Tóm tắt luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

48
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án nhằm xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng và bước đầu đánh giá được độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng. Đánh giá được tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo luận án để nắm chi tiết nội dung kiến thức.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG (Trevesia palmata (Roxb. e x Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliace ae) Chuyên ngành : Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc Mã số : 9720202 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI- NĂM 2020
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Võ Xuân Minh 2. PGS.TS. Đỗ Quyên Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến Phản biện 2: PGS.TS. Trần Việt Hùng Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Văn Minh Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại Học viện Quân y vào hồi: giờ 00 ngày tháng năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện Quốc Gia 2. Thư viện Học viện Quân y
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 1 Lê Thị Thanh Thảo, Đỗ Quyên, Nguyễn Thị Ngọc, Lê Thanh Sơn, Bùi Hữu Tài, Phan Văn Kiệm (2016), “Phân lập một số hợp chất saponin từ cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata)”, Tạp chí Y-Dược học Quân sự số chuyên đề Dược, tr. 23-31. 2 Le Thi Thanh Thao, Do Quyen, Duong Binh Vu and Phan Van Kiem (2018), “New acetylated saponins from the leaves of Trevesia palmata”, Natural Product Communications, Vol. 12, N001-2, p.407-410. 3 Le Thi Thanh Thao, Nguyen Trong Diep, Nguyen Hong Van, Nguyen Nu Huyen My, Vo Xuan Minh (2019), “Study on the extraction of total saponin from folium Trevesiae palmatae using Ultrasonic method” Tạp chí Y-Dược học Quân sự, số 9 tháng 12/2019, p.175-180. 4 Lê Thị Thanh Thảo, Đỗ Quyên, Nguyễn Hồng Vân, Võ Xuân Minh (2020), “Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố, thông số của qui trình phun sấy đến chất lượng của cao khô lá đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae)” Tạp chí Y học Việt Nam, số tháng 5/2020, p. 73-78.
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Phần viết đầy đủ 1. A Độ hấp thụ quang 2. Aer Aerosil 3. AO Acid oleanolic 4. BC Bạch cầu 5. C Nồng độ 13 6. C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ carbon 13) 7. CI Carr's compressibility index (Chỉ số nén Carr) 8. CR/DP là tỷ lệ % (khối lượng/khối lượng) của chất rắn trên tổng khối lượng dịch phun sấy 9. cs. Cộng sự 10. Cyc Cyclophosphamid 11. DĐVN Dược điển Việt Nam 12. DM/DL Dung môi/dược liệu (ml/g) 13. ĐĐR Đu đủ rừng 14. EtOH Ethanol 15. HMBC Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) 16. HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) 17. HS chiết Hiệu suất chiết 18. HSPL Hệ số pha loãng 19. HSPS Hiệu suất phun sấy 20. HR-ESI- High resolution - electrospray ionization - mass MS spectroscopy (Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử) 21. IL Interleukin
22. INF Interferon 23. KLCT Khối lượng cơ thể 24. KTTP Kích thước tiểu phân 25. KLRbk Khối lượng riêng biểu kiến 26. LD50 Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% số con vật thử) 27. LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) 28. LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) 29. M Khối lượng 30. Mal Maltodextrin 31. MeOH Methanol 32. m/z Mass to charge ratio (tỉ lệ khối lượng/điện tích) 33. OA Ovalbumin + Al(OH)3 34. RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) 35. SPN Hàm lượng Saponin toàn phần 36. SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) 37. SE Standard error (Sai số chuẩn) 38. STT Số thứ tự 39. TCCS Tiêu chuẩn cơ sở 40. TCMD Tăng cường miễn dịch 41. TD/CR Tá dược/Chất rắn 42. TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) 43. KLLTĐ Khối lượng lách tương đối 44. KLTƯTĐ Khối lượng tuyến ức tương đối 45. TB Trung bình 46. TNF Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử khối u) 47. UV – VIS Ultraviolet-visible (Tử ngoại - khả kiến)
