intTypePromotion=1

Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana để ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

0
59
lượt xem
4
download

Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana để ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án nghiên cứu với mục tiêu xây dựng được quy trình công nghệ thích hợp nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot trong điều kiện trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng và thu sinh khối đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu thức ăn tươi sống cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana để ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN VĂN CÔNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI SINH KHỐI VI TẢO Thalassiosira pseudonana ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM THỨC ĂN CHO ẤU TRÙNG TÔM THẺ CHÂN TRẮNG Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2019
  2. Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. ĐỖ THỊ HOA VIÊN 2. PGS. TS. ĐẶNG DIỄM HỒNG Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi: ..... giờ........., ngày ...... tháng ........ năm 2019. Có thể tìm hiểu Luận án tại: 1. Thư viện Quốc gia Việt Nam 2. Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
  3. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 1. Nguyen Van Cong, Dinh Thi Le Giang, Nguyen Kim Duong, Tran Dinh Quang, Do Thi Hoa Vien (2016). Effects of feed on the survival rate, growth rate and metamorphosis time of the white leg shrimp larvae (Litopenaeus vannamei Boone, 1931) at zoea stage. Journal of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and Technology 54 (4A), p 205 - 212. 2. Nguyễn Văn Công, Đinh Thị Lệ Giang, Nguyễn Kim Đường, Trần Đình Quang, Đỗ Thị Hoa Viên (2016). Ảnh hưởng của mật độ nuôi đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và thời gian biến thái của ấu trùng tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei Boone, 1931) ở giai đoạn zoea. Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VII Youth fish 2016, p 142 - 150. 3. Nguyễn Văn Công, Nguyễn Kim Đường, Trần Đình Quang, Đỗ Thị Hoa Viên (2017). Kỹ thuật nhân nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana. Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VIII Youth fish 2017, p 77 - 90, Nhà xuất bản Nông nghiệp. 4. Nguyen Van Cong, Do Thi Hoa Vien, Dang Diem Hong (2018). Fatty acid profile and nutrition values of the microalga (Thalassiosira pseudonana) used in white shrimp culture. Vietnam Journal of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and Technology 56 (4A), p 138 - 145. 5. Nguyễn Văn Công, Đỗ Thị Hoa Viên, Đặng Diễm Hồng (2018). Định tên hai loài vi tảo biển (Thalassiosira pseudonana và Thalassiosira weissflogii) dựa trên hình thái tế bào và phân tích gen 18S rRNA. Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2018, p 21 - 27, Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. 6. Nguyễn Văn Công, Nguyễn Kim Đường, Trần Đình Quang, Đỗ Thị Hoa Viên (2018). Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sự phát triển của vi tảo Thalassiosira pseudonana. Tạp chí Sinh học 40 (2se), p 5 - 10.
  4. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Hiện nay, trong trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng (TTCT) việc nuôi sinh khối vi tảo gặp nhiều khó khăn như dễ bị nhiễm vi sinh vật và tảo tạp, nguồn giống ban đầu kém chất lượng, môi trường dinh dưỡng dư thừa gây ô nhiễm môi trường nước nuôi, mật độ tế bào (MĐTB) đạt cực đại thấp, tảo tàn lụi nhanh, tốc độ sinh trưởng đặc trưng thấp, kích thước tế bào không đồng đều, tế bào bị dị dạng nhiều, sinh khối đạt thấp, chi phí cho nuôi trồng là cao. Giai đoạn zoea của ấu trùng TTCT sử dụng vi tảo phải giàu dinh dưỡng, kích thước tế bào phải vừa với cỡ miệng ấu trùng tôm.... Kích thước tế bào vi tảo càng nhỏ sẽ cho phép sử dụng cho ấu trùng TTCT ở giai đoạn càng sớm. Cung cấp đủ thức ăn tươi sống có chất lượng dinh dưỡng cao trong 15 ngày đầu của ấu trùng TTCT là bí quyết công nghệ ở các trang trại nuôi trồng thủy sản (NTTS) hiện nay. Loài Thalassiosira pseudonana có kích thước tế bào nhỏ hơn so với Thalassiosira weissflogii tuy nhiên nuôi trồng chúng lại khó khăn hơn. Hiện nay, ở một số trang trại NTTS đã nuôi được loài T. weissflogii rất thành công và ổn định nhưng kích thước của loài này lớn, giá trị dinh dưỡng thấp, MĐTB đạt cực đại thấp, thời gian lưu giữ quần thể tảo là ngắn, trong khi đó ở các trang trại này lại chưa nuôi được loài T. pseudonana. Loài T. pseudonana có kích thước tế bào từ 4 - 5 µm, rất vừa với cỡ miệng của ấu trùng TTCT ở giai đoạn zoea (4 ngày nuôi đầu cho zoea 1, 2, 3) và mysis (3 ngày tiếp theo cho mysis 1, 2, 3), giai đoạn tiếp theo từ postlarvae 1 đến postlarvae 12 (nếu có đủ sinh khối tươi sống để cung cấp thì cũng rất tốt). Giá trị dinh dưỡng của T. pseudonana cao, hàm lượng lipít từ 20,60 - 24,67% sinh khối khô (SKK) trong đó, axít béo bão hòa (SFAs, saturated fatty acid) chiếm 36,72% so với axít béo tổng số (TFA, total fatty acid), axít béo không bão hòa một nối đối (MUFAs, monounsaturated fatty acid) chiếm 44,67% so với TFA, axít béo không bão hòa đa nối đôi (PUFAs, polyunsaturated fatty acid) chiếm 12,85% so với TFA và axít eicosapentaenoic (EPA, eicosapentaenoic acid) chiếm 2,15% so với TFA [8]; hàm lượng protein đạt (18 - 30% SKK), carbohydrate (17 - 26% SKK) [5]. Ngoài ra, sinh khối của vi tảo này còn giàu các chất khoáng đa và vi lượng giúp tôm tiêu thụ thức ăn tốt và giữ được năng lượng hiệu quả hơn, từ đó giúp tôm tăng trưởng nhanh và ổn định, rút ngắn thời gian biến thái và có tỉ lệ sống cao. Hơn thế nữa, vi tảo T. pseudonana có khả năng sinh trưởng và phát triển ổn định trong hệ thống nuôi trồng, chúng có MĐTB đạt cực đại cao là 0,82 x 106 tb/mL [5] và thời gian lưu giữ, cấy chuyển dài. Đây là ưu điểm nổi bật để có thể lưu giữ ổn định trong thời gian kéo dài quần thể tảo. Thời gian lưu giữ ở nhiệt độ thường có thể kéo dài từ 1 - 2 tháng sẽ giúp cho các trại sản xuất giống TTCT chủ động về nguồn giống, thời gian cấy chuyển và sàng lọc lại giống dễ dàng, dễ bảo quản giống. Do vậy, sản xuất sinh khối T. pseudonana làm thức ăn sống để cung cấp đủ dinh dưỡng cho ấu trùng TTCT là yếu tố quyết định đến tỉ lệ sống, tăng trưởng, thời gian biến thái và nâng cao chất lượng tôm giống. Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng ứng dụng T. pseudonana trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhưng các kết quả nghiên cứu nhìn chung chưa mang tính hệ thống. Nguồn giống chủ yếu là nhập ngoại; tảo chưa được phân lập lại khi bị nhiễm tạp và vi sinh vật; việc lưu giữ tảo giống cũng như là chưa nuôi trồng được T. pseudonana trên quy mô lớn và sử dụng loài này cho TTCT. Việc chứng minh tính an toàn của sinh khối T. pseudonana nuôi trồng được và sử dụng chúng cho sản xuất giống TTCT ở Việt Nam là hoàn toàn mới ở Việt Nam. Chính vì vậy, trong trại sản xuất giống TTCT, việc phân lập lại tảo khi bị nhiễm vi sinh vật và tảo tạp, lưu giữ giống, nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho nuôi sinh khối T. pseudonana thành công cũng như nâng cao chất lượng sinh khối tươi sống của chúng ở các hệ thống nuôi hở là rất quan trọng và cần thiết cho việc tạo nguồn thức ăn để nâng cao năng suất và chất lượng giống TTCT ở điều kiện Việt Nam. Xuất phát từ thực trạng nghiên cứu và tính cấp thiết nêu trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana để ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng được quy trình công nghệ thích hợp nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot trong điều kiện trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng và thu sinh khối đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu thức ăn tươi sống cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập lại khi tảo bị nhiễm vi sinh vật và tảo tạp, lưu giữ, nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh dưỡng của Thalassiosira pseudonana ở các quy mô bình thủy tinh 0,25 - 2 L và bể composite 0,2 - 3,5 m3. 1
  5. - Xây dựng quy trình công nghệ tối ưu nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana trong các quy mô bình thủy tinh 0,25 - 2 L và bể composite 0,2 - 3,5 m3. - Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn và tác dụng sinh dược của sinh khối Thalassiosira pseudonana đạt tiêu chuẩn an toàn làm thức ăn cho các loài động vật thủy sản. - Nghiên cứu sử dụng sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống nuôi trồng được làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng ở các trang trại sản xuất giống. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án - Kết quả nghiên cứu thu được của Luận án đã cung cấp những cơ sở dữ liệu về đặc điểm sinh học của Thalassiosira pseudonana cho tập đoàn giống vi tảo được nuôi trồng tại Việt Nam; các số liệu khoa học thu được cho phép làm chủ quy trình nhân nuôi sinh khối trong điều kiện phòng thí nghiệm, khả năng cung cấp sinh khối tươi sống ổn định và mang tính bền vững ở quy mô bể composite 3,5 m3. - Các kết quả của Luận án có ý nghĩa thực tiễn cung cấp các dẫn liệu khoa học giúp các cơ sở sản xuất sinh khối vi tảo làm chủ được quy trình nuôi, thu sinh khối tươi sống đạt chất lượng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng. 5. Những điểm mới của luận án - Luận án Tiến sĩ là công trình nghiên cứu đầu tiên có hệ thống về việc lưu giữ và nuôi trồng được loài Thalassiosira pseudonana từ phòng thí nghiệm đến quy mô pilot 3,5 m3 trong điều kiện ở Việt Nam. - Sinh khối thu được từ quy trình công nghệ nuôi trồng loài Thalassiosira pseudonana này đã được đánh giá là an toàn, đạt tiêu chuẩn làm thức ăn tươi sống cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng. - Đã sử dụng thành công sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống nuôi được để làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng trong trại sản xuất giống ở Việt Nam. Đã sử dụng nguồn tôm giống sản xuất được bằng sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống để nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng thành công ở Việt Nam. 6. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 150 trang với 29 bảng số liệu, 54 hình và ảnh liên quan, và 147 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: Mở đầu (03 trang), Tổng quan (26 trang), Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (18 trang), Kết quả và Thảo luận (87 trang), Kết luận và Kiến nghị (02 trang), Danh mục công trình công bố (01 trang), Tài liệu tham khảo (13 trang) và Phụ lục (40 trang). CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Hiện nay, có nhiều loài vi tảo được sử dụng trong các trại sản xuất giống tôm biển và tôm thẻ chân trắng như Thalassiosira weissflogii, Thalassiosira pseudonana, Spirulina platensis, Skeletonema costatum, Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros gracilis, Tetraselmis chuii, Tetraselmis suesica, Isochrysis galbana. Trong đó, Thalassiosira pseudonana được xem là nguồn thức ăn sống rất quan trọng cho ương nuôi ấu trùng tôm [33], [34], [35], [36], [37]. Zhukova (2004) [64] đã chỉ ra rằng nuôi T. pseudonana trong môi trường F/2 ở 20oC, 3,5 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12:12 giờ. Kết quả thu được của nghiên cứu này cho thấy các thành phần axít béo thay đổi theo thời gian nuôi cấy như sau: sau 3 ngày nuôi cấy (SFAs đạt 36,1% so với TFA, MUFAs - 20,8% và PUFAs - 38,9%), 6 ngày nuôi cấy (SFAs đạt 38,3% so với TFA, MUFAs - 21,3% và PUFAs - 37,0%), 10 ngày nuôi cấy (SFAs đạt 34,7% so với TFA, MUFAs - 24,6% và PUFAs - 37,0%), 14 ngày nuôi cấy (SFAs đạt 30,6% so với TFA, MUFAs - 21,5% và PUFAs - 45,0%) và 20 ngày nuôi cấy (SFAs đạt 29,6% so với TFA, MUFAs - 18,2% và PUFAs - 48,7%). CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Loài Thalassiosira pseudonana Hasle và Heimdal, 1970 giống nhập nội từ Thái Lan của trung tâm nghiên cứu Shrimp genetic improvement center - Charoen Pokphand Foods PCL, khi tảo bị nhiễm vi sinh vật và tảo tạp cần được phân lập lại, lưu giữ và nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam để tiếp tục được sử dụng trong nghiên cứu. 2
