Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin

Chia sẻ: Trần Văn Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng cho các nguyên liệu TEZ, IAT, IBT và ICT tổng hợp được. Thiết lập được chất chuẩn TEZ, tạp chuẩn IAT, tạp chuẩn IBT, tạp chuẩn ICT và ứng dụng trong kiểm nghiệm

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ THANH THUỶ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN VÀ TẠP CHUẨN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM TERAZOSIN Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT Mã số: 62720410 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, năm 2019
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đoàn Cao Sơn GS. TS. Nguyễn Hải Nam Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại............................................................... .............................................................................................. Vào hồi........giờ.......phút.......ngày........tháng.....năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt (BPH) và cao huyết áp là bệnh gặp nhiều ở nam giới trung niên. Terazosin là chất ức chế α1- adrenergic thuộc nhóm -zosin có đồng thời cả hai tác dụng điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt và điều trị tăng huyết áp. Vì vậy, terazosin hay được chỉ định trong điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt đặc biệt là những trường hợp có kèm theo tăng huyết áp. Ngoài ra, trong một số công bố terazosin còn có tác dụng như: điều trị ung thư tuyến tiền liệt, điều trị chứng xuất tinh sớm, làm giảm triệu chứng đường tiết niệu do BPH gây nên, đặc biệt cải thiện các triệu chứng đau, khó chịu ở các bệnh nhân đặt stent niệu quản và giảm lượng thuốc giảm đau phải sử dụng ở những bệnh nhân này. Sử dụng terazosin cho những bệnh nhân bị BPH có kèm cao huyết áp mà đã cắt bỏ tuyến tiền liệt thì huyết áp được kiểm soát tốt và giảm nhanh các triệu chứng đường tiết niệu. Hiện nay terazosin được lưu hành trong các nước ASEAN và nhiều nước khác trên thế giới dưới nhiều dạng biệt dược khác nhau với nhiều hàm lượng khác nhau. Để đảm bảo chất lượng thuốc cho người sử dụng, việc kiểm tra nguyên liệu đầu vào trước khi sản xuất cũng như kiểm tra chất lượng thành phẩm khi lưu hành là yêu cầu bắt buộc. Khi kiểm tra chất lượng các nguyên liệu và thành phẩm thuốc nói chung đều cần đến chất chuẩn và tạp chuẩn nhưng số lượng chất chuẩn đặc biệt là tạp chuẩn được thiết lập tại Việt Nam hiện nay còn rất hạn chế. Trong số vài trăm chất chuẩn được thiết lập tại Việt Nam mới chỉ có gần chục tạp chuẩn do đó các nghiên cứu đóng góp thêm chất chuẩn, tạp chuẩn cho quỹ chuẩn trong nước là rất cần thiết. Đối với terazoin, khi kiểm tra chất lượng nguyên liệu và thành phẩm chứa terazosin ngoài những yêu cầu về con người, trang thiết bị, thuốc thử cần phải có chất chuẩn terazosin và các tạp chuẩn A, B, C của terazosin để thực hiện các phép thử quan trọng là định tính, định lượng, độ hòa tan và xác định giới hạn tạp chất. Tuy nhiên, các chất 1
chuẩn, tạp chuẩn này chưa được thiết lập tại Việt Nam mà đặt mua ở nước ngoài thì giá thành cao và không chủ động do thời gian đặt hàng lâu. Vì vậy, việc nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn terazosin và các tạp chuẩn của terazosin góp phần cung cấp thêm chất chuẩn, tạp chuẩn cho quỹ chuẩn trong nước và tạo thuận lợi cho việc kiểm nghiệm terazosin cũng như thúc đẩy các nghiên cứu phát triển phương pháp kiểm nghiệm terazosin. Đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin” được thực hiện với các mục tiêu sau: Mục tiêu 1: Tổng hợp được các nguyên liệu terazosin hydroclorid (TEZ), tạp chất A của terazosin dạng muối dihydroclorid (IAT), tạp chất B của terazosin (IBT) và tạp chất C của terazosin dạng muối dihydroclorid (ICT) để thiết lập chuẩn. Mục tiêu 2: Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng cho các nguyên liệu TEZ, IAT, IBT và ICT tổng hợp được. Mục tiêu 3: Thiết lập được chất chuẩn TEZ, tạp chuẩn IAT, tạp chuẩn IBT, tạp chuẩn ICT và ứng dụng trong kiểm nghiệm. 