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh suy giảm miễn dịch là một nhóm các tình trạng khác nhau gây nên do một hay nhiều khiếm khuyết của hệ miễn dịch và biểu hiện trên lâm sàng bởi gia tăng tình trạng dễ mắc các bệnh nhiễm trùng. Ngày nay, các bệnh suy giảm miễn dịch có xu hướng ngày càng gia tăng với hậu quả cấp tính, tái diễn hay mạn tính thường là nặng nề. Hiện nay, cơ quan quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ (US FDA) đã cấp phép cho nhiều thuốc có tác dụng điều trị cho bệnh nhân suy giảm miễn dịch được dùng trên lâm sàng. Các thuốc tăng cường miễn dịch (TCMD) có nguồn gốc phong phú, các chất có nguồn gốc từ các chế phẩm sinh học (Immunoglobulin, Interferon, …) là sản phẩm công nghệ hiện đại, giá thành còn khá cao. Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược thường có nhiều tác dụng không mong muốn. Có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng TCMD của các loài thực vật đã được công bố. Đặc biệt, trong số các nhóm hợp chất thiên nhiên, nhóm chất saponin là nhóm có tác dụng TCMD nổi bật nhất. Đu đủ rừng (ĐĐR, Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis. họ Nhân sâm Araliaceae) là một cây nhỡ, mọc nhiều và dễ mọc ở bìa rừng hay rừng tái sinh. Với nguyên liệu nghiên cứu là lá, nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có ở các khu vực Hà Giang, Ba Vì, Cúc Phương, Phú Thọ…, nên việc thu hái không làm ảnh hưởng đến môi trường sinh thái hay đa dạng sinh học. Cho đến nay, cây ĐĐR ở Việt Nam mới chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian lấy lõi thân thay cho vị thuốc thông thảo. Trên
2 thế giới cũng chỉ có rất ít nghiên cứu về loài này và chưa có chế phẩm nào có tác dụng TCMD từ ĐĐR được nghiên cứu. Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliace ae)” được nghiên cứu với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng được qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng ở qui mô phòng thí nghiệm. 2. Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng và bước đầu đánh giá được độ ổn định của cao k hô lá Đu đủ rừng. 3. Đánh giá được tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm. *Những đóng góp mới của luận án: 1. Đã xác định được nhóm chất chính có trong lá ĐĐR là saponin. Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 6 hợp chất saponin, trong đó có 2 chất mới. 2. Đã xây dựng và thẩm định TCCL lá ĐĐR. Đã khảo sát và xây dựng được qui trình chiết xuất cao lá ĐĐR qui mô 2 kg dược liệu/mẻ, qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR bằng phương pháp phun sấy. 3. Đã xây dựng và thẩm định TCCL sản phẩm cao khô lá ĐĐR. Sản phẩm ổn định trong các điều kiện nghiên cứu. 4. Đã đánh giá được tác dụng TCMD trên động vật thực nghiệm, cho thấy sản phẩm bào chế được có khả năng cải thiện đáp ứng miễn dịch trên động vật thực nghiệm.
3 *Nội dung và cấu trúc mới của luận án: Luận án bao gồm 147 trang. Đặt vấn đề: 2 trang; chương 1 (tổng quan): 27 trang; chương 2 (nguyên liệu, thiết bị, đối tượng và phương pháp nghiên cứu): 23 trang; chương 3 (kết quả nghiên cứu): 66 trang; chương 4 (bàn luận): 26 trang; kết luận và kiến nghị: 3 trang. * Tài liệu tham khảo: Luận án bao gồm 107 tài liệu, trong đó có 84 tài liệu tiếng Anh. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan của luận án đã cập nhật các vấn đề: - Về ĐĐR: Đặc điểm thực vật và phân bố, thành phần hóa học, tác dụng sinh học và dược lý đã được công bố, công dụng-liều dùng dùng theo dân gian. - Cao thuốc: khái niệm; phân loại theo DĐVN V và DĐ Châu Âu. 2 giai đoạn chính trong kỹ thuật điều chế cao thuốc: chiết xuất và làm khô. Trong đó có trình bày về chiết xuất bằng siêu âm và làm khô bằng phun sấy là các kỹ thuật sử dụng trong luận án - Mô hình đánh giá tác dụng TCMD: in vitro và invivo: tổng quan được các mô hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên vật liệu Lá cây ĐĐR được thu hái vào tháng 5/2015, nguyên liệu được rửa sạch, sấy khô (40oC) trong tủ sấy có quạt gió đến độ ẩm dưới 12%, rồi được làm nhỏ đến kích thước mong muốn và bảo quản trong túi nilon kín, để nơi thoáng mát, khô ráo. Để xây dựng TCCS mẫu được thu hái tại 5 tỉnh của Việt Nam. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập, bào chế sử dụng mẫu được thu hái ở Hà Giang.
