Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử" trình bày các nội dung chính sau: Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ trên thị trường; Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Phan Thị Thanh Hà NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ VI RÚT CÓ NGUY CƠ CAO TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2024
Công trình được hoàn thành tại: Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Quang Hòa PGS.TS. Trương Tuyết Mai Phản biện 1: PGS. TS. Đặng Thị Lụa Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Hoàng Anh Phản biện 3: PGS. TS. Trần Văn Tuấn Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Đại học Bách Khoa Hà Nội họp tại Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi 8 giờ 30, ngày 16 tháng 1 năm 2024 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tạ Quang Bửu - ĐHBK Hà Nội 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Báo cáo thống kê ngành thủy sản toàn cầu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp Quốc (FAO) cho thấy nhu cầu đối với các mặt hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so với 2020. Nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước; trong đó, Liên minh châu Âu (EU) là thị trường nhập khẩu NTHMV lớn nhất, chiếm 62% tổng giá trị xuất khẩu mặt hàng này của Việt Nam ra các thị trường trên thế giới. Tuy nhiên, EU cũng là thị trường có quy định chặt chẽ nhất đối với các sản phẩm nhập khẩu, gây nhiều thách thức đối với ngành nuôi trồng NTHMV ở Việt Nam. Trong những năm qua, tình trạng viêm dạ dày ruột, viêm gan do tiêu thụ NTHMV nhiễm vi rút luôn là vấn đề được lưu tâm. Theo dấu hiệu lâm sàng, đã xác định được hơn 100 loại vi rút đường ruột có mặt trong thực phẩm bị ô nhiễm; trong đó, Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ở người (HAstV) là các vi rút gây bệnh thường gặp trong NTHMV. Đáng chú ý, một số nghiên cứu về các vi rút này tại Việt Nam đã cho thấy tình trạng đồng nhiễm nhiều tác nhân vi rút trên cùng một mẫu bệnh phẩm. Hiện nay, trong khi quy trình chuẩn ISO 15216-2:2013 có thể ứng dụng để xác định NoV và HAV trong thực phẩm thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV và HEV còn chưa được chuẩn hóa, gây nhiều hạn chế trong công tác kiểm nghiệm. Vì vậy, việc xây dựng quy trình xác định HAstV và HEV với bộ mồi, mẫu dò đảm bảo độ bao phủ trên các biến chủng hiện có, đồng thời tối ưu các điều kiện của phản ứng Real-time RT-PCR, cho phép xác định cùng lúc cả bốn tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV với một chu trình nhiệt của ISO 15216-2:2013 sẽ góp phần rút ngắn thời gian phân tích, hỗ trợ kịp thời cho công tác điều trị. Bên cạnh đó, các số liệu về đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại Việt Nam còn rất hạn chế. Vì vậy, việc xác định đặc điểm sinh học phân tử của vi rút thông qua xác định kiểu gen (genotype) là công đoạn cần thiết để đánh giá chính xác nguy cơ bùng phát dịch bệnh gây ra bởi các tác nhân vi rút có mặt trong NTHMV. Do vậy, luận án nghiên cứu sinh “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử” đã được thực hiện. 1
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV trong NTHMV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-2:2013. - Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV trên thị trường - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 2.2.1.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV - Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã in vitro - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-2:2013 - Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này - Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-2:2013 2.2.1.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV - Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên mã in vitro - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-2:2013 - Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này - Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-2:2013 2