2. Những đóng góp mới của luận án  Đã xây dựng được phương pháp tinh chế terazosin bằng sắc ký cột làm nguyên liệu thiết lập chuẩn phù hợp với quy mô sản xuất nguyên liệu thiết lập chuẩn.  Đã xây dựng được các quy trình tổng hợp mới với các tạp chất A, B, C của terazosin làm nguyên liệu thiết lập tạp chuẩn. Lần đầu tiên các tạp chất A, B, C của terazosin được tổng hợp tại Việt Nam với hiệu suất và quy mô phù hợp với mục đích thiết lập chuẩn.  Lần đầu tiên các chỉ tiêu chất lượng cho các nguyên liệu thiết lập chuẩn gồm TEZ, IAT, IBTvà ICT được xây dựng tại Việt Nam trong đó các phương pháp kiểm nghiệm IAT, IBT, ICT như định tính bằng TLC, định tính, định lượng, xác định tạp chất liên quan bằng HPLC là các phương pháp phân tích mới chưa được công bố trong tài liệu nào. 2
 Lần đầu tiên chất chuẩn TEZ và các tạp chuẩn IAT, IBT, ICT được thiết lập tại Việt Nam và đã được theo dõi độ ổn định trong điều kiện bảo quản 2 - 8 C, trên tất cả các chỉ tiêu chất lượng với chu kỳ 3 tháng 1 lần.  Các sản phẩm chất chuẩn, tạp chuẩn đã được ứng dụng để kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng của các nguyên liệu TEZ và thành phẩm TEZ, đặc biệt là chỉ tiêu giới hạn tạp chất liên quan mà trước đó chưa thể tiến hành tại Việt Nam vì thiếu các tạp chuẩn A, B, C của TEZ. 3. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 150 trang, 103 bảng, 79 hình. Bố cục gồm các phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (34 trang); Nguyên liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu (9 trang); Kết quả nghiên cứu (75 trang); Bàn luận (28 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án (1 trang). Luận án có 116 tài liệu tham khảo (gồm 33 tài liệu tiếng Việt, 72 tài liệu tiếng nước ngoài, 11 trang web) và 29 phụ lục. Chương 1. TỔNG QUAN Đã tổng quan được các nội dung chính liên quan đến luận án gồm có: - Tổng quan về terazosin: đặc điểm cấu tạo, tính chất, các tạp chất có trong terazosin, tác dụng dược lý, chỉ định, liều dùng, tác dụng không mong muốn của terazosin, các sản phẩm chứa terazosin lưu hành trên thị trường, một số phương pháp tổng hợp terazosin trên thế giới và tại Việt Nam, tình hình thiết lập chất chuẩn terazosin trên thế giới. - Tổng quan về tạp chất A của terazosin: Đặc điểm cấu tạo, nguồn gốc, quy định về giới hạn tạp A trong nguyên liệu và thành phẩm TEZ theo một số dược điển, một số phương pháp tổng hợp tạp A và dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp A trên thế giới, tình hình thiết lập tạp chuẩn A trên thế giới - Tổng quan về tạp chất B của terazosin: Đặc điểm cấu tạo, qui định về giới hạn tạp B trong nguyên liệu và thành phẩm TEZ theo một số dược điển, một số phương pháp tổng hợp dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp B trên thế giới, tình hình thiết lập tạp chuẩn B trên thế giới 3
- Tổng quan về tạp chất C của terazosin: Đặc điểm cấu tạo, quy định về giới hạn tạp C trong nguyên liệu và thành phẩm TEZ theo một số dược điển, một số phương pháp tổng hợp dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp C trên thế giới, tình hình thiết lập tạp chuẩn C trên thế giới. - Tổng quan về kiểm nghiệm terazosin và các tạp chất A, B, C của terazosin: Một số phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu, thành phẩm terazosin; một số phương pháp định lượng đồng thời terazosin và các thuốc ức chế ức chế α1-adrenergic, định lượng terazosin trong dịch sinh học; một số phương pháp phân tích tạp chất A của terazosin; một số phương pháp phân tích tạp chất B của terazosin; một số phương pháp phân tích tạp chất C của terazosin. Trên thế giới đã công bố khá nhiều phương pháp kiểm nghiệm TEZ cũng như phân tích các tạp chất A, B, C của TEZ. Các phương pháp định lượng TEZ rất đa dạng như phương pháp tạo màu đo quang, phương pháp HPLC detecter UV, phương pháp HPLC với detector huỳnh quang, phương pháp HPTLC, phương pháp đo thế. Các đối tượng mẫu chứa TEZ được nghiên cứu để kiểm nghiệm trong các công bố này gồm nguyên liệu, viên nén, viên nang và dịch sinh học (huyết tương và nước tiểu). Bên cạnh các phương pháp định lưong TEZ riêng biệt thì rất nhiều phương pháp định lượng đồng thời TEZ và các thuốc thuốc ức chế α1-adrenergic khác cũng được nghiên cứu. Hầu hết các phương pháp kiểm nghiệm này dù các đối tượng mẫu khác nhau đều cần sử dụng đến chất chuẩn terazosin hydroclorid, một số phương pháp phân tích còn yêu cầu cả chất chuẩn terazosin hydroclorid và các tạp chuẩn A, B, C của terazosin. Các phương pháp phân tích tạp chất A, B, C của terazosin chủ yếu là các phương pháp HPLC với các loại detector khác nhau như detector UV, detector khối phổ cho các đối tượng mẫu là nguyên liệu và thành phẩm TEZ hay chính nguyên liệu các tạp chuẩn này. Đa số các phương pháp đều dùng các tạp chuẩn A, B, C của terazosin ở các nồng độ khác nhau. Ngoài ra, tạp chuẩn A và tạp chuẩn C còn được dùng để kiểm nghiệm doxazosin là một hoạt chất khác cũng thuộc nhóm ức chế α1- 4
adrenergic đang lưu hành rộng rãi tại Việt Nam. - Tổng quan về chất chuẩn đối chiếu: Khái niệm, vai trò, phân loại chất chuẩn đối chiếu, qui trình thiết lập chất chuẩn DĐVN. - Tình hình thiết lập chất chuẩn, tạp chuẩn tại Việt Nam hiện nay: Theo thống kê hiện nay Việt Nam đã thiết lập được hơn 500 chất chuẩn đối chiếu hóa học trong đó Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (VKNTTƯ) đã cung cấp hơn 300 chất chuẩn, Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh (VKNTPHCM) cung cấp 200 chất chuẩn. Số lượng tạp chuẩn thiết lập được tại Việt Nam chưa nhiều, mới có khoảng gần chục tạp chuẩn được thiết lập trong danh mục chất chuẩn của VKNTTƯ và VKNTPHCM. Các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn đối chiếu hóa học là hoạt chất chủ yếu dùng các nguyên liệu dược dụng mua ở nước ngoài, còn nguyên liệu thiết lập tạp chuẩn mới chỉ có một số ít nghiên cứu tổng hợp tạp chất làm nguyên liệu thiết lập các tạp chuẩn trong nước nhưng cũng chưa có nghiên cứu nào về tổng hợp thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin. - Tổng quan về thẩm định phương pháp phân tích nguyên liệu hóa dược: Các chỉ tiêu phải thẩm định theo từng loại quy trình phân tích; khái niệm và cách xác định độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng. Chương 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Chất chuẩn, tạp chuẩn - Chất chuẩn terazosin hydroclorid của Hội đồng Dược điển Mỹ, lô G0F290, hàm lượng nguyên trạng 91,9% - Tạp chuẩn A của Hội đồng Dược điển Mỹ dạng muối dihydroclorid, lô F0C245, hàm lượng nguyên trạng 90,0% - Tạp chuẩn B của terazosin của Hội đồng Dược điển Mỹ, lô F0C218, hàm lượng nguyên trạng 100%. - Tạp chuẩn C của terazosin của Hội đồng Dược điển Mỹ dạng muối 5
dihydroclorid, lô H0M084, hàm lượng nguyên trạng 95,0%. 2.1.2. Nguyên liệu - 2-cloro-6,7-dimethoxyquinazolin-4-amin (ACDQ) PA, Sigma- Aldrich, lô STBC3541V, hàm lượng nguyên trạng 99,7% - Nguyên liệu terazosin tổng hợp tại Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội, hàm lượng nguyên trạng 90,2% 2.1.3. Dung môi, hóa chất Các hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu là của hãng Merck (Đức), của hãng Fisher Chemical (Mỹ) và của hãng Xilong (Trung Quốc) đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. Các dung môi dùng chạy HPLC đều đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC. 2.2. TRANG THIẾT BỊ Sử dụng các trang thiết bị dùng cho tổng hợp và phân tích tại Trường Đại học Dược Hà Nội, VKNTTƯ, Trung tâm Kiểm nghiệm Vĩnh Phúc, Phòng thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp tổng hợp 2.3.1.1. Phương pháp tổng hợp terazosin hydroclorid Tổng hợp terazosin hydroclorid theo TLTK [17] theo sơ đồ “Hình 1.10” ở phần “Tổng quan” nhưng tiến hành đến giai đoạn tạo terazosin thô. Hóa chất và điều kiện: a) CH3OH, H2SO4, 25 - 35 C/4 giờ, b) Piperazin, CH3COOH 5%/dioxan, đun hồi lưu 12 giờ c) dioxan, hồi lưu 12 giờ, d) HCl/EtOH; TEA, ethylacetat, 60 – 65 C Hình 1.10. Sơ đồ tổng hợp terazosin tại Việt Nam 6
2.3.1.2. Phương pháp tổng hợp tạp chất A Tổng hợp tạp chất A từ ACDQ và piperazin (Hình 2.2 ). Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp IAT 2.3.1.3. Phương pháp tổng hợp tạp chất B Tổng hợp tạp chất B từ terazosin bằng phản ứng diazo hóa tạo muối diazoni sau đó thủy phân muối diazoni thu được trong môi trường acid yếu rồi chiết bằng ethyl acetat thu được sản phẩm thô (Hình 2.3) Hình 2.3. Sơ đồ tổng hợp IBT 2.3.1.4. Phương pháp tổng hợp tạp chất C Tổng hợp tạp chất C của terazosin từ IAT base và ACDQ (Hình 2.4). Hình 2.4. Sơ đồ tổng hợp ICT 7