  6. Loài Thalassiosira weissflogii (Grunow) Hasle và Fryxell, 1977 giống nhập nội từ Thái Lan của trung tâm nghiên cứu Shrimp genetic improvement center - Charoen Pokphand Foods PCL, được nuôi sinh khối tại Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam và sử dụng như là công thức đối chứng cho một số thí nghiệm đối với T. pseudonana. Trạng thái mẫu giống ban đầu của T. pseudonana và T. weissflogii: ở dạng đĩa petri thạch đặc, được bọc gói cẩn thận bằng giấy bạc, quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần thấy có các khuẩn lạc đang sống và có màu sắc đặc trưng của tế bào vi tảo. Chuột nhắt trắng dòng Swiss trưởng thành, không phân biệt giống, khối lượng 20 - 25 g/con. Chuột thí nghiệm được nuôi trong điều kiện chuồng thoáng mát, chế độ sáng/tối là 12/12 giờ, đảm bảo vệ sinh và không hạn chế về thức ăn và nước uống. Chuột cống trắng dòng Wistar trưởng thành, không phân biệt giống, trọng lượng 200 ± 20 g/con do Trung tâm động vật, Học viện Quân y cung cấp. Chuột được nuôi trong điều kiện chuồng thoáng mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu của chuột cống trắng. Chuột được theo dõi ổn định trong vòng 5 - 7 ngày và khi chúng đạt tiêu chuẩn thí nghiệm được đưa vào sử dụng. Chuột nhắt trắng giống đực, khỏe mạnh 10 - 12 tuần tuổi, trọng lượng 20 - 30 g/con, do Ban chăn nuôi động vật Học viện Quân y cung cấp để tiến hành thử nghiệm đánh giá tính an toàn dược lý của sinh khối T. pseudonana. Ấu trùng tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei Boone, 1931) giai đoạn nauplii 4 - 5, do Bộ phận tôm bố mẹ sản xuất của Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam cung cấp và đạt chất lượng có tỉ lệ đột biến ≤ 10%, vi khuẩn phát sáng < 1.00 x 103 CFU/g và không phát hiện bệnh EHP và VPA: AHPND. Nguồn giống postlarvae 12 được lấy từ Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam đã được kiểm tra và cho kết quả âm tính với các loại mầm bệnh nguy hiểm như WSD, TS, YHD, IHHN, NHP và IMN được sử dụng để nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng. 2.1.2. Hóa chất và thiết bị Hóa chất: Các loại hoá chất HCl, H2O2, Iophor được dùng vệ sinh thiết bị và hệ thống nuôi. Các hóa chất xử lý nước như Na2EDTA, CaCO3, NaClO. Thiết bị và dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm (CHLB Đức), kính hiển vi quang học, lam kính, lamen, buồng đếm hồng cầu Neubauer và một số thiết bị chuyên dụng khác được dùng cho phòng thí nghiệm. 2.2. Các môi trường nuôi cấy Thành phần các môi trường nuôi cấy của Thalassiosira pseudonana gồm môi trường dinh dưỡng F2, TMRL, AGP (Algal Growth Potential), Conway và Walne. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp chụp ảnh hình thái tế bào Các tế bào vi tảo được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) JEOL JSM - 6400 (Nhật Bản) của Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương ở độ phóng đại 15.000 lần. Các tế bào đứng riêng rẽ và có hình dạng đặc trưng cho loài nghiên cứu sẽ được chọn để chụp ảnh. 2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử Phương pháp sinh học phân tử được tiến hành các bước như sau: Tách chiết DNA tổng số (theo mô tả của Hoàng Thị Lan Anh và cộng sự (2010) [108]), phản ứng PCR nhân một phần gen 18S rRNA, điện di trên gel agarose, tinh sạch sản phẩm PCR và xác định trình tự gen. 2.3.3. Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp Thalassiosira pseudonana ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của Thalassiosira pseudonana ở quy mô phòng thí nghiệm (0,25 - 2 L) và quy mô pilot bể composite (0,2 - 3,5 m3). + Bố trí thí nghiệm: a. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ % môi trường AGP lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh 0,25 - 2 L gồm có 5 công thức lần lượt là môi trường AGP 5, 10, 15, 20 và 25% dưới điều kiện như: độ mặn 30‰, pH 7,0, 5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, 25oC, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vô khuẩn. Môi trường AGP được pha loãng theo tỉ lệ nói trên được chọn từ dung dịch AGP đậm đặc, cung cấp 1 mL/L và bổ sung silicate 2 mL/L. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL. b. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh (0,25 - 2 L) và bể composite 0,2 m3 có 5 công thức lần lượt là môi trường AGP 20%, F2, TMRL, Conway và Walne. Các loại môi trường dinh dưỡng này được pha loãng theo công thức cho sẵn, cung cấp 1 mL/L và bổ sung silicate 2 mL/L. Điều kiện môi trường thí nghiệm: độ mặn 30‰, pH 7,0, 5,0 - 6,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, 25oC, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vô khuẩn. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL. 3
  7. c. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu khác nhau lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh (0,25 - 2 L) và bể composite (0,2 - 3,5 m3) được bố trí với 5 công thức lần lượt là 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 và 0,3 x 106 tb/mL. MĐTB được quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần và lựa chọn kỹ thông qua các thông số như MĐTB ổn định, cụm tế bào và tế bào đồng đều, đẹp, góc của tế bào không có dấu hiệu gãy góc, không bị vón cục, kết dính, không tạo thành từng hàng, cụm dày đặc và có màu sắc đặc trưng của tảo và đảm bảo độ đồng đều cao giữa các MĐTB ban đầu đem thí nghiệm, tiến hành pha loãng MĐTB ban đầu theo các nghiệm thức đã chọn nói trên. Điều kiện môi trường thí nghiệm: môi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, pH 7,0, 5,0 - 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, 25oC, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vô khuẩn. d. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh 0,25 - 2 L bao gồm 5 công thức lần lượt là 15, 20, 25, 30 và 35oC. Sử dụng máy điều hòa 2 chiều công suất lớn để điều chỉnh nhiệt độ và sử dụng hệ thống tủ container có dải nhiệt độ (-40oC đến 50oC) để bố trí thí nghiệm ở 15oC. Điều kiện môi trường thí nghiệm: môi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, pH 7,0, 5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vô khuẩn. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL. e. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng khác nhau lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh (0,25 - 2 L) và bể composite (0,2 - 3,5 m3) bố trí với 5 công thức lần lượt là 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 và 7,0 klux. Còn ở bể composite 3,5 m3 thay đổi với 5 mức CĐAS lần lượt là 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 và 12,0 klux. Chúng tôi thay đổi khoảng cách chiếu sáng của đèn LED (loại 240 W) từ 40 - 130 cm để điều chỉnh CĐAS cho các thí nghiệm nói trên và cố định chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ. Điều kiện môi trường thí nghiệm: môi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, pH 7,0, 25oC, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vô khuẩn. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL. f. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH khác nhau lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh 0,25 - 2 L gồm có 6 công thức lần lượt là 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 và 9,0. Để giảm độ pH trong môi trường nước nuôi của thí nghiệm cần sử dụng đá bọt CO2 để sục vào và kiểm tra mức độ giảm của pH theo giờ. Để tăng độ pH trong môi trường nước nuôi của thí nghiệm cần sử dụng vôi Ca(OH)2 để tạt vào và kiểm tra mức độ tăng của pH theo giờ và giữ ở mức ổn định trong suốt thời gian theo dõi thí nghiệm. Vôi Ca(OH)2 trước khi cung cấp vào cần được pha loãng với nước rồi chờ lắng mới sử dụng, cần tiến hành tỉ mỉ, cẩn thận để kiểm soát pH ổn định như thí nghiệm đã đặt ra. Điều kiện môi trường thí nghiệm: môi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, 25oC, 5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vô khuẩn. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL. g. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh (0,25 - 2 L) và bể composite (0,2 - 3,5 m3) có 5 công thức lần lượt là 15, 20, 25, 30 và 35‰. Các độ mặn thấp ở 15, 20 và 25‰ thì sử dụng nước ngọt để làm giảm độ mặn và ổn định độ mặn từ 3 - 4 ngày rồi mới tiến hành đem vào xử lý để bố trí thí nghiệm. Đối với độ mặn 35‰ thì sử dụng muối (NaCl) để tăng độ mặn cho thí nghiệm. Điều kiện môi trường thí nghiệm: môi trường AGP 20%, 25oC, 5,0 - 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vô khuẩn. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL. h. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ kiềm lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh 0,25 - 2 L bao gồm 7 công thức lần lượt là 150, 155, 160, 165, 170, 175 và 180 ± 5 mg CaCO3/L. Sử dụng NaHCO3 (Natri bicarbonat) để tăng và CaSO4.2H2O (thạch cao sống) để giảm độ kiềm theo công thức đã chọn cho thí nghiệm. Điều kiện môi trường thí nghiệm: môi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, 25oC, 5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0 và CĐSK 24/24 giờ với nguồn khí cấp vào đã được xử lý vô khuẩn. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL. i. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ sục khí khác nhau lên sự phát triển của Thalassiosira pseudonana ở bình thủy tinh (0,25 - 2 L) và bể composite (0,2 - 3,5 m3) bao gồm 6 công thức lần lượt là 15/24, 17/24, 19/24, 21/24, 23/24 và 24/24 giờ. Sử dụng máy thổi khí (GSD GRB - 50, loại 3,7 KW) để sục và ngắt khí theo giờ đã mặc định cho các thí nghiệm nói trên. Điều kiện môi trường thí nghiệm: môi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, 25oC, 5,0 - 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ và pH 7,0. MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL. - Tần suất và số lượng mẫu lấy: tần suất lấy mẫu 1 lần/ngày, lượng mẫu lấy mỗi lần là 1 - 2 mL/lần. - Thời gian theo dõi thí nghiệm: các thí nghiệm được theo dõi 14 ngày, mỗi công thức được lặp lại 3 lần. - Xác định sinh trưởng của T. pseudonana trong nghiên cứu thông qua mật độ tế bào (x 106 tb/mL), tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ/ngày), kích thước (µm), hình thái tế bào (quan sát bằng kính hiển vi độ phóng đại 400 lần) và màu sắc của dịch nuôi cấy (quan sát bằng cảm quan). 2.3.4. Xác định các thông số sinh trưởng của Thalassiosira pseudonana Sinh trưởng của Thalassiosira pseudonana được đánh giá thông qua các chỉ số như xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Neubauer (Đức), lượng sinh khối khô (SKK, g/L) và hàm lượng sắc tố chlorophyll a, b, carotenoit (μg/L). 2.3.5. Phân tích thành phần sinh hóa trong sinh khối của Thalassiosira pseudonana 2.3.5.1. Phương pháp phân tích hàm lượng lipít tổng số 4
  8. Hàm lượng lipít tổng số được phân tích theo phương pháp của Bligh và Dyer (1959) [117] có một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện của Việt Nam [113]. 2.3.5.2. Phương pháp phân tích thành phần và hàm lượng các axít béo bão hòa và không bão hòa đa nối đôi Sinh khối của Thalassiosira pseudonana sẽ được phân tích thành phần và hàm lượng SFAs và PUFAs (EPA, DHA, DPA) bằng sắc kí khí theo mô tả của Đặng Diễm Hồng và cộng sự (2007) [16] thực hiện tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. 2.3.5.3. Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng và kim loại nặng Sinh khối của vi tảo Thalassiosira pseudonana dùng để phân tích thành phần dinh dưỡng được thu hoạch ở pha log của đường cong sinh trưởng được sử dụng để phân tích thành phần dinh dưỡng, hàm lượng protein tổng số được xác định theo phương pháp Kjeldahl sau đó nhân với hệ số 6,25. 2.3.6. Nghiên cứu ứng dụng Thalassiosira pseudonana trong sản xuất giống tôm thẻ chân trắng 2.3.6.1. Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và hành vi của động vật thực nghiệm sử dụng sinh khối Thalassiosira pseudonana Chúng tôi tiến hành thử độc tính cấp và giá trị LD50 trên CNT, và độc tính bán trường diễn trên CCT của SKK Thalassiosira pseudonana được xác định theo phương pháp của Litchfield - Wincoxon [119] theo hướng dẫn của Bộ Y tế Việt Nam [120], hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) [121] và của Tổ chức Y tế thế giới [122] được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu sinh lý bệnh - Học viện Quân y. 2.3.6.