Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

14
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án "Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam" là phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam; Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn làm cơ sở đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀO THỊ THANH XUÂN NGHIÊN CỨU CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI: 2021 1
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học 1. PGS.TS Lê Thanh Hà 2. PGS.TS. Phí Quyết Tiến Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi : ……giờ, ngày……tháng ….. năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường ĐHBK Hà Nội 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam 2
1. Tính cấp thiết của luận án Cellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật, là nguyên liệu sinh học dồi dào nhất trên trái đất. Không những thế vật liệu cellulose và hemicellulose còn là phụ phấm, phế thải của ngành nông nghiệp và nhiều ngành nghề khác. Việc xử lý nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm làm nguyên liệu sản xuất trong các lĩnh vực khác như công nghiệp giấy, sản xuât ethanol, sản xuất thức ăn gia súc và đặc biệt sản xuất nhiên liệu sinh học đã và đang là tiềm năng vô cùng to lớn. Việt Nam, cho đến nay, hơn 100 loài mối khác nhau đã được mô tả. Tuy nhiên, việc phân lập các vi sinh vật có khả năng phân giải lignocellulose với mục đích khai thác chủng vi sinh vật phân lập từ ruột mối trong phân giải lignocellulose cũng như khai thác hệ gen của chúng chưa được nghiên cứu. Chính vì lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam” Với mục đích phân lập, tuyển chọn và đánh giá được đa dạng vi khuẩn phân giải cellulase từ ruột mối. Đồng thời thông qua giải trình và phân tích hệ gen vi khuẩn để đánh giá tiềm năng phân giải các vật liệu cellulose của vi khuẩn ruột mối. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam - Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn làm cơ sở đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được 3. Nội dung nghiên cứu (1) Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh cellulase từ ruột mối (2) Định tên một số vi khuẩn phân lập được từ ruột mối (3)Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ hai vi khuẩn lựa chọn (4)Thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn lựa chọn và xác định đặc tính CMCase của chế phẩm (5)Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của một chủng vi khuẩn (6)Sử dụng dịch enzym thô từ hai vi khuẩn lựa chọn để thủy phân vật liệu giàu cellulose 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học (1) Luận án đã cung cấp số liệu về việc phân lập một số chủng vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối Việt Nam. (2) Đã khảo sát được các điều kiện thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn từ ruột mối (3) Lần đầu tiên giải trình tự toàn bộ hệ gen của chủng vi khuẩn từ ruột mối Cellulosimicrobium cellulans và phân tích chi tiết các gen liên quan đến phân giải lignocellulose từ đó đánh giá được tiềm năng của chủng. 1