4 2.1.2. Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng trưởng thành dòng Swiss, không phân biệt giống, cân nặng 18 - 22 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp; Chuột cống trắng trưởng thành, dòng Wistar, không phân biệt giống, cân nặng mỗi con tại thời điểm bắt đầu thí nghiệm là 160 - 180 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do ban chăn nuôi Học viện Quân Y cung cấp. 2.1.3. Thuốc thử, hóa chất, dung môi Các thuốc thử, hóa chất, dung môi, trang thiết bị đạt tiêu chuẩn cho nghiên cứu chiết xuất, phân lập hợp chất; xây dựng tiêu chuẩn; bào chế; đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính. 2.1.4. Máy móc, trang thiết bị nghiên cứu Các thiết bị đặc thù: thiết bị chiết siêu âm (SONY MEDI SM30- CEP, Hàn Quốc), thiết bị phun sấy PG-5 (Trung Quốc), máy đo quang phổ UV-VIS, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, máy phân tích huyết học, máy xét nghiệm sinh hóa... và một số thuốc thử, hóa chất, thiết bị dụng cụ thông thường khác. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 2.2.1.1. Phương pháp xác định một số hợp chất chính sử dụng làm chất đánh dấu Khảo sát các nhóm thành phần hoá học bằng các phản ứng hóa học đặc trưng. Lá cây ĐĐR (5kg) được chiết siêu âm với methanol; chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần. Phân lập các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký. Phát hiện chất bằng đèn tử
5 ngoại hoặc dùng thuốc thử, kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập bằng các phương pháp kết hợp như: TLC, HPLC và NMR. Xác định cấu trúc hóa học dựa trên các thông số lý hóa và so sánh với các số liệu đã công bố. 2.2.1.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng * Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng SPN bằng UV-Vis - Nguyên tắc: Saponin toàn phần trong lá ĐĐR được định lượng bằng đo quang phổ UV-Vis sau khi thực hiện phản ứng tạo màu Rosenthaler. Hàm lượng SPN được tính theo AO. - Chuẩn bị: dãy dung dịch chuẩn AO trong MeOH nồng độ từ 100 - 300 µg/ml; dung dịch thử: 5,0 g lá ĐĐR, sau khi loại chlorophyl, chiết siêu âm 2 lần với MeOH x 2 h ở 50◦C, gom dịch chiết, thêm dung môi vừa đủ 200 ml, pha loãng 2,5 lần; lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi làm phản ứng; mẫu trắng: MeOH. - Tiến hành phản ứng tạo màu Rosenthaler: Hút chính xác 0,2 ml dung dịch thử (hoặc chuẩn hoặc trắng), cho vào ống nghiệm, rồi thêm 0,2 ml dung dịch vanilin 5% trong acid acetic băng và 1,2 ml acid percloric. Đậy kín ống nghiệm rồi ủ cách thủy ở 70oC±1oC trong khoảng thời gian thích hợp. Ngâm ống nghiệm trong nước đá rồi chuyển vào bình định mức 5 ml, tráng ống nghiệm bằng ethyl acetat và bổ sung ethyl acetat vừa đủ đến vạch. - Xây dựng phương pháp: + Khảo sát cực đại hấp thụ: Quét phổ từ 400 tới 800 nm, chọn λmax. + Khảo sát thời gian phản ứng tạo màu: Thực hiện phản ứng tạo màu với dãy dung dịch chuẩn làm việc AO có nồng độ: 92,50; 138,75; 185,0; 231,25; 277,50 µg/ml với thời gian ủ lần lượt là 10, 20,