2.3.1.5. Phương pháp tinh chế Tinh chế các sản phẩm thô bằng phương pháp sắc ký cột sử dụng silica gel 60 dùng cho sắc ký cột (kích thước 63 - 200 µm) với các hệ dung môi rửa giải phù hợp tùy từng sản phẩm. Sử dụng phương pháp nhồi cột ướt, tỷ lệ 50 g silicagel nhồi cột cho 1 g mẫu thô cần tinh chế. 2.3.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được 2.3.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Các sản phẩm được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp TLC do luận án xây dựng, sử dụng 3 hệ dung môi pha động khác nhau cho mỗi sản phẩm, với nồng độ chất phân tích phù hợp, phát hiện vết bằng soi đèn UV 254 nm và 312 nm. Riêng sản phẩm IAT được kiểm tra độ tinh khiết bằng 4 hệ dung môi pha động khác nhau trong đó 3 hệ phát hiện vết bằng soi đèn UV 254 nm và 312 nm, 1 hệ để kiểm tra piperazin tồn dư thì phát hiện vết bằng thuốc thử Nihydrin. 2.3.2.2. Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) Xác định hàm ẩm của sản phẩm sử dụng máy phân tích nhiệt trọng lượng Labsys TG 1600, SETARAM (Pháp), với tốc độ dòng khí bảo vệ 2,5 lít/giờ, tốc độ gia nhiệt là 2 oC/phút, duy trì nhiệt độ 105 oC trong 4 giờ, lượng mẫu thử khoảng 10 mg. 2.3.3. Phương pháp phân tích cấu trúc 2.3.3.1. Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) Được đo bằng máy Shimazdu FTIR Afinity - 1S hoặc máy đo phổ IR 670-FTIR Nicolet-NEXUS với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400 cm-1. 2.3.3.2. Phương pháp đo phổ khối lượng (MS) Được đo bằng máy khối phổ LTQ ORBITRAP XL bằng phương pháp đưa mẫu trực tiếp với dung môi là methanol, kỹ thuật ESI để ion hóa các chất cần đo. 2.3.3.3. Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Được ghi trên máy cộng hưởng từ Bruker Ascend 500 MHz hoặc máy cộng hưởng từ Bruker AVANCE 500 MHz, dung môi DMSO- 8
d6. Phổ 1H-NMR, HSQC, HMBC đo ở tần số 500 MHz, phổ 13 C-NMR đo ở tần số 125 MHz. Độ dịch chuyển hóa học (δ, ppm) được hiệu chỉnh theo chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS). 2.3.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector đo độ dẫn để xác định tỷ lệ mol HCl kết hợp trong ICT Sử dụng máy HPLC Shimadzu với detector đo độ dẫn CDD-10A VP, cột Shodex IC SI-52 4E (4,0 mm x 250 mm), pha động: Na2CO3 3,6 mM, tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột: 45 C, thể tích tiêm mẫu: 50 µl. 2.3.3.5. Phương pháp hóa học Xác định acid kết hợp trong TEZ, IAT và ICT bằng phản ứng với AgNO3 0,1 N. 2.3.4. Phương pháp kiểm nghiệm các sản phẩm TEZ, IAT, IBT và ICT 2.3.4.1. Phương pháp đo phổ IR Như mục 2.3.3.1 2.3.4.2. Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy Xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy xác định nhiệt độ nóng chảy SMP 3 Stuart (Anh). 2.3.4.3. Phương pháp TGA Như mục 2.3.2.2 2.3.4.4. Phương pháp TLC Các phương pháp TLC do luận án xây dựng để định tính sản phẩm IAT, IBT, ICT bằng TLC, sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254, phát hiện vết bằng soi đèn UV 254 nm với mỗi sản phẩm sử dụng 1 hệ dung môi khai triển phù hợp và nồng độ chấm sắc ký phù hợp. 2.3.4.5. Phương pháp HPLC - Phương pháp HPLC do luận án xây dựng để định tính, định lượng và xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu và các sản phẩm chuẩn TEZ, IAT, IBT; sử dụng cột C8 (4,6 mm × 25 cm), nhiệt độ cột là 30 C, detector UV (bước sóng 254 nm với định lượng TEZ và phân tích tạp chất liên quan trong TEZ; 245 nm với định lượng IAT, 9
