Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu cải tiến qui trình tổng hợp nguyên liệu mesna và ứng dụng bào chế thuốc tiêm

Chia sẻ: Trần Văn Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm Đánh giá được độc tính cấp, độ ổn định của nguyên liệu mesna. Xây dựng được công thức bào chế và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu cải tiến qui trình tổng hợp nguyên liệu mesna và ứng dụng bào chế thuốc tiêm

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO B ộ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Đào Nguyệt Sương Huyền NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUI TRÌNH TỎNG HỢP NGUYÊN LIỆU MESNA VÀ ỨNG DỤNG BÀO CHẾ THUỐC TIÊM Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc Mã số: 62720402 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIÉN s ĩ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2018
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Dược Hà Nội. Viện Kiếm nghiệm thuốc Trung Ương Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Đình Luyện PGS.TS. Nguyễn Văn Hân Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại: Phòng Hội thảo 1 - Trường Đại học Dược Hà Nội Vào hồi ... giờ ... phút ngày ... tháng ... năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Chú thích chữ viết tắt 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ carbon 13 (Carbon-ỉ 3 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) ^ -N M R Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (.Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) BP Dược điển Anh (The British Pharmacopoeia) 6 Độ dịch chuyển hóa học (ppm) dd Dung dịch DĐVN Dược điển Việt Nam đvC Đơn vị carbon ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electrospray Ionization Mass spectrometry) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) KLPT Khối lượng phân tử ICH Hội nghị hòa hợp quốc tế (International Conference on Harmonisation) IR Phô hông ngoại (Infrared Spectroscopy) Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard deviation) SKLM Sắc ký lớp mỏng t°nc Nhiệt độ nóng chảy t°pư Nhiệt độ phản ứng ÍR Thời gian lưu TLTK Tài liệu tham khảo Vmax Số sóng cực đại (em'1) USP Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia)
1 M Ở ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới tỉ lệ các ca tử vong do ung thư là 70%. Các oxazaphosphorin như ifosfamicỊ, cyclophosphamid có tác dụng hiệu quả trên nhiều loại ung thư khác nhau. Tuy nhiên nhóm này có độc tính cao trên tủy xương, thận và bàng quang. Mesna (natri 2- suỉfanyỉethansuỉfonaf) được chỉ định bắt buộc trong quá trình trị liệu, do tương tác với các chất chuyển hóa (bao gồm cả acrolein) của các thuốc kháng ung thư, làm giảm độc đối vói đường tiết niệu. Ưu điểm lán nhất khi sử dụng mesna vừa có hiệu lực cao chống lại độc tính trên bàng quang của acrolein (hạn chế được tác dụng không mong muốn của CYP và IFM) vừa không ảnh hưởng đến tác dụng của các thuốc ung thư dùng đồng thời. Cấu tạo của mesna có hai nhóm chức thiol và sulíbnat, được nối bởi cầu ethylen. Tuy cấu trúc đơn giản, nhưng dược chất này lại rất dễ bị oxy hóa, đặc biệt là trong môi trường giàu khí oxy. Do vậy cần có biện pháp để tổng hợp, tinh chế nguyên liệu đạt tiêu chuẩn và chống oxy hóa dược chất trong bào chế. Sản xuất nguyên liệu làm thuốc ở Việt Nam còn thiếu do rất nhiều nguyên nhân, trong đó cần đề cập tói qui trình sản xuất chưa khả thi, việc tinh chế tạp chất chưa đạt yêu cầu và giá thành nguyên liệu còn cao. Mesna nằm trong danh mục thuốc thiết yếu của Việt Nam lần thứ VI vói dạng bào chế viên nén 400 mg, 600 mg và dung dịch tiêm 100 mg/ml. Là một dược chất được sử dụng nhiều trong điều trị nhưng chưa được nghiên cứu và sản xuất trong nưóc. Do vậy, vấn đề nghiên cứu cải tiến các qui trình tổng hợp đã được công bố trên thế giới và tìm kiếm các phương pháp mói tổng hợp mesna hướng đến sản xuất nguyên liệu và bào chế thành phẩm trong nước là việc làm cần thiết. Từ thực tế đó, luận án được tiến hành nhằm xây dựng các phương pháp tổng hợp mói, cải tiến qui trình tổng hợp cũ để thu được nguyên liệu ứng dụng trong bào chế thuốc tiêm. Các mục tiêu của luận án như sau: ỉ. Thiết kế được phương pháp mới tổng hợp mesna
