Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án "Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu" nhằm phát triển phương pháp phân tích định lượng thuốc kháng sinh fluoroquinolon trong dịch sinh học bằng hai phương pháp khác nhau đó là phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS) và phương pháp sắc ký hỏng hiệu năng cao (HPLC).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Nguyễn Thị Minh Diệp NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ KHÁNG SINH THUỘC NHÓM FLUROQUINOLON TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG VÀ NƯỚC TIỂU Ngành: Hóa học Mã số: 9440112 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2022
Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Xuân Trường 2. GS.TS. Trần Tứ Hiếu Phản biện 1:……………………………………… Phản biện 2: ……………………………………….. Phản biện 3: ……………………………………….. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. vào hồi.......giờ.......phút, ngày.......tháng.......năm ……… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường ĐHBK Hà Nội. - Thư viện Quốc gia Việt Nam.
A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Fluoroquinolon (FQL) là nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp có hiệu lực kháng khuẩn mạnh, phổ rộng, chống lại nhiều vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm. Chúng có tác dụng tốt với nhiều bệnh nhiễm khuẩn như: nhiễm trùng đường tiết niệu, đường tiêu hóa, hô hấp, tình dục, da và mô mềm. Các kháng sinh này được sử dụng phổ biến nhất trong điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm tuyến tiền liệt, nhiễm trùng da, xương, nhiễm trùng đường ruột do vi khuẩn và các bệnh do các chủng vi sinh vật đã kháng penicillin và macrolid, dự phòng trong bệnh bạch cầu trung tính. Tác dụng kháng khuẩn của nhóm kháng sinh này do ức chế ADN gyrase, ngăn cản sự tổng hợp ADN của vi khuẩn. Ngoài ra, chúng còn tác dụng cả trên mARN nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn. Do cơ chế ức chế tổng hợp acid nucleic, nhóm kháng sinh này được cho là cơ nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai cho người và động vật mang thai khi sử dụng. Các FQL được sử dụng phổ biến trong điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu tại Hòa Kỳ và Châu Âu là ciproflxacin, levofloxacin, moxifloxacin và norfloxacin. Mức liều sử dụng được quy định đối với từng kháng sinh trên, giúp phân bố thuốc đạt nồng độ tại vị trí nhiễm trùng để thể hiện tác dụng. Tuy nhiên khi sử dụng liều chuẩn, có thể dẫn tới phơi nhiễm quá mức ở một số cá thể, thể hiện nhiều tác dụng không mong muốn làm cho bệnh nhân không tuân thủ hoặc ngừng dùng thuốc. Hoặc, một số bệnh nhân bị thiếu hàm lượng thuốc tại vị trí tác dụng, dẫn đến thất bại trong điều trị. Các yếu tố ảnh hưởng tới nồng độ tối ưu tại đích tác dụng như đặc điểm sinh lý bệnh nhân, vi khuẩn gây bệnh, vị trí nhiễm trùng, dược động học, dược lực học của thuốc. Trong phân tích FQL, nhiều phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các kỹ thuật phát hiện khác nhau đã được áp dụng. Phổ biến nhất là HPLC ghép nối với detector UV hay PDA, huỳnh quang (FLD) và khối phổ (MS). Để phân tích các FQL trong các chế phẩm bào chế thường đơn giản, chỉ cần hòa tan dược chất, pha loãng nếu cần sau đó phân tích trên hệ thống HPLC. Đối với các mẫu dịch sinh học như huyết tương, dịch mật, nước tiểu, nước bọt sẽ phức tạp 1