6 30, 40 và 60 phút; lặp lại 6 lần, lựa chọn được thời gian phản ứng thích hợp nhất. - Thẩm định phương pháp: Xác định khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng theo hướng dẫn của ICH. *Thẩm định phương pháp định lượng AO bằng HPLC - Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: cột C18 (4,6 × 250 mm; 5 µm); tốc độ dòng: 0,8 ml/phút; thể tích tiêm: 10 µl; Detector UV: Bước sóng 215 nm; Pha động: H2O/MeOH (5/95, v/v). - Chuẩn bị: dãy dung dịch chuẩn: AO trong MeOH nồng độ từ 10-100 µg/ml; mẫu thử: ĐĐRchiết siêu âm 5,0 g lá với MeOH x 2 lần x 2 h thu được 250 ml, lọc dịch lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký; mẫu trắng: MeOH. - Thẩm định phương pháp: Tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu của phương pháp, khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): theo hướng dẫn của ICH. *Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá ĐĐR Mô tả dược liệu (hình thái thực vật, vi phẫu, soi bột), mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng (Cd, Hg, As, Pb) theo phương pháp của DĐVN V. Định tính acid oleanolic bằng TLC; Định lượng SPN bằng phương pháp UV-Vis, định lượng AO bằng HPLC đã được thẩm định. 2.2.1.3. Phương pháp xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng * Qui trình bào chế dịch chiết - Khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất: chiết siêu âm, ngấm kiệt, chiết hồi lưu, sắc truyền thống.
7 - Khảo sát các thông số qui trình chiết xuất: KTTP dược liệu, loại dung môi chiết, tỷ lệ DM/DL và số lần chiết, thời gian chiết. - Sau khi cô cao, loại tạp; tiến hành kiểm nghiệm và điều chỉnh cao lỏng đựa trên chỉ tiêu tỷ lệ chất rắn trong cao và hàm lượng SPN. * Qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy - Các yếu tố / thông số khảo sát: Loại tá dược phun sấy (Mal, Aer, lactose monohydrat, Starch 1500), tỷ lệ TD/CR (10 - 30 %), nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch (120 - 150ºC, 20 - 40 ml/ phút), tỷ lệ CR/DP (10 - 20 %) - Căn cứ để lựa chọn: cảm quan hình thái bột, khối lượng riêng biểu kiến và chỉ số nén CI, mất khối lượng do làm khô, tính hút ẩm, hiệu suất thu hồi hoạt chất và hiệu suất phun sấy. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 2.2.2.1. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao k hô lá Đu đủ rừng Hình thức: Đánh giá bằng cảm quan; mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng (Cd, Hg, As, Pb), giới hạn nhiễm khuẩn theo phương pháp của DĐVN V. Định tính acid oleanolic bằng TLC; định lượng SPN bằng phương pháp UV-Vis, định lượng AO bằng HPLC đã được thẩm định. 2.2.2.2. Sơ bộ đánh giá độ ổn định của cao k hô lá Đu đủ rừng - Điều kiện bảo quản: Thử nghiệm dài hạn (nhiệt độ 30 ± 2ºC, độ ẩm 75 ± 5%); lão hóa cấp tốc (Nhiệt độ 40 ± 2ºC, độ ẩm 75 ± 5%). Thời gian lấy mẫu: 0, 3, 6, 9, 12 tháng với thử nghiệm dài hạn và 0, 3, 6 tháng với lão hóa cấp tốc. Tiêu chuẩn đánh giá: Theo TCCS.