2 2. Xây dựng được quỉ trình tổng hợp mesna qui mô 200 g/mẻ 3. Đánh giá được độc tính cấp, độ ổn định của nguyên ỉiệu mesna 4. Xây dựng được công thức bào che và đề xuất tiêu chuẩn cơ sờ dung dịch tiêm mesna ỉ 00 mg/mỉ. Những đóng góp mới của luận án. - Đã thiết kế, xây dựng được 02 phương pháp mói tổng hợp mesna qua trung gian muối Bunte và monoalkyltrithiocarbonat. Ket quả thực nghiệm bưóc đầu đã xác định được một số tính chất lý hóa và cung cấp các dữ liệu phổ (1R, MS, NMR) của 3 chất trung gian quan trọng 6, 7, 7a. - Đã xây dựng được qui tình tổng hợp và tinh chế mesna qui mô 200 g/mẻ bằng phương pháp mói qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat với hiệu suất 52,1% tính từ natri 2-cloroethansulfonat. Trong đó đã công bố qui trình tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn BP 2015 qui mô 200 g/mẻ sử dụng ethanol 96%, nhiệt độ 55 °c. - Lần đầu tiên ở Việt Nam đã thử nghiệm về độ ổn định của nguyên liệu mesna được tổng hợp theo phương pháp mới qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat. Khả năng oxy hóa của nguyên liệu mesna trong không khí, là cơ sở cho quá trình bảo quản, sử dụng nguyên liệu trong bào chế. - Lần đầu tiên ở Việt Nam đã công bố các dữ liệu về độc tính cấp của mesna được tổng hợp theo phương pháp mói (qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat) phù hợp với dữ liệu về độc tính của mesna được công bố trên thế giới. Mesna tổng hợp được, không phân loại độc theo đường uống và độc tính trung bình theo đường tiêm tĩnh mạch. Ket quả này cho phép sử dụng nguyên liệu mesna được tổng hợp theo phương pháp mói để nghiên cứu về bào chế. - Lần đầu tiên ở Việt Nam đã xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng mesna trong dung dịch tiêm bằng HPLC sử dụng cột c 18 (250 X 4,6 mm; 10 ỊLim), detector u V, bước sóng phát hiện 215 nm. Phương pháp định lượng đơn giản, phù hợp với thiết bị hiện có. - Lần đầu tiên ở Việt Nam đã xây dựng được công thức bào chế dd tiêm mesna 100 mg/ml từ nguyên liệu mesna (được tổng hợp theo phương pháp
3 mói), sử dụng chất chống oxy hóa dinatriedetat (0,25 mg/ml), dd natri hydroxyd IM điều chỉnh pH 7,2-7,6. 2 . Cấu trú c của luận án Luận án gồm 167 trang, 71 bảng, 11 hình và 60 sơ đồ. Bố cục gồm các phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (35 trang); Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu (13 trang); Thực nghiệm và K ết quả (64 trang); Bàn luận (40 trang); K ết luận và đề xuất (2 trang); Danh mục các công trình đã cồng bố liên quan đến luận án (1 trang). Luận án có 134 tài liệu tham khảo (10 trang) và 72 phụ lục. Chương I. TÔNG QUAN Tống quan về tính chất lý hóa của mesna Cấu trúc hóa học Hg^ \ ^ s°3Na Công thức phân tử: C2H 5Na 0 3 S2, Khối lượng phân tử: 164,17 đvC. Thành phần: c 14,63%; H 3,07%; Na 14,00%; o 29,24%; s 39,06%. Tên khoa học: natri 2-sulfanylethansulfonat. Mesna là bột kết tinh trắng hoặc vàng nhạt, dễ hút ẩm. Tan tự do trong nước, không tan trong cyclohexan. Phương pháp định lượng theo BP 2015: chuẩn độ thể tích (chế phẩm phải chứa từ 96,0 - 102,0% theo chế phẩm đã làm khan). Mesna là hợp chất có chứa nhóm thiol nên rất dễ bị oxy hóa bởi các hợp chất peroxid, halogen, các ion kim loại, oxid kim loại, oxy.... Nó cũng có vai trò như một nucleophyl. Đặc điểm dược lý Mesna có tác dụng tiêu chất nhầy giống ÀT-acetyl-L-cystein vì vậy được dùng làm thuốc long đờm. Nhóm thiol tự do của mesna kết hợp trực tiếp với một liên kết đôi của acrolein hoặc với chất chuyển hóa 4- hydroxyoxazaphosphorin (như 4-hydroxycyclophosphamid và 4- hydroxyifosfamid) để tạo thành hợp chất không độc hại và ngăn cản hình thành acrolein. Ngoài ra, mesna còn tăng đào thải cystein, chất này phản ứng hóa học với acrolein góp phần bảo vệ đường tiết niệu.