hơn do lẫn nhiều tạp và có nồng độ thấp khó phát hiện. Do đó, cần có phương pháp thích hợp để chiết xuất chất phân tích ra khỏi mẫu, đồng thời loại các tạp gây nhiễu. Phương pháp phân tích đồng thời các FQL được xây dựng với ưu điểm dùng một phương pháp, trong cùng một điều kiện có thể áp dụng để định lượng các FQL khác nhau. Tuy nhiên, việc lựa chọn tối ưu các điều kiện phân tích cho các FQL khác nhau sẽ gặp khó khăn hơn do tính chất khác nhau của chúng. Việc theo dõi đánh giá dược động học của các kháng sinh FQL sẽ là công cụ hữu ích để tránh các thất bại trong sử dụng thuốc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Do đó, xây dựng các phương pháp phân tích xác định hàm lượng kháng sinh trong dịch sinh học người bệnh là cần thiết. Các phương pháp được đề xuất phù hợp với điều kiện kỹ thuật sẵn có của các cơ sở y tế, sẽ góp phần ứng dụng thành công trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh FQL. Căn cứ trên điều kiện thực tế của các phòng thí nghiệm, kiểm nghiệm, phòng nghiên cứu tại Việt Nam và vai trò của việc phân tích hàm lượng kháng sinh trong dịch sinh học, chúng tôi đã đề xuất và thực hiện đề tài luận án tiến sỹ có tên: “Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu ”. 3. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN Phát triển phương pháp phân tích định lượng thuốc kháng sinh fluoroquinolon trong dịch sinh học bằng hai phương pháp khác nhau đó là phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS) và phương pháp sắc ký hỏng hiệu năng cao (HPLC), cụ thể như sau: 1. Xây dựng quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong mẫu huyết tương bằng phương pháp HPLC –PDA 2. Xây dựng quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp FLS. 3. Xây dựng quy trình tách và xác định đồng thời bốn fluoroquinolon (norfloxacin, ciprocaxin, levofloxacin, moxifloxaxin) trong huyết tương và nước tiểu bằng phương pháp HPLC-FLD. 4. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2
Đối tượng nghiên cứu: bốn loại kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon thế hệ 2, 3 và 4 gồm norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin trong nền mẫu huyết tương và nước tiểu. Các loại kháng sinh này, trong đó mới nhất là moxifloxacin (thế hệ 4), đang được sử dụng phổ biến trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng đến rất nặng. Phạm vi nghiên cứu: khảo sát xây dựng và đánh giá các quy trình phân tích đơn kháng sinh (moxifloxacin) trong nền mẫu huyết tương và phân tích đồng thời 4 kháng sinh (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin) trong nền mẫu huyết tương và nước tiểu; áp dụng thử nghiệm các quy trình phân tích đã xây dựng với đơn kháng sinh moxifloxacin trong nền mẫu thử huyết tương. 5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN  Về giá trị khoa học - Moxiflocaxin là kháng sinh fluoroquinolon thế hệ mới chưa có phương pháp phân tích trong Dược điển Việt Nam. Moxifloxacin hiện nay được sử dụng rộng rãi trong điều trị do đặc tính ít độc hơn so với các FQL khác. Phương pháp xác định moxifloxacin trong dược phẩm và dịch sinh học (huyết tương, nước tiểu) cũng đã có không ít công trình đã công bố. Tuy nhiên tại Việt Nam hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào về việc định lượng moxiflocaxin trong huyết tương, đề tài đã xây dựng được quy trình định lượng kháng sinh này bằng hai phương pháp đó là phương pháp HPLC- PDA và phương pháp FLS. Phương pháp để xác định đối tượng nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ đề tài nào. Đối với phương pháp quang phổ huỳnh quang việc sử dụng chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl benzen sulfonat (SDBS) làm tăng cường độ huỳnh quang, tăng độ nhạy và giới hạn phát hiện cũng là một điểm mới trong việc nghiên cứu phân tích xác định moxiflocaxin trong huyết tương cho tới thời điểm này tại Việt Nam. - Khả năng phát huỳnh quang là đặc trưng điển hình cho cấu trúc của kháng sinh họ FQL và đó cũng là cơ sở để định lượng FQL trong dược phẩm và dịch sinh học. Ngoài việc phát triển phương pháp quang phổ huỳnh quang để định lượng moxifloxacin trong huyết tương, trong luận án này chúng tôi còn phát triển thành công phương 3
