Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

43
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh được loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên trồng ở Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp và Tây Ninh; tạo được oligochitosan-silica nano trên cơ sở các phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định và hiệu quả kích kháng cao đối với bệnh thán thư trên ớt.... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- PHẠM ĐÌNH DŨNG NGHIÊN CỨU TẠO OLIGOCHITOSAN-SILICA NANO VÀ KHẢO SÁT TÍNH KÍCH KHÁNG BỆNH THÁN THƯ DO NẤM Colletotrichum spp. GÂY HẠI CÂY ỚT (Capsicum frutescens L.) Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 9 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – 2020
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. BÙI VĂN LỆ Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 20…. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Ớt (Capsicum sp.) là cây gia vị trồng ở vùng nhiệt đới, được tiêu thụ trên khắp thế giới do có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, dịch bệnh do nấm, virus và vi khuẩn gây ra trên cây ớt là một vấn đề gây trở ngại rất lớn đến quá trình canh tác. Trong các loại bệnh trên ớt, bệnh do nấm là một trong các bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất là và làm tổn thất từ 10 - 80% sản lượng ớt ở Việt Nam và các nước trên thế giới như Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc. Các loại bệnh nấm thường gặp trên cây ớt là bệnh héo cây con (Rhizoctonia solani), bệnh thán thư (Colletotrichum spp.), bệnh mốc xám (Botrytis cinerea), bệnh héo vàng lá (Fusarium oxysporum), bệnh sương mai (Phythopthora capsici), trong đó bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra là loại bệnh phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đối với cây ớt. Bệnh thán thư trên cây ớt do nấm Colletotrichum spp. gây ra, nấm gây hại trên cả cành, lá, bông và trái. Trên vỏ trái vết bệnh lúc đầu là những đốm hình tròn úng nước lỏm vào bên trong, sau đó cứ lan rộng dần, nếu nặng nhiều vết hoà lẫn với nhau bao gần hết cả vỏ trái rồi khô dần và chuyển sang màu nâu xám hay xám, bên trong có nhiều vòng đồng tâm và có những chấm nhỏ li ti màu đen, làm cho trái teo quắt lại không ăn được hoặc gây rụng trái, có thể gây thiệt hại làm giảm năng suất 70 - 80%. Hiện nay, nhiều loại thuốc hóa học được sử dụng để phòng trừ các loại nấm gây hại cho cây trồng, tuy nhiên việc sử dụng với liều lượng cao trong thời gian dài đã làm mất cân bằng quần thể vi sinh vật có ích trong đất, tạo điều kiện để nấm bệnh và các loài côn trùng có hại cho cây trồng trở nên kháng thuốc. Dư lượng thuốc trừ sâu trong sản phẩm nông nghiệp và đất đã làm ô nhiễm nguồn nước ngầm, môi trường và gây tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe con người và vật nuôi. Biện pháp trồng giống chống chịu bệnh bị hạn chế do năng suất và độ ổn định giống không cao. Biện pháp sinh học sử dụng chất kích kháng thực vật (elicitor) giúp kích hoạt các cơ chế đề kháng bệnh trong cây trồng là một xu hướng phát triển nông nghiệp xanh
2 đang được áp dụng rộng rãi trên thế giới với mục đích giảm thiểu tối đa việc sử dụng các hóa chất độc hại và sử dụng giống chuyển gen. Chitin và silic là hai nguồn nguyên liệu phổ biến trong tự nhiên. Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan, oligochitosan (dẫn suất của chitin) cùng với silic và silica nano khi dùng riêng lẻ hoặc phối hợp có các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm và làm tăng khả năng chống chịu bệnh ở đa số các loài thực vật, giúp cây tiết ra một số enzyme, hoạt chất chống lại sự xâm nhập của nấm, vi khuẩn gây bệnh; kích thích sự tăng trưởng và phát triển cây trồng. Xuất phát từ các lý do trên đề tài ‘Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)’ đã được thực hiện. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh được loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên trồng ở Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp và Tây Ninh. - Tạo được oligochitosan-silica nano trên cơ sở các phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định và hiệu quả kích kháng cao đối với bệnh thán thư trên ớt. - Đánh giá được khả năng phòng trừ bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà màng và ngoài đồng ruộng của oligochitosan-silica nano tạo được. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Luận án gồm các nội dung sau: - Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu phân lặp và định danh bằng hình thái, và đặc điểm phân tử loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.). - Nội dung 2: Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano. - Nội dung 3: Đánh giá khả năng kích kháng đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides và C. truncatum
3 gây ra của oligochitosan-silica nano tạo được trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Nội dung 4: Đánh giá khả năng kích kháng đối với bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano tạo được trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng và ngoài đồng. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về cây ớt Cây ớt (Capsicum sp.) thuộc họ cà (Solanaceae) có nguồn gốc từ Châu Mỹ, có dạng bụi nhỏ, thường cao 60-80 cm có thể cao đến 1 m; thân nhẵn, có nhiều cành; Lá mọc so le, hình thuôn dài, đầu nhọn; Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá. Ớt là cây dễ trồng, không kén đất và thích hợp với nhiều vùng sinh thái. Trong vỏ quả ớt có chứa alkaloid là capsaicin. Cây ớt đòi hỏi khí hậu ấm áp và độ ẩm cao cho sự tăng trưởng và thời tiết khô trong quá trình trưởng thành. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây ớt là từ 18-30oC. Nhiệt độ cao trên 32oC hoặc thấp dưới 15oC cây tăng trưởng kém và hoa dễ rụng (Tripodi vả Kumar, 2019). Chi (genus) ớt có khoảng 25-30 loài nhưng có năm loài (Capsicum frutescens L., C. annuum L., C. chinense Jacq, C. pubescens Keep và C. baccatum L.) đã được thuần hóa và canh tác. Hiện nay, C. frutescens L. là loài được trồng phổ biến nhất kế đó là C. annuum L.. (Jaret và cộng sự 2019) 1.2. Sơ lược về nấm Colletotrichum spp. và bệnh thán thư trên cây ớt 1.2.1. Giới thiệu chung về nấm Colletotrichum spp. Nấm Colletotrichum spp. thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Sordarriomycetes, bộ Phyllachorales, họ Phyllachoraceae. Bệnh do nấm Colletotrichum spp. rất phổ biến trên cây trồng (cây hoa kiểng, cây ăn lá và cây ăn quả). Theo xếp hạng của Tạp chí Bệnh học thực vật phân tử (2012), nấm Colletotrichum spp., gây ra bệnh thán thư, được xếp ở vị trí thứ 8 trong 10 loại nấm gây bệnh cây hàng đầu, làm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sinh trưởng, phát triển và năng suất trên nhiều loại cây trồng có giá trị như cây có múi, ớt (Capsicum sp.), đậu tương (Glycine
4 max (L.) Merr.), cà chua (Solanum lycopesicum) (Dean và cộng sự 2012; Cannon và cộng sự 2012) Hính 1.2. Nảy mầm Bào tử nang phát triển Hình 1.2. Chu trình gây bệnh do nấm Colletotrichum spp. trên thực vật (A, B) và cây phân loại của nấm (C) 1.3. Tổng quan về Cơ chế kháng và kích kháng bệnh ở thực vật 1.3.1. Cơ chế kháng bệnh ở thực vật: Có 2 cơ chế kháng bệnh ở thực vật: cơ chế thuộc cấu trúc mô học và cơ chế thuộc về sinh hóa học (Andersen và cộng sự 2018). Cơ chế kháng bệnh về mặt mô học có 4 cơ chế, tùy thuộc vào 4 cách xâm nhập của nấm gây bệnh (Shen và cộng sự 2017). Đối với cơ chế kháng bệnh thuộc về sinh hóa học thì cơ chế kháng bệnh đầu tiên được phản ứng tại vi trí xâm nhiễm (Localized Acquired Resistance hay LAR) và sau đó lan truyền đến cả hệ thống thực vật (Systemic Acquired Resistance hay SAR) (Gao và cộng sự 2015) SAR (kháng hệ thống) liên kết với tác động gây nhiểm bởi PAMPs hay DAMPs còn MAMPs liên kết với tính kháng cảm ứng của thực vật hay ISR (Induced Systemic Resistance). SAR và ISR cùng giúp thực vật chống lại sự tấn công bởi các tác nhân gây bệnh (Virus, nấm, vi khuẩn hay côn trùng, động vật ăn cỏ, hóa chất). Các nghiên cứu sinh