8 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm 2.2.3.1. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao k hô lá Đu đủ rừng * Mô hình đánh giá: Sử dụng mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid (cyc) trên chuột nhắt: - Chuột thí nghiệm được chia thành 5 lô, mỗi lô 8 con: Lô 1 - Chứng sinh học: chuột uống nước cất; Lô 2 - Mô hình: Chuột được tiêm Cyc + uống nước cất; Lô 3 - Chứng dương: Chuột được tiêm Cyc + uống levamisol liều 100 mg/kg; Lô 4: Chuột được tiêm Cyc + uống cao khô ĐĐR liều 1 (400 mg/kg); Lô 5: Chuột được tiêm Cyc + uống cao khô ĐĐR liều 2 (800 mg/kg). Sau khi tiêm Cyc liều 200 mg/kg ở các lô 2, 3, 4, 5, vào ngày thứ 2 các lô chuột được uống nước cất và các thuốc liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8, giết chuột, lấy máu và các tổ chức lympho để làm xét nghiệm. * Xét nghiệm chức năng miễn dịch: Các chỉ số chung: khối lượng lách tương đối (KLLTĐ), khối lượng tuyến ức tương đối (KLTƯTĐ); Số lượng BC chung, BC lympho và BCTT, làm giải phẫu vi thể lách và tuyến ức. Các thông số đánh giá miễn dịch dịch thể và qua trung gian tế bào: đo kết quả phản ứng quá mẫn chậm với kháng nguyên OA qua bề dày bàn chân chuột, định lượng IgG, cytokin IL-2 và TNF-α. 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá độc tính của cao k hô lá Đu đủ rừng * Độc tính cấp: tiến hành tên chuột nhắt trắng (10 lô, mỗi lô 10 con), cho uống Cao khô ĐĐR (hòa tan với nước) với các mức liều tăng dần, xác định tỷ lệ chuột chết trong 72 h, theo dõi cho đến hết
9 thời gian 7 ngày. LD50 được tính bằng phương pháp dùng Excel, sau đó có kiểm chứng lại bằng phương pháp Litchfield-Wilcoxon. * Độc tính bán trường diễn: Tiến hành trên chuột cống trắng (3 lô, mỗi lô 10 con: lô chứng - sinh lý: uống nước cất; lô trị 1: uống cao khô lá ĐĐR liều 240 mg/kg/ngày; lô trị 2: uống cao khô lá ĐĐR liều 720 mg/kg/ngày). Các chỉ tiêu đánh giá: tình trạng chung của chuột, các chỉ số huyết học, sinh hóa, quan sát hình ảnh đại thể gan, lách, thận ngày thứ 90. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kế t quả nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 3.1.1. Kết quả xác định một số hợp chất chính làm chất đánh dấu Thực hiện khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ cho thấy saponin là thành phần chính của lá ĐĐR. Chiết xuất, phân lập đã xác định được 6 hợp chất saponin triterpenoid thuộc dẫn xuất của acid oleanolic và acid ursolic; trong đó có 4 hợp chất saponin đã biết là acid ole anolic, ilekudinosid C, kalopanaxsaponin H, và davisianosid B và 2 hợp chất mới được đặt tên là acetyltreve siasaponin A và ace tyltrevesiasaponin B. 3.1.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng làm nguyên liệu chiết xuất 3.1.2.1. Kết quả xấy dựng và thẩm định các phương pháp định lượng chất đánh dấu trong lá Đu đủ rừng * Phương pháp định lượng SPN trong lá ĐĐR bằng UV-Vis - Xây dựng phương pháp
10 + Khảo sát cực đại hấp thụ: Quét bước sóng từ 400 -800 nm, có cực đại hấp thụ ở 550 nm. + Khảo sát thời gian phản ứng tạo màu: kết quả cho thấy trong các mẫu có hệ số tương quan cao thì ở mẫu có thời gian phản ứng là 40 phút có độ hấp thụ quang cao nhất. Do vậy, đề tài lựa chọn thời gian để làm phản ứng màu là 40 phút để khảo sát tiếp. - Thẩm định phương pháp + Xác định khoảng tuyến tính: Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ AO khảo sát, độ hấp thụ và lượng AO có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan r2 = 0,9986 và phương trình hồi qui tuyến tính là Y = 0,0742 X – 0,0364. + Độ lặp lại và độ đúng: Kết quả cho thấy các giá trị RSD trong ngày và khác ngày đều nhỏ hơn 