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector huỳnh quang hai kênh. Ưu điểm của HPLC-FLD cho độ nhạy và độ chọn lọc cao. Phương pháp HPLC-FLD hai kênh đã được khảo sát và lựa chọn hai cặp bước sóng kích thích/phát xạ phù hợp với hai nhóm chất sao cho đạt được tín hiệu chất phân tích là lớn nhất, tăng độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện của phương pháp.  Ý nghĩa thực tiễn: - Đề tài đã nghiên cứu xây dựng thành công hai quy trình định lượng đơn kháng sinh moxifloxacin bằng HPLC-PDA và FLS trong nền mẫu huyết tương. Việc áp dụng thử nghiệm các quy trình phân tích này trên một số mẫu thử huyết tương cho kết quả tốt. Bên cạnh đó, đề tài đã xây dựng thành công quy trình định lượng đồng thời 4 FQL (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin), đại diện cho 3 thế hệ FQL 2, 3 và 4, trong nền mẫu huyết tương và nước tiểu. Các FQL này đang được sử dụng rất phổ biến trong phác đồ điều trị của các y bác sỹ cho các bệnh nhiễm khuẩn nặng. Các quy trình này có thể áp dụng trong trường hợp nhiều bệnh nhân đang sử dụng các kháng sinh khác nhau trong 4 kháng sinh trên, chỉ cần một quy trình xử lý mẫu, cùng một điều kiện sắc ký có thể định lượng đồng thời giúp rút ngắn thời gian mà vẫn cho kết quả chính xác. Từ đó gợi ý cho việc nghiên cứu ứng phương pháp phân tích này trong hỗ trợ giám sát nồng độ thuốc, điều chỉnh phác đồ trong điều trị hoặc nghiên cứu dược động học của thuốc kháng sinh. - Các quy trình phân tích xây dựng trong luận án tương đối đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với điều kiện thực tiễn trong các phòng thí nghiệm ở Việt Nam, máy móc thiết bị, dung môi, hóa chất tương đối phổ biến. 6. CẤU TRÚC LUẬN ÁN Luận án gồm : phần mở đầu (3 trang), tổng quan (39 trang) , thực nghiệm (19 trang), kết quả và thảo luận (55 trang), kết luận (2 trang) danh mục các công trình đã công bố của luận án (1 trang), tài liệu tham khảo (7 trang), phụ lục (42 trang). B. NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN Chƣơng này đề cập đến các nội dung sau: 4
Tổng quan về kháng sinh fluoroquinolon là đối tượng nghiên cứu của đề tài, gồm nguồn gốc, cơ chế tác dụng, dược động học và tính chất quang. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu: phương pháp phân tích HPLC và phương pháp quang phổ huỳnh quang. Xử lý mẫu dịch sinh học trong phân tích bằng HPLC và các vấn đề gặp phải khi phân tích mẫu chứa fluoroquinolon. Một số công trình nghiên cứu đã được công bố trong và ngoài nước liên quan đến đối tượng và phương pháp nghiên cứu của luận án. CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Kháng sinh fluoroquinolon Đối tượng nghiên cứu gồm bốn kháng sinh nhóm fluoroquinolon: norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin. 2.1.2. Đối tƣợng phân tích Mẫu huyết tương, nước tiểu: Là các mẫu lưu được thu thập tại bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội và bệnh viện Quân Y 108 Hà Nội. Mẫu trắng không chứa FQL được thu thập từ người khỏe mạnh, không bị bệnh suy thận, không sử dụng thuốc kháng sinh trong thời gian lấy mẫu. 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 2.2.1. Hóa chất, thuốc thử Các hóa chất được dùng trong nghiên cứu đạt mức độ yêu cầu, cung cấp bởi các hãng Merk, Fisher, Sigma. 2.2.2. Chất chuẩn Norfloxacin (99,54%), ciprofloxacin (98,3%), levofloxacin (98,2%), moxifloxacin hydrochlorid (97,0%) cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm thuốc Thành Phố Hồ Chí Minh. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc MOXI 500 µg/ml. Hỗn hợp dung dịch FQL chuẩn 1000 µg/ml. Các dung dịch này được pha loãng bằng MeOH thành các dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ 100, 10, 1,0 µg/ml thích hợp trước khi sử dụng. 5