IBT; 254 nm với phân tích tạp chất trong IAT và IBT), pha động gồm methanol và dung dịch đệm citrat pH 3,2 (16: 84), tốc độ dòng 1,0 ml/phút. - Phương pháp HPLC theo BP 2017 để xác định tạp 1-[(tetrahydro- 2-furanyl) carbonyl] piperazin (TFCP) trong nguyên liệu và chất chuẩn TEZ. - Phương pháp HPLC luận án xây dựng để định tính, định lượng và xác định tạp chất trong nguyên liệu và tạp chuẩn ICT sử dụng cột C8 (4,6 mm × 25 cm), nhiệt độ cột là 40 C detector UV 254 nm, chương trình pha động gradient dung môi, tốc độ dòng 1,0 ml/phút. 2.3.4.6. Phương pháp GC theo USP 40 Phương pháp sắc ký khí (GC) theo USP 40 để xác định tạp acid tetrahydro-2-furancarboxylic trong nguyên liệu và sản phẩm chuẩn TEZ sử dụng detector ion hóa ngọn lửa. 2.3.5. Các phương pháp kiểm nghiệm viên nén TEZ 2.3.5.1. Phương pháp HPLC theo USP 40 đế định tính, định lượng TEZ trong viên nén TEZ 2.3.5.2. Phương pháp HPLC theo USP 40 đế xác định tạp chất liên quan trong viên nén TEZ 2.3.5.3. Phương pháp HPLC theo tiêu chuẩn nhà sản xuất Abbott để định tính, định lượng TEZ trong viên nén TEZ 2.3.5.4. Phương pháp xác định độ hòa tan theo USP 40 và tiêu chuẩn nhà sản xuất Abbott để xác định độ hòa tan của viên nén TEZ 2.3.5.5. Phương pháp đo phổ UV theo USP 40 Phương pháp đo phổ UV theo USP 40 để định tính viên nén TEZ 2.3.6. Các phương pháp xử lý số liệu  Xử lý kết quả phân tích trong từng phòng thí nghiệm - Tập hợp kết quả và loại giá trị thô theo hướng dẫn - Tính giá trị trung bình (X) - Tính độ lệch chuẩn (S) - Tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD)  Xử lý kết quả phân tích liên phòng thí nghiệm 10
- Áp dụng test F để so sánh 2 phương sai - Áp dụng test T để so sánh 2 giá trị hàm lượng trung bình  Xác định giá trị hàm lượng chất chuẩn, tạp chuẩn công bố trên chứng chỉ - Tính giá trị trung bình của cả 2 phòng thí nghiệm (X) - Tính độ lệch chuẩn (S) - Tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD) - Tính độ không đảm bảo đo chuẩn của phép đo: U (x) = SX - Tính độ không đảm bảo đo mở rộng của giá trị hàm lượng: U = k. U(x) = k. S(x)  - Tính giá trị công bố trên chứng chỉ phân tích: X U Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. TỔNG HỢP TERAZOSIN VÀ CÁC TẠP CHẤT A, B, C 3.1.1. Tổng hợp terazosin hydroclorid Kế thừa qui trình tổng hợp TEZ tại Việt Nam của Nguyễn Hải Nam và cộng sự đến giai đoạn tạo ra TEZ dang muối hydroclorid thô, phương pháp tinh chế khác bằng sắc ký cột sử dụng silica gel dùng cho sắc ký cột (63-200 µm) với hệ dung môi rửa giải là diclorometan - aceton - methanol ở các tỷ lệ (8: 8: 1), (8: 12: 1), (8: 12: 2) được thực hiện. Dịch rửa giải của các phân đoạn sau khi kiểm tra bằng TLC chỉ có TEZ được tập trung lại, loại dung môi bằng cất quay chân không rồi sấy trong chân không ở 60 C trong 4 giờ, thu được sản phẩm là bột kết tinh màu trắng, tnc: 273,1C. hiệu suất khi tinh chế 92,2%; Rf = 0,44 (hệ 1T); 0,66 (hệ 2T); 0,33 (hệ 3T). IR (KBr), νmax (cm -1): 3420 (NH2); 3080 (C-H vòng thơm); 2961 (CH2); 1630 (C=O); 1591 (C=C vòng thơm); 1244 (CH3O-); 991 (C-H vòng thơm). Hệ số tương đồng phổ IR của sản phẩm TEZ và chất chuẩn TEZ USPRS: 99,44%. ESI-MS (CH3OH), m/z: 388,1993 [M+H]+, 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d ), δ(ppm): 1,85-1,88 (2H, m, H22); 6 1,98-2,11 (2H, m, H21); 3,57-3,81 (8H, m, H23, H13, H15, H16); 3,84 (3H, s, H17), 3,87(3H, s, H18); 3,89-3,96 (2H, m, H12); 4,73- 4,76 (1H, m, H20); 7,60 (1H, s, H8); 7,76 (1H, s, H5); 8,67 (1H, s, 11
NH); 8,94 (1H, s, NH); 12,42 (1H, s, NH). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ(ppm): 25,73 (C22); 28,40 (C21); 41,21 (C15), 44,39 (C13), 44,67 (C16), 45,28 (C12), 56,54 (C18), 56,74 (C17), 68,75 (C23); 75,36 (C20); 99,66 (C8); 102,19 (C9); 105,45 (C5); 136,70 (C10); 147,28 (C7); 151,82 (C2); 155,70 (C6); 161,75 (C4); 170,21 (C19). 3.1.2. Tổng hợp tạp chất A của terazosin Hòa tan hoàn toàn 0,89 g (0,01 mol) piperazin bằng 8 ml alcol isoamylic (IAM), thêm 0,50 g 2-cloro-6,7-dimethoxyquinazolin-4- amin (ACDQ) (0,002 mol), siêu âm 15 phút để đồng nhất hỗn hợp. Duy trì 120 C trong 5 giờ có khuấy từ hồi lưu, sau đó hạ nhiệt độ xuống 70 C, duy trì trong 15 giờ. Lọc nóng lấy tủa, rửa tủa bằng IAM nóng, sấy khô tủa ở 60 C trong chân không thu được tạp A dạng base là bột kết tinh màu trắng với hiệu suất 82,6%. Hòa tan lượng tạp A dạng base trên với 100 ml MeOH, thêm 4 ml HCl đặc, duy trì ở 60 C trong 1 giờ có khuấy từ hồi lưu, sau đó cô quay trong chân không thu cắn. Hòa tan cắn trong 400 