5 học phân tử cho biết các elicitor hormone thực vật như acid salicylic (SA), acid jasmonic (JA) và Ethylen (ET) đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát mạng lưới tín hiệu tạo tính kháng thực vật trong đó SA tham gia con đường SAR còn JA, ET đi theo con đường ISR (Imran và Yun 2020). 1.3.2. Chất kích kháng bệnh (elicitor) ở thực vật Gần đây một số chất đã được phát hiện có vai trò này, gọi là chất kích kháng (elicitor). Khi xử lý chất kích kháng trực tiếp trên hạt giống, lá cây, rễ cây hoặc cho vào đất, các cơ chế kháng trong cây trồng sẽ được “đánh thức” giúp cây trồng kháng lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh hay hạn chế tổn thương do tác động từ các yếu tố môi trường. Chất kích kháng không trực tiếp tiêu diệt mầm bệnh mà chỉ kích hoạt các cơ chế đề kháng trong cây trồng. Số lượng và nguồn gốc chất kích kháng rất đa dạng. Các elicitor thông qua các thụ quan (receptor) và con đường truyền tín hiệu (perception and signal transduction) tạo nên sự đáp ứng miễn dịch ở thực vật (plant innate immunity). Chất kích kháng có thể phân loại thành hai nhóm: Chất kích kháng tổng quát và chất kích kháng chuyên biệt. Chất kích kháng tổng quát có khả năng gây ra sự đề kháng ở bất cứ loài thực vật chủ nào, trong khi đó các chất kích kháng chuyên biệt chỉ tạo tính kháng ở những vật chủ chuyên biệt. Chất kích kháng tổng quát tạo nên các đáp ứng miễn dịch sơ cấp thực vật (primary innate immunity) và PTI (PAMP triggered immunity). Chất kích kháng chuyên biệt tạo ra bởi một vài tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn) phóng thích chất cảm ứng đặc biệt (effector hay còn gọi protein Avr) ức chế con đường kháng bệnh sơ cấp PTI thực vật, làm cho một số thực vật trở nên mẫn cảm với tác nhân gây bệnh. Trong trường hợp này để kháng bệnh, thực vật hoạt hóa một con đường đề kháng thứ hai để tạo ra tính miễn dịch (Secondary innate immunity) hay ETI (Effector-triggered- immunity) thông qua trung gian các gen kháng R (gen R) dùng trung hòa các sản phẩm gen gây nhiễm (gen Avr). Các chất kích kháng thường không có chung một cấu trúc hóa học, nó là một phổ rộng các nhóm chất khác nhau như oligosaccharide, peptide, protein, glycoprotein và lipid. Các chất kích kháng
6 oligosaccharide bao gồm oligoglucan, oligochitin, oligochitosan và oligogalacturonic. Chúng thường là những phân tử từ cấu tạo vách tế bào (glucan, chitin, flagellin vi khuẩn hay lipopolysaccharide (LPS), hay những chất được xâm nhập bởi sự tấn công của tác nhân gây bệnh. Một vài elicitor có chức năng chưa rõ. Trong tương tác gây bệnh thực vật, elicitor cảm ứng sản xuất các enzyme phân hủy vách tế bào, phóng thích các phân đoạn pectic, oligogalacturonides (OGAs) đóng vai trò các nội elicitor (Abdul-Malik và cộng sự 2020) Hình 1.4. Hình 1.4. Cơ chế kháng bệnh nấm ở thực vật (A) và cơ chế kích kháng của chitin (B) Các elicitor do virus hay côn trùng có thể là các acid béo amino acid liên hợp (Fatty acid Amino acid Conjugates) dẫn tới sự hình thành các hợp chất bay hơi dẫn dụ hay hoạt hóa các gen kháng côn trùng. Các elicitor hóa học hoạt hóa tính kháng bao gồm việc tích lũy phytoalexin. Các elicitor là những tác nhân phi sinh học (abiotic) như ion kim loại và hợp chất vô cơ hay các chất chuyển hóa từ các sinh vật khác như các chất hóa học phóng thích từ vị trí tấn công hay tích lũy trong hệ thống do bệnh hay côn trùng gây ra (Tawasaki và cộng sự 2017; Jamiolkowska 2020).
7 1.4. Chitin/Chitosan và Silic trong kích kháng bệnh cây trồng 1.4.1. Vai trò chitin/chitosan trong kích kháng bệnh Chitin (poly N-acetylglucosamin) là một đại phân tử trùng hợp từ N-acetyl-D-glucosamin liên kết bởi cầu nối β (1-4) glucoside, có trọng lượng phân tử lớn. Chitosan là một polyglucosamin được chuyển hóa từ chitin sau khi được khử nhóm acetyl (deacetylation). Mức độ deacetyl hóa ảnh hưởng đén khả năng hòa tan của chitosan trong dung dịch acid loãng. Một tính năng đặc biệt của cấu trúc hóa học của chitosan là sự hiện diện của các nhóm amin đã bị oxi hóa. Những nhóm này trở thành cation trong môi trường acid thúc đẩy sự hòa tan của chitosan thành các đơn vị poly-electrolyte trong dung dịch. Đây là các sản phẩm tự nhiên, không độc, an toàn với môi trường và được sử dụng rộng rãi (Katiyar và cộng sự 2015). Các khảo sát về chitin và các phân đoạn thủy phân cho thấy chúng có khả năng tác động trực tiếp chống lại các tác nhân gây bệnh như nấm và