Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có khả năng ức chế bơm ngược ở vi khuẩn

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học "Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có khả năng ức chế bơm ngược ở vi khuẩn" được nghiên cứu với mục tiêu: Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng các mô hình sàng lọc ảo EPI mới, vượt qua các hạn chế của các mô hình in silico trước đó bao gồm mô hình dựa trên phối tử ở vi khuẩn Gram âm còn hạn chế do cấu trúc của các EPI rất đa dạng nên khó khăn trong việc tìm ra mối liên quan giữa cấu trúc-tác dụng, mô hình sàng lọc ảo EPI NorA đã xây dựng chủ yếu dựa trên phối tử và mô hình tương đồng vì cấu trúc tinh thể bơm chưa được xác định trước đó.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có khả năng ức chế bơm ngược ở vi khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ---------------------------- PHAN THIỆN VY NGHIÊN CỨU TÌM KIẾM CÁC HỢP CHẤT CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC Ở VI KHUẨN Ngành: Hóa dược Mã số: 9720203 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2023
Công trình được hoàn thành tại: Khoa Dược – Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Thái Khắc Minh TS. Vũ Thanh Thảo Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại ........... vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp - Thư viện Đại học
1 1. Giới thiệu luận án: a. Lý do và tính cần thiết của nghiên cứu Tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh (KS) đang ngày một nghiêm trọng, trong khi các nỗ lực phát triển KS mới ngày càng khó khăn. Để khắc phục tình trạng thiếu KS mới, một hướng tiếp cận khác đang được quan tâm đó là tìm kiếm các chất hỗ trợ, làm tăng hiệu quả hoặc phục hồi hoạt tính của các KS đang có. Bơm ngược là một trong những nguyên nhân hàng đầu của hiện tượng (đa) đề kháng. Do đó thuốc ức chế bơm ngược có khả năng cải thiện tác dụng và hiệu quả của KS trên các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Sàng lọc dưới sự hỗ trợ máy tính được sử dụng ngày càng rộng rãi trong nghiên cứu phát hiện thuốc với nhiều lợi ích như giảm thời gian và chi phí tổng hợp, sàng lọc theo phương pháp truyền thống. Trên cơ sở đó, đề tài luận án tiến hành nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế bơm ngược (EPI) nhằm phát hiện các hợp chất có khả năng khôi phục tác dụng của các KS đã bị đề kháng bởi bơm ngược trên một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm ưu tiên quan trọng như E. coli, P. aeruginosa, và S. aureus. b. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng các mô hình sàng lọc ảo EPI mới, vượt qua các hạn chế của các mô hình in silico trước đó bao gồm mô hình dựa trên phối tử ở vi khuẩn Gram âm còn hạn chế do cấu trúc của các EPI rất đa dạng nên khó khăn trong việc tìm ra mối liên quan giữa cấu trúc-tác dụng, mô hình sàng lọc ảo EPI NorA đã xây dựng chủ yếu dựa trên phối tử
2 và mô hình tương đồng vì cấu trúc tinh thể bơm chưa được xác định trước đó. Từ đó sàng lọc ảo nhằm tìm kiếm các EPI trên NorA, MexAB-OprM và AcrAB-TolC từ các ngân hàng cơ sở dữ liệu, khôi phục tác dụng của các KS đã bị đề kháng bởi bơm ngược. Các mô hình được đánh giá thống kê và kiểm chứng sinh học trên vi khuẩn biểu hiện bơm ngược để khám phá các EPI tiềm năng. Nghiên cứu tập trung vào các mục tiêu cụ thể sau: (i) Tìm kiếm các chất ức chế bơm NorA ở S. aureus từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính; (ii) Tìm kiếm các chất ức chế bơm MexAB-OprM ở P. aeruginosa từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính; (iii) Tìm kiếm các chất ức chế bơm AcrAB-TolC ở E. coli từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính; (iv) Khảo sát hoạt tính ức chế bơm ngược AcrAB-TolC in vitro. c. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Bơm MFS NorA ở S. aureus, bơm RND MexAB-OprM ở P. aeruginosa, bơm RND AcrAB-TolC ở E. coli. Phương pháp nghiên cứu: Xây dựng các mô hình in silico dựa trên phối tử và dựa trên cấu trúc. Sàng lọc các ngân hàng dữ liệu để tìm kiếm các EPI trên NorA, MexAB-OprM, AcrAB-TolC bằng các mô hình in silico đã xây dựng. Mô phỏng động lực học phân tử (MD) để làm rõ cơ chế hoạt động của các EPI. Dự đoán dược động học và độc tính (ADMET) của các EPI tiềm năng. Khảo sát hoạt tính ức chế bơm ngược AcrAB-TolC in vitro.