4 Chỉ định: Mesna được chỉ định để dự phòng tác dụng độc hại đối vói đường tiết niệu do dùng hóa trị liệu ifosfamid hoặc cyclophosphamid. Neu dùng ifosfamid hoặc cỵclophosphamid ở những liều trên 10 mg/kg luôn phải dùng kèm mesna. - Nghiên cứu trên động vật thực nghiệm cho thấy chưa có bằng chứng về tác dụng gây đột biến, ung thư, quái thai của mesna. Tống quan về các phương pháp tống hợp mesna Sơ đồ 1.6. Các phương pháp chính tống hợp mesna đã công bố Hiện nay có 03 phương pháp chính để tổng hợp mesna: qua trung gian muối thiouroni, thioester và muối xanthat (sơ đồ 1.6). Ngoài ra trong quá trình tổng hợp dimesna, mesna được tạo ra như một chất trung gian, sử dụng tác nhân NaSH và H 2 S, vì vậy phương pháp này không đề cập đến hiệu suất cũng như quá trình tinh chế mesna. Đe tài cũng đã tổng quan về các phương pháp tổng hợp nhóm thiol, trong đó nhấn mạnh đến một số phương pháp qua trung gian muối Bunte và
5 alkyl trithiocarbonat cũng như các phương pháp tổng hợp nhóm thiol đã được công bố. Tổng quan về bào chế mesna Đã tổng quan một số nghiên cứu liên quan đến dạng bào chế của mesna, một số biện pháp chống oxy hóa trong dung dịch của các dược chất có chứa nhóm thiol. Đe tài cũng đã tổng quan về một số nghiên cứu liên quan đến độ ổn định của dd tiêm mesna. Chương 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG TH IẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thuốc thử Các nguyên liệu, hóa chất đều là loại đạt tiêu chuẩn DĐVN, BP, USP hoặc tinh khiết phân tích. Các dung môi sử dụng cho phân tích đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC. Chất chuẩn mesna hàm lượng 98%. 2.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm Sử dụng các thiết bị tổng hợp và phân tích tại Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia, Phòng thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Hóa học - Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3. Nội dung nghiên cứu Tổng hợp hóa học: Khảo sát qui trình tổng hợp mesna ở qui mô phòng thí nghiệm theo 04 con đường, qua các chất trung gian muối thiouroni 3 (con đường I), thioester 5 (con đường II), muối Bunte 6 (con đường III), alkyl trithiocarbonat 7 fcon đường IV). Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các phản ứng tốt nhất. Lựa chọn dung môi để tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn BP 2015. Phân tích, đánh giá, lựa chọn phương pháp để xây dựng qui trình tổng hợp mesna qui mô 200 g/mẻ. Đánh giá độc tính của nguyên liệu mesna được tổng hợp theo phương pháp mới. Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu mesna. Bào chế dung dịch tiêm mesna: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng mesna, đề xuất tiêu chuẩn chất lượng dung dịch tiêm mesna 100
mg/ml. Nghiên cứu xây dựng công thức và lựa chọn phương pháp bào chế dd tiêm mesna 100 mg/ml. Nghiên cứu độ ổn định và dự đoán tuổi thọ của dung dịch tiêm. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp tong hợp và xác định cấu trúc mesna - Tổng hợp hóa học được thực hiện tại Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội bằng các phản ứng hữu cơ cơ bản: alkyl hóa, acyl hóa, thủy phân, sắc ký cột trao đổi ion, một số phương pháp tạo muối... - Tinh chế các chất trung gian và sản phẩm cuối: kết tinh phân đoạn, lọc, cất, sắc ký cột, chiết rắn-lỏng. - Xác định điểm kết thúc phản ứng và sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng đo nhiệt độ nóng chảy và SKLM trên bản mỏng Silicagel F254 Merck vói hệ dung môi thích hợp Hệ A: «-BuOH : AcOH : H 2O = 9,0 : 2,0 : 2,5; Hệ B: n- BuOH : AcOH : H20 = 5,0 : 2,5 : 2,5; Hệ C: «-BuOH : AcOH : H20 = 6,0 : 2,0 : 2,0; Hệ D: «-BuOH : AcOH : H20 = 9,0 : 6,0 : 6,0 Khẳng định cấu trúc sản phẩm mesna và các chất trung gian tổng hợp được dựa trên các dữ liệu phổ IR, MS, NMR.
7 2.4.2. Phương pháp đánh giá chất lượng nguyên liệu mesna Chất lượng nguyên liệu được đánh giá theo tiêu chuẩn BP 2015, thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương. 2.4.3. Phương pháp thử độc tính cấp của nguyên liệu mesna Phương pháp thử độc tính cấp của nguyên liệu mesna là mô hình liều cố định theo hướng dẫn của OECD đối với các hóa dược kết hợp vói hưóng dẫn của Bộ Y tế. Căn cứ vào các TLTK đã công bố về độc tính cấp của mesna, lựa chọn liều khởi đầu là một trong những liều cố định 5, 50, 300, 2000, 5000 mg/kg theo hưóng dẫn của OECD. Tùy theo kết quả đáp ứng của liều khởi đầu mà tiến hành thử tiếp mức liều cao hơn hoặc thấp hơn trên 5 chuột nhắt trắng, trưởng thành, giống cái cho mỗi nhóm. Căn cứ vào kết quả thu được để phân loại mẫu thử theo mức độ độc GHCS. 2.4.4. Phương pháp bào chế Bao bì thuốc: lọ thủy tinh, nút cao su và nắp nhôm được xử lý theo phương pháp thường qui. Dung dịch tiêm được bào chế theo thứ tự: sục khí nitơ vào nước cất pha tiêm 10 phút, hòa tan tá dược trong khoảng 70% thể tích nưóc cất, hòa tan dược chất, điều chỉnh pH đến giá trị thích hợp bằng dung dịch natri hydroxyd IN, bổ sung thể tích vừa đủ, khuấy, lọc qua màng lọc 0,2 jj.m, đóng lọ thủy tinh trung tính, thể tích 4ml, sục khí nitrogen trong 2 phút, đóng nút cao su, siết nắp nhôm, hấp tiệt khuẩn ở 121 °c trong 15 phút. 2.4.5. Phương pháp đánh giá chất lượng dung dịch tiềm mesna lOOmg/ml Mesna được định lượng bằng phương pháp HPLC với các điều kiện như sau: Cột Lichrospher C18 (250 X 4,6 mm; 10 Ị i i m ) hoặc cột tương đương; Nhiệt độ cột: 30 °C; Detector u v : 215 nm; Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm: 20 ỊL il. Thẩm định phương pháp định lượng: Phương pháp định lượng mesna được thẩm định các tiêu chuẩn: độ đặc hiệu, tính thích hợp, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, độ chính xác trung gian theo qui định của ICH và USP 38.
Căn cứ tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu mesna được qui định trong BP2015, USP38, đề tài đề xuất phương pháp xác định giói hạn tạp chất trong dung dịch tiêm mesna được tiến hành bằng phương pháp HPLC. Cột: C18 (250 X 4,6 mm; 10 Jim); Detector: 235 nm; Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Thể tích tiêm: 20 ỊL4.1. Các chỉ tiêu chất lượng khác theo qui định trong Dược điển Việt Nam IV. 2.4.6. Phương pháp đánh giá độ on định Mau nguyên liệu, dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml được thử nghiệm lão hóa: ở điều kiện nhiệt độ 40 ± 2 °c, độ ẩm tương đối 75 ± 5%, thời gian theo dõi 6 tháng. Thử nghiệm dài hạn ở điều kiện nhiệt độ 30 ± 2 °c, độ ẩm tương đối 75 ± 5% tại Bộ môn Công nghiệp Dược và Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia - Trường Đại học Dược Hà Nội. Tuối thọ của thuốc được tính toán với sự trợ giúp của phần mem MINITAB 17.0.1 2.4.7. Phương pháp x ử lý so liệu, kết quả nghiên cứu Các thí nghiệm được lặp lại 03 lần và lấy kết quả trung bình. Đánh giá phương pháp phân tích và các kết quả phân tích sử dụng phương pháp thống kê với công cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft office excel 2010. Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 3.1. Tống hợp và tinh chế mesna ở qui mô phòng thí nghiệm 3.1.1. Tổng họp natri 2-cloroethansul/onat (2) 1 2 M = 98,95 M = 166,55 Tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat (2) được thực hiện theo phương pháp của R. Bai trên cơ sở phản ứng Strecker với hiệu suất 74,5% tính theo natri sulíìt, t°„c: 293,0 - 295,0 °c, Rf= 0,31 (Hệ A); R f = 0,42 (hệ C). IR (KBr), Vmax (cm4): 1195 và 1043 (-SCV), 806 và 604 (C-Cl). ESI-MS (MeOH), m/z: 142,9 [M-Na]- (CTPT: C2H4ClNa03S, M = 166,55 đvC). 1H- NMR (500 MHz, D20), (5 (ppm): 3,35 (2H, t,J = 7,0 Hz, H -l); 3,86 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-2). 1SC~NMR (125 MHz, c), ổ (ppm): 37,96 (C-2); 52,88 (C- 1). Các thông số tốt nhất cho phản ứng tổng hợp chất 2 từ 24,37 g natri
9 Sulfit (hiệu suất cao nhất 80,6 ± 0,33%) là: Tỉ lệ mol 1,2-dicloroethan : natri Sulfit = 3 : 1 ; t°pư: hồi lưu; Tỉ lệ thể tích dung môi nước : ethanol 96% = 7 : 5; Tổng thể tích dung môi: 450 ml. 3.1.2. Tổng hợp mesna qua ừung gian muối thiouroni HjN'’’ 'N H i S 0 3Na ' 1 Trao dối ion ddNHs 25% H s _______ e NKj (Purolile CIOƠR) ---- —► SO3 H2N=C ------------- *" Ss^ SOjNa Vrrr 2.NaOH,pH6,6 4 2 Man« Ọ) Tổng hợp 2-S-thiouroni ethansulfonat (3) từ 2 sử dụng tác nhân thioure, với xúc tác KI, hiệu suất 69,7%, t°nc: 267,5 - 269,0 °c, R/ = 0,19 (hệ C). IR (KBr), Vmax (cm"1): 3300 và 3088 (N-H); 2727 và 2226 (N+-H); 1653 (-C = N+), 1199 và 1041 (SO3-). ESI-MS (CH3OH), m/z: 185,0 [M+H]+; 182,9 [M-H]* (CTPT C3ĨỈ 8N 2O3 S2 , M = 184,24 đvC). XH-NMR (500 MHz, D20), 5 (ppm): 3,29 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-2); 3,48 (2H, t, J = 7,0 Hz5 H-l). Các thông số sau khảo sát phản ứng tổng hợp chất 3 từ 24,48 g chất 2 cho hiệu suất tốt nhất (75,1 ± 0,17%) là: Tỉ lệ mol chất 2 : thioure = 1 : 1,25; t°pư: 90 °c. Thể tích dung môi nước tham gia phản ứng là 60 ml. Tổng hợp guanidini 2-mercaptoethansulfonat (4) từ chất 3 sử dụng tác nhân NH3 với hiệu suất 88,9%, t°nc: 82,3-83,5 °c, R/ = 0,27 (hệ C). IR (KBr), vmax (em'1): 3398, 324ố, 3197 (N-H); 2991, 2943 (C-H no), 2571 (S- H); 2198 (N -H), 1668 (C = N+); 1197 và 1043 (-SO3 -). ESI-MS (MeOH), m/z: 140,816 [M-NH2C(NH2)2] (CTPT: C3H 1 1 N3 O3 S2, M = 201,27 đvC). 13C-NMR (125 MHz5 CD3 OD), 5 (ppm): 20,08 (C-2); 56,60(C-1); 159,95 (C-guanidini). Các thông số sau khảo sát phản ứng tổng hợp chất 4 từ 18,42 g chất 3 (hiệu suất phản ứng cao nhất 93,0 ± 0,78%) là: t°pư: 50 °C; Tỷ lệ mol natri 2-iS,-thiouroni ethansulfonat: NH 3 = 1 : 4 . Tổng hợp mesna từ 4 sử dụng tác nhân natri nitrat hiệu suất 15,9%; t°nc: 265,0 - 267,5 °c. R/= 0,49 («-BuOH : AcOH : H20 = 6,0 : 2,0 : 2,0).
10 Tổng hợp mesna từ chất 4, sử dụng cation purolite C100E chuyển về acid 2-mercaptoethansulfonic, điều chỉnh về pH 6,6 bằng dd NaOH IM, tinh chế thu được mesna, hiệu suất 76,0%, t°nc: 263,0 - 265,5 °C5R /= 0,49 (w-BuOH: AcOH: H20 = 6,0 : 2,0 : 2,0). IR (KBr), vmax (em'1): 2929 và 2852 (C-H no), 2553 (S-H), 1168 và 1058 (S 0 3-> ESI-MS (MeOH), m/z: 140,835 [M-Na]' (CTPT C2H5N a03S2, M = 164,17 đvC). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 (ppm): 2,83-2,86 (2H, m, H-2); 3,03-3,06 (2H, m, H-l). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD),Ô (ppm): 20,12 (C-2); 56,61(C-1). Hiệu suất tổng hợp mesna qua trung gian muối thiouroni tính từ chất 2 là 53,0 ± 0,37%. Hàm lượng mesna 86,54 ± 0,28%. 3.1.3. Tong hợp mesna qua trung gian thioester Tổng hợp natri 2-(benzoylthio)ethansulfonat (5) từ acid thiobenzoic và NaHC03, hiệu suất 67,0%, t°„c: 314,0 - 316,0 °c (phân hủy), Rf = 0,74 (hệ B). IR (KBr), iứtnax (em'1): 3057 và 3007 (C-H thơm), 2954 (C-H no), 1664 (C = o thioester), 1178 và 1068 (SO3 -). ESI-MS (CH3 OH), m/z: 291,0 [M+Na]+ (CTPT CpHpNaCuSí, M = 268,29 đvC). ^H-NMR (500 MHz, D 2 O), 5 (ppm): 3,41-3,44 (2H, m, H-l); 3,23-3,26 (2H, m, H-2); 7,55 (2H, dd, Ji = 7,5 Hz, J2 = 8,5 Hz, H-3’, H-5’); 7,71-7,74 (1H, m5 H-4’); 7,98 (2H, dd, Jj= 1,5 Hz, J2 = 8,5 Hz, H -2\ H-6’). 13C-NMR (125 MHz, D20), 5 (ppm): 23,52 (C-2); 50,33 (C-l); 127,08 (C-3’, C-5’); 128,95 (C-2’, C- 6’); 134,28 (C-4’); 136,27 (C -l’); 195,03 (C = O). Hiệu suất cao nhất đạt 70,9 ± 0,45% từ 2,9 g chất 2 với các thông số: t°pư: 85 °C; Tỉ lệ acid thiobenzoic: chất 2 là 1,1 : 1,0; Lượng nưóc tham gia phản ứng 60 ml. Tổng hợp mesna từ thioester 5, sử dụng tác nhân NH 3 hiệu suất 70,3%, t°„c = 263,0-267,5 °c, R/= 0,61 (hệ B). IR (KBr), ũmaxCcrn1): 2970 và 2937 (C-H no), 2571 (S-H), 1161 và 1047 (SO3 -). ESI-MS (MeOH, negative), m/z: 140,9 [M-Na]' (CTPT C2H5Na03S2>M =164,17 đvC). XH-NMR (500
11 MHz, D 2O), 6 (ppm): 2,87-2,90 (2H, m, H-2); 3,18-3,21 (2H, m, H-l). 13C- NMR (125 MHz, D20), 5 (ppm): 54,37 (0-1); 18,43 (C-2). Các thông số tối ưu cho phản ứng tổng hợp mesna từ 2,8 g thioester 5 íhiệu suất cao nhất 75,9 %): t°pư: 50 °C; Tỉ lệ mol NH3: thioester là 4 : 1; Thể tích nước là 19 ml. Hiệu suất tổng hợp mesna qua trung gian thioester tính từ chất 2 là 53,9± 2,25%, hàm lượng mesna 88,3 ± 1,46%. 3.1.4. Tong hợp mesna qua trung gian muối Bunte Tổng hợp natri £-(2-sulfonatoethyl)sulfurothioat (muối Bunte 6) từ 2, sử dụng natri thiosulfat pentahydrat, hiệu suất 78,8%, t°nc: 230,5-233,0 °c (phân hủy), R/ = 0,28 (hệ B). IR (KBr), -Umax (cm'1): 2987 và 2926 (C-H no); 1188, 1134 và 1039 (SO3 -). ESI-MS (MeOH), m/z: 221,1 [M-2Na+H]‘ (CTPT C2H 4Na 2 S3Oổ5 M = 266,22 đvC). ‘H-NMR (500 MHz, D20), 5 (ppm): 2§ (ppm): 2,81-2,89 (2H, m, H-2); 3,03-3,08 (2H, m, H-l). 13C- NM R (125 MHz, D20), 8 (ppm): s (ppm): 30,02 (C-2); 52,49 (C-l). Các thông số tối ưu cho phản ứng tổng hợp muối Bunte 6 từ 1,0 g chất 2 (hiệu suất cao nhất 82,1 ± 0,36%): Tỉ lệ mol chất 2 : Na2 S2 0 3 .5 ĩỈ 2 0 = 1 : 1,1; Tỉ lệ nước : ethanol = 6 : 7 ; t°pư: hồi lưu; Dung môi tinh chế: methanol : nưóc (50 : 1). Cl N iijS ^ ____g ^ -" ^ S O jN a NaOjS ^ ^ S O jN a natri 2-doroethansulfonat natri 5^2-mlfomtoe*hyl)*ulfuToibioat (2) » HjO/H* Mtsn» (9) ,N aO H pH ~ 6,6 HS'-^ 'S 0 3H 2-merwptoethan5nlfo£iic (8) Tổng hợp mesna từ 6, sử dụng HCl thủy phân, dung dịch NaOH điều chỉnh pH 6,6, tinh chế bằng ethanol 96%, hiệu suất 32,4%, t°nc: 264,1 - 267,0 °c, R /= 0,61 (hệ B). IR (KBr), ũmax (cm4): 2972 và 2924 (C-H no); 2571 (S-H); 1130 và 1049 (SCV). ESI-MS (MeOH), m/z: 141,2 [M-Na]- (CTPT C2H5N a03S2, M = 164,17 đvC). ‘H-NM R (500 MHz, D20), 5 (ppm): 2,84-2,87 (2H, m, H-2); 3,15-3,18 (2H, m, H-l). 15C-INlMDR (125 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm): 19,79 (C-2); 55,21 (C-l). Các thông số sau khảo
12 sát phản ứng tổng hợp mesna từ 1,0 g chất 6 (hiệu suất cao nhất 35,7%): 25ml dung môil,4-dioxan : nưóc (1,5 : 1), acid HC1 đặc thủy phân ở 70 °c. Hiệu suất tổng hợp mesna từ 2: 29,3± 0,88%, hàm lượng 88,1 ±0,47%. 3.1.5. Tồng hợp mesna qua ừung gian alkyl trithiocarbonat C1'—^SOjNa NijCS, ỉa S.S>C^SX N ^ SQaJfa nsttri 2-elaroe*awulfonat M oooalkyi tritìdocartKmât etìiaimi]frrtiic 0) (*) Tổng hợp natri 2-(dithiocarboxylatothio)ethansulfonat (7) từ 2, sử dụng dd natri trithiocarbonat 40%, hiệu suất 69,9% (tính theo 2), t°nc: 210,0 - 216.0 ° c (phân hủy), R/= 0,45 (hệ B). IR (KBr), vmax (em'1): 2972 và 2927 (C-H no); 1130 (C = S); 1197 và 1053 (SO3 -). ESI-MS (MeOH), m/z: 238,99 [M-Na]' (CTPT C3H4Na03S4, M = 262,30 đvC). ‘H-NM R (500 MHz, DMSO-đe), 5 (ppm): 3,16-3,20 (2H, m, H -l); 2,68-2,71 (2H, m, H- 2). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-
13 2569 (S-H), 1174 và 1047 (SO3 -), ESI-MS (MeOH), m/z\ 140,782 [M-Na]-; (CTPT C2H5N a03S2, M = 164,17 đvC), ‘H-NMR (500 MHz, CD3OD), Ỗ (ppm): 2,83-2,86 (2H, m, H-2); 3,03-3,06 (2H, m, H-l). 15C-NMDR (125 MHz, CD3OD), Ỗ (ppm): 20,11 (C-2); 56,60 (C-l). Chúng tôi đã tiến hành tạo nhóm thiol từ dialkyl trithiocarbonat bằng cách thủy phân trong dd H2SO4 với các nồng độ khác nhau (25, 35, 45, 55 %) ở các pH khác nhau, amoniac phân, khử hóa bằng NaBELi và ethanolamin đều không thu được mesna. Từ đó có thể kết luận mesna được tổng hợp từ monoalkyl trithiocarbonat 7. Trong quá trình tổng hợp monoalkyl trithiocarbonat 7 luôn thấy xuất hiện vết tạp dimesna. Vì vậy, chúng tôi đã đề xuất qui trình tổng hợp mesna một giai đoạn íone-pot) từ 2 qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat, hiệu suất 47,6% (tính theo 2), t°„c: 264,0-267,5 °c. R /= 0,61 (hệ B). IR (KBr), Vmax (em '1): 2970 và 29378 (C-H), 2571 (S-H), 1161 và 1047 (SO3-). ESI- MS (MeOH), m/z: 141,34 [M-Na]-; (C2H5N a03S2, M = 164.17 đvC). 1H- NMR (500 MHz, CD3OD), 5 (ppm): 2,74-2,77 (2H, m, H-2); 3,06-3,09 (2H, m, H-l). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-dổ) s (ppm): 18,36 (C-2); 54,34(C-1). Các thông số tốt nhất cho qui trình one-pot: tỉ lệ mol chất 2: natri trithiocarbonat là 1:1,5; t°pư: 55 °C; Acid thủy phân: dd H 2 SO4 35%; pH thủy phân: 1,4. Hiệu suất tính từ 2 là 50,3 ± 0,26%, hàm lượng mesna đạt 91,0 ±0,40%. 3.1.6. So sánh các phương pháp tổng hợp mesna từ natri 2- cloroethansulfonat Từ các kết quả ở qui mô phòng thí nghiệm đã so sánh 4 phương pháp và tìm được 2 phương pháp thích hợp để nâng cấp qui mô tổng hợp mesna 100 g/mẻ qua trung gian muối thiouroni và monoalkyl trithiocarbonat. 3.1.7. Tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn về hàm lượng theo B P 2015 Sau khảo sát, đã lựa chọn được ethanol 96% là dung môi tinh chế với qui trình như sau: trong bình cầu 50 ml, phân tán 1,00 g mesna vào 15 ml ethanol 96% ở 55 °c đã sục khí nitơ. Lọc nóng, sục khí nitơ, để kết tinh lạnh qua đêm, lọc lấy tinh thể (đối với mesna được tổng hợp theo con
14 đường I kết tinh lại 1 lần nữa trong ethanol 96%). sấy chân không ở nhiệt độ 40 °c trong 5 giờ. Hiệu suất tinh chế đối vói mesna được tổng hợp theo COĨ1 đường I là 77,0%, con đương IV là 88,0%. 3.2. Xây dựng qui trình tống họp và tinh chế mesna qui mô 200 g/mẻ Tổng hợp 3 mẻ nguyên liệu natri 2-cloroethansulfonat từ 251,0g natri Sulfit và 631 ml 1,2-dicloroethan (tốc độ khuấy 200 vòng/phút) đã thu được hiệu suất 81,8%, tăng nhẹ so vói qui mô 24,37 g natri Sulfit (80,6%). s
15 Tổng hợp mesna theo con đường I qui mô lOOg/mẻ: Thực hiện 3 mẻ phản ứng, mỗi mẻ 261 g chất 2, hiệu suất tổng hợp giảm nhẹ so với qui mô 24,48 g chất 2 (52,3 so vói 53,0%), hiệu suất tinh chế đạt 77,2%, hiệu suất toàn qui trình tính từ 2 là 40,3%. Sản phẩm đã được kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, được xác nhận đạt tất cả các chỉ tiêu chất lượng theo qui định của BP 2015. Tổng hợp mesna theo con đường IV qui mô lOOg/mẻ: Thực hiện 3 mẻ phản ứng, mỗi mẻ 268 g chất 2, hiệu suất tổng hợp tăng nhẹ so vói qui mô 20.0 g chất 2 (52,4% so với 50,3%), hiệu suất tinh chế đạt 86,6%, hiệu suất toàn qui trình tính từ 2 là 45,4% cao hơn so với con đương I (p-value =0,000). Sản phẩm đã được kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương và được xác nhận đạt tất cả các chỉ tiêu chất lượng theo qui định của BP 2015. Từ kết quả nghiên cửu qui trình tổng hợp mesna qui mô 100 g/mẻ qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat vói hiệu suất ổn định, chúng tôi tiến hành nâng cấp qui trình ở qui mô 200 g/mẻ nhằm đánh giá sự ổn định của qui trình tổng hợp mesna ở qui mô lớn hơn. Thực hiện 3 mẻ vói 550,00 g chất 2, hiệu suất toàn qui trình tính từ 2 là 45.0 ± 0,16%. Sản phẩm đã được kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương và được xác nhận đạt tất cả các chỉ tiêu chất lượng theo qui định của BP 2016. 3.4. Đánh giá độ ốn định của nguyên liệu mesna Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu mesna ở điều kiện lão hóa cấp tốc trong 6 tháng và điều kiện dài hạn trong ít nhất 12 tháng. Ket quả cho thấy nguyên liệu mesna ổn định sau thời gian theo dổi về các chỉ tiêu: hình thức, pH, hàm lượng và tỉ lệ tạp chất liên quan. 3.5. Đánh giá độc tính cấp của mesna Ket quả thử độc tính cho thấy mesna được tổng hợp theo con đường IV gần như không độc (không phân loại độc) theo đường uống, độc tính trung bình (phân loại 4) theo đường tiêm tĩnh mạch. 3.6. Xây dựng phương pháp định lượng mesna bằng HPLC Quy trình định lượng được thẩm định và đạt các chỉ tiêu về độ đặc hiệu (sắc ký đồ dung dịch thử xuất hiện pic sắc ký tương ứng với thời gian lưu
16 của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn mesna ở thời gian 5,1 phút, sắc ký đồ dung dịch placebo không xuất hiện pic sắc ký tại thời gian lưu của pic chính mesna và tạp C). Tính tuyến tính: diện tích pic và nồng độ mesna trong khoảng 0,l-l,0mg/ml có sự tương quan tuyến tính, thể hiện ở phương trình đường chuẩn: y=1871,7x + 7,8046 với R2=0,9996. Độ chính xác: độ lặp lại cho RSD = 0,11% < 2% ÍN=6); độ chính xác trung gian được thực hiện ở 2 ngày khác nhau cho RSD - 0,16% < 2%. Độ đúng được thực hiện trên 3 mẫu bằng phương pháp thêm chuẩn tương ứng với các tỉ lệ 80%, 100%, 120% của công thức, tỉ lệ tìm lại dược chất 99,77-101,6%, độ lệch chuẩn tương đối đều nhỏ hơn 2%. Đánh giá tính tương thích của hệ thống sắc ký cho tR và diện tích pic của pic mesna đều bé hơn 2% (N=6), pic mesna và pic tạp chất c có độ phân giải 3,06. 3.7. Nghiên cứu bào chế dung dịch tiêm mesna lOOmg/ml Bảng 3.60. Công thức dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml TT Thành phần Lưựng/Iọ 4 ml Lượng/mẻ 1000 ml 1 Mesna 400 100 R 2 Dinatri edetat 1 mg 250 mg 3 dd Natri hydroxid 1,0N pH 7,2-7,6 pH 7,2-7,6 4 Nưóc cất pha tiêm vừa đủ 4 mì 1000 ml Sục nưóc cất p la tiêm và trước khi 5 Khí nitơ đc>ng nắp Đe xuất tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp thử của dd tiêm mesna: (1) Tính chất: dd trong suốt không màu đựng trong lọ thủy tinh không màu. (2) Độ trong: dd phải trong suốt và không có tiểu phân kiểm tra bằng mắt thường. (3) Giới hạn tiểu phân không nhìn thấy bằng mắt thường: phải đạt DĐVN IV. (4) Định tính: Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của Mesna. (5) Thể tích: từ 4,0 - 4,6 ml thể tích ghi trên nhãn. (6) pH: 6,5- 8,0. í7) Nội độc tố vi khuẩn: không quá 0,20 IU/mg Mesna. (8) Độ vô khuẩn: Chế phẩm phải vô khuẩn. Thử theo DĐVN IV. (9) Tạp chất liên quan: Tạp D: Không quá 3,0%; Tạp chất C: Không quá 0,2%; Tạp chất A, B, E: Không quá 0,3%; Tạp chất không định danh: Không quá 0,1%; Tổng tạp đơn không định danh: Không quá 0,3%. (10) Định lượng: chế phẩm