Oomycete thông qua cơ chế gia tăng khả năng đề kháng của cây dựa theo con đường PTI (PAMP triggered Immunity), giúp cây tiết ra các chất kháng lại sự xâm nhập của mầm bệnh (Imran và cộng sự 2020). Bên cạnh đó, khi chitin xâm nhập vào mô cây, thường kết dính quanh các vị trí xâm nhập và có ba tác động chính: Thứ nhất là lập hàng rào cách ly vị trí xâm nhập để tránh mầm bệnh lây lan và bảo vệ các tế bào khỏe mạnh khác. Tại vị trí cách ly, cây sẽ nhận biết để kích thích sự phản ứng nhạy cảm giúp tiết ra các oxygen hoạt hóa (Reactive oxygen species, ROS) để giúp tăng cường thành tế bào và báo động cho các tế bào bên cạnh. Chitin có điện tích dương và có khả năng bám chặt vào màng sinh học, chitin cung cấp khả năng làm lành vết thương nhanh chóng khi có tổn hại cơ học hay mầm bệnh tấn công. Chitin là chất có khả năng kích hoạt các cơ chế phòng thủ của cây, chitin tiếp xúc với các mô thực vật và kích thích tiết ra các enzyme bảo vệ như chitinase, glucanase, các protein kháng bệnh hay các hợp chất phytoalexin để từ đó tiêu diệt mầm bệnh và kích kháng cây trồng (Jamiolkorska 2020). Các nghiên cứu sử dụng chitin
8 và oligochitin cho kích kháng bệnh thực vật cho thấy cơ chế kích kháng bệnh của chitin thông qua con đường PTI với vai trò thụ quan kinase của chitin trong tương tác chitin và thực vật (Hình 1.4B). Chitin liên kết với các tiểu phần thụ quan là CEBiP (Chitin elicitor binding protein, motif lysine hay LYM) và CERK1 (Chitin elicitor receptor kinase 1) trên màng tế bào mở đầu con đường truyền tín hiệu RLCK (Receptor Like cytoplasmic Kinase) dẫn truyền đến RLCK185 qua sự phosphoryl hóa MAPKK (Mitogen activated ptotein kinase) theo tầng để cảm ứng tính kháng bệnh thực vật từ chitin. Một cơ chế tương tự cũng được tìm thấy trên thụ quan PBL27 của Arabidopsis thaliana. Trong thí nghiệm này phân đoạn oligochitin (DP = 7 - 8) được tìm thấy thích hợp cho con đường truyền tín hiệu trong Arabidopsis thaliana (Kawasaki và cộng sự 2017). Kết quả dựa trên cây mô hình được thực hiện khẳng định vai trò kích kháng thực vật của chitin. 1.4.2. Vai trò Silic trong kích kháng bệnh Silic (Si) được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp và nhiều lĩnh vực khác nhau. Si được báo cáo làm tăng cường tăng trưởng và nâng cao năng suất của thực vật. Si cải thiện một số hình thái và đặc tính cơ học (chiều cao, chỉ số ure, tiếp xúc của lá với ánh sáng, kích kháng) ở một số loài thực vật. Si giảm bốc hơi nước và tăng cường sức đề kháng cho cây trồng chịu hạn, mặn, nhiễm độc kim loại và làm tăng hoạt động của enzyme. Si còn tham gia vào sự tái tạo vách tế bào một hàng rào phòng thủ hữu hiệu ở thực vật. Si bảo vệ thực vật chống lại stress, không làm ảnh hưởng đến tăng trưởng và năng suất cây trồng. Hơn nữa, Si đã được chứng minh giúp cải thiện sức đề kháng ở nhiều thực vật đối với tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn và virus) khác nhau (Sakr 2016; Bhat và cộng sự 2019]. Có hai giả thuyết cho rằng SI nâng cao kháng nấm bệnh đã được đề xuất. Đầu tiên là sự liên kết với lắng động cao hơn của sI trong lá để hình thành các rào cản vật lý để cản trở tác nhân gây bệnh xâm nhập (phòng thủ vật lý). Điều thứ hai có liên quan đến vai trò hoạt tính sinh học của nó trong sự biểu hiện của cơ chế phòng vệ tự nhiên (phòng thủ sinh hóa) với sự tăng hoạt động của các
9 enzyme phòng vệ liên quan trong lá như polyphenoloxidase, peroxidase, phenylalanine ammonialyase, chitinase, β-1,3- glucanase …; sự gia tăng hợp chất kháng nấm, như là sản phẩm chuyển hoá phenolic (lignin), flavonoid, phytoalexin và protein liên quan bệnh trên thực vật; và sự kích hoạt của một số gen phòng bệnh trên thực vật (Epstein 2009). 