2.2.3. Thiết bị Hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu SPD-M10vp (Shimadzu, Nhật Bản ). Cột sắc ký MRC-ODS C18 250× 4,6 mm, 5 μm. Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)- Auto sample Sil-20AC XR, detector huỳnh quang RF-20A, lò cột CTO- 10AS.VP, CBM-20A (Shimazu – Nhật Bản). Cột C18 YMC-pack ODS-A (150×4,6mm, 5µm), SUPELCO (250×4,6mm, 5µm). Máy đo quang phổ Nanolog (Horiba, Hoa Kỳ) được trang bị đèn hồ quang Xe 450 W và bộ đơn sắc kích thích/phát xạ kép. Máy quang phổ huỳnh quang Brolight 6102. Máy li tâm Mrc Scientific Instrument (Israel); Máy đo pH hãng HANNA Instruments (Romani); Cân phân tích Shimadzu AUW220D – 0,00001g (Nhật Bản); Cân phân tích Precia XB 220 A, độ chính xác 0,0001g; Máy lắc Vortex ZX-Classic (Velp – Italy); Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC (Mỹ); Máy trộn Vortex Mixer của hãng Labnet (Mỹ); Máy đo quang UV-Vis Agilent 8453 (Mỹ); Thiết bị cô quay chân không (B.U.CHI –Thụy Sỹ); Tủ sấy chân không (Alab Tech – Hàn Quốc). 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Thu thập, xử lý sơ bộ và bảo quản mẫu Mẫu huyết tương là phần chất lỏng của máu toàn phần sau khi tiến hành làm đông tụ bằng EDTA. Cục máu đông được loại bỏ bằng cách ly tâm, thu lấy dịch nổi phía trên bằng micropipet, chuyển vào một ống polypropylen sạch. Các mẫu được duy trì ở 2-8°C trong khi xử lý. Nếu mẫu huyết tương không được phân tích ngay lập tức, phải được bảo quản bằng cách cấp đông ở -20°C. Trước khi xử lý thử nghiệm, các mẫu này được rã đông đến nhiệt độ phòng. Mẫu thử: Mẫu huyết tương của bệnh nhân sau 1, 2 và 3 giờ sử dụng thuốc có chứa kháng sinh MOXI. Mẫu trắng: Mẫu thu thập từ người khỏe mạnh, không sử dụng thuốc chứa kháng sinh FQL trong thời gian lấy mẫu. Mẫu thử tự tạo: Lấy một thể tích dung dịch gốc FQL đã biết nồng độ, làm bay hơi dung môi thu cặn (nhiệt độ 40oC, khí N2). Hòa tan cặn trong một thể tích chính xác mẫu trắng (huyết tương, nước tiểu), lắc xoáy trong 2 phút để thu được mẫu thử tự tạo có nồng độ FQL biết trước. 6
2.3.2. Xây dựng quy trình phân tích 2.3.2.1. Xây dựng quy trình phân tích MOXI trong huyết tương bằng phương pháp HPLC-PDA - Khảo sát bước sóng hấp thụ, sau đó tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký: thành phần và tỷ lệ pha động, pH đệm. - Khảo sát phương pháp xử lý mẫu huyết tương bằng tác nhân kết tủa là dung dịch TCA (trichloroacetic acid): nồng độ, thể tích dung dịch TCA, tốc độ ly tâm, thời gian ly tâm. - Đánh giá độ tin cậy của phương pháp: độ đặc hiệu, LOD, LOQ, khoảng tuyến tính, đường chuẩn, độ đúng, độ chính xác. 2.3.2.2. Xây dựng quy trình phân tích MOXI trong huyết tương bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang - Khảo sát các điều kiện phân tích: sự tạo phức của MOXI với Eu , thời gian ổn định phức, pH, lượng Eu(III), lượng chất hoạt 3+ đồng bề mặt SBDS tới cường độ phát xạ huỳnh quang, xây dựng đường chuẩn. - Quy trình xử lý huyết tương: Lấy 1,0 ml mẫu huyết tương, kết tủa protein bằng cách thêm 5 ml methanol, lắc xoáy 2500 vòng/phút trong vòng 10 phút, ly tâm trong 15 phút ở 8000 vòng/phút. Lấy 4 ml dịch nổi, bốc hơi dung môi, hòa tan cắn thu được trong 1 ml nước cất 2 lần. Lọc mẫu qua màng 0,45µm. - Đánh giá độ tin cậy của phương pháp: Độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, đường chuẩn, LOD, LOQ, độ lặp lại, độ đúng, độ chính xác. 2.3.2.3. Xây dựng quy trình tách và định lượng đồng thời bốn FQL trong huyết tương và nước tiểu bằng phương pháp HPLC- FLD - Khảo sát điều kiện sắc ký: xác định cặp bước sóng kích thích- phát xạ, dung môi pha động, pH của pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ lò cột. - Xử lý mẫu phân tích: + Đối với mẫu huyết tương: khảo sát tác nhân kết tủa protein bằng MeOH và TCA, tỷ lệ thể tích mẫu/tác nhân kết tủa, thời gian ly tâm, nồng độ tác nhân, hiệu suất thu hồi. + Đối với mẫu nước tiểu: 7