2.2.2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 - Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2022 - So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 và năm 2022 2.2.3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của NoV phát hiện trong NTHMV - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HEV phát hiện trong NTHMV - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HAstV phát hiện trong NTHMV 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học - Thiết kế, hiệu chỉnh bộ mồi, mẫu dò có độ bao phủ cao với các trình tự HEV và HAstV hiện có trên ngân hàng dữ liệu GenBank. - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR để có thể phát hiện được RNA của HEV và HAstV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216- 2:2013; từ đó mở ra khả năng phát hiện được 4 tác nhân vi rút NoV, HAV, HEV và HAstV trong một lần chạy Real - time RT-PCR. - Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV và HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh các vi rút này - Xác định các kiểu gen (genotype) của NoV, HAV, HEV và HAstV nhiễm tạp trong NTHMV, góp phần đánh giá nguy cơ bùng phát dịch bệnh. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp một quy trình phân tích cả 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV với tính chính xác cao (4 phản ứng Real-time RT-PCR riêng rẽ chạy đồng thời với cùng một chu trình nhiệt) trong NTHMV nói riêng và trong các mẫu thực phẩm, bệnh phẩm, môi trường nói chung để các cơ sở xét nghiệm có thể ứng dụng trong phân tích. - Góp phần nâng cao năng lực kiểm soát an toàn thực phẩm, tăng tính cạnh tranh của NTHMV và các mặt hàng thủy sản xuất khẩu trên thị trường quốc tế. 3
4. Tính mới của đề tài - Thiết kế, hiệu chỉnh được tổ hợp mồi, mẫu dò phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV có độ bao phủ cao với các trình tự hiện có trên Ngân hàng dữ liệu Genbank. - Tối ưu hóa phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-2:2013. - Xác định được tỷ lệ và mức nhiễm tạp của 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV trong năm 2016 và 2022 tại Việt Nam. - Xác định được kiểu gen của NoV, HAV, HEV và HAstV lưu hành trong NTHMV trong năm 2016 tại Việt Nam. 4
TỔNG QUAN 1.1. Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an toàn thực phẩm 1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.1.2. Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.2. Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.2.1. Norovirus 1.2.2. Hepatitis A virus 1.2.3. Hepatitis E virus 1.2.4. Astrovirus 1.3. Quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.3.1. Các phương pháp tách chiết RNA vi rút 1.3.2. Các phương pháp xác định vi rút 1.4. Các quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR 1.5. Ứng dụng công nghệ MGB và LNA nhằm tăng nhiệt độ nóng chảy của bộ mồi, mẫu dò trong phản ứng Real - time RT – PCR 1.5.1. Công nghệ MGB (Minor Groove Binders) 1.5.2. Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids 1.6. Phương pháp xác định kiểu gen vi rút 1.6.1. Kỹ thuật Nested RT - PCR 1.6.2. Kỹ thuật giải trình tự Sanger 1.7. Tình hình nghiên cứu sự lưu hành các kiểu gen của NoV, HAV, HEV, HAstV trên thế giới và tại Việt Nam 1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.7.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 5
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu kiểm soát 2.1.2. Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 2.1.3. Oligonucleotide 2.1.4. Hóa chất 2.1.5. Thiết bị 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Lựa chọn, hiệu chỉnh, thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng Real- time RT-PCR - Chuẩn bị nền mẫu RNA của nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Tách dòng, tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đich của HEV và HAstV bằng phiên mã in vitro - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ  Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV và HAstV với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-2:2013  Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này - Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-2:2013 2.2.2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Phương pháp tách chiết RNA vi rút theo ISO 15216-2:2013 - Phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng quy trình Real-time RT-PCR theo ISO 15216-1:2013 - Phân tích số liệu bằng phần mềm SPSS 1.2.3. Xác định kiểu gen của các chủng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm phát hiện được trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Kỹ thuật PCR lồng (Nested RT-PCR) - Giải trình tự và xác định kiểu gen các chủng vi rút phát hiện được - Xây dựng cây phát sinh loài của vi các rút gây bệnh thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phần mềm MEGA 6