1.5. Chế tạo oligochitosan, nano silica và ứng dụng trong kích kháng bệnh Sự kết hợp chitosan/oligochitosan với các kim loại khác như vàng, bạc hay kẽm (hạt nano) cho thấy có nhiều hiệu quả hơn do hiệu ứng phối hợp và được áp dụng rộng rải trên nhiều lĩnh vực khác nhau như y học, thực phẩm và nông nghiệp. CHƯƠNG 2. NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu * Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu phân lặp và định danh bằng hình thái, đặc điểm phân tử loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên. - Phân lập nấm gây bệnh thán thư trên cây ớt -Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng gây bệnh của các mẫu phân lập nấm bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm. -Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng gây bệnh của các mẫu phân lập nấm bệnh trong điều kiện nhà màng. - Định danh hình thái và sinh học phân tử các loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt đã phân lập. * Nội dung 2: Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano. - Điều chế các phân đoạn oligochitosan - Đánh giá khả năng ức chế nấm bệnh thán thư C. gloeosporioides của các phân đoạn oligochitosan điều chế - Điều chế hạt nano silica từ vỏ trấu - Điều chế oligochitosan-silica nano * Nội dung 3: Đánh giá khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra của
10 oligochitosan-silica nano trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm - Thí nghiệm 3 và 4: đánh giá khả năng kích kháng nấm C. gloeosporioides và C. truncatum của oligochitosan. - Thí nghiệm 5 và 6: đánh giá khả năng kích kháng nấm C. gloeosporioides và C. truncatum của nano silica. - Thí nghiệm 7 và 8: đánh giá khả năng kích kháng nấm C. gloeosporioides và C. truncatum của oligochitosan-silica nano. * Nội dung 4: Đánh giá khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng và đồng ruộng - Thí nghiệm 9 và 10: đánh giá khả năng kích kháng nấm C. gloeosporioides và C. truncatum của oligochitosan trong điều kiện nhà màng. - Thí nghiệm 11 và 12: đánh giá khả năng kích kháng nấm C. gloeosporioides và C. truncatum của nano silica trong điều kiện nhà màng. - Thí nghiệm 13 và 14: đánh giá khả năng kích kháng nấm C. gloeosporioides và C. truncatum của oligochitosan-silica nano trong điều kiện nhà màng. - Thí nghiệm 15 và 16: đánh giá khả năng kích kháng nấm C. gloeosporioides và C. truncatum của oligochitosan trong điều kiện đồng ruộng. - Thí nghiệm 17 và 18: đánh giá khả năng kích kháng nấm C. gloeosporioides và C. truncatum của nano silica trong điều kiện đồng ruộng. - Thí nghiệm 19 và 20: đánh giá khả năng kích kháng nấm C. gloeosporioides và C. truncatum của oligochitosan-silica nano trong điều kiện đồng ruộng. Nội dung chi tiết theo sơ đồ sau: Nội dung 1 Nội dung 2 Kết quả tốt nhất từ ND 1, 2 Nội dung 3 Nội dung 4
11 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nội dung 1. Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh chủng nấm gây bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây ớt 2.2.1.1 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh thán thư trên cây ớt - Phân lập nấm sử dụng môi trường PDA 2.2.1.2 Đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm bệnh đã phân lập trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà màng - Khả năng gây bệnh của các chủng nấm bệnh được đánh giá theo cấp độ bệnh trên lá/trái theo QCVN 01- 160:2014/BNNPTNT. 2.2.1.3 Định danh hình thái và sinh học phân tử các chủng nấm gây bệnh -Định danh hình thái các chủng nấm bệnh dựa theo Sutton (1992). Định danh sinh học phân tử bằng kỹ thuật PCR dựa vào tham khảo trình tự các mồi khuếch đại các vủng gene đặc trưng của nấm ( ITS4,5; GPDH; TUB2; GS; CHS và CAL). 2.2.2 Nội dung2. Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan- silica nano (SiO2) 2.2.2.1 Điều chế các phân đoạn oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp bằng phương pháp xạ tia xác định liều lượng chiếu xạ tia ɣ Co60 kết hợp với H2O2 Phương pháp điều chế các phân đoạn oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp (2,5 kDa-10 kDa), khảo sát một số đặc trưng tính chất phân đoạn (IR và XRD). Phương pháp đánh giá khả năng ức chế nấm bệnh của các phân đoạn oligochitosan bằng cách đo hoạt lực ức chế đưởng kính (mm) khuẩn lạc nấm Colletotrichum sp phát triển trên môi trường PDA có hay không có bổ sung phân đoạn oligochitosan điều chế 2.2.2.2 Điều chế hạt silica nano từ nguồn vỏ trấu Phương pháp nung ở nhiệt độ cao 700oC kế hợp HCl 5-10% dùng điều chế hạt silica nano từ vỏ trấu và đặc trưng tính chất của hạt silica nano điều chế (TEM, XRD, EDX).