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại thức ăn đến tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng * Các chỉ tiêu theo dõi: Tăng trưởng của ấu trùng tôm thẻ chân trắng; thời gian biến thái Z1 - PL1 và tỉ lệ sống từ N - PL6. * Bố trí thí nghiệm: Ảnh hưởng của loại thức ăn đến tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng nuôi trong bể composite 50 L: Thí nghiệm về ảnh hưởng của các loại thức ăn khác nhau lên nuôi ấu trùng TTCT đã được bố trí với 3 nghiệm thức: Khẩu phần 1 (KP 1 - công thức đối chứng) là tảo khô Spirulina + thức ăn tổng hợp (TATH) + Artemia; Khẩu phần 2 (KP 2 - công thức đối chứng dương) là tảo tươi Thalassiosira weissflogii + TATH + Artemia; Khẩu phần 3 (KP 3): là tảo tươi Thalassiosira pseudonana + TATH + Artemia. Mật độ nuôi 150 N/L. Trong đó, lô đối chứng là KP1, KP2, lô thử nghiệm là KP3. Loài T. weissflogii được nuôi ở bể composite 3,5 m3 trong môi trường AGP 20%, 29 - 30‰, pH 7,5, 27oC, 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12:12 giờ, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ. Thu hoạch sinh khối T. weissflogii tươi sống làm thức ăn cho ấu trùng TTCT với tổng sinh khối T. weissflogii tươi sống (khoảng 55 - 58 L cho 1 bể composite 50 L) và tổng sinh khối T. pseudonana tươi sống (khoảng 55 - 58 L cho 1 bể composite 50 L). MĐTB của T. weissflogii và T. pseudonana được sử dụng cho thí nghiệm này là 0,025 - 0,03 x 106 tb/mL.TATH được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm thức ăn nhân tạo TNT 100, 200, 300, 400 có các kích cỡ hạt khác nhau. Thử nghiệm nuôi ấu trùng tôm thẻ chân trắng trong bể xi măng thể tích 30 m3 bằng thức ăn tảo tươi Thalassiosira pseudonana + TATH + Artemia (KP 3): Thí nghiệm được bố trí với 3 lô sản xuất, mỗi lô 4 bể xi măng thể tích 30 m3, mật độ 150 N/L. Các điều kiện khác được giữ nguyên như thí nghiệm trên. Chúng tôi đã sử dụng tổng sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống khoảng 33 - 35 m3 cho 1 bể xi măng thể tích 30 m3. MĐTB của T. pseudonana được sử dụng ở thí nghiệm này là 0,025 - 0,03 x 106 tb/mL. 2.3.6.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tôm nuôi đến tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng * Bố trí thí nghiệm: Ảnh hưởng của mật độ tôm nuôi đến tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng nuôi trong bể composite 50 L: Thí nghiệm ương ấu trùng tôm thẻ chân trắng được bố trí trong bể composite 50 L với các mật độ nuôi lần lượt là 125, 150, 175, 200, 225 và 250 N/L nuôi dưới điều kiện: 30 - 31‰; 29 - 30oC; 180 - 200 mg CaCO3/L và pH 7,9 - 8,2; thức ăn sử dụng là tảo tươi Thalassiosira pseudonana + TATH + Artemia. Chúng tôi đã sử dụng tổng sinh khối T. pseudonana tươi sống từ 55 - 58 5
  9. L cho 1 bể composite 50 L. MĐTB của T. pseudonana được sử dụng cho thí nghiệm này là 0,025 - 0,03 x 106 tb/mL. Thử nghiệm ảnh hưởng của mật độ tôm nuôi thích hợp đến tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng trong bể xi măng 30 m3: Thí nghiệm ương ấu trùng tôm thẻ chân trắng được nuôi trong bể xi măng 30 m3 với các mật độ nuôi đã được lựa chọn lần lượt là 125, 130, 155 và 175 N/L. Tổng sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống được sử dụng từ 33 - 35 m3 cho 1 bể xi măng thể tích 30 m3. MĐTB của T. pseudonana được sử dụng ở thí nghiệm này là 0,025 - 0,03 x 106 tb/mL. 2.3.6.4. Phương pháp thử nghiệm nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng với nguồn con giống được sản xuất bằng Thalassiosira pseudonana * Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên trong 9 ao gồm 2 công thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần. Kích cỡ giống tôm thẻ chân trắng PL12 được thả nuôi trong ao có diện tích 6.400 m2. Mật độ thả ban đầu: 86 con/m2 được nuôi tại Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam. Điều kiện thí nghiệm: các ao lót bạt có diện tích và mật độ thả, chế độ sục khí 24/24 giờ, chế độ thức ăn, chế độ chăm sóc và quản lý như nhau. Đối với các ao thuộc lô thử nghiệm sử dụng nguồn giống PL12 được sản xuất từ nguồn thức ăn tươi sống của Thalassiosira pseudonana và các ao thuộc lô đối chứng được sử dụng nguồn giống PL12 được sản xuất từ nguồn thức ăn tươi sống Thalassiosira weissflogii. Nguồn sinh khối T. weissflogii tươi sống sử dụng để làm thức ăn cho ấu trùng TTCT được nuôi bằng bể composite 3,5 m3 trong môi trường AGP 20%, 29 - 30‰, pH 7,5, 27oC, 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12:12 giờ, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và CĐSK 24/24 giờ. Thành phần dinh dưỡng trong sinh khối của T. weissflogii có hàm lượng PUFAs đạt (34,77 ± 0,08)% so với TFA, EPA đạt (13,17 ± 0,14)%; protein đạt (6,63 ± 0,25)% so với SKK, lipít đạt (10,75 ± 1,17)%, carbohydrate (7,86 ± 0,76)%. 2.3.7. Xử lý số liệu nghiên cứu Các số liệu thu thập được tính toán các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và đồ thị về sự biến thiên của chúng được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel. So sánh phương sai mẫu để đánh giá sai khác thống kê giữa các nghiệm thức ở mức (p
  10. Ảnh hình thái tế bào của Thalassiosira sp. quan sát dưới SEM được trình bày ở hình 3.2. Hình 3.2. Hình thái tế bào của Thalassiosira sp. chụp dưới kính SEM 3.1.2. Định tên khoa học Thalassiosira sp. bằng kỹ thuật đọc và so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA Kết quả trình bày ở hình 3.4 đã cho thấy Thalassiosira sp. có độ tương đồng cao nhất với loài T. pseudonana CCAP 1085/12 (KU900218.1) đạt 99,5%. Trình tự đoạn gen 18S rRNA của vi tảo nêu trên đã được đăng ký trên GenBank với mã số được cấp là MH545685.1. Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loại của Thalassiosira sp. dựa trên trình tự gen 18S rRNA 3.1.3. Nghiên cứu lưu giữ, khả năng sinh sản và sinh trưởng của Thalassiosira pseudonana 3.1.3.1. Lưu giữ Thalassiosira pseudonana ở nhiệt độ phòng Kết quả trình bày ở hình 3.5 minh họa cho việc lưu giữ thành công loài vi tảo này trong môi trường lỏng với chu kỳ cấy chuyển 1 - 2 tuần/lần và giữ ở cả 3 đợt cấy chuyển liên tiếp (3 thế hệ). Hình 3.5. Thalassiosira pseudonana (A, B) trong môi trường lỏng Hình 3.6. Đĩa thạch (A, B) và khuẩn lạc của T. pseudonana (C, D) trên môi trường thạch agar 7