o Xử lý mẫu bằng chiết lỏng-lỏng: khảo sát dung môi chiết, thể tích, thời gian lắc, hiệu suất thu hồi. o Xử lý mẫu bằng chiết pha rắn: cột chiết, thành phần dung môi rửa tạp, thành phần dung môi rửa giải, thể tích rửa giải. - Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích: Độ đặc hiệu, LOD, LOQ, khoảng tuyến tính, đường chuẩn, độ lặp lại, độ đúng. 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu Các kết quả phân tích và định lượng được xử lý theo phần mềm của thiết bị phân tích: phần mềm Analyst của thiết bị LC-UV và LC- FLD. Xử lý số liệu bằng phần mềm Origin® và Microsolf Excel®. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG MOXICFLOXACIN TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-PDA 3.1.1. Điều kiện phân tích 3.1.1.1. Bước sóng hấp thụ Bước sóng hấp thụ cực đại tại 295 nm, tránh được sự hấp thụ quang của dung môi hoặc tạp khác nên được lựa chọn. 3.1.1.2. Điều kiện sắc ký Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng gồm thành phần pha động, tỷ lệ pha động pH của dung dịch đệm phosphat, tốc độ dòng. Điều kiến sắc ký: cột C18 MRC-ODS (25 cm × 4,6 mm, 5µm); detector PDA; bước sóng λmax = 295 nm; pha động ACN– đệm phosphat pH 4,0; nồng độ đệm 20 mM (60:40); rửa giải đẳng dòng tốc độ 0,8 ml/phút; thời gian lưu (7,40 ± 0,05) phút; thể tích tiêm 10 µl. 3.1.2. Xử lý mẫu huyết tƣơng Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương trên mẫu thử tự tạo. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu dựa trên các điều kiện đã khảo sát. Quy trình thu được như sau: mẫu huyết tương (1,0 mL), kết tủa protein bằng cách thêm 1,0 mL dung dịch TCA 20%, sau đó lắc votex 2000 vòng/phút, trong 15 phút. Tiếp theo thu toàn bộ dịch nổi, lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiêm vào hệ thống HPLC. 3.1.3. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích 8
Độ đặc hiệu Tiến hành phân tích 2 mẫu, mẫu huyết tương trắng và mẫu huyết tương tự tạo (thêm chuẩn nồng độ MOXI là 3,0 µg/mL), theo quy trình đã xây dựng. Kết quả cho thấy mẫu tự tạo nồng độ MOXI 3,0 µg/mL Hình 3.1b xuất hiện pic tại thời gian lưu 7,4 phút, trùng với thời gian lưu của MOXI chuẩn trên nền pha động Hình 3.9a, đối với mẫu trắng không xuất hiện píc tạp tại thời gian lưu của MOXI trên sắc ký đồ. Do vậy, phương pháp có độ đặc hiệu cao đối với MOXI.. Hình 3.9. Sắc ký đồ của MOXI (a) mẫu trắng, (b) mẫu huyết tương tự tạo với nồng độ MOXI 3,0 µg/mL Đường chuẩn: Khoảng nồng độ thực hiện 0,3-25,0 µg/mL. Phương trình đường chuẩn được thiết lập: y= 93241x-33414. Trong đó: x là nồng độ MOXI, y là đáp ứng diện tích pic. 9
LOD và LOQ: Giá trị LOD, LOQ xác định được lần lượt là 0,15 và 0,50 µg/mL. Độ đúng, độ chính xác: Tiến hành với các mẫu thử tự tạo, nồng độ FQL: 1,0; 5,0; 10,0 µg/mL. Mỗi nồng độ được thực hiện 5 lần. Kết quả thu được hiệu suất thu hồi ở cả 3 nồng độ đạt từ 89,20 % đến 97,32%, RSD% đạt từ 1,18-10,22% đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn AOAC. 3.1.4. Ứng dụng phƣơng pháp phân tích một số mẫu thực Áp dụng quy trình để phân tích MOXI trong mẫu huyết tương của các bệnh nhân tiêm truyền thuốc Avelox với liều 450mg/250ml sau 1–3h. Các mẫu được thu nhận từ Viện Quân y trung ương 108. Kết quả thu được: các bệnh nhân Trần Văn A, Nguyễn Văn B và Cao Thị C sau thời gian tiêm lần lượt là 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ thu được kết quả hàm lượng MOXI trong huyết tương, tương ứng của từng bệnh nhân là: 1,52 ±0,05; 2,61 ±0,2; 2,07±0,14 µg/mL. Sắc ký đồ Hình 3.11. mAU×1000 PDA Ch1 (295nm)×1.00 MOXI min Hình 3.11. Sắc ký đồ của MOXI trong mẫu huyết tương người bệnh sử dụng thuốc tiêm truyền Avelox So sánh với các nghiên cứu công bố trước đây, nồng độ của MOXI trong huyết tương xác định được sau thời gian tiêm 1h, lượng sử dụng 400 mg có giá trị là 4,81 µg/mL. Jian Lu và cộng sự xác định khoảng nồng độ từ 2,60 – 3,79 µg/mL có thể đạt được trong khoảng 1 – 3h sau liều uống 400 mg. Kết quả phân tích của phương 10