ml nước và lọc để loại tạp không tan trong nước. Bay hơi dịch lọc bằng cất quay chân không thu cắn. Sấy cắn thu được trong chân không ở 60 C trong 12 giờ thu sản phẩm IAT thô là bột kết tinh màu trắng với hiệu suất 78,7%. Triển khai sắc ký cột để tinh chế IAT thô sử dụng silicagel dùng cho sắc ký cột (63- 200 µm) làm pha tĩnh với hệ dung môi rửa giải là diclomethan - methanol ở các tỷ lệ (9: 1), (7: 3), (6: 4). Dịch rửa giải của các phân đoạn sau khi kiểm tra bằng TLC chỉ có IAT được tập trung lại, loại dung môi bằng cất quay chân không rồi sấy trong chân không ở 60 C trong 12 giờ thu sản phẩm là bột kết tinh màu trắng, t : 219,2 C; nc hiệu suất 71,1%; Rf = 0,41 (hệ 1A); 0,47 (hệ 2A); 0,42 (hệ 3A); 0,38 (hệ 4A). IR (KBr), νmax (cm -1): 3436 (NH2); 3317 (NH); 3166 (C-H vòng thơm); 2944 (CH2); 1651 (C=C vòng thơm); 1266 (CH3O-); 834 (C-H vòng thơm). Hệ số tương đồng phổ IR của sản phẩm IAT và chất chuẩn IAT USPRS: 99,38%. ESI-MS (CH3OH), m/z: 290,1600 [M+H]+, 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ(ppm): 3,27 (4H, s, H13, 12
H15); 3,86 (3H, s, H18); 3,88 (3H, s, H17); 4,18 (4H, s, H12, H16); 7,71 (1H, s, H5); 7,81 (1H, s, H8); 8,72 (1H, s, NH); 9,06 (1H, s, NH); 9,71 (2H, s, NH2); 12,86 (1H, s-br, NH). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ(ppm): δ 42,25 (C13); 42,38 (C15); 49,06 (C12, C16); 56,56 (C18); 56,79 (C17); 99,69 (C5); 102,32 (C8); 105,45 (C9); 136,71 (C10) ; 147,42 (C6); 151,84 (C2); 155,74 (C7); 161,84 (C4). 3.1.3. Tổng hợp tạp chất B của terazosin Hòa tan hoàn toàn 0,5 g terazosin hydroclorid (1,1 mmol) trong 25 ml nước cất. Cho thêm 2 g KBr, siêu âm để hỗn hợp tan hoàn toàn. Thêm vào hỗn hợp này 10 ml dung dịch NaNO2 được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1,52 g natri nitrit (22 mmol) trong 10 ml nước và 22 ml acid sulfuric 5 M (110 mmol), trộn đều. Khuấy từ ở nhiệt độ 0 - 5 C trong 4 giờ. Điều chỉnh hỗn hợp phản ứng tới pH 6 bằng NaOH 40%. Khuấy từ hồi lưu ở 60 C trong 2 giờ. Loại dung môi bằng cất quay chân không thu cắn 1. Hòa tan cắn 1 trong 250 ml ethyl acetat, lọc. Cất quay dịch lọc trong chân không thu cắn 2. Sấy cắn 2 trong chân không ở 60 C trong 12 giờ thu được sản phẩm IBT thô là bột màu trắng, hiệu suất 92,4%. Triển khai sắc ký cột để tinh chế IBT thô sử dụng silicagel dùng cho sắc ký cột (63-200 µm) làm pha tĩnh với hệ dung môi rửa giải là acetonitril - cloroform - n-hexan - methanol ở các tỷ lệ (5: 4: 1: 0), (5: 4: 0: 0), (5: 4: 0: 1), (5: 3: 0: 2). Dịch rửa giải của các phân đoạn sau khi kiểm tra bằng TLC chỉ có IBT được tập trung lại, loại dung môi bằng cất quay chân không rồi sấy trong chân không ở 60 C trong 12 giờ thu sản phẩm là bột kết tinh màu trắng; tnc: 247,3 C; hiệu suất 78,3%; Rf = 0,46; (hệ 1B); 0,69 (hệ 2B); 0,51 (hệ 3B); IR (KBr), νmax (cm-1): 3502 (-OH phenol); 3125 (C-H vòng thơm); 2959 (-CH2); 1666 (C=O); 1262 (CH3O-); 836 (C-H vòng thơm). Hệ số tương đồng giữa phổ IR của sản phẩm IBT với tạp chuẩn IBT USPRS: 98,70%. ESI-MS (CH3OH), m/z: 387,1671 [M- H]- . 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ(ppm): 1,85-1,88 (2H, m, H22); 1,99-2,09 (2H, m, H21); 3,53-3,66 (8H, m, H12, H13, H15, H16); 3,75-3,79 (2H, m, H23); 3,81 (3H, s, H18); 3,86 (3H, s, H17); 13
4,71-4,73 (1H, m, H20); 6,82 (1H, s, H5); 7,30 (1H, s, H8); 11,38 (1H, br, OH). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ(ppm): 25,71 (C22); 28,44 (C21); 41,36 (C15); 44,71 (C13); 45,27 (C16); 45,76 (C12); 56,02 (C18); 56,21 (C17); 68,71 (C23); 75,36 (C20); 105,96 (C5-C8); 109,97 (C9-C10); 146,37 (C6); 150,84 (C2); 155,35 (C7); 162,97 (C4); 170,07 (C19). 