(4) Bước đầu khảo sát được khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn ruột mối trên lignocellulose của rơm Ý nghĩa thực tiễn: (1) Góp phần đánh giá sự đa dạng của hệ vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối cũng như áp dụng phân tích hệ gen trong khai thác tiềm năng phân giải lignocellulose của vi khuẩn ruột mối (2) Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy và có giá trị, là tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này 5. Những điểm mới của luận án - Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phân lập và thu nhận cellulase từ vi khuẩn ruột mối. - Là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn Cellulosimicrobium cellulans MP1 phân lập từ ruột mối để phân tích tiềm năng sinh cellulase và hemicellulase của chủng, thông qua đó dự đoán tiềm năng ứng dụng của chủng trong phân hủy lignocellulose 6. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 117 trang với 30 bảng số liệu, 36 hình và 02 sơ đồ với 120 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (03 trang), tổng quan (25 trang), nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (18 trang), kết quả và thảo luận (53 trang), kết luận và đề xuất nghiên cứu tiếp tục (01 trang), danh mục công trình công bố (01 trang), tài liệu tham khảo (9 trang). CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cellulase Phân loại cellulase, sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn, đặc tính cellulase 1.2. Mối Phân loại mối, hệ vi sinh vật và vi khuẩn trong ruột mối 1.3. Ứng dụng của cellulase trong xử lý lignocellulose Thành phần lignocellulose, hệ enzym phân giải lignocellulose, sự phối hợp tác động các enzym trong quá trình phân giải và ứng dụng cellulase trong phân giải lignocellulose 1.4. Ứng dụng giải trình tự genome phát hiện tiềm năng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase trong phân giải lignocellulose CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu mối Mối thu thập tại các thân cây gỗ, mía mục tại huyện Thanh Chương, Nghi Lộc, núi Quyết thành phố Vinh, các tổ mối tại khuôn viên trong trường Đại học Bách khoa Hà nội trong khoảng thời gian từ tháng từ 2014 -2016. 2.1.2. Các chủng vi khuẩn 2
Các chủng phân lập được lưu giữ trong glycerol 15% ở -20°C. Trong thời gian làm thí nghiệm, chủng được giữ ở 4ºC. 2.2. Thiết bị và hóa chất 2.2.1 Thiết bị Nồi hấp thanh trùng (Hirayama, Nhật Bản), Kính hiển vi chụp ảnh (Optia -Italia); Máy đo mật độ quang UV-VIS (BIOVUAVEII – Mỹ), Máy đo pH (PL-600-MRC - Israel); Các thiết bị và các phần mềm trong nghiên cứu sinh học phân tử… 2.2.2. Hóa chất Các hóa chất cao nấm men (Merk), CMC (Sigma), peptone (Merk), agar (Việt nam), cellulose thô (giấy lọc Whatman No1, Sigma), DNS (Trung Quốc), Congo đỏ (Trung Quốc)… 2.3. Các môi trƣờng nuôi cấy 2.3.1. Môi trƣờng làm giàu vi khuẩn sinh cellulase Môi trường M1: NaNO3 2,5g/l, KH2PO4 2g/l, CaCl2.6H2O 0,1g/l, NaCl 0,1g/l MgSO4: 0,2g/l, CMC 5g/l, hoặc giấy lọc 5g/l…. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phân lập và nghiên cứu đặc tính vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối. Phân lập theo sơ đồ tham khảo của Sreena và cộng sư 2.4.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp cellulase 2.4.3. Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm cellulase từ vi khuẩn ruột mối 2.4.4. Khảo sát khả năng thủy phân rơm sử dụng cellulase thu nhận từ vi khuẩn 2.4.5. Phƣơng pháp định tên vi khuẩn thông qua giải trình tự 16S rDNA 2.4.6. Phƣơng pháp giải trình tự hệ genom của Cellulosimicrobium cellulans MP1 và dự đoán gen chức năng 2.5. Các phƣơng pháp phân tich Xác định hoạt độ enzym, phân tích các thành phần nguyên liệu, phân tích các sản phẩm thủy phân Sơ đồ nghiên cứu của luận án 3