3 d. Những đóng góp mới của nghiên cứu về mặt lý luận, thực tiễn - Xây dựng 3 tập mô hình sàng lọc in silico sàng lọc chất ức chế NorA, MexAB-OprM, AcrAB-TolC. Các mô hình được đánh giá, so sánh và nêu rõ sự khác biệt với các mô hình trước đây. - Tìm kiếm được các chất mới có tiềm năng ức chế bơm NorA, MexAB-OprM và AcrAB-TolC từ các ngân hàng dữ liệu bằng các mô hình sàng lọc ảo kết hợp. - Hoạt tính ức chế đặc hiệu bơm ngược AcrAB-TolC in vitro của một số EPI tiềm năng được khảo sát bằng thử nghiệm tác dụng hiệp đồng KS với levofloxacin, oxacilin, và thử nghiệm tăng tích lũy H33342. Từ đó xác định được 2 dẫn chất từ thư viện nội bộ (A4 và T-08) và 1 hợp chất từ DrugBank (dasatinib) có tác dụng ức chế bơm tốt. - Quy trình sàng lọc ảo được xây dựng có khả năng dự đoán tốt, được khẳng định bằng kết quả thử nghiệm in vitro. Các mô hình này giải quyết các hạn chế của các mô hình trước đó. e. Bố cục của luận án Luận án được trình bày trong 146 trang, bố cục gồm Đặt vấn đề 3 trang, Tổng quan tài liệu 31 trang, Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 25 trang, Kết quả 51 trang, Bàn luận 33 trang, Kết luận và kiến nghị 3 trang. Ngoài ra còn có các danh mục từ viết tắt, bảng, hình và 44 trang phụ lục các kết quả nghiên cứu. 2. Tổng quan tài liệu NorA S. aureus là bơm MFS tham gia tống xuất nhiều KS đặc biệt là nhóm fluoroquinolon. MexAB-OprM P. aeruginosa và AcrAB-TolC E. coli là bơm ba thành phần RND tham gia tống xuất
4 hầu hết các kháng sinh hiện có. Các mô hình sàng lọc ảo EPI trên mục tiêu bơm ngược đã được quan tâm nghiên cứu nhưng vẫn còn một số hạn chế. Cụ thể, ở vi khuẩn Gram dương, NorA là bơm ngược được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất hiện nay, tuy nhiên do thiếu cấu trúc có độ phân giải cao, các nghiên cứu in silico trước đây chủ yếu dựa vào phối tử. Các mô hình QSAR trong và ngoài nước đã được báo cáo giúp xác định sơ bộ các EPI NorA. Mô hình tương đồng của NorA được dùng trong các nghiên cứu docking và mô phỏng MD. Gần đây, Brawley (2022) đã phân tích cấu trúc NorA bằng kính hiển vi điện tử nghiệm lạnh làm tiền đề cho các mô hình in silico dựa trên cấu trúc tiếp theo. Trong khi đó, ở vi khuẩn Gram âm các nghiên cứu dựa trên cấu trúc được ưu tiên hơn trong việc sàng lọc các EPI. Các cấu trúc 3D của MexB, AcrB có độ phân giải cao giúp thiết kế các mục tiêu chức năng và tìm ra các EPI mạnh. MexB và AcrB có mức độ tương đồng cao nên thường được tiến hành các nghiên cứu đồng thời trong các mô hình dựa trên cấu trúc. Tuy nhiên, do cấu trúc của các EPI rất đa dạng nên khó khăn trong việc tìm ra mối liên quan giữa cấu trúc-tác dụng. Các mô hình in vitro dựa trên phối tử còn rất hạn chế, đặc biệt chưa có công bố về mô hình hồi quy 2D-QSAR trên mục tiêu MexAB-OprM và AcrAB-TolC. Nhiều nghiên cứu đã tìm ra các EPI mới bằng các thử nghiệm kết hợp KS-EPI, và đo quang cơ chất huỳnh quang. Một số EPI trên bơm NorA, MexAB-OprM và AcrAB-TolC đã được xác định bao gồm các thuốc đang sử dụng, hợp chất tổng hợp hoặc sản phẩm tự nhiên. Độc tính hiện đang là một rào cản lớn trong việc phát