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và Hast từ NTHMV 3.1.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ NTHMV 3.1.1.1 Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real- time RT-PCR phát hiện HEV Hình 3.2. Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Schlosser (Hình A) và Jothikumar (Hình B) với các hệ gen HEV công bố trên GenBank Bảng 3.2. Tổ hợp mồi xác định HEV sau khi ứng dụng công nghệ MGB và LNA Tên tổ Tm Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) hợp mồi (oC) HEV.A-F GTDCCGGCRGTGGTTTCTG 66,7 Tổ hợp FAM-TGACMGGGTTGATTCTCARCC- HEV.A-P - mồi A MGB-Eclipse HEV.A-R GCRAAGGGRTTGGTTGGATG 65,9 HEV.B-F RGTGGTTTCTGGRGTGAC 62,9 Tổ hợp FAM-T+G+ATTCTC+AR+C+CCTTC+GC*- HEV.B-P 75,9 mồi B 31ABkFQ HEV.B-R AGGGRTTGGTTGGATGAA 62,3 * Vị trí nucleotide có gắn LNA được ký hiệu + ở trước (+A, +G, +T, +C) 7
3.1.1.2. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã in vitro Hình 3.5. Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.A Hình 0.8. Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.B 3.1.1.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-2:2013 Bảng 3.6. Thành phần tối ưu của phản ứng Realt-time RT-PCR phát hiện HEV Nồng độ làm Thành phần phản ứng Thể tích việc 2X Reaction Mix 1X 12,5 µL SuperScript™ III RT/Platinum™ Taq Mix - 0,5 µL MgSO4 4mM 0,5 µL Mồi 0,5 µM 1 µL Mẫu dò 0,4 µM 1 µL RNA - 5 µL H2O - 4,5 µL Tổng thể tích 25 L 8
3.1.1.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh 95oC 95oC 3 phút 15 giây 60oC 55oC 30 giây 30 phút Phiên mã Hoạt hóa Biến Gắn mồi và ngược Enzyme tính kéo dài mạch 1 chu kỳ 40 chu kỳ Hình 0.9. Chu trình nhiệt rút gọn của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV 3.1.1.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình tiêu chuẩn ISO 15216-2:2013 Giới hạn phát hiện của quy trình Real-time RT-PCR phân tích HEV theo ISO 15216-2:2013 và theo quy trình nhanh lần lượt là 3,54 × 102 bản sao/mL và 6,08 × 108 bản sao/mL với tổ hợp mồi A (phát triển từ bộ mồi, mẫu dò của Schlosser năm 2014; trong đó mẫu dò được kết hợp công nghệ MGB); 6,84 x 102 bản sao/mL và 6,92 x 102 bản sao/mL với tổ hợp mồi B (phát triển từ bộ mồi, mẫu dò của Jothikumar năm 2006, trong đó mẫu dò sử dụng công nghệ LNA). Khoảng định lượng của các quy trình đều ở mức 2 × 103 đến 2 × 108 bản sao/mL. Kêt quả phân tích độ đặc hiệu của các quy trình trên 5 tác nhân virus gây bệnh thường gặp trong NTHMV cho thấy tổ hợp mồi và mẫu dò đã thiết kế không có phản ứng chéo, đảm bảo đặc hiệu 100%. 9
3.1.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 3.1.2.1. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real- time RT-PCR phát hiện HAstV Hình 3.13. Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Cann và cộng sự. Số trong ngoặc đơn thể hiện số lượng trình tự ở mỗi nhóm biến thể. Trình tự mồi và mẫu dò hiệu chỉnh được in đậm và gạch chân. Các nucleotide suy biến được đánh dấu đỏ. Bảng 3.14. Tổ hợp mồi xác định HAstV sau khi ứng dụng công nghệ MGB và LNA Tổ hợp mồi, Mean Tm Trình tự (5’ – 3’) mẫu dò (oC) HAstV-F CCGAGTAGGAWCGAGGGT 64 FAM-CTTT+TCTG+TYTC+T+GT+TTA+GAT- HAstV-P 69 3lABkFQ HAstV-R GCWYC+TGAT+TAAA+TCAATTT+TAA 64,7 Vị trí nucleotide có gắn LNA được ký hiệu + ở trước (+A, +G, +T, +C) 3.1.2.2. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên mã in vitro Hình 3.16. Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HAstV 10
3.1.2.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-2:2013 Bảng 3.17. Thành phần tối ưu của phản ứng Realt-time RT-PCR phát hiện HAstV Nồng độ Thành phần phản ứng Thể tích làm việc 2X Reaction Mix 1X 12,5 µL SuperScript™ III RT/Platinum™ Taq Mix - 0,5 µL MgSO4 4mM 0,5 µL Mồi 0,5 µM 1 µL Mẫu dò 0,4 µM 1 µL RNA - 5 µL H2O - 4,5 µL Tổng thể tích 25 µL 3.1.2.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT- PCR phát hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh Thời gian của giai đoạn gắn mồi và kéo dài mạch có thể rút xuống 30 giây, hoàn toàn tương tự với chu trình nhiệt rút gọn đã tối ưu được đối với quy trình phát hiện và định lượng HEV ở trên, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ứng dụng xác định hai tác nhân HEV và HAstV trong cùng một lần chạy phản ứng Real-time RT-PCR, cho phép đơn giản hóa việc phân tích và giảm chi phí vận hành thiết bị. 3.1.2.