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột mối và tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase cao 3.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột mối và tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase cao Các mẫu mối được thu thập từ tổ mối trên cây gỗ và mía đã mục, trên thân cây ở các địa điểm khác nhau của các huyện Thanh Chương, Nghi Lộc thuộc địa bàn thành phố Vinh và trường Đại học Bách Khoa Hà nội (Bảng 2.1). Số lượng chủng phân lập từ các mẫu mối và khả năng tạo vòng thủy phân trên môi trường nhuôm congo 1% của các chủng phân lập đươc tổng hợp ở bảng 3.1. Bảng 3.1 Thống kê kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột mối Ký hiệu mẫu Số lượng Tỷ lệ D/d mối chủng phân ≤2 2-5 ≥5 lập 01 16 5 9 2 02 10 5 5 0 03 18 11 7 0 04 18 9 6 3 05 10 9 0 1 06 7 6 1 0 07 17 10 3 4 08 12 11 0 1 Tổng 108 66 31 11 Các chủng vi khuẩn phân lập từ các môi trường làm giàu có thành phần khác nhau cũng không giống nhau. Các mẫu mối 1, 2, 3, 4 được làm giàu cùng lúc trên 5 loại môi trường M1, M2, M3, M4 và M5 được tổng kết trên bảng 3.2. Bảng 3.2 Số lượng các chủng vi khuẩn phân lập được trên các môi trường làm giàu STT Môi trường Số chủng Tỷ lệ (%) Cơ chất Cơ chất làm giàu CMC giấy lọc 1 M1 16 25,81% 8 8 2 M2 13 20,97% 7 6 3 M3 19 30,65% 8 11 4 M4 8 12,90% 2 6 5 M5 6 9,68% 3 3 Tổng 62 28 34 4
Kết quả bảng 3.2, cho thấy các môi trường làm giàu M1 và M3 là môi trường khoáng nghèo dinh dưỡng cho số lượng chủng loại lớn hơn so với các môi trường còn lại. Bảng 3.3 Các chủng có tỷ lệ (D/d) cao được chọn lựa STT Cơ chất sử Mẫu mối Môi Tên chủng Tỷ số D/d dụng cho quá trường trình làm giàu làm giàu 1 CMC 01 M5 G4 10 2 05 M2 T2-11 8 3 06 M1 TM1-7-1 4,8 4 07 M1 D1-8 5 5 07 M1 D1-12 5,5 6 08 M2 CM2-4 6,6 7 04 M1 MP1 7,5 8 Giấy lọc 04 M3 MP3 6,5 9 Cơ chất tự 07 M6 CG2 4,8 10 nhiên cám gạo, 07 M6 CG4 5,0 11 đậu tương 07 M6 CG4-1-2- 6,3 Các chủng vi khuẩn có tỷ lệ đường kính vòng thủy phân cao tiếp tục được nuôi trên môi trường lỏng LB với cơ chất CMC và bã mía 0,5%, ở nhiệt độ 370C, lắc 150 rpm. Xác định hoạt độ enzym tương ứng 5
Hình 3.2 Hoạt độ enzym các chủng vi khuẩn từ ruột mối Các chủng lựa chọn có hoạt độ CMCase dao động trong khoảng từ 0,124 U/ml đến 0,752 U/mL. Các chủng phân lập được ngoài hoạt tính CMCase còn có hoạt tính các hoạt tính khác như FPU, β-glucosidase, acevilase và xylanase. 3.2. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng lựa chọn 3.2.1. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa Đặc điểm hình thái và đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn lựa chọn được tổng kết ở bảng 3.5.Sử dụng 2 loại kit là Kit 20E và Kit 50 CHB để xác định các đặc tính sinh hóa. Sau khi đã có bảng đặc tính của các chủng vi khuẩn chúng tôi tiếp tục phân tích trình tự 16S rDNA để định tên các vi khuẩn 3.2.2. Định tên các vi khuẩn ruột mối Bảng 3.6 Kết quả định tên các chủng vi khuẩn lựa chọn từ ruột mối STT Ký hiệu Định tên ID Phương chủng (API)/Mừc pháp định độ tương tên đồng trình tự (%) 1 CM2-4 Bacillus lentus 99.9 API 50CHB 2 CG2 Trabulsiella guamensis 99.63 16S rDNA 3 CG4 Klebsiella variicola 100 16S rDNA 4 CG4-1-2 Bacillus firmus 97.2 API 50CHB 5 T2-11 Bacillus sonorensis 100% 16S rDNA 6
Không tìm được độ tương API 50CHB đồng 6 TM1-7-1 Pseudomonas aeruginosa 99.9 16S rDNA 7 G4 Bacillus 99.7 API 50CHB subtilis/amyloliquefaciens Bacillus subtilis 97.14 16S rDNA 8 MP1 Cellulosimicrobium sp. 99.93 16S rDNA 9 MP3 Cellulosimicrobium funkei 100 16S rDNA Lựa chọn 2 chủng là Bacillus G4 và Cellulosimicrobium sp MP1 để nghiên cứu thu nhận cellulase và đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của chủng. 3.3. Nghiên cứu thu nhận cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis G4 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trƣờng và điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase 3.3.1.1. Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase 2 CMCase(U/ml) Hoạt độ 1 0 LB M1 M2 M6 Môi trường sinh tổng hợp Hình 3.3 Hoạt độ CMCase của chủng B. G4 trên các môi trường Kết quả hình 3.3 cho thấy M6 là môi trường thích hợp nhất cho quá trình sinh CMCase. 3.3.1.2 Ảnh hưởng của các thông số lên men đến hoạt độ CMCase 7