5 triển EPI cho thử nghiệm lâm sàng. 3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Cấu trúc bơm ngược: NorA (PDB: 7LO8), MexB (PDB: 6IIA), AcrB (PDB: 4DX7). EPI đã biết: 32 chất ức chế bơm NorA (IC50), 143 chất ức chế bơm ngược MexAB-OprM (MPC8), 170 chất ức chế bơm ngược AcrAB-TolC (MPC4) thu thập từ các bài báo khoa học. MPC4, MPC8 là nồng độ tối thiểu làm giảm 4 hoặc 8 lần MIC KS bị đề kháng do bơm. Ngân hàng dữ liệu: DrugBank (8.823 chất), TCM (57.423 chất), ZINC15 (9,2 triệu chất), VKN (383 chất), nội bộ: NB1 (247 chalcon tổng hợp và 36 chất tổng hợp có cấu trúc khác), NB2 (51 chất tự nhiên phân lập từ thực vật, địa y). Chủng vi khuẩn thử nghiệm: E. coli hoang dại BW25113 (WT), JW0451 (ΔacrB::kan)-E. coli đột biến mất bơm AcrB, JW0453 (ΔacrR::kan)-E. coli đột biến tăng bơm AcrB. Phương pháp nghiên cứu Các mô hình in silico: - PH4: xây dựng dựa trên các EPI đã biết bằng phần mềm MOE 2015.10. - 2D-QSAR: Các thông số mô tả được tính toán bằng MOE và Dragon 5.5. Mô hình hồi quy tuyến tính 2D-QSAR được tạo bằng phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS) trên MOE dựa trên giá trị hoạt tính sinh học. - Docking: Khoang gắn kết được xác định bằng SiteFinder và
6 Dock của MOE, kết hợp với Define Binding Site của LeadIT 2.0.2; hoặc dựa vào phối tử đồng kết tinh. - Sàng lọc ảo: Các tập dữ liệu được sàng lọc theo thứ tự (i) thỏa mô hình PH4; (ii) thỏa mô hình 2D-QSAR (nếu có); (iii) thỏa mô hình docking. - Phân loại cấu trúc EPI: ứng dụng nền tảng web ClassyFire. - MD: tiến hành bằng GROMACS 2020.6, dữ liệu từ các quỹ đạo MD được sử dụng để tính toán RMSD, RMSF, Rg, và SASA. Mười chất có điểm số docking thấp nhất được mô phỏng MD 20 ns. Do quá trình MD trên protein càng lớn thì tiêu tốn càng nhiều tài nguyên máy tính và thời gian nghiên cứu nên đề tài thực hiện mô phỏng MD 300 ns cho NorA (388 acid amin) và 100 ns cho MexB, và AcrB (1046 và 1049 acid amin). Năng lượng liên kết tự do (∆Gliên kết) được tính toán bằng phương pháp MM/GBSA. Tần suất hình thành liên kết hydro được phân tích bằng phần mềm VMD, các tương tác khác được thống kê bằng công cụ PLIF của MOE. - ADMET được dự đoán bằng ADMETlab2.0. Thử nghiệm in vitro: - Thử nghiệm hiệp đồng với KS bằng phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng, resazurin làm chất chỉ thị màu. - Thử nghiệm tích lũy H33342 đo độ hấp thu ở Ex 355 nm/Em 460 nm bằng máy HTS Victor2 V 1420 Multilabel. 4. Kết quả 4.1. Tìm kiếm các chất ức chế bơm NorA ở S. aureus từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Đề tài đã xây dựng được các mô hình in silico có khả năng dự
7 đoán tốt để tìm kiếm các chất ức chế bơm NorA ở S. aureus. Mô hình được lựa chọn để sàng lọc ảo gồm: (i) Mô hình PH4: truy vấn RHHH (1 vòng thơm, 3 nhóm kỵ nước) được xây dựng từ 5 EPI có cấu trúc đa dạng và hoạt tính ức chế bơm IC50 < 10 µM. Khả năng phân loại của mô hình được đánh dựa trên 32 EPI và 350 decoy cho giá trị Se=87,5%; Sp=91,43% và MCC=0,69. (ii) Mô hình docking có vị trị gắn kết tại khoang trung tâm được xác định bằng công cụ SiteFinder, Dock/MOE và Define Binding Site/LeadIT. Mô hình được đánh giá khả năng phân loại dựa trên 32 EPI và 2000 decoy, cho giá trị ROC-AUC là 0,684. Từ cơ sở dữ liệu ban đầu hơn 9,2 triệu chất, các EPI NorA đã được sàng lọc qua mô hình PH4 RHHH và mô hình docking phân tử tại khoang trung tâm NorA với điểm số docking ≤ −20 kJ/mol. Kết quả đã phát hiện được 498 chất từ tập DrugBank, 2.296 chất từ tập ZINC15, 137 chất từ tập TCM, 7 chất từ VKN và 12 chất từ tập dữ liệu nội bộ. Sau sàng lọc ảo, ClassyFire đã phân loại cấu trúc 2.950 EPI tiềm năng thành 12 nhóm cấu trúc chính, trong đó hợp chất dị vòng chiếm hơn 50%. Cấu trúc phổ biến là indol, amid, chalcon và quinolin. 12 chất nội bộ thoả các mô hình sàng lọc ảo EPI trên NorA gồm 6 chalcon, 3 dẫn xuất thiosemicarbazon, 1 dẫn xuất imidazol-4,5-dicarboxamid và 2 flavonol. Mô phỏng MD 20 ns với 10 EPI tiềm năng sau sàng lọc ảo, sau đó mô phỏng MD 300 ns với 2 EPI được dự đoán tốt nhất là DB06364 và TCM22216. Kết quả MD xác định các acid amin tham gia gắn kết với các EPI trong suốt quá trình mô phỏng tại