12 2.2.2.3 Điều chế hỗn hợp oligochitosan-silica nano Dùng phương pháp phối trộn nguyên liệu giữa oligochitosan và silica nano ở độ bền pH thích hợp (5; 6,5; 7,5; 8,5) kết hợp với chất tạo đặc HEC (Hydroxylethylcellulose) và khảo sát tính chất chế phẩm tạo hành (TEM, FT-IR) 2.2.3 Nội dung3. Đánh giá khả năng kích kháng bệnh nấm Colletotrichum spp. của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm 2.2.3.1 Đánh giá về tình hình bệnh thán thư do nấm Colletotricum spp. trên cây ớt - Thí nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kích kháng bệnh trong phòng thí nghiệm được thực hiện trên vỉ xốp loại 50 lỗ (55 cm x30 cm x5 cm). Cây ở giai đoạn 2 lá được chuyển sang các ly nhựa được trồng trong phòng sinh trưởng điều kiện 16 giờ sáng/ngày với nhiệt độ khoảng 28oC±2oC. Cây ớt được xử lý nấm bệnh và chế phẩm theo từng nghiệm thức trước khi phân tích 2.2.4. Nội dung 4. Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum spp. của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trong điều kiện nhà màng và đồng ruộng Thí nghiệm trong nhà màng và đồng ruộng được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố và 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức bố trí 30 cây ớt/lần lặp lại. Số ô thí nghiệm là 5 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 15 ô. Mỗi ô thí nghiệm có diện tích là 20 m2, tổng diện tích thí nghiệm 900 m2 2.2.5. Xử lý số liệu Số liệu được phân tích phương sai ANOVA và trắc nghiệm phân hạng Duncan với xác suất tin cậy P < 0,01 bằng chương trình SAS 9.1. Các số liệu được chuyển đổi trước khi phân tích: chuyển đổi arsin√x đối với chỉ tiêu tỷ lệ bệnh; √x đối với chỉ tiêu chỉ số bệnh (Gomez và Gomez, 1984).
13 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.) Tổng cộng đã thu thập được 20 mẫu bệnh thán thư hại ớt (trên thân, lá và trái) trên các ruộng ớt sản xuất tại Củ Chi (Thành phố Hồ Chí Minh), Thanh Bình (Tỉnh Đồng Tháp) và Tân Châu (Tỉnh Tây Ninh). Kết quả ghi nhận được cho thấy có 20 mẫu phân lập nấm là Colletotrichum spp. dựa trên khóa phân loại của Sutton (1992) [103] với các đặc điểm: hệ sợi nấm khí sinh mọc bung trên mặt thạch hay mọc sát mặt thạch. Tản nấm có dạng hình hoa hay hình tròn. Tản nấm có màu trắng, cam nhạt đến màu hồng hay màu nâu xám đến xám đen; mép gợn sóng hay mép cong tròn. Xuất hiện những hạch nấm màu đen trên bề mặt hệ sợi nấm. Bào tử có dạng từ hình trụ, hai đầu tròn, một đầu nhọn một đầu tròn hay hai đầu nhọn, đến dạng bào tử hình hơi thoi nhọn hai đầu hay bào tử có dạng hình liềm. Ổ bào tử dạng giọt dầu màu cam đến đen. Đĩa cành có hoặc không có lông gai. Bào tử nảy mầm sau 12 giờ, hình thành giác bám sau 24 giờ, giác bám có dạng hình tròn, hình trụ, hình thùy, hình trứng ngược hay bất định, có hoặc không có phân thùy. Lúc mới hình thành giác bám không màu về sau có màu nâu đến nâu đen, bề mặt trơn hay gồ ghề. Kết quả lây nhiễm của các chủng nấm Colletotrichum spp. đã phân lập trên mẫu trái trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy có 20 chủng nấm Colletotrichum spp. đều gây bệnh trên trái trong điều kiện gây vết thương và có 4 mẫu nấm gây bệnh trong điều kiện không gây vết thương sau 7 ngày NSLN là TN-Tr2 TN-L3, TN-Th1, và ĐT-Th1.Kết quả lây nhiễm của các chủng nấm Colletotrichum spp. đã phân lập trên mẫu lá cho thấy, trong điều kiện có gây vết thương các dòng nấm gây bệnh nhưng không gây bệnh ở điều kiện không gây vết thương. Các mẫu phân lập TN-L3, TN-Tr2, TN-L1 và TN-Th1 cho tỷ lệ bệnh cao tại thời điểm 3 NSLN, 7 NSLN và có khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê. Các mẫu phân lập TN-L3, HCM-Tr2 và TN- Th1 có chỉ số bệnh có giá trị cao nhất. Kết quả đánh giá khả