pháp trong luận án này thu được nồng độ MOXI từ 1,52-2,61 µg/mL. Giá trị nồng độ MOXI có sự khác biệt nhất định, do có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới nồng độ MOXI trong huyết tương như cân nặng, độ tuổi, sức khỏe, chức năng gan, chức năng thận. Tuy nhiên, kết quả thu được này tương đối phù hợp với các nghiên cứu trước đã công bố. Phương pháp phân tích định lượng MOXI trong huyết tương xây dựng được có thể ứng dụng trong đánh giá điều trị sử dụng thuốc trên lâm sàng và cũng như trong nghiên cứu về dược động học của thuốc. 3.2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG MOXIFLOXACIN TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ HUỲNH QUANG 3.2.1. Khảo sát xây dựng phƣơng pháp phân tích Phương pháp được thiết lập dựa trên phản ứng tạo thành phức chất giữa MOXI với ion Eu(III) với sự có mặt của chất hoạt động bề mặt SDBS. Kết quả cường độ tín hiệu phát xạ của phức Eu(III)- MOX-SBDS tăng gấp xấp xỉ 3 lần so phức Eu(III)-MOXI (Hình 3.12). Như vậy, sự có mặt của SBDS có vai trò làm tăng độ nhạy khi xác định MOXI bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang. 2500 1 Eu EuEu Eu MOXI MOX 2000 0.8 MOXI MOX SDBS SBDS A Eu-MOXI Eu-MOX 0.6 Eu-MOX Eu-MOXI 1500 I Eu-MOX-SBDSSDBS Eu-MOXI - Eu-MOXI-SDBS Eu-MOX-SBDS 0.4 1000 0.2 500 0 0 200 250 300 350 400 450 500 500 550 600 650 700 750 Bước sóng / nm Bước sóng / nm Hình 3.12. Phổ -VIS (a) và phổ phát xạ (b) của dung dịch Eu , MOXI, Eu3+-MOXI, Eu3+-MOXI-SBDS 3+ Khảo sát điều kiện phân tích gồm thời gian phản ứng tạo phức, sự ảnh hưởng của pH, sự ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của nồng độ Eu(III), ảnh hưởng của nồng độ Eu(III), ảnh hưởng của nồng độ 11
SBDS. Kết quả thu được điều kiện phân tích để định lượng MOXI trong huyết tương như sau (Bảng 3.5). Bảng 3.5. Điều kiện phân tích MOXI bằng phương pháp phổ huỳnh quang T Điều kiện phản ứng Giá trị T 1 Bước sóng kích thích 405 nm 2 Bước sóng phát xạ huỳnh quang 616 nm 3 Thời gian ổn định phức 30 phút 4 Đệm Tris-HCl pH 9,3 5 Nồng độ Eu(III) 3,0×10-5M 6 Nồng độ SBDS 3,5×10-5M 3.2.2. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích 3.2.2.1. Độ đặc hiệu Tiến hành với mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn MOXI. Kết quả cho thấy đối với mẫu trắng không chứa chất phân tích không có tín hiệu huỳnh quang đặc trưng tại các vị trí tương ứng của mẫu thêm chuẩn MOXI. Như vậy có thể khẳng định rằng phương pháp có tính đặc hiệu cao. 3.2.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính Pha dãy mười nồng độ MOXI có giá trị từ 0 – 2,8×10-5 M, sau đó tiến hành đo cường độ huỳnh quang. Kết quả cho thấy cường độ tín hiệu huỳnh quang của phức Eu(III)-MOXI-SBDS tăng khi tăng dần nồng độ MOXI. Khoảng tuyến tính phân tích MOXI được xác định nằm trong khoảng từ 5,010-7  2,210-5 M. 3.2.2.3. Đường chuẩn Tiến hành đo cường độ huỳnh quang của các mẫu chuẩn ứng với nồng độ MOXI trong mẫu từ 0,05×10-5 - 1,6 ×10-5M. Thiết lập đường chuẩn tương quan giữa nồng độ và cường độ huỳnh quang của mẫu, phương trình hồi quy được xác định là y = 8020,5x + 150,35 với hệ số tương quan là R2 = 0,9950. 3.2.2.3. Giá trị LOD, LOQ và độ lặp lại Tiến hành lặp lại 10 thí nghiệm của cùng một mẫu, tính được giá trị trung bình nồng độ MOXI : 0,155310-5M. Giá trị độ lệch chuẩn SD 0,0068 ×10-5M. LOD, LOQ của phương pháp được xác định là: 12