Hình 3.4. Ảnh hưởng của các thông số nuôi cấy đến hoạt độ CMCase của B. subtilis G4. Tỷ lệ giống (A), tốc độ lắc (B), Nhiệt độ (C) và pH môi trường (D). Hoạt độ enzym thu được đạt cao nhất khi tỷ lệ cấp giống 1%, tốc độ lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ môi trường nuôi cấy 37ºC, pH môi trương 7. Chủng vi khuẩn G4 được nuôi trong các điều kiện lựa chọn ở trên, thay đổi thời gian khác nhau để xác định thời điểm có hoạt độ CMCase cao nhất. Hoạt độ CMCase 5.00 (U/ml) 0.00 24h 48h 72h 96h Thời gian nuôi cấy (giờ) Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp CMCase từ vi khuẩn G4 Kết quả xác định hoạt độ ở các thời điểm khác nhau cho thấy với thời gian nuôi cấy là 72 giờ là thời gian thích hợp nhất cho quá trình sinh enzym từ vi khuẩn G4. 3.3.1.3. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase Hình 3.6 . Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A), nito (B) và bột đậu tương lên hoạt độ CMCase của B. subtilis G4 Hoạt độ CMCase được biểu diễn bằng mô hình bậc hai như sau: CMCase = 4,44 + 0,47A + 1,21B + 0,75C + 0,14AB – 0,11AC – 0,32BC – 0,62A2 – 0,24B2 - 0,45C2 8
Hình 3.7 Bề mặt đáp ứng của quá trình sinh tổng hợp CMCase từ B. subtilis G4 cho thấy sự tương tác giữa (a) Hàm lượng bột đậu tương và tinh bột . (b) Hàm lượng Casein và Tinh bột. (c) Hàm lượng bột đậu tương và casein. Kết quả tối ưu cho thấy hoạt tính CMCase cao nhất đạt được là 5,63 U/ml ở nồng độ casein 19,92g/l, nồng độ bột đậu tương 15,9 g/l và nồng độ tinh bột 19,52 g/l. Tại các giá trị tối ưu hoạt tính enzym tăng lên 1,68 lần so với trước tối ưu. Kết quả xác định hoạt độ FPU của dịch enzym thô sau tối ưu có hoạt độ đạt được là 0,113 ± 0,005 U/ml. Sự tăng hoạt độ CMCase trên môi trường sau tối ưu đã được kiểm chứng bằng vòng khuyếch tan đĩa thạch và zymogram (Hình 3.8). Hình 3.8 Zymogram (A) và vòng thủy phân (B) trên môi trường cám (1) và môi trường tinh bột (3) Kết quả xác định số lượng vi sinh vật cho thấy sự gia tăng mật độ tế bào lên gần 2 cơ số log là một trng những nguyên nhân dẫn đến sự gia tăng hoạt độ CMCase trên môi trường sau tối ưu 9
Hình 3.9. Kết quả xác định hoạt độ CMCase và mật độ tế bào trên môi trườngtrước và sau tối ưu 3.3.3. Thu nhận cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4 và xác định đặc tính của chế phẩm 3.3.3.1. Thu nhận chế phẩm cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4 Thu dịch enzym bằng ly tâm dịch nuôi cấy 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC. Kết tủa enzym bằng ammonium sulfate nồng độ 60% -80% bão hòa (Bảng 3.8) và acetone 60% -80% (Bảng 3.9). Bảng 3.9 Kết tủa cellulase bằng acetone Acetone Hoạt tính Tổng Hoạt độ Độ tinh Hiệu suất (%) tổng Protein riêng sạch thu (UI/ml) (mg/ml) (UI/mg) hồi(%) 50 0,65 2,35 0,29 3,63 31,40 60 1,32 4,16 0,32 4,0 63,77 70 1,56 4,60 0,34 4,25 75,36 80 1,73 4,90 0,35 4,38 83,57 Enzyme 2,070,01 25,300,36 0,0820,001 1 100 thô 3.3.3.2. Đặc tính của chế phẩm cellulase từ vi khuẩn B. subtilis G4 10
Hình 3.10 Nhiệt độ tối ưu của CMCase thu nhận từ G4 150 Hoạt độ CMCase còn 100 lại (%) 50 0 30 40 50 60 70 80 Nhiệt độ (°C) Hình 3.11 Độ bền của enzym bởi nhiệt độ Kết quả hình trên cho thấy cellulase từ vi khuẩn G4 có hoạt tính ổn định khi bảo quản dưới 50ºC, với nhiệt độ 60ºC trở lên hoạt tính enzym giảm dần và giảm nhanh đến mất hoạt tính khi giữ ở nhiệt độ 70ºC trở lên. Hình 3.12. pH tối ưu cho hoạt dộ CMCase của chế phẩm cellulase từ B. subtilis G4 11