2,21%, đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại của phương pháp phân tích. Tỷ lệ % chất chuẩn tìm lại trong ngày và giữa các ngày thay đổi trong khoảng từ 92,67% - 97,11%, đáp ứng yêu cầu về độ đúng của phương pháp phân tích. * Phương pháp định lượng AO bằng HPLC - Kết quả thẩm định + Tính tương thích hệ thống: Kết quả cho thấy: RSD về thời gian lưu và diện tích pic của acid oleanolic đều nhỏ hơn 2%. Giá trị số đĩa lý thuyết cao N>20.000 và hệ số bất đối xứng píc khoảng 1,15. Như vậy, phương pháp phân tích này là tương thích với hệ thống sắc ký. + Tính đặc hiệu của phương pháp: sắc đồ của mẫu thử có píc trùng với thời gian lưu của chuẩn AO; trên sắc đồ mẫu trắng không xuất hiện píc nào tại thời gian lưu của AO. So sánh phổ của píc chất AO trên sắc đồ chuẩn và píc có cùng thời gian lưu trong mẫu thử cho
11 thấy 2 phổ này chồng khít với mức tương quan 99%, chứng tỏ phương pháp có tính đặc hiệu cao. + Khoảng nồng độ tuyến tính: Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát (từ 11,13 đến 111,25 µg/ml) có mối liên quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích. Đường hồi qui y = 11333 x – 9726,9 với r2 =0,9972. + Độ lặp lại và độ đúng: Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao với các giá trị RSD trong ngày và khác ngày đều nhỏ hơn 3,3%, đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại của phương pháp phân tích. Tỷ lệ % tìm lại trong ngày và giữa các ngày thay đổi trong khoảng từ 96,30 - 99,05%, đáp ứng yêu cầu về độ đúng của phương pháp phân tích. + Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): kết quả thu được LOD = 0,0122 µg/ml và LOQ = 0,04 µg/ml. 3.1.2.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng TCCS dược liệu được đề xuất có các chỉ tiêu như sau: Mô tả dược liệu: hình thái thực vật, vi phẫu, soi bột; mất khối lượng do làm khô (≤12%); tro toàn phần (10%); giới hạn kim loại nặng theo phương pháp AAS (As ≤ 1,0 mg/kg; Cd ≤ 1,0 mg/kg; Hg ≤ 0,1 mg/kg; Pb ≤ 3,0 mg/kg); định tính acid oleanolic: theo phương pháp TLC; định lượng: hàm lượng SPN ≥ 15 mg/g tính theo AO bằng UV – Vis, hàm lượng AO ≥ 750 µg/g bằng HPLC. 3.1.3. Kết quả xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 3.1.3.1. Kết quả xây dựng qui trình bào chế dịch chiết lá Đu đủ rừng Từ kết quả khảo sát đã lựa chọn được các thông số của qui trình chiết xuất dịch chiết lá ĐĐR bằng phương pháp chiết siêu âm như sau:
12 Bảng 3.18. Thông số qui trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ rừng bằng phương pháp chiết siêu âm STT Phương pháp/ thông số Thiết bị/ thông số 1 Chiết siêu âm Thiết bị SM30-CEP 2 Bột khô lá ĐĐR Kích thước 0,5 - 1mm 3 Dung môi chiết Ethanol 50º 4 Nhiệt độ chiết 70ºC 5 Số lần chiết 2 lần 6 Tỷ lệ DM/ DL 15ml/1g/ lần x 2 lần 7 Thời gian chiết 90 phút/ lần x 2 lần Tiến hành chiết xuất qui mô 2 kg/mẻ x 3 mẻ chiết khác nhau. Tiến hành cô cao, loại tạp (lọc qua vải dày, cô thu hồi dung môi (70ºC, áp suất giảm, cô tới cao 3:1, để lắng 24h, gạn. Cắn được thêm EtOH gấp 5 lần, lắng, gạn, lọc điều chỉnh về cao 3:1) kết quả thu được như sau: Bảng 3.20. Kết quả chiết xuất, cô đặc và loại tạp cao lá Đu đủ rừng 3:1 Dịch Cao 3:1 Cao 3:1 đã Nội dung Lá ĐĐR chiết chưa loại tạp loại tạp Khối lượng, 5,48 kg 170,0 lít 1,83 kg 1,83 kg thể tích 683,98 156,00 ± 4,61 205,67 ± SPN (1) 22390 µg/g µg/ml mg/g 4,45 mg/g Khối lượng 123,28 g 116,28 g 102,33 g 94,77 g SPN Tỷ lệ cắn khô trong cao 35,93% 25,24% Hiệu suất chiết, cô cao tính theo SPN 83,44% - Hiệu suất chiết, cô và loại tạp tính theo SPN 77,27% Tỷ lệ làm giàu SPN 131,84% (1) : hàm lượng SPN trong 1 g chất rắn trong cao tính theo k hô kiệt.