LOD = 3SD = 0,02.10-5M; LOQ = 10SD = 0,06810-5M. Độ lặp lại của phương pháp phân tích với RSD% = 4,38%. Như vậy phương pháp có LOD, LOQ thấp và độ lặp lại cao, đáp ứng theo tiêu chuẩn AOAC, ICH. 3.2.2.5. Độ thu hồi Mẫu huyết tương được xử lý theo quy trình Mục 2.3.1. Sau đó tiến hành phân tích theo điều kiện đã khảo sát, độ thu hồi thu được nằm trong khoảng 94,83-101,34% với độ lệch chuẩn tương đối từ 1,48-4,27% đạt yêu cầu theo hướng dẫn. 3.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích MOXI trong mẫu thực Mẫu được phân tích là mẫu huyết tương người bệnh truyền dịch Avelox 450mg/250ml; mẫu lấy sau 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ truyền, thí nghiệm lặp lại (n=5). Kết quả xác định MOXI trong huyết tương được xác định có độ lặp lại tốt với RSD < 7%. Tùy thuộc vào thời gian lấy mẫu sau khi truyền, hàm lượng MOXI trong huyết tương của bệnh nhân là khác nhau, dao động từ 1,773 – 2,884 g/ml sau 1 đến 3 giờ truyền. So sánh kết quả này với hàm lượng MOXI (1,52- 2,07 g/ml) trong mẫu huyết tương của 3 bệnh nhân được xác định bằng phương pháp HPLC-PDA đã xây dựng được ở mục 3.1 cho thấy hai phương pháp phân tích cho kết quả tương đối tương đồng. 3.3. QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI BỐN FLUOROQUINOLON TRONG HUYẾT TƢƠNG VÀ NƢỚC TIỂU BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-FLD 3.3.1. Quy trình định lƣợng NOR, CIP, LEVO, MOXI trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp HPLC-FLD 3.3.1.1. Điều kiện sắc ký: Qua khảo sát các điều kiện sắc ký Mục 2.3.2.3. Kết quả, điều kiện tối ưu cho phương pháp như sau: cột Supelco - C18, 25cm×4,6mm, 5µm, detector huỳnh quang - cặp bước sóng kích thích/phát xạ λEx /λEm 290/500nm (LEVO và MOXI), λEx /λEm 280/445nm (NOR và CIP). Dung môi pha động: MeOH:H3PO4 0,025M, pH 3, gradient nồng độ Nồng độ MeOH từ 15% (0-2 phút), 15-35% (2-17 phút), 15-80 % (17-22 phút), và 80 % (22-27 phút). Thể tích tiêm 10µl, nhiệt độ lò cột 30oC. 13
3.3.1.2. Xử lý mẫu huyết tương Trong mục 3.1. đề tài đã sử dụng dung dịch TCA 20% làm tác nhân kết tủa protein, phương pháp kết tủa đẳng điện nàyđạt hiệu suất thu hồi MOXI từ 89,20 % đến 97,32%. Tuy nhiên trong phần nghiên cứu này đề tài tiến hành khảo sát một tác nhân kết tủa protein khác là MeOH. Mục đích để phát triển, mở rộng thêm phương pháp, mặt khác để so sánh khả năng kết tủa của hai tác nhân dựa trên hiệu suất thu hồi của phương pháp sau khi đã tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu: thể tích, nồng độ dung dịch/dung môi kết tủa, thời gian kết tủa, thời gian ly tâm, tốc độ ly tâm. Kết quả hai tác nhân này đều cho hiệu suất thu hồi khá cao, tuy nhiên với việc sử dụng MeOH cho kết quả hiệu suất cao hơn so (92,6-102,0%) với TCA (83,2-89,8%). Điều này được giải thích là do MeOH có thể làm giảm sự phân hủy thuốc, cho nên kết quả độ thu hồi cao. Trong khi đó sử dụng tác nhân kết tủa là acid mạnh như TCA có thể làm kết tủa đồng thời hoặc phân hủy một phần chất phân tích. Như vậy, quy trình phân tích đồng thời bốn FQL trong huyết tương bằng phương pháp HPLC-FLD kết hợp kỹ thuật xử lý mẫu lựa chọn dung môi MeOH làm tác nhân kết tủa protein. Quy trình phân tích như sau: mẫu huyết tương được kết tủa protein bằng MeOH với tỷ lệ thể tích 1:4, tiến hành lắc xoáy votex 2500 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó ly tâm 6000 vòng/phút trong 20 phút. Hút dịch nổi, lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiêm vào hệ thống HPLC. 3.3.1.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích Độ đặc hiệu: Kết quả trên sắc ký đồ Hình 3.32 cho thấy mẫu trắng không có pic tạp xuất hiện tại vị trí thời gian lưu của các FQL chuẩn. Đối với mẫu thử tự tạo, sắc ký đồ cho các pic tương ứng tại vị trí thời gian lưu của FQL chuẩn (± 0,05 phút) trong dung môi pha động, các pic được tách hoàn toàn, sắc nhọn và không trùng vào vị trí của các pic tạp trong mẫu huyết tương. Như vậy, có thể kết luận phương pháp phân tích đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đặc hiệu. 14