3.1.4. Tổng hợp tạp chất C của terazosin Hòa tan 0,82 g ACDQ (0,0034 mol) trong bình cầu dungg tích 100 ml bằng 35 ml DMF, thêm 0,50 g IAT base (0,0017 mol), siêu âm 15 phút để đồng nhất hỗn hợp. Duy trì nhiệt độ 100 ± 5 C trong 7 giờ có khuấy từ hồi lưu, sau đó lọc nóng khối phản ứng thu tủa, sấy khô tủa trong chân không ở 60 C trong 24 giờ thu được tạp C dạng base là bột kết tinh màu trắng với hiệu suất 89,8%. Thêm vào lượng tạp C dạng base này 50 ml methanol và 3,5 ml HCl đặc, duy trì 60 C trong 3 giờ có khuấy từ hồi lưu. Loại dung môi bằng cất quay chân không thu cắn. Rửa cắn để loại HCl bằng H2O đến khi pH dịch rửa trung tính và dịch rửa âm tính khi phản ứng với dung dịch thuốc thử AgNO3 0,1 N. Sấy cắn trong chân không ở 60 C trong 12 giờ thu được ICT thô là bột kết tinh màu trắng, hiệu suất 84,6%. Triển khai sắc ký cột để tinh chế ICT thô sử dụng silicagel dùng cho sắc ký cột (63-200 µm) làm pha tĩnh với hệ dung môi khai triển CHCl3 - MeOH ở các tỷ lệ khác nhau là (10: 2), (8: 4), (6: 6). Dịch rửa giải của các phân đoạn sau khi kiểm tra bằng TLC chỉ có ICT được tập trung lại, cất quay loại dung môi thu lấy cắn, sấy cắn trong chân không ở 60 C trong 12 giờ thu sản phẩm là bột kết tinh màu trắng, tnc 305,7 C; hiệu suất 62,1%; Rf = 0,41 (hệ 1C); 0,37 (hệ 2C); 0,68 (hệ 3C). IR (KBr), νmax (cm-1): 3590 (NH2); 3327 (NH); 3202 (C-H vòng thơm); 2853 (CH2- ); 1639 (-C=C vòng thơm); 1248 (CH3O-); 851 (C-H vòng thơm). Hệ số tương đồng phổ IR của sản phẩm ICT với tạp chuẩn ICT USPRS: 99,45%. ESI-MS (CH3OH), m/z =493,2302 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ(ppm): 3,77 (4H, s, H12, H16, H13, H15); 3,79 (3H, s, H17, H30); 3,84 (3H, s, H18, H29); 6,75 (1H, s, H5, H22 ); 14
7,12 (2H, s, 4-NH2, 21-NH2 ); 7,45 (1H, s, H8, H25). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ(ppm): 43,67 (C12, C15, C13, C16); 55,38 (C18, C29); 55,85 (C17, C30); 102,91 (C9, C27); 103,78 (C8, C25); 105,17 (C5, C22); 144,87 (C7, C24); 148,82 (C10, C28); 154,17 (C6, C23); 158,59 (C2, C19); 161,09 (C4, C21). Xác định tỷ lệ mol HCl kết hợp trong sản phẩm ICT bằng HPLC với detector đo độ dẫn. Kết quả cho thấy tỷ lệ mol HCl kết hợp trong sản phẩm và ICT là 2:1. 3.2. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG CHO CÁC NGUYÊN LIỆU TỔNG HỢP ĐƯỢC 3.2.1. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu terazosin hydroclorid - Các chỉ tiêu chất lượng cho sản phẩm TEZ được xây dựng theo USP 40 và BP 2017 gồm các chỉ tiêu: +Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng + Độ trong và màu sắc dung dịch: Dung dịch 1% phải trong + Định tính: IR, HPLC, phản ứng của ion Cl- + Mất khối lượng do làm khô (TGA): ≤ 1% + Tạp acid tetrahydro-2-furancarboxylic (GC): ≤ 0,1% + Tạp 1-[(tetrahydro-2-furanyl)carbonyl] piperazin: ≤ 0,1% + Tạp chất liên quan: Tạp A ≤ 0,3%; Tạp C ≤ 0,4%; Tạp rửa giải trước TEZ ≤ 0,3%; Tạp khác ≤ 0,1%; Tổng tạp ≤ 0,6%. + Định lượng (HPLC): 98,0 – 102,0% hàm lượng khan - Theo qui định các chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu terazosin được xây dựng phương pháp thử theo chuyên luận nguyên liệu terazosin trong USP 40 và BP 2017 là các dược điển tham chiếu nên không yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích. 3.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp A - Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính IAT bằng TLC - Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng IAT bằng HPLC 15
- Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định tạp chất trong IAT bằng HPLC - Các chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu IAT + Tính chất: Bột kết tinh màu trắng + Định tính: IR, TLC, HPLC, phản ứng của ion Cl- + Nhiệt độ nóng chảy: 217 – 221 C + Mất khối lượng do làm khô (TGA): ≤ 3% + Tạp chất liên quan: Tạp đơn ≤ 0,5%; Tổng tạp ≤ 1,0%. + Định lượng (HPLC): 98,0 – 102,0% hàm lượng khan 3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp B - Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính IBT bằng TLC - Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng IBT bằng HPLC - Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định tạp chất trong IBT bằng HPLC - Các chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu IBT + Tính chất: Bột kết tinh màu trắng + Định tính: IR, TLC, HPLC + Nhiệt độ nóng chảy: 245 – 249 C + Mất khối lượng do làm khô (TGA): ≤ 1% + Tạp chất liên quan: Tạp đơn ≤ 0,5%; Tổng tạp ≤ 1,0%. + Định lượng (HPLC): 98,0 – 102,0% hàm lượng khan 3.2.4. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp C - Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính ICT bằng TLC - Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng ICT bằng HPLC - Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định tạp chất trong ICT bằng HPLC - Các chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu ICT + Tính chất: Bột kết tinh màu trắng + Định tính: IR, TLC, HPLC, phản ứng của ion Cl- + Nhiệt độ nóng chảy: 303 - 307 C 16