13 Kết quả cho thấy: Hàm lượng SPN trong cao 3:1 chưa loại tạp là 156,00 ± 4,61 mg/g. Sau khi loại tạp, cô đặc và điều chỉnh về cao 3:1 cho hàm lượng saponin toàn phần là 205,67 ± 4,45 mg/g. Tỷ lệ làm giàu SPN là 131,84%. 3.1.3.2. Kết quả bào chế cao k hô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy Từ kết quả khảo sát, đã lựa chọn được công thức và thông số của qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR bằng phương pháp phun sấy như sau: Bảng 3.29. Công thức và thông số qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy STT Tên thông s ố Thông số Cao lá ĐĐR (3:1) phối hợp 1 Dịch phun sấy thêm tá dược 2 Tá dược phun sấy Aerosil 3 Tỷ lệ tá dược/ chất rắn 30% 4 Nhiệt độ đầu vào 130 ± 2ºC 5 Tốc độ cấp dịch 30 ml / phút 6 Tỷ lệ CR/DP 14% 7 Áp suất khí nén đầu phun 2 Bar
14 Xây dựng được qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR như sau: Bột lá ĐĐR EtOH 50º Đạt TCCS DM/DL = 15ml/1g Chiết siêu âm lần 1 700 C, 90 phút Gạn, lọc Bã ĐĐR 1 Dịch chiết ĐĐR 1 DM/DL = 15ml/1g Chiết siêu âm lần 2 700 C, 90 phút Gạn, lọc Bã ĐĐR 2 Dịch chiết ĐĐR 2 EtOH thu hồi Dịch chiết ĐĐR 1+2 Cô thu hồi dung môi Cao ĐĐR 3:1 Để lắng, gạn EtOH 96º Phần cắn 1 Phần dịch lỏng 1 Để lắng, gạn Phần cắn 2 Phần dịch lỏng 2 Cô thu hồi dung môi Kiểm nghiệm: - Hàm lượng SPN: 165 - 245 mg/g Cao ĐĐR 3:1 - Tỷ lệ chất rắn: 20 - 30% Hình 3.12. Sơ đồ các giai đoạn điều chế cao lá đu đủ rừng 3:1
15 Cao ĐĐR 3:1 - Thêm Aer, nước: tỷ lệ Aer 30% so với chất rắn, tỷ lệ CR/ DP: 14%; - Khuấy đều đồng nhất Dịch phun sấy Cấp dịch phun (30ml/phút) Phun sấy Nhiệt độ đầu vào 130 ± 20 C Áp suất khí nén đầu phun 2 Bar. Cao k hô lá ĐĐR Kiểm nghiệm theo Đóng gói TCCS Hình 3.13. Sơ đồ tóm tắt giai đoạn bào chế cao khô lá đu đủ rừng bằng phương pháp phun sấy 3.2. Kế t quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 3.2.1. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của cao khô lá Đu đủ rừng Tiến hành trên 3 lô cao khô (mỗi lô 2 mẻ chiết, mỗi mẻ 2 kg dược liệu); kết quả đề xuất TCCS của cao khô lá ĐĐR gồm các chỉ