  11. Đối với T. pseudonana đã lưu giữ thành công trong điều kiện phòng thí nghiệm sẽ tiếp tục được nuôi trên môi trường thạch. Chúng tôi đã thu nhận được khuẩn lạc riêng rẽ của các tế bào vi tảo nói trên (hình 3.6). 3.1.3.2. Đặc điểm sinh học sinh sản của Thalassiosira pseudonana Kết quả của nghiên cứu được trình bày ở trên hình 3.7. Các tế bào đặc biệt này ở trên ống nghiệm có nhân rõ ràng, có dấu hiệu sắp phân chia. Các tế bào bị đột biến dị dạng hoàn toàn so với giống gốc ban đầu và hình thù có thể ở dạng bình thường nhưng bên trong đã hình thành nhân của các tế bào con. Hình 3.7. Bào tử sinh trưởng của T. pseudonana ở ống nghiệm. A: các tế bào có dấu hiệu hình thành nhân của tế bào con, B: các tế bào con có nhân tăng lên chuẩn bị phân chia, C: các tế bào con phân chia thành tế bào mới 3.1.3.3. Sinh trưởng của Thalassiosira pseudonana Kết quả nghiên cứu đường cong sinh trưởng của T. pseudonana sau 14 ngày nuôi cấy ở quy mô bình thủy tinh 1 L được trình bày trên hình 3.8. Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng của T. pseudonana sau 14 ngày nuôi cấy ở bình thủy tinh 1 L. Ghi chú: Lô thử nghiệm: T. pseudonana; Lô đối chứng: T. weissflogii Kết quả nghiên cứu được chỉ ra trên hình 3.8 đã cho thấy MĐTB cực đại của T. pseudonana đạt cao hơn (1,59 ± 0,05) x 106 tb/mL so với công thức đối chứng (Thalassiosira weissflogii - (1,11 ± 0,03) x 106 tb/mL) - đối tượng hiện đang được nuôi trồng chủ yếu trong các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng. Tuy nhiên, thời gian MĐTB đạt cực đại ở loài T. pseudonana là 6 ngày (tương tự như ở công thức đối chứng). 3.2. Điều kiện nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana ở các quy mô khác nhau 3.2.1. Điều kiện thích hợp để nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana ở quy mô phòng thí nghiệm 3.2.1.1. Quy mô bình thủy tinh 0,25 L Kết quả nghiên cứu được trình bày trên hình 3.9, 3.10, 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 và hình 3.17. Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ % môi trường AGP lên sinh Hình 3.10. Ảnh hưởng của môi trường khác nhau lên sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy bình thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy 8
  12. Hình 3.11. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của T. trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong bình thủy tinh thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy Hình 3.13. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của T. trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình thủy tinh 0,25 L thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy sau 6 ngày nuôi cấy Hình 3.15. Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của T. Hình 3.16. Ảnh hưởng của độ kiềm lên sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong bình thủy tinh pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình thủy tinh 0,25 L 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy sau 6 ngày nuôi cấy Hình 3.17. Ảnh hưởng của chế độ sục khí lên sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong bình thủy tinh 0,25 L sau 6 ngày nuôi cấy Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d, e trong cùng thời điểm thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p
  13. Hình 3.20. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh Hình 3.21. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của T. trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong bình thủy tinh 1 L thủy tinh 1 L sau 6 ngày nuôi cấy sau 6 ngày nuôi cấy Hình 3.22. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh Hình 3.23. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của T. trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong bình thủy tinh 1 L thủy tinh 1 L sau 6 ngày nuôi cấy sau 6 ngày nuôi cấy Hình 3.24. Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của T. Hình 3.25. Ảnh hưởng của độ kiềm lên sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong bình thủy tinh 1 L pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình thủy tinh 1 L sau sau 6 ngày nuôi cấy 6 ngày nuôi cấy Hình 3.26. Ảnh hưởng của chế độ sục khí lên sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình thủy tinh 1 L sau 6 ngày nuôi cấy Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d trong cùng thời điểm thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p
  14. Hình 3.29. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh Hình 3.30. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của T. trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong bình thủy tinh 2 L thủy tinh 2 L sau 6 ngày nuôi cấy sau 7 ngày nuôi cấy Hình 3.31. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh Hình 3.32. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của T. trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình thủy tinh 2 L sau 6 bình thủy tinh 2 L sau 6 ngày nuôi cấy ngày nuôi cấy Hình 3.33. Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của T. Hình 3.34. Ảnh hưởng của độ kiềm lên sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong bình thủy tinh 2 L pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình thủy tinh 2 L sau 6 sau 6 ngày nuôi cấy ngày nuôi cấy Hình 3.35. Ảnh hưởng của chế độ sục khí lên sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bình thủy tinh 2 L sau 6 ngày nuôi cấy Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trong cùng thời điểm thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p
  15. Hình 3.38. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng Hình 3.39. Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của T. của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong bể composite pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong bể composite 0,2 0,2 m3 sau 6 ngày nuôi cấy m3 sau 6 ngày nuôi cấy Hình 3.40. Ảnh hưởng của chế độ sục khí lên sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bể composite 0,2 m 3 sau 6 ngày nuôi cấy Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d trong cùng thời điểm thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p
  16. Kết luận: nuôi sinh khối T. pseudonana trong bể composite 1 m3 đã xác định được các điều kiện môi trường thích hợp như sau: môi trường dinh dưỡng AGP 20%, mật độ tế bào ban đầu 0,2 x 106 tb/mL, nhiệt độ 25oC, cường độ ánh sáng 6,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0, độ mặn 30‰, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L và chế độ sục khí 24/24h có MĐTB đạt cực đại ở ngày nuôi thứ 6 (0,82 ± 0,01 x 106 tb/mL) và tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ = 0,26/ngày). 3.2.2.3. Quy mô bể composite 3,5 m3 Kết quả nghiên cứu được trình bày ở trên hình 3.45, 3.46, 3.47 và hình 3.48. Hình 3.45. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu khác nhau Hình 3.46. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng khác nhau lên sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở lên sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bể composite 3,5 m3 sau 6 ngày nuôi cấy bể composite 3,5 m3 sau 6 ngày nuôi cấy Hình 3.47. Ảnh hưởng của độ mặn khác nhau lên sinh Hình 3.48. Ảnh hưởng của chế độ sục khí khác nhau lên trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại trong bể sinh trưởng của T. pseudonana có MĐTB đạt cực đại ở bể composite 3,5 m3 sau 6 ngày nuôi cấy composite 3,5 m3 sau 6 ngày nuôi cấy Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d, e trong cùng thời điểm thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p
  17. 3.2.3. Thành phần hóa học của sinh khối Thalassiosira pseudonana ở quy mô pilot Tiến hành thu hoạch sinh khối T. weissflogii và T. pseudonana ở pha cân bằng sớm trong bể composite 3,5 m3 để phân tích thành phần và hàm lượng các axít béo được trình bày ở trên bảng 3.3. Bảng 3.3. Thành phần và hàm lượng các axít béo của sinh khối T. pseudonana nuôi trồng được ở bể composite 3,5 m3 Hàm lượng axít Hàm lượng axít Hàm lượng axít béo (% so với béo (% so với béo (% so với Axít béo Tên khoa học TFA) của TFA) của TFA) của T. T. pseudonana T. weissflogii pseudonana [8] C14:0 Axít Tetradecanoic 1,06 ± 0,01 0,53 ± 0,07 0,60 C14:1 - - 13,75 C15:0 Axít Pentadecanoic 1,07 ± 0,01 0,22 ± 0,05 0,51 C16:0 Axít Hexadecanoic 38,10 ± 0,03 43,01 ± 1,33 2,69 Axít Hexadecenoic 4,74 ± 0,01 - - C16:1n - 9 Axít 7 - Hexadecenoic - 12,51 ± 0,19 - C16:1n - 7 Axít 9 - Hexadecenoic 6,15 ± 0,01 3,46 ± 0,12 24,21 Axít Hexadecadienoic 12,85 ± 0,02 - - C16:2n - 4 Axít 7.10 - Hexadecadienoic - 11,13 ± 0,13 - Axít Hexadecatrienoic 8,87 ± 0,01 - - C16:3n - 3 Axít 7.10.13 - Hexadecatrienoic - 7,47 ± 0,11 - C17:0 Axít Heptadecanoic 0,72 ± 0,01 0,38 ± 0,00 27,33 C18:0 Axít Octadecanoic 1,31 ± 0,02 0,62 ± 0,07 3,11 Axít Octadecenoic 2,06 ± 0,03 - - C18:1n - 9 Axít 9 - Octadecenoic - 0,30 ± 0,00 - Axít Octadecenoic 1,37 ± 0,01 - 4,51 C18:1n - 7 Axít 11 - Octadecenoic - 0,53 ± 0,08 1,80 C18:3n - 6 Axít Octadecatrienoic 0,61 ± 0,01 - 3,99 Axít Octadecenoic 1,16 ± 0,03 - 3,38 C18:2n - 6 Axít Hexadecenoic - 0,80 ± 0,02 - C19:0 Axít Nonadecanoic 0,31 ± 0,01 0,99 ± 0,02 - C20:0 Axít Eicosanoic - 0,40 ± 0,00 1,46 C20:1n - 7 Axít 13 - Eicosenoic 0,68 ± 0,01 - - C20:3 - - 3,33 Axít Arachidonic (AA) 0,14 ± 0,00 - - C20:4n - 6 Axít Docosenoic - 0,65 ± 0,02 - C20:4n - 3 Axít 5.8.11.14 - Eicosatetraenoic - 1,55 ± 0,06 - Axít 5.8.11.14.17 - C20:5n - 3 16,42 ± 0,06 13,17 ± 0,14 2,15 Eicosapentaenoic (EPA) C22:0 Axít Docosanoic - 2,28 ± 0,08 - C22:1 - - 0,397 C22:4n - 6 Axít Docosatetraenoic 0,73 ± 0,02 - - C22:6n - 3 Axít Docosahexaenoic (DHA) 1,65 ± 0,01 - - C24:0 - - 1,01 Khác 0,02 ± 0,01 - - Tổng số axít béo no (SFAs) 42,50 ± 0,08 48,43 ± 0,20 36,72 Tổng số axít béo không no có 1 nối đôi (MUFAs) 14,99 ± 0,06 16,80 ± 0,10 44,67 Tổng số axít béo không no đa nối đôi (PUFAs) 42,44 ± 0,16 34,77 ± 0,08 12,85 Ghi chú: (-) Không phát hiện; SFAs: Axít béo no; MUFAs: Axít béo không no có 1 nối đôi; PUFAs: Axít béo không no đa nối đôi; Lô thử nghiệm: T. pseudonana; Lô đối chứng: T. weissflogii Chúng tôi đã tiến hành phân tích hàm lượng các khoáng chất đa và vi lượng của sinh khối T. pseudonana được nuôi trong bể composite 3,5 m3 và thu hoạch ở pha logarít sau 6 ngày nuôi trồng. Kết quả được trình bày ở trên bảng 3.4. 14
  18. Bảng 3.4. Thành phần hóa học của T. pseudonana QCVN 8 - STT Chỉ tiêu phân tích T. pseudonana T. weissflogii 2:2011/BYT 1 Xơ tổng số (%) 0,64 ± 0,00 0,23 ± 0,01 2 Nitơ tổng số (%) 0,47 ± 0,00 0,28 ± 0,03 3 Phospho tổng số (%) 0,06 ± 0,00 0,04 ± 0,02 4 Tro (550oC) 38,76 ± 0,02 40,42 ± 0,04 5 Protein (% SKK) 13,20 ± 0,01 6,63 ± 0,25 6 Lipít (% SKK) 20,80 ± 0,24 10,75 ± 1,17 7 Carbohydrate (% SKK) 10,00 ± 0,12 7,86 ± 0,76 8 Chlorophyll a (% SKK) 1,01 ± 0,13 0,23 ± 0,01 9 Chlorophyll b (% SKK) 0,61 ± 0,25 0,05 ± 0,01 10 Carotenoit (% SKK) 0,55 ± 0,07 0,12 ± 0,02 11 K (mg/kg) 693,02 719,74 12 Na (mg/kg) 8227,80 8676,52 13 Mg (mg/kg) 1072,52 1098,72 14 Ca (mg/kg) 200,97 207,46 15 Co (mg/kg)