+ Mất khối lượng do làm khô (TGA): ≤ 1% + Tạp chất liên quan: Tạp đơn ≤ 0,5%; Tổng tạp ≤ 1,0%. + Định lượng (HPLC): 98,0 – 102,0% hàm lượng khan 3.3. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TERAZOSIN VÀ CÁC TẠP CHUẨN A, B, C CỦA TERAZOSIN  Thiết lập các chất chuẩn, tạp chuẩn Chất chuẩn TEZ và các tạp chuẩn IAT, IBT, ICT được tiến hành thiết lập đúng theo qui trình thiết lập chuẩn DĐVN gồm các bước: - Xây dựng thường qui kỹ thuật thiết lập chuẩn - Kiểm tra chất lượng các nguyên liệu theo các tiêu chuẩn chất lượng đã xây dựng. Kết quả các nguyên liệu TEZ, IAT, IBT và ICT đều đạt tiêu chuẩn quy định để sản xuất chuẩn. - Đóng lọ: Sử dụng buồng đóng chuẩn chuyên dụng (Glove box Labconco) có kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm buồng đóng, nạp khí nitơ buồng đóng, với điều kiện đóng lọ thực tế là: Độ ẩm ≤ 2%, nhiệt độ:  25,0 oC, nạp khí nitơ độ tinh khiết: 99,99%. - Đánh giá độ đồng nhất của các chất chuẩn, tạp chuẩn: Kết quả giá trị RSD của các giá trị hàm lượng trong các lọ kiểm tra < 1,0%, như vậy các lô sản phẩm chuẩn TEZ, IAT, IBT, ICT đồng nhất về hàm lượng và quy trình đóng ống ổn định. - Kiểm tra chất lượng các sản phẩm chuẩn và đánh giá liên phòng thí nghiệm: Tiến hành trên 2 phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP và ISO 17025 là Khoa Thiết lập chất chuẩn, chất đối chiếu và Khoa Vật lý đo lường của VKNTTƯ. Dùng test F so sánh 2 phương sai của 2 dãy kết quả hàm lượng, dùng test T để so sánh các giá trị hàm lượng trung bình. Kết quả cho thấy, các kết quả định lượng giữa 2 phòng thí nghiệm khác nhau không có ý nghĩa thống kê. - Tính giá trị công bố trên chứng chỉ: + Chất chuẩn terazosin có SKS: WS.0118347.01; hàm lượng nguyên trạng: 99,35%; độ không đảm bảo đo mở rộng: U: ± 0,12% với hệ số phủ k = 2 ở độ tin cậy 95%. + Tạp chuẩn IAT có SKS: WS.0117344.01; hàm lượng nguyên trạng: 17
97,26%; độ không đảm bảo đo mở rộng: U: ± 0,23% với hệ số phủ k = 2 ở độ tin cậy 95%. + Tạp chuẩn IBTcó SKS: WS.0117345.01; hàm lượng nguyên trạng 98,80%; độ không đảm bảo đo mở rộng: U: ± 0,15% với hệ số phủ k = 2 ở độ tin cậy 95%. + Tạp chuẩn ICT có SKS: WS.0118350.01; hàm lượng nguyên trạng: 99,45%; độ không đảm bảo đo mở rộng: U: ± 0,12% với hệ số phủ k = 2 ở độ tin cậy 95%.  Đánh giá độ ổn định của các sản phẩm chất chuẩn, tạp chuẩn Các sản phẩm chất chuẩn, tạp chuẩn thiết lập được, được đánh giá độ ổn định trong điều kiện bảo quản 2-8 C, định kỳ 3 tháng 1 lần trên đầy đủ các chỉ tiêu chất lượng đã xây dựng. Thời gian đánh giá tùy thuộc vào thời gian cho phép thực hiện luận án. Kết quả cho thấy các sản phẩm chất chuẩn, tạp chuẩn đều ổn định trong khoảng thời gian đánh giá. (TEZ từ 0 tháng đến 9 tháng; IAT từ 0 tháng đến 15 tháng; IBT từ 0 tháng đến 15 tháng; ICT từ 0 tháng đến 6 tháng).  Sử dụng các chất chuẩn, tạp chuẩn thiết lập được trong kiểm nghiệm terazosin Sử dụng chất chuẩn TEZ thiết lập được để kiểm nghiệm 4 mẫu viên nén TEZ theo USP 40 gồm các chỉ tiêu: định tính bằng đo quang, định tính bằng HPLC, xác định độ hòa tan bằng đo quang, định lượng, xác định tạp hữu cơ bằng HPLC; kiểm nghiệm 5 mẫu viên nén TEZ theo tiêu chuẩn của nhà sản xuấ Abbott gồm các chỉ tiêu: định tính bằng HPLC, xác định độ hòa tan bằng đo quang, định lượng bằng HPLC; kiểm nghiệm 5 mẫu nguyên liệu TEZ theo USP 40 gồm các chỉ tiêu: định tính bằng IR, định tính bằng HPLC, định lượng bằng HPLC, xác định tạp chất liên quan bằng HPLC. Kết quả 9 mẫu viên nén TEZ đều đạt trên các chỉ tiêu kiểm nghiệm; 5 mẫu nguyên liệu TEZ không đạt về hàm lượng và chỉ tiêu giới hạn tạp chất liên quan. Chương 4. BÀN LUẬN 4.1.VỀ TỔNG HỢP CÁC NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN Trên thế giới mới thấy có 1 công bố về tổng hợp tạp A dạng base, 18