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-2:2013 Giới hạn phát hiện với xác suất 95% ở quy trình phân tích HAstV bằng phương pháp Real-time RT-PCR theo quy trình ISO là 6,84 × 102 bản sao/mL; theo quy trình phát hiện nhanh là 8,44 × 102 bản sao/mL. Các quy trình phân tích đều có khoảng định lượng từ 2 × 103 đến 2 × 108 bản sao/mL. Quy trình Real-time RT-PCR xác định HAstV trong NTHMV đảm bảo đặc hiệu 100% trên 5 tác nhân virus gây bệnh thường gặp trong NTHMV. 11
3.2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ 3.2.1. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 Hình 3.20. Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2016 2 tác nhân 7,50 1,67 1 tác nhân 29,17 27,50 Không nhiễm 13,33 20,83 0 20 40 60 Tỉ lệ nhiễm (%) Chợ Siêu thị Hình 3.21. Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh thực phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2016 12
80 70 60 Tỉ lệ nhiễm (%) 50 NoV GI 40 NoV GII 30 HEV 20 AstV 10 0 Tháng 3 Tháng 4 Tháng 5 Tháng 6 Tháng 7 Tháng 8 Tháng 9 Tháng Tháng Tháng 10 11 12 Thời điểm lấy mẫu Hình 3.22. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh thực phẩm trong NTHMV theo thời điểm lấy mẫu năm 2016 3.2.2. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2022 Hình 3.23. Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2022 13
0 tác nhân 40,0 42,5 1 tác nhân 8,3 7,5 2 tác nhân 1,70,0 0 20 40 60 80 100 Tỉ lệ nhiễm (%) Chợ Siêu thị Hình 3.24. Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh thực phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2022 18 16 14 Tỉ lệ nhiễm (%) 12 NoV GI 10 8 NoV 6 GII 4 HEV 2 0 Tháng 3 Tháng 4 Tháng 5 Tháng 6 Tháng 7 Tháng 8 Tháng 9 Tháng Tháng Tháng 10 11 12 Thời điểm lấy mẫu Hình 3.25. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh thực phẩm trong NTHMV theo thời điểm lấy mẫu năm 2022 14
3.2.3. So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 và năm 2022 60 51,7 50 40 Tỉ lệ nhiễm (%) 35,0 30 20 8,3 7,5 10 5,0 5,8 5,0 2,5 0 NoV GI NoV GII HEV HAstV 2016 2022 Hình 3.26. So sánh tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh thực phẩm trong NTHMV năm 2016 và năm 2022 Hình 3.27. So sánh sự phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2016 và năm 2022 15
Kết quả phân tích thống kê nhận được từ số liệu đánh giá tình trạng nhiễm các tác nhân vi rút gây bệnh thực phẩm trên 240 mẫu NTHMV đã chỉ ra: các mẫu NTHMV được thu thập vào thời điểm năm 2022 đã giảm nguy cơ nhiễm NoV GI và NoV GII so với các mẫu được thu thập vào thời điểm năm 2016. Bên cạnh đó, các kết quả phân tích trong cùng một năm (kết quả trong cùng năm 2016 và kết quả trong cùng năm 2022) đã cho thấy thời kỳ thu hoạch NTHMV (từ tháng 4 đến tháng 10) là thời điểm có nguy cơ nhiễm vi rút gây bệnh thực phẩm cao hơn, các mẫu được thu thập tại các chợ cũng có nguy cơ nhiễm hơn so với các mẫu được thu thập tại siêu thị. 16
3.3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ 3.3.1. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng NoV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ Hình 3.31. Cây phát sinh loài của các mẫu NoV GI phát hiện được trong nghiên cứu với các trình tự NoV GI tham chiếu từ GenBank. 17
4% 8% 8% NoV GI.5 NoV GI.6 NoV GI.2 56% 24% NoV GI.4 NoV GI.8 Hình 3.32. Phân bố kiểu gen Norovirus GI của các mẫu phát hiện được trong nghiên cứu Kết quả tại Hình 3.36 cho thấy, có 5 kiểu gen phát hiện được là các kiểu gen: GI.2, GI.4, GI.5, GI.6 và GI.8. Trong đó, kiểu gen GI.5 là kiểu gen chiếm ưu thế, chiếm tỉ lệ 56%; tiếp đến là kiểu gen GI.6 với tỉ lệ 24%; các kiểu gen GI.4, GI.2 chiếm tỉ lệ 8% và GI.8 thấp nhất với tỉ lệ 4%. Kết quả phân tích đặc điểm sinh học phân tử, sự khác biệt di truyền thông qua cây phát sinh loài (phylogenetic tree) thể hiện ở Hình 3.31 chỉ ra các chủng NoV GI phát hiện được có độ tương đồng cao với các chủng đang lưu hành tại Châu Á. Cụ thể, phần lớn các mẫu thuộc kiểu gen GI.5 có độ tương đồng cao với các chủng NoV GI.5 được phân lập trong một số nghiên cứu tại Trung Quốc, Hàn Quốc và Đài Loan. 18