150 Hoạt độ CMCase còn lại 100 (%) 50 0 3 4 5 6 7 8 9 10 pH Hình 3.13. Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ B. subtilis G4 Các kết quả trên cho thấy cellulase thu nhận từ G4 có hoạt tính cao nhất tại pH 7. 3.3.4. Khảo sát khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn G4 đối với các vật liệu giàu cellulose. Bảng 3.10 Kết quả thủy phân lignocelluloses sử dụng enzym từ vi khuẩn G4 Cơ chất thủy phân Hàm lƣợng đƣờng khử tạo thành Rơm 1,12±0,13 Bã mía 1,09±0,27 Rơm đã tiền xử lý bằng NaOH 1,78±0,21 Bã mĩa đã tiền xử lý bằng NaOH 1,49±0,15 Hiệu quả quá trình thủy phân thấp, hiệu suất ước tính chỉ đạt từ 15-30%. 12
Hình 3.14: Kết quả phân tích sản phẩm thủy phân bằng HPLC Kết quả kiểm tra sản phẩm thủy phân bằng HPLC cũng cho thấy không có sự tạo thành các sản phẩm đường của quá trình thủy phân như glucose, xylose 3.4. Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn Cellulosimicrobium MP1 3.4.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trƣờng và điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ MP1 3.4.1.1. Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase Bảng 3.11 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh enzym Môi trƣờng Hoạt tính CMCase(U/ml) LB 0,65± 0.11 M1 0,42± 0.17 M2 0,36± 0.21 M6 1,32± 0.15 Kết quả Bảng 3.13 cho thấy, cũng giống như vi khuẩn ruột mối G4, M6 cũng là môi trường tốt nhất trong các môi trường đã khảo sát đối với quá trình sinh enzym của chủng Cellulosimicrobium MP1. 3.4.1.2. Ảnh hưởng của các thông số tới sinh tổng hợp CMCase MP1 13
Hình 3.15 Ảnh hưởng các thông số tới sinh tổng hợp enzym từ MP1 Nghiên cứu yếu tố thời gian để xác định được thời điểm thu nhận enzym từ vi khuẩn. Hoạt độ CMCase 3.00 2.00 (U/ml) 1.00 0.00 24h 48h 72h 96h Thời gian nuôi cấy (giờ) Hình 3.16 Ảnh hưởng của thời gian CMCase của MP1 3.4.2. Ảnh hƣởng các nguồn dinh dƣỡng tới quá trình sinh tổng hợp CMCase 3.4.2.1. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nguồn N tới khả năng sinh enzym MP1 Nguồn Nitơ Hoạt tính CMCase(U/ml) Peptone 1% 0,84± 0.1 Casein 1% 2,89± 0.18 Casein 0,5% 1,05 ± 0.15 NH4NO3 1% 0,15± 0.11 Cao nấm men 1% 0,99± 0.17 Không có nitơ 0,08± 0.13 14
3.4.2.2. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon tới sinh enzym chủng MP1 Nguồn Cacbon Hoạt tính CMCase(U/ml) Glucose1% 0,84± 0.1 Cám gạo 1% 1,89± 0.18 Cám gạo 2% 1,05 ± 0.15 Tinh bột 1% 3,15± 0.11 Tinh bột 2% 0,99± 0.17 Tinh bột 2,5% 0,08± 0.13 Kết quả trên cho thấy tinh bột 1% là nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng vi khuẩn MP1. 3.4.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới quá trình sinh cellusae Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ bột đậu tương tới khả năng sinh enzym của chủng MP1 Nồngđộ bột đậu tƣơng Hoạt tính CMCase(U/ml) (%) 0 0,84± 0.1 0,5 1,89± 0.18 1,0 1,05 ± 0.15 1,5 3,25± 0.11 2.0 0,92 ± 0.15 Môi trường có nồng độ tinh bột 1%, casein 1%, bột đậu tương 1,5 % với các điều kiện nhiệt độ 37ºC, thời gian nuôi cấy 72h, tỷ lệ giống 5%, tốc độ lắc 100 vòng/phút, pH môi trường 7.5 là môi trường phù hợp cho quá trình sinh cellulase. Hoạt độ CMCase đạt cao nhất là 3,25 U/ml. 3.4.2. Xác định đặc tính cellulase tạo thành bởi Cellulosimicrobium sp. MP1 3.4.2.1. Thu nhận chế phẩm cellulase bằng kết tủa bởi ethanol Bảng 3.15 Thông số enzym từ MP1 sau kết tủa bằng ethanol Nồng độ V dich CMCase Protein Hoạt độ Hiệu Độ tinh dung (mL) (U/mL) (mg/mL) riêng suất thu sạch môi (U/mg) hồi (%) E thô 100 3.12 0,023 1,36 100 1 20% 10 1.60 0,03 5,25 5,13 3,85 40% 10 2.03 0,05 3,88 6,50 2,85 60% 10 9.71 0,13 7,58 31,14 5,56 80% 10 9.80 0,18 5,46 31,43 4,00 Chế phẩm enzym ở nồng độ cồn 60% v/v được lựa chọn cho nghiên cứu đặc tính chế phẩm. 15
3.4.2.2. Xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Cellulosimicrobium sp. MP1 Nhiệt độ và pH tối ƣu Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của CMCase từ MP1 Kết quả cho thấy khoảng pH hoạt động hiệu quả của enzym kết tủa từ dịch lên men của chủng Cellulosimicrobium sp. MP1 là tương đối rộng từ 5-10 Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase từ MP1 Xác định độ bền nhiệt và bền pH Kết quả Hình 3.19 cho thấy ở pH axit bằng 4, hoạt tính enzyme giảm mạnh còn 20% sau 20h. Hình 3.19. Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ MP1 16
Hình 3.20. Độ bền nhiệt chế phẩm cellulase từ MP1 3.5. So sánh giữa B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1 Bảng 3.16. So sánh giữa enzyme từ B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1 Thông số B. subtilis G4 Cellulosimicrobium sp. MP1 Enzym thô Hoạt độ CMCase 5,59± 0.11 3,25± 0.11 tối ưu Hoạt độ FPU 0,113 ± 0,005 0,325± 0.10 Hoạt độ xylanase 0,170± 0,006 1,14±0,06 Chê phẩm cellulase pH tối ưu 7,0 6,0 Bền pH 5-8 5-10 Nhiệt độ tối ưu 60 60 (°C) Bền nhiệt (°C) 40-50 40-50 Mặc dù enzym thô từ B. subtilis G4 có hoạt độ CMCase cao hơn từ Cellulosimicrobium sp. MP1, hoạt tính FPU và xylanase đều thấp hơn. Hơn nữa qua quan sát quá trình thủy phân có thể thấy MP1 thủy phân giấy lọc tốt hơn G4, phù hợp với hoạt tính FPU cao hơn (Hình 3.21). Hình 3.21. Thử nghiệm phân giải giấy lọc của MP1 và G4 Vi những lý do trên chủng Cellulosimicrobium sp. MP1 sẽ được tiếp tục nghiên cứu ở mức độ AND. 17
3.5. Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của chủng C. cellulans MP1 3.5.1. Trình tự gen và một số đặc điểm khái quát của chủng C. cellulans MP1 Trình tự gen của chủng C. cellulans MP1 đã được phân tích thu được 443 986 169 nucleotit và được tổng hợp để tạo thành 4 487 842 bản đọc với vị trí cụ thể và với độ lặp là 92,2 lần. Trình tự genome của chủng MP1 được sắp xếp lại thành một nhiễm sắc thể hình tròn với 23 contigs và không phát hiện thấy có plasmid. Toàn bộ genome của chủng được dự đoán có 4117 gen bao gồm 4 046 trình tự mã hóa protein (CDS), 67 trình tự quy định rRNA, 3 trình tự quy định tRNA, 1 trình tự quy định tmRNA (hình 3.22). Hình 3.22 Sơ đồ genom của C.cellulans MP1 3.5.2. Các cụm gen và chức năng gen của chủng MP1 Trong toàn bộ các trình tự mã hóa protein thì 79.5% (3216 trong 4046) được phân vào 21 trong 25 nhóm chức năng COG. Trong đó, các nhóm chiếm nhiều nhất là: phiên mã (K: 365 trình tự), vận chuyển và chuyển hóa carbonhydrate (G: 307), vận chuyển và chuyển hóa amino acid (E: 224), sản sinh và chuyển hóa năng lượng (C: 199), và vận chuyển và chuyển hóa (P: 180). Ngược lại, nhóm liên quan đến việc điều hòa chu trình, phân chia tế bào và nhiễm sắc thể (D: 33), cấu tạo và điều khiên sợi nhiễm sắc (B: 2) và di chuyển tế bào (N: 1) là các nhóm chiếm ít nhất. 3.5.3. So sánh COG toàn bộ genome và các enzyme liên quan đến chuyển hóa carbonhydrate C. cellulans MP1 được so sánh với của 4 chủng khác gồm J36, LMG16121, và JKA48. Chủng C. cellulans MP1 có 3405 gen thuộc vào các nhóm COG và 794 gen độc lập. Trong đó thì số gen đơn lẻ lớn nhất thuộc về chủng MP1. Biểu đồ Venn Edward 6 chiều cho thấy rằng có 2539 gen COG được tìm thấy trong cả 4 chủng thuộc chi C. cellulans. Trong số các COG riêng biệt của mỗi chủng thì chủng MP1 có 20 và là số lượng lớn nhất trong 4 chủng. 18