  19. Ghi chú: Lô chứng: uống dung dịch NaCl 0,9% tương ứng với liều 1,00 mL/kg trọng lượng cơ thể/ngày; Lô trị 1: uống vi tảo liều 100 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày (liều dự kiến có tác dụng); Lô trị 2: uống vi tảo liều 300 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Mức liều ở lô trị 2 gấp 3 lần mức liều lô trị 1 Như vậy, T. pseudonana với các mức liều và thời gian sử dụng trong nghiên cứu không gây ảnh hưởng đến sự phát triển thể trọng của chuột. b. Ảnh hưởng của Thalassiosira pseudonana lên một số chỉ tiêu huyết học của chuột Kết quả theo dõi được trình bày ở bảng 3.7 và bảng 3.8. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của T. pseudonana lên một số chỉ tiêu huyết học của chuột (n = 8, ± SD) Thời điểm Lô chứng Lô trị 1 Lô trị 2 xét nghiệm 12 Số lượng hồng cầu trong máu chuột (x 10 tế bào/L) Trước thí nghiệm 8,06 ± 0,61 7,95 ± 0,86 7,53 ± 0,40 Sau 28 ngày 7,79 ± 0,52 6,99 ± 0,87 6,80 ± 0,71 P trước - sau >0,05 >0,05 >0,05 Hàm lượng huyết sắc tố trong máu chuột (g/dL) Trước thí nghiệm 139,25 ± 6,71 137,00 ± 10,81 132,25 ± 7,23 Sau 28 ngày 155,63 ± 5,58 145,13 ± 12,44 146,25 ± 8,26 P trước - sau >0,05 >0,05 >0,05 Số lượng bạch cầu trong máu chuột (x 109 g/L) Trước thí nghiệm 7,34 ± 0,39 7,21 ± 0,62 7,35 ± 0,53 Sau 28 ngày 9,52 ± 3,27 9,56 ± 3,35 9,83 ± 3,15 P trước - sau >0,05 >0,05 >0,05 Ghi chú: Lô chứng: uống dung dịch NaCl 0,9% tương ứng với liều 1,00 mL/kg trọng lượng cơ thể/ngày; Lô trị 1: uống vi tảo liều 100 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày (liều dự kiến có tác dụng); Lô trị 2: uống vi tảo liều 300 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Mức liều ở lô trị 2 gấp 3 lần mức liều lô trị 1 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của T. pseudonana lên công thức bạch cầu trong máu chuột (n = 8, ± SD) Thời điểm Lô chứng Lô trị 1 Lô trị 2 xét nghiệm Lympho (%) Trung tính Lympho (%) Trung tính Lympho (%) Trung tính (%) (%) (%) Trước thí nghiệm 42,41±9,98 38,34±7,81 50,55±9,88 36,24±10,26 42,06±11,46 34,54±10,55 Sau 28 ngày 48,91±2,77 40,64±12,24 42,39±12,37 43,08±11,85 47,84±13,95 37,24±5,57 P trước - sau >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Ghi chú: Lô chứng: uống dung dịch NaCl 0,9% tương ứng với liều 1,00 mL/kg trọng lượng cơ thể/ngày; Lô trị 1: uống vi tảo liều 100 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày (liều dự kiến có tác dụng); Lô trị 2: uống vi tảo liều 300 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Mức liều ở lô trị 2 gấp 3 lần mức liều lô trị 1 Như vậy, T. pseudonana sử dụng với các mức liều và thời gian khác nhau trong nghiên cứu đã không làm thay đổi các chỉ tiêu chức năng tạo máu của chuột. c. Đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan và chức năng gan chuột khi dùng Thalassiosira pseudonana dài ngày Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.9. Bảng 3.9. Đánh giá mức độ tổn thương tế bào và chức năng gan, thận của chuột khi dùng T. pseudonana dài ngày (n = 8, ± SD) Thời điểm Lô chứng Lô trị 1 Lô trị 2 xét nghiệm Hoạt độ AST trong máu chuột (UI/L) Trước thí nghiệm 148,13 ± 31,03 141,00 ± 33,16 146,25 ± 21,56 Sau 28 ngày 142,75 ± 21,86 128,88 ± 8,34 146,88 ± 16,73 P trước - sau >0,05 >0,05 >0,05 Hoạt độ ALT trong máu chuột (UI/L) Trước thí nghiệm 101,25 ± 9,21 120,63 ± 9,29 126,88 ± 22,00 Sau 28 ngày 106,38 ± 7,42 100,63 ± 9,87 107,13 ± 14,26 P trước - sau >0,05 >0,05 >0,05 Nồng độ Ure trong máu chuột (mg/dL) Trước thí nghiệm 7,69 ± 0,68 6,75 ± 1,05 5,00 ± 1,53 Sau 28 ngày 6,09 ± 1,58 5,88 ± 0,67 4,28 ± 0,79 16
  20. P trước - sau >0,05 >0,05 >0,05 Nồng độ Creatinin trong máu chuột (mg/dL) Trước thí nghiệm 56,25 ± 3,15 55,13 ± 3,18 54,50 ± 4,00 Sau 28 ngày 41,88 ± 5,38 39,75 ± 3,01 50,38 ± 25,09 P trước - sau >0,05 >0,05 >0,05 Ghi chú: Lô chứng: uống dung dịch NaCl 0,9% tương ứng với liều 1,00 mL/kg trọng lượng cơ thể/ngày; Lô trị 1: uống vi tảo liều 100 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày (liều dự kiến có tác dụng); Lô trị 2: uống vi tảo liều 300 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Mức liều ở lô trị 2 gấp 3 lần mức liều lô trị 1 Từ các kết quả trên đã khẳng định, T. pseudonana với các mức liều và thời gian sử dụng trong nghiên cứu không làm thay đổi hoạt độ của AST và ALT trong máu chuột nghiên cứu. Do đó, T. pseudonana không gây tổn thương tế bào gan và không làm ảnh hưởng đến chức năng gan chuột trong nghiên cứu. d. Đánh giá ảnh hưởng lên chức năng thận của chuột khi dùng Thalassiosira pseudonana dài ngày Kết quả được trình bày ở bảng 3.9. Như vậy, T. pseudonana với các mức liều và thời gian sử dụng trong nghiên cứu (28 ngày) không làm thay đổi nồng độ ure và creatinin trong máu chuột cho thấy chúng không ảnh hưởng lên chức năng thận của chuột. e. Giải phẫu mô bệnh học gan, thận của chuột khi dùng Thalassiosira pseudonana dài ngày Kết quả nghiên cứu mô bệnh học gan, thận chuột cho thấy T. pseudonana (liều 100 và 300 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày) dùng bằng đường uống liên tục trong 28 ngày, không gây tổn thương trên gan của chuột. Cấu trúc các bè gan bình thường, không thấy hình ảnh hoại tử, thoái hóa tế bào gan. Cấu trúc các tế bào ống thận và các vùng chức năng khác của thận bình thường. Như vậy, có thể kết luận T. pseudonana an toàn cho tôm thẻ chân trắng khi chúng sử dụng làm thức ăn tươi sống. 3.3.1.3. Hành vi của chuột thực nghiệm sau khi sử dụng sinh khối Thalassiosira pseudonana Các kết quả nghiên cứu về vận động, khả năng nhận thức và trí nhớ của chuột khi sử dụng sinh khối của T. pseudonana (tương ứng liều 100, 150 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày) đã không ảnh hưởng đến chức năng vận động nhưng lại tăng khả năng khám phá và giúp tăng cường trí nhớ ở chuột sau 4 tuần. 3.3.2. Sử dụng Thalassiosira pseudonana trong sản xuất giống tôm thẻ chân trắng 3.3.2.1. Ảnh hưởng của loại thức ăn đến sinh trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng a. Ảnh hưởng của loại thức ăn đến tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng tôm thẻ chân trắng nuôi trong bể composite 50 lít Hình 3.50. Hình ảnh nuôi cấy của T. pseudonana ở quy mô phòng thí nghiệm đến pilot, ứng dụng sản xuất giống và nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng (A): đĩa thạch, (B): Ảnh tế bào dưới kính hiển vi quang học nuôi trong đĩa, (C): ống nghiệm, (D): bình thủy tinh 0,25 L, (E): bình thủy tinh 1 L, (F): bình thủy tinh 2 L, (G): bể composite 0,2 m3, (H, I): bể composite 1 m3, (K, L, M, N, O): bể composite 3,5 m3, (P, Q): ương nuôi ấu trùng tôm thẻ chân trắng trong bể xi măng 30 m3, (R, S): nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng trong ao có diện tích 6.400 m2 17
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2