14 năng gây bệnh của các chủng nấm Colletotrichum spp. trên giống ớt chỉ thiên trong điều kiện nhà màng cho thấy mẫu phân lập TN–L3, HCM-Tr2, TN-Tr2, HCM-L2, TN-Th1 và ĐT-Th1 có khả năng gây bệnh trên cây ớt thí nghiệm là cao nhất. Sự khác biệt giữa các nghiệm thức thí nghiệm rất có ý nghĩa về mặt thống kê. TN-Tr2 HCM-Tr2 Hình 3.2. Đặc trưng hình thái của Colletotrichum gloeosporioides qua các mẫu TN-Th1 HCM-L2 ĐT-Th1 Hình 3.3. Đặc trưng hình thái của Colletotrichum truncatum qua các mẫu Kết quả định danh các chủng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt (Capsicum frutescens L.) đã phân lập có độc tính cao bằng đặc điểm hình thái học và phương pháp sinh
15 học phân tử cho kết quả mẫu phân lập TN-Tr2 và HCM-Tr2 thuộc phức hợp loài Colletotrichum gloeosporioides và mẫu phân lập TN-Th1, TN-L3, HCM-L2 và ĐT-Th1 là Colletotrichum truncatum. Bảng 3.6. Kết quả định danh loài Colletotrichum spp. dựa vào trình tự các vùng gen Tên mẫu/ TN-Tr2 (1) HCM-Tr2 (2) ĐT-TH1 (3) TN-TH1 (4) HCM-L2 (5) TN-L3 (6) Vùng gen ITS (I) C.gloeosporioides C. scovillei C. truncatum C. truncatum C. truncatum C. truncatum ACTIN (A) C. siamense C. siamense C. truncatum C. truncatum C. truncatum C. truncatum GAPDH (G) C. siamense C. scovillei C. truncatum C. truncatum C. truncatum C. truncatum TUBULIN (T) C. siamense C. scovillei C. truncatum C. truncatum C. truncatum C. truncatum GS (S) C. gloeosporioides C. acutatum C. truncatum C. truncatum C. truncatum C. truncatum CHS (C) C. fructicola C. scovillei C. truncatum C. truncatum C. truncatum C. truncatum CAL (L) C. siamense C. scovillei C. siamense C. siamense C. siamense C. siamense 3.2. Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano 3.2.1. Điều chế oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp bằng phương pháp xác định liều lượng chiếu xạ tia ɣ Co60 kết hợp với H2O2 Khi tăng liều xạ, khối lượng phân tử (KLPT) của chitosan đều giảm xuống đối với cả 3 mẫu dung dịch chitosan 4% có và không có H2O2 (Bảng 3.7). Khi có mặt H2O2, mức độ suy giảm KLPT của chitosan nhanh hơn so với dung dịch không có H2O2 và mức độ suy giảm tăng khi hàm lượng H2O2 tăng từ 0,5 đến 1%. Từ kết quả Bảng 3.7, chọn được 02 mẫu oligochitosan từ dung dịch chitosan 4%/H2O2 1%, chiếu xạ ở liều 10,5 và 17,5 kGy có KLPT tương ứng là 7,7 kDa và 4,6 kDa dùng cho thí nghiệm ức chế nấm bệnh trên thực vật. Bảng 3.7. Sự suy giảm KLPT của chitosan trong dung dịch 4% có và không có H2O2 theo liều xạ Liều xạ, kGy CTS 4% CTS 4%/H2O2 0,5% CTS 4%/H2O2 1% 0 44,500 44,500 44,500 3,5 19,000 17,900 16,700 7,0 14,800 12,600 10,500 10,5 12,300 9,000 7,700 14,0 10,500 6,600 5,500 17,5 9,100 5,500 4,600 21,0 7,900 5,000 4,200
16 Bảng 3.8. Độ ĐĐA% và chỉ số đa phân tán (PI) của chitosan Liều CTS 4% CTS 4%/H2O2 0,5% CTS 4%/H2O2 1% xạ, ĐĐA % PI ĐĐA % PI ĐĐA % PI kGy 0 91,3 3,37 91,3 3,37 91,3 3,37 3,5 90,2 2,63 89,9 2,78 89,6 2,69 7,0 89,4 2,60 89,1 2,52 88,5 2,55 10,5 89,0 2,56 88,6 2,48 87,7 2,31 14,0 88,7 2,49 88,0 2,18 86,2 1,95 17,5 88,5 2,43 87,6 1,97 85,9 1,81 21,0 88,3 2,30 87,2 1,88 85,6 1,71 Kết quả Bảng 3.8 cho thấy đối với mẫu chitosan 4%/H2O2 1%, liều xạ 21 kGy, ĐĐA giảm từ 91,3% của chitosan trước khi chiếu xạ xuống thấp nhất là 85,6%. KLPT của chitosan hoặc oligochitosan càng nhỏ chỉ số PI càng thấp chứng tỏ độ phân tán hẹp và đồng nhất hơn mẫu chitosan ban đầu (PI=3,37). Với nồng độ chitosan nhỏ hơn, cụ thể là 2% thì mức độ suy giảm KLPT theo liều xạ nhanh hơn so với dung dịch chitosan nồng độ cao (4%). Từ kết quả bảng 3.9, lựa chọn được mẫu oligochitosan có KLPT 2,5 kDa nhận được ở liều xạ 21 kGy dùng để thí nghiệm kích kháng trên cây ớt. Bảng 3.9. KLPT (Mw), PI và ĐĐA của chitosan trong dung dịch 2%/ H2O2 0,5% theo liều xạ Liều xạ, kGy KLPT, Mw ĐĐA % PI 0,0 44.500 91,3 3,37 3,5 11.900 90,7 2,90 7,0 6.300 89,4 2,33 10,5 4.400 88,1 1,63 14,0 3.500 87,6 1,40 17,5 2.900 86,4 1,32 21,0 2.500 85,9 1,25 Tính chất phổ hồng ngoại (IR): Kết quả phổ hồng ngoại trên hình 3.6 cho thấy chitosan cắt mạch tạo oligochitosan có KLPT từ 2,5 kDa đến 7,7 kDa có cấu trúc chính hầu như không thay đổi so với chitosan ban đầu (Hình IR 3.6a).
17 Đã lựa chọn 03 mẫu oligochitosan với KLPT là: 7,7 kDa; 4,6 kDa và 2,5 kDa để làm thí nghiệm kích kháng bệnh và tăng trưởng đối với cây ớt. Mẫu oligochitosan cũng được dùng để tạo hỗn hợp vật liệu lai với nano (SiO2) chế tạo từ vỏ trấu. Các kết quả khảo sát cho thấy phân đoạn Oligochitosan 2 (4,6 kDa) nồng độ 0,1% có khả năng ức chế nấm Colletotrichum spp. thích hợp nhất trong ba phân đoạn Oligochitosan được khảo sát. Hình 3.6. Phổ hồng ngoại (IR) và nhiễu xạ tia X (XRD) của các mẫu chitosan (a) và các phân đoạn oligochitosan 7,7 kDa (b); 4,6 kDa (c) và 2,5 kDa (d) 3.2.2 Điều chế hạt nano silica (SiO2) từ nguồn vỏ trấu Vỏ trấu xử lý với axít khi nung tạo ra nano SiO2 màu trắng và độ tinh khiết cao. Hiệu suất tạo nano SiO2 từ vỏ trấu được xử lý thống kê là: 10,21± 0,38% (Bảng 3.15). Kích thước hạt nano SiO2 chế tạo được trong khoảng 10-30 nm. Bảng 3.15. Hiệu suất tạo nano silica từ vỏ trấu đã xử lý với axít 5% Mẫu Vỏ trấu (g) nano-SiO2 (g) Hiệu suất (%) 1 5 0,5105 10,33 2 5 0,5022 10,04 3 5 0,5128 10,26 Kết quả (theo Hình 3.8A, B) cho thấy kích thước hạt nano silica chế tạo được trong khi nung vỏ trấu ở 700oC, 2 giờ khoảng 10 - 30 nm. Kết quả cũng cho thấy phân bố kích thước hạt nano silica là phân bố hình chuông (Gaussian distribution). Giản đồ
18 nhiễu xạ tia X của nano silica trên Hình 3.8D cho thấy chỉ có 1 đỉnh 2 ~22o. Thí nghiệm dùng vỏ trấu (không phải là than đốt từ vỏ trấu) được xử lý với acid HCl trước khi nung, do đó các tạp chất oxíd kim loại đã được loại bỏ. Mặc dù vậy trong nano silica vẫn còn tạp chất Al2O3 (k tại đỉnh 1.486 keV) với hàm lượng ~0,7% tính theo thành phần nguyên tử. Các giá trị k của Silicon (Si) và oxy (O) trên phổ EDX tương ứng là 1,739 và 0,525 keV (Hình 3.8E). Kết quả nầy tương tự với cấu trúc vô định hình nano silica nhận được từ nung vỏ trấu. Hình 3.8. Hình chụp TEM (A, B); phân bố kích thước hạt đo bằng phương pháp tán xạ laser (C); và các giản đồ XRD (D) và EDX (E) hạt nano silica điều chế Kết luận: Đã chế tạo được nano silica theo phương pháp nung vỏ trấu đã được xử lý với acid để loại bỏ các tạp chất chủ yếu là ion kim loại. Kích thước hạt nano silica nhận được trong khoảng 10 - 30 nm với đặc trưng cấu trúc pha vô định hình có đỉnh nhiễu xạ tia X góc 2 ~22o. Sản phẩm nano silica nhận được dùng cho thí nghiệm kích kháng bệnh và tăng trưởng đối với cây ớt. Ngoài ra, nano silica còn được sử dụng chế tạo hỗn hợp vật liệu lai oligochitosan-silica nano cũng với mục đích