa 3 10.5966 1.6458 8.9508 84.47 Từ kết quả trên cho thấy độ ẩm trong lá Bứa tươi khoảng 70,70 ± 0,62 %, độ ẩm trung bình trong lá là 70,70 %. Độ ẩm trong lá Bứa cao, chiếm khoảng 70% khối lượng lá. Độ ẩm trong vỏ quả bứa khoảng 84,31 ± 0,16 %, độ ẩm trung bình trong vỏ quả là 84,31 %. Độ ẩm trong vỏ quả bứa là rất cao, chiếm khoảng 84 % khối lượng vỏ quả. 3.2. Kết quả xác định cấu trúc bằng phổ hồng ngoại (IR) Kết quả chụp phổ IR cho thấy xuất hiện pic có bước sóng từ 3300 – 3600 cm -1, đó là phổ dao động của nhóm –OH có liên kết hiđro, và pic có bước sóng từ 1600 – 1800 cm -1, là phổ của nhóm C=O trong nhóm – COOH (hình 2, 3). 0.65 0.60 0.24 0.55 0.22 0.50 0.20 0.45 0.18 0.40 0.16 Absorbance 0.35 0.14 Absorbance 0.30 0.12 0.25 0.10 0.20 0.08 0.15 0.06 0.10 0.04 0.05 0.02 0.00 0.00 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavenumbers (cm-1) Wavenumbers (cm-1) Hình 2: Phổ IR mẫu vỏ quả bứa chiết trong Hình 3: Phổ IR mẫu lá bứa chiết trong nước nước
Từ những phổ hồng ngoại trên, có thể kết luận trong mẫu chiết từ nước của lá và vỏ quả bứa có sự tồn tại của axit hữu cơ có nhóm –OH. 3.3. Kết quả xác định axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa Bảng 2: So sánh axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC và phương pháp chuẩn độ Axit hữu cơ xác định bằng HPLC (g/100 g) Mẫu Dung môi chiết HCA Axit xitric Chuẩn độ axit-bazơ (g/100g) Lá bứa Nước 2,863 0 3,554 Vỏ quả bứa Nước 15,221 0,406 17,468 khô Vỏ quả bứa Axeton 12,999 0,239 13,711 khô Vỏ quả bứa Metanol 9,508 0,078 10,492 khô Số mẫu n=3, kết quả tính trung bình Thành phần axit hữu cơ xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp và phương pháp chuẩn độ được thể hiện trong bảng 2. Tổng axit xác định bằng phương pháp chuẩn độ axit-bazơ có kết quả lớn hơn tổng axit xác định bằng HPLC. Từ bảng trên cho thấy, chiết bằng dung môi nước cho lượng axit là lớn nhất, tiếp đến là axeton và metanol. Giá trị thu được chủ yếu của phương pháp HPLC được tính đến chỉ là HCA, bởi vì giá trị thu được từ diện tích pic của HCA lớn nhất. Axit chủ yếu được tìm thấy trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC là HCA, được thể hiện trên sắc kí đồ hình 5, 6, 7, 8. Pic thứ yếu được xác định là pic của axit xitric. Trên sắc kí đồ, HCA cho pic đơn trong tất cả các mẫu chiết. Riêng đối với mẫu lá bứa chiết trong nước không xuất hiện pic của axit xitric. Xác định pic HCA được dựa vào pic của axit HCA chuẩn xuất hiện ở thời gian lưu là 4,939 phút, tương tự pic của axit xitric xác định nhờ pic axit chuẩn xuất hiện ở thời gian lưu là 5,623 phút (hình 4). Thời gian lưu của HCA và axit xitric được tìm thấy trong tất cả các mẫu lần lượt là 4,992 ± 0,065, 5,609 ± 0,010 phút. Đường chuẩn được xác định bằng cách thay đổi nồng độ của 05 mẫu chuẩn. Đường chuẩn được xây dựng với nồng độ từ 10 đến 320 ppm, phương trình đường chuẩn: C = 1,37A-6,88 với A là diện tích pic của HCA, C là nồng độ HCA, hệ số tương quan R2=0,999698. Hình 4. Sắc kí đồ mẫu axit HCA và axit xitric chuẩn Hình 5. Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong metanol
Hình 6: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong nước Hình 7: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong axeton Hì nh 8: Sắc kí đồ mẫu lá bứa chiết trong nước
4. Kết luận Bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) đã xác định được hàm lượng axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa. Kết quả cho thấy axit (-) hyđroxy xitric là thành phần axit chủ yếu có trong lá, vỏ quả bứa. Hàm lượng HCA tìm thấy trong lá, vỏ quả bứa khô là khá cao, cụ thể HCA trong lá, vỏ quả bứa khô lần lược là 2,863 và 15,221 %. Từ kết quả này có thể tiếp tục nghiên cứu sâu để sản xuất thực phẩm chữa trị béo phì từ cây bứa Việt nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. [2] TCVN 4589-88: Đồ hộp-Phương pháp xác định hàm lượng axit tổng số và axit bay hơi. [3] Bhabani S. Jena, Guddadarangavvanahally. Jayaprakasha, Kunnumpurath K. Sakariah*. (2002), "Organic Acids from Leaves, Fruits, and Rinds of Garcinia cowa", Journal of Agricultural and Food chemistry, Vol 50, No. 12, 2002. [4] Jayaprakasha GK, Sakariah KK. (2002 Apr 15), "Determination of organic acids in leaves and rinds of Garcinia indica (Desr.) by LC", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 28(2):379-84. [5] Jena BS, Jayaprakasha GK, Singh RP, Sakariah KK. (2002 Jan 2), "Chemistry and biochemistry of (-)-hydroxycitric acid from Garcinia", Journal of Agricultural and Food chemistry, 50(1):10-22. [6] Shara M, Ohia SE, Schmidt RE, Yasmin T, Zardetto-Smith A, Kincaid A, Bagchi M, Chatterjee A, Bagchi D, Stohs SJ. (2004 May), "Physico-chemical properties of a novel (-)-hydroxycitric acid extract and its effect on body weight, selected organ weights, hepatic lipid peroxidation and DNA fragmentation, hematology and clinical chemistry, and histopathological changes over a period of 90 days", Molecular and Cellular Biochemistry, 260(1-2):171-86.