8 khoang gắn kết là Asp 307, Glu 222, Phe 140, Asn 137, Asn 340 và Gln 51. Kết quả MD 300 ns cho thấy NorA tạo thành phức hợp bền vững với hai phối tử là DB06364 và TCM22216 với ∆Gliên kết tương ứng là −56,60 và −56,44 kcal/mol. Phân tích PCA và RMSF Cα cho thấy sự liên kết của các hợp chất trong quá trình mô phỏng không làm thay đổi đáng kể hình dạng của protein, đặc biệt là ở vị trí gắn kết. Dự đoán ADMET cho thấy các EPI tiềm năng sau sàng lọc ảo đều có tiềm năng phát triển thành thuốc đường uống. 4.2. Tìm kiếm các chất ức chế bơm MexAB-OprM ở P. aeruginosa từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Đề tài đã xây dựng được các mô hình in silico có khả năng dự đoán tốt để tìm kiếm các chất ức chế bơm MexAB-OprM ở P. aeruginosa. Mô hình được lựa chọn để sàng lọc ảo gồm: (i) Mô hình PH4: RHHa (1 vòng thơm, 2 nhóm kỵ nước và 1 hình chiếu điểm nhận liên kết hydro) được xây dựng từ 5 EPI có cấu trúc đa dạng và hoạt tính ức chế bơm MPC8 dưới 5 µM. Mô hình được đánh giá khả năng phân loại dựa trên 19 EPI (MPC8 dưới 5 µM) và 700 decoy, cho giá trị Se=84,2%; Sp=98,3%, MCC=0,68. (ii) Mô hình 2D-QSAR được xây dựng từ 47 EPI có giá trị hoạt tính MPC8 trên aztreonam ở chủng P. aeruginosa PAM1723. Các thông số xây dựng mô hình gồm: F06[N-O], BCUT_SMR_0, PEOE_VSA-0, SMR_VSA2, MATS8p. Các giá trị đánh giá khả năng dự đoán của mô hình: Q2=0,71; 𝑅 2 𝑝𝑟𝑒𝑑 =0,88, RMSE tập kiểm tra =0,25, ̅̅̅ tập kiểm tra =0,68, 𝑟 tập kiểm tra =0,17. 𝑟2𝑚 2 𝑚
9 (iii) Mô hình docking tại túi xa có vị trị gắn kết được xác định bằng công cụ SiteFinder, Dock/MOE và Define Binding Site/LeadIT. Mô hình được đánh giá khả năng phân loại dựa trên 129 EPI và 700 decoy, cho giá trị ROC-AUC là 0,678. Sàng lọc các EPI MexAB-OprM bằng các mô hình sàng lọc ảo với các yêu cầu cụ thể như thỏa mô hình PH4 RHHa, có giá trị hoạt tính MPC8 dự đoán < 10 µM và có điểm số docking ≤ −20 kJ/mol. Riêng tập ZINC15 do có số lượng chất lớn (9,2 triệu chất) đề tài chỉ chọn chất có MPC8 < 3 µM để tiết kiệm tài nguyên máy tính và thời gian nghiên cứu. Kết quả đã phát hiện được 17 chất từ tập DrugBank, 593 chất từ tập ZINC15, 1 chất từ tập TCM (TCM- 28434), không có chất nào từ VKN và dữ liệu nội bộ. ClassyFire đã phân loại cấu trúc 611 EPI tiềm năng thành 8 nhóm chính, trong đó, các hợp chất dị vòng chiếm hơn 60%, cấu trúc phổ biến nhất là dẫn xuất amid, piperazin, pyridin, pyrazol, acid benzoic và piperidin. Mô phỏng MD 20 ns được thực hiện cho 10 EPI tiềm năng nhất từ các mô hình sàng lọc ảo, sau đó, thực hiện mô phỏng MD 100 ns cho 2 phối tử ổn định và có khả năng gắn kết mạnh nhất (ZINC009296881 và ZINC009200074). Kết quả MD cho thấy các acid amin có tần suất gắn kết cao với EPI tại túi xa MexB là Lys 134, Phe 136, Phe 178, Tyr 327, Phe 615, Phe 617, và Leu 672. ZINC009296881 và ZINC009200074 đều có giá trị ∆Gliên kết tốt với MexB là –38,97 và –30,19 kcal/mol. Phân tích PCA và RMSF Cα cho thấy sự liên kết của các hợp chất trong quá trình mô phỏng đã gây ra tác động làm thay đổi đáng kể cấu dạng protein ở vị trí
10 vòng β (Ser 215-Ile 235) thuộc miền phễu gắn với kênh màng ngoài OprM, nhưng không làm thay đổi đáng kể các acid amin ở vị trí gắn kết túi xa. Dự đoán ADMET cho thấy các EPI tiềm năng sau sàng lọc ảo đều có tiềm năng phát triển thành thuốc đường uống. 4.3. Tìm kiếm các chất ức chế bơm AcrAB-TolC ở E. coli từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Đề tài xây dựng được các mô hình in silico có khả năng dự đoán tốt để tìm kiếm các chất ức chế bơm AcrAB-TolC ở E. coli. Mô hình được lựa chọn để sàng lọc ảo gồm: (i) Mô hình PH4: truy vấn RHHa (1 vòng thơm, 2 nhóm kỵ nước và 1 hình chiếu điểm nhận liên kết hydro) được xây dựng từ 5 EPI có cấu trúc đa dạng và hoạt tính ức chế bơm MPC4 dưới 5 µM. Mô hình được đánh giá khả năng phân loại dựa trên 33 EPI (MPC4 dưới 5 µM) và 1629 decoy cho giá trị Se=96,9%, Sp=96,7%, và MCC=0,59. (ii) Mô hình 2D-QSAR: Mô hình 1 và mô hình 3 được xây dựng với giá trị hoạt tính tương ứng là MPC4 trên nhiều loại KS (115 chất) và MPC4 trên cùng 1 loại KS levofloxacin (54 chất). Phương trình mô hình 1: pMPC4 = 4,20711 + 3,04890*EEig12d - 2,58468*SlogP_VSA7 + 0,39631*MATS2m -1,29129*MATS5v Phương trình mô hình 3: pMPC4 = 3,52924 - 1,20213*GATS1p + 0,82656*nCb- + 2,95859*X0v Các giá trị đánh giá khả năng dự đoán của mô hình 1 và 3: Q2 là 0,83 và 0,89; 𝑅 2 𝑝𝑟𝑒𝑑 0,93 và 0,90; RMSEtập kiểm tra là 0,30 và 0,38; ̅̅̅ tập kiểm tra là 0,81 và 0,75, 𝑟 2 tập kiểm tra 0,12 và 0,11. 𝑟2 𝑚 𝑚
11 (iii) Mô hình docking: hai vị trí gắn kết Túi xa (ROC- AUC=0,827), Túi gần (ROC-AUC=0,706) được xác định dựa vào phạm vi bán kính 6,5 Å từ phối tử đồng kết tinh tại hai chuỗi B và A của protein 4DX7. Đồng thời hai vị trí gắn kết này được đánh giá khả năng phân loại dựa trên 159 EPI và 1629 decoy. Ngân hàng dữ liệu được sàng lọc lần lượt qua các mô hình in silico để tìm kiếm các EPI trên AcrAB-TolC với các điều kiện ràng buộc giống với quá trình sàng lọc các EPI trên MexAB-OprM. Tuy nhiên, mô hình 2D-QSAR sử dụng để sàng lọc EPI AcrAB-TolC là mô hình kép gồm hai mô hình dự đoán 1 và 3. Quá trình docking được thực hiện đồng thời cho 2 vị trí gắn kết là túi gần và túi xa. Một chất được cho là có tiềm năng khi có điểm số docking tại một trong hai vị trí gắn kết ≤ −20 kJ/mol. Tại vị trí túi xa, xác định được 34 chất tiềm năng từ DrugBank, 107 chất từ ZINC15, 30 chất từ TCM, và 2 chất nội bộ. Tại vị trí túi gần, các EPI tiềm năng được đề xuất gồm 32 chất từ DrugBank, 82 chất từ ZINC15, 9 chất từ TCM và 1 chất nội bộ. Sử dụng ClassyFire để phân loại cấu trúc các EPI tiềm năng, kết quả cho thấy các EPI tiềm năng được chia thành 9 nhóm cấu trúc chính với hơn 50% là hợp chất dị vòng, cấu trúc chiếm ưu thế là amid, piperazin, quinolin, benzodioxol, phenylpiperidin, acid benzoic và morpholin. Từ các hợp chất nội bộ NB1, hai chất có điểm số docking tốt nhất trên túi xa là A4 và A9, tốt nhất trên túi gần là A9; cả hai chất đều thuộc nhóm dẫn xuất imidazol-4,5-dicarboxamid. Tương tự như trong mô phỏng MD với MexB, mô phỏng MD với AcrB cũng được tiến hành với quá trình 20 ns cho 10 chất tốt
12 nhất từ sàng lọc ảo và 100 ns cho 2 phức hợp ổn định và có khả năng gắn kết mạnh nhất ở mỗi vị trí gắn kết là DB02581-AcrBtúi xa, DB09233-AcrBtúi xa, DB02581- AcrBtúi gần và DB15224- AcrBtúi gần. Cả 4 phức hợp đều có giá trị ∆Gliên kết dưới −30 kcal/mol. Kết quả thống kê các acid amin tham gia tương tác trong quá trình mô phỏng MD thấy rằng ở túi gần, các acid amin có tần suất liên kết cao là Leu 564, Asp 566, Glu 640, Glu 645, Arg 653, và Ala 677. Các acid amin có tần suất gắn kết cao tại túi xa được xác định trong quá trình mô phỏng MD là Ser 134, Phe 136, Gln 176, Phe 178, Phe 615, Phe 617, Arg 620, Phe 628, Val 672, và Glu 673. Kết quả phân tích RMSF Cα và PCA cho thấy các acid amin có sự dao động mạnh trong quá trình mô phỏng MD là vị trí Ala 215-Ile 235 trên vòng β và các acid amin His 505-Pro 560 trên xoắn α; còn các acid amin tại vị trí gắn kết đều có độ ổn định cao. Dự đoán ADMET cho thấy các EPI tiềm năng sau sàng lọc ảo đều có tiềm năng phát triển thành thuốc đường uống. 4.4. Khảo sát hoạt tính ức chế bơm ngược AcrAB-TolC in vitro Kết quả thử nghiệm in vitro trên chứng dương NMP cho thấy, NMP làm tăng tác dụng của KS bị đề kháng bởi bơm ngược, đồng thời làm tăng tích lũy H33342 mạnh hơn ở chủng đột biến tăng bơm so với chủng hoang dại và ảnh hưởng không đáng kể trên chủng mất bơm (Bảng 3.13). Như vậy, mô hình thử nghiệm in vitro phù hợp để khảo sát hoạt tính ức chế bơm AcrB ở E. coli. Từ kết quả sàng lọc ảo các EPI trên AcrAB-TolC, đề tài đã thu thập được DB01254 và hai hợp chất nội bộ là A4, A9 để tiến hành thử nghiệm hoạt tính ức chế bơm in vitro. Kết quả in vitro cho thấy
13 A4 và DB01254 tác dụng trực tiếp trên bơm E. coli AcrAB-TolC và làm giảm MIC của KS bị đề kháng do bơm, trong khi đó, A9 không có tác dụng ức chế bơm đáng kể (Bảng 3.13). Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế bơm AcrAB- TolC in vitro của DB01254, A4, và A9 Mức độ giảm MIC KS Tỷ lệ % mức độ tăng tích (lần) lũy H33342 so với chứng Chất (200 µM) âm (50 µM) Levofloxacin Oxacilin BW25113 ∆acrR ∆acrB NMP 4* 4* 66 87 14 DB01254 2 4 49 179 28 A4 2 4 76 52 9 A9 2 2 10 - - *NMP làm giảm MIC KS ở nồng độ 50 µM; (-) không thực hiện Để đánh giá thêm tiềm năng ức chế bơm AcrAB-TolC của các dẫn xuất imidazol-4,5-dicarboxamid nội bộ, đề tài tiến hành đánh giá hoạt tính của các hợp chất A1, A2, A3, A4, và A9. Kết quả thử nghiệm cho thấy các chất có hoạt tính ức chế bơm giảm dần theo thứ tự A4>A3>A2>A1>A9 (Bảng 3.14). Để đánh giá khả năng dự đoán của mô hình sàng lọc ảo, 30 hợp chất được lựa chọn tiến hành thử nghiệm in vitro. Do chứng dương NMP có MPC4 là 50 µM nên đề tài sử dụng những chất có MPC4 dự đoán ≤ 100 µM để khảo sát. Dựa trên khả năng tiếp cận với các chất thử trong thực nghiệm, đề tài chọn ra 30 chất có mức độ phù hợp với các mô hình sàng lọc ảo (PH4, 2D-QSAR, docking) khác nhau. Các chất được chia thành 7 nhóm thử nghiệm sao cho mỗi nhóm gồm tối thiểu 3 chất. Mức độ phù hợp với thử
14 nghiệm in silico được xác định như sau: thỏa/không thỏa mô hình PH4 RHHA; có/không có MPC4 dự đoán bằng cả 2 mô hình QSAR mô hình 1 và mô hình 3 đều dưới 100 µM; có/không có điểm số docking tại túi xa hoặc túi gần ≤ –20 kJ/mol. Bảng 3.14. Cấu trúc, hoạt tính ức chế bơm AcrAB-TolC của các dẫn chất imidazol-4,5-dicarboxamid Số lần Tỷ lệ % tăng ∆Gliên kết Mã giảm tích lũy 2 3 4 5 20 ns chất MIC KS H33342 (kcal/mol) (100 µM) (100 µM) A1 - - - - 2 17% −10,43 A2 Cl - - - 2 23% −20,34 A3 - Cl Cl - 2 28% −31,09 A4 Cl - Cl Cl 4 88% −28,21 A9 NO2 - Cl - 2 10% −20,50 Trong thử nghiệm in vitro, chất có tác dụng hiệp đồng KS khi chất đó làm giảm MIC của levofloxacin và/hoặc oxacilin từ 2 đến 4 lần ở nồng độ ≤ 200 µM. Chất có tác dụng ức chế bơm AcrB được xác định khi có khả năng làm tăng tích lũy H33342 trên chủng vi khuẩn có bơm và không ảnh hưởng đáng kể trên chủng mất bơm. Để đánh giá khả năng phân loại chất có tác dụng và không có tác dụng của các mô hình in silico một cách chi tiết, nghiên cứu đã tiến hành thống kê như các giá trị như Se, Sp, Acc, Ya, E, GH và MCC (Bảng 4.8).
15 Bảng 4.8. Phân tích thống kê kết quả sàng lọc in silico với thử nghiệm in vitro Điều kiện in silico Se Sp Acc Ya E GH MCC Tác dụng hiệp đồng KS PH4 0,73 0,32 0,47 0,38 13,76 0,15 0,05 QSAR 0,73 0,74 0,73 0,62 22,22 0,47 0,45 Docking 0,73 0,68 0,70 0,57 20,63 0,42 0,40 PH4+QSAR 0,55 0,79 0,70 0,60 21,66 0,46 0,34 PH4+Dock 0,64 0,79 0,73 0,64 22,98 0,50 0,43 PH4+QSAR+Docking 0,55 1,00 0,83 1,00 36,11 0,89 0,66 Tác dụng ức chế bơm AcrB PH4 1,00 0,33 0,40 0,14 5,16 0,12 0,22 QSAR 0,67 0,59 0,60 0,15 5,55 0,17 0,16 Docking 1,00 0,59 0,63 0,21 7,74 0,24 0,36 PH4+QSAR 0,67 0,70 0,70 0,20 7,22 0,22 0,24 PH4+Dock 1,00 0,70 0,73 0,27 9,85 0,32 0,44 PH4+QSAR+Docking 0,67 0,85 0,83 0,33 12,04 0,35 0,39 5. Bàn luận 5.1. Tìm kiếm các chất ức chế bơm NorA ở S. aureus từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Cấu trúc độ phân giải cao của NorA (7LO8) mới được công bố gần đây, nên các nghiên cứu dựa trên cấu trúc trước đây chủ yếu là mô hình tương đồng. Trong khi đó, nhiều nghiên cứu dựa trên phối tử trong và ngoài nước, đặc biệt là các mô hình 2D-QSAR đã được công bố. Trong nghiên cứu này, cấu trúc mới 7LO8 được sử dụng để xây dựng các mô hình docking, MD nhằm bổ sung cho các quan điểm trước đây, đồng thời mô hình PH4 dựa trên phối tử được xây dựng để sàng lọc nhanh các EPI NorA từ các cơ sở dữ liệu. Dự đoán ADMET cũng được tiến hành để đánh giá tiềm năng phát triển thành thuốc đường uống của các EPI sau sàng lọc ảo.
16 So với các nghiên cứu trước, truy vấn PH4 RHHH trong nghiên cứu nhấn mạnh vào tính kỵ nước của các EPI, phù hợp và bổ sung cho các nghiên cứu trước đó của Brincat 2012, Ngo 2016. Vị trí gắn kết trùng với khoang trung tâm, phù hợp với các nghiên cứu trước đó của Bhaskar 2016 và Felicetti 2022. Cấu trúc 7LO8 của NorA lần đầu tiên được thực hiện mô phỏng MD 20 ns với 10 EPI tiềm năng, sau đó là mô phỏng MD 300 ns với 2 EPI được dự đoán tốt nhất là DB06364 và TCM22216. Nghiên cứu này củng cố giả thiết của Handzlik 2013 về cấu trúc các EPI NorA mạnh gồm liên kết đôi liên hợp, các gốc indol, dihydronaphthyl-, 2-cloro-5-bromo-phenyl- hoặc piperidin thường làm tăng hoạt tính, đồng thời bổ sung các khung cấu trúc tiềm năng mới như quinolin, pyrol, piperazin và quinazolin. Ngoài ra, kết quả SAR của 6 chalcon nội bộ phù hợp với kết luận của Le 2022. Nhìn chung, các EPI NorA tiềm năng có các thuộc tính như: tối thiểu ba điểm kỵ nước, ít nhất một vòng thơm; nhóm nhận liên kết hydro và dị vòng nitơ thường làm tăng hoạt tính EPI, nhóm nitro làm giảm khả năng gắn kết. 5.2. Tìm kiếm các chất ức chế bơm MexAB-OprM ở P. aeruginosa từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Các mô hình in silico dựa trên phối tử là các EPI trên MexAB- OprM còn rất hạn chế, đặc biệt chưa có công bố nào về mô hình hồi quy 2D-QSAR. Vì vậy, nghiên cứu này đã phát triển các mô hình 2D-QSAR dự đoán hoạt tính MPC8 của các EPI, giúp định hướng cho sự thay đổi cấu trúc nhằm tăng hoạt tính. Bên cạnh đó,
17 mô hình PH4 dựa trên các phối tử được xây dựng giúp sàng lọc nhanh các EPI tiềm năng từ ngân hàng dữ liệu. Đồng thời, docking phân tử với cấu trúc 6IIA được thực hiện nhằm khẳng định lại khả năng gắn kết vào túi xa của MexB của các EPI. Đây là vị trí gắn kết quan trọng đã được công bố trước đó. Sau đó, mô phỏng MD và dự đoán ADMET được tiến hành trên các EPI tiềm năng sau sàng lọc ảo nhằm làm rõ cơ chế gắn kết và khả năng phát triển thành thuốc đường uống. So với mô hình PH4 của Aparna và cộng sự, bên cạnh yếu tố vòng thơm và điểm nhận liên kết hydro, truy vấn RHHa của đề tài nhấn mạnh hơn vào tính kỵ nước của EPI giống với mô hình PH4 của Nakayama 2004. Mô hình 2D-QSAR các EPI trên MexAB-OprM lần đầu tiên đã được phát triển. Các đặc tính lý hóa được nhấn mạnh trong mô hình 2D- là yếu tố diện tích bề mặt Van der Waals, độ phân cực, và độ âm điện. Bên cạnh đó, việc lựa chọn các thông số có mức độ tương quan với nhau dưới 20%, giúp đa dạng hóa tối đa các thông tin phân tử có liên quan đến hoạt tính. Các acid amin tại túi xa tham gia gắn kết với các EPI trùng với các công bố trước đây của Nakashima 2013, Aparna 2014, Dey 2020, và Gervasoni 2022 gồm Lys 134, Phe 136, Phe 615 và Phe 617. Mô phỏng MD 20 ns được thực hiện cho 10 hợp chất có tiềm năng nhất từ các mô hình sàng lọc ảo, sau đó, mô phỏng MD 100 ns cho 2 phức hợp ổn định và có khả năng gắn kết mạnh nhất được thực hiện. Thống kê các acid amin tham gia tương tác trong quá
18 trình MD cho thấy sự tham gia tương tác của Phe 178, Tyr 327 và Phe 615 trùng với kết quả nghiên cứu của Kumar 2020. Nhìn chung, các EPI tiềm năng trên MexAB-OprM đa số đều có hai vòng kỵ nước, ít nhất là một dị vòng chứa nitơ; các nhóm thế halogeno làm tăng tương tác kỵ nước; nhóm cho liên kết hydro làm tăng khả năng gắn kết. Bên cạnh các dị vòng nitơ pyridin, indol, và quinolin giống với giả thiết của Lamut 2019 về các EPI mạnh, đề tài đề nghị một số dị vòng khác như piperazin, pyrazol, piperidin, oxadiazol, benzylpiperidin, benzodiazepin, purin, và triazol. 5.3. Tìm kiếm các chất ức chế bơm AcrAB-TolC ở E. coli từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Tương tự như các mô hình in silico trên các EPI ở MexAB- OprM, các mô hình sàng lọc ảo dựa trên phối tử ở bơm AcrAB- TolC còn rất hạn chế. Vì vậy, mô hình PH4 dựa trên các phối tử và mô hình 2D-QSAR dự đoán hoạt tính MPC4 của các EPI đã được xây dựng nhằm bổ sung các cho mô hình in silico hiện có, giúp sàng lọc nhanh và định hướng cho sự thay đổi cấu trúc nhằm tăng hoạt tính các EPI. Mô hình docking phân tử với cấu trúc 4DX7 được thực hiện nhằm khẳng định lại khả năng gắn kết vào túi xa của AcrB, vị trí gắn kết quan trọng đã được công bố. Đồng thời, đề tài phát triển thêm mô hình docking tại vị trí gắn kết túi gần, khu vực truy cập của cơ chất, giúp tìm ra các phối tử có khả năng gắn kết vào nhiều vị trí khác nhau của AcrB. Cuối cùng, mô phỏng MD và dự đoán ADMET cũng được tiến hành cho các EPI tiềm năng.