mV 500 450 400 a) 350 300 250 200 150 100 50 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min mV 18..3 1500 19.4 1250 b) 17.3 22.4 1000 750 500 250 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min Hình 3.32. Sắc ký đồ mẫu trắng (a) và mẫu huyết tương tự tạo chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml kết tủa bằng MeOH (b) Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Tiến hành trên mẫu dịch nổi thu được sau khi xử lý mẫu, thêm các chuẩn FQL có nồng độ bắt đầu bằng 0,02 µg/ml, tiêm vào hệ thống HPLC. Từ sắc ký đồ thu được, lấy chiều cao pic chất trung bình của 3 lần đo của 4 FQL (S) và chiều cao trung bình ở 3 vị trí của nhiễu nền (N). Nồng độ giảm dần cho tới khi đạt kết quả S/N = 3. Xác định các giá trị MDL = 5×LOD; MQL = 5×LOQ. Kết quả trong Bảng 3.24. Khoảng tuyến tính Mẫu huyết tương không chứa FQL, xử lý mẫu theo quy trình đã khảo sát. Dung dịch thu được sau xử lý mẫu được thêm vào các thể tích dung dịch FQL chuẩn nồng độ 100,0 µg/ml và 1,0 µg/ml đã tính toán và pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng MeOH sao cho tạo thành một dãy nồng độ như sau: 0,02; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 2.5; 5,0; 10,0; 15,0 và 20,0 µg/ml. Kết quả thu được ở Bảng 3.24. Bảng 3.24. Phương trình đường chuẩn, hệ số hồi quy, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, MDL và MQL của các FQL 15
Hệ số Khoảng Phƣơng trình tƣơng LOD LOQ MDL MQL FQL tuyến tính đƣờng chuẩn quan (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (R2) y = 1,09×107x 0,9991 0,05-15 0,0071 0,0234 0,0355 0,1170 NOR 6 + 1,50×10 y = 1,13×107x 0,9992 0,05-10 0,0080 0,0264 0,0400 0,1320 CIP 6 + 1,40×10 y = 7,62×106x 0,9990 0,05-15 0,0074 0,0244 0,0370 0,1220 LEVO 5 + 9,70×10 y = 7,30×106x 0,9995 0,10-10 0,0171 0,0564 0,0855 0,2820 MOXI 6 + 1,25×10 Chú thích: y diện tích pic; x nồng độ FQL trong huyết tương; R2: hệ số hồi quy tuyến tính. Độ lặp lại và độ thu hồi Các thử nghiệm được tiến hành trên mẫu thử tự tạo, ở 3 nồng độ: 1,0; 5,0; 10,0 µg/ml, mỗi nồng độ được lặp lại 6 lần, mỗi mẫu bơm 3 lần, lấy diện tích trung bình của 3 lần bơm và trung bình của 6 lần lặp lại của 1 nồng độ. Kết quả thu được giá trị RSD% của các FQL nằm trong khoảng từ 0,7 đến 5,43%, độ thu hồi đạt từ 98,8–103,5% đối với NOR và 95,0–105,4% với CIP, 99,6–105,4 % với LEVO và 92,5–99,8 % đối với MOXI, các giá trị này đều chấp nhận được theo hướng dẫn của AOAC. Phương pháp này được phát triển phù hợp để xác định đồng thời bốn FQL trong huyết tương do nồng độ pic khoảng từ 1,60–2,87 µg/ml cho một liều uống norfloxacin 400 mg, 1,3–2,0 µg/ml cho một liều uống ciprofloxacin (10 mg/kg thể trọng), sau 12 h ở trẻ suy dinh dưỡng nặng, 2,8 và 5,2 µg/ml cho 250 và 500 mg levofloxacin uống và 2,60–3,79 µg/ml khi uống moxifloxacin 400 mg. 3.3.2. Quy trình định lƣợng NOR, CIP, LEVO, MOXI trong nƣớc tiểu bằng phƣơng pháp HPLC-FLD 3.3.2.1. Điều kiện sắc ký Trong nghiên cứu định lượng đồng thời 4 FQL trong mẫu huyết tương đã sử dụng cột sắc ký C18 MRC-ODS (250×4,6 mm, 5 μm), phương pháp đã xây dựng được có nhiều ưu điểm như đã trình bày ở 16
mục 3.3.1. Tuy nhiên thời gian cho một mẫu sắc ký còn khá dài trên 22 phút cho chất phân tích cuối cùng ra khỏi cột. Trong phần nghiên cứu này, đề tài sử dụng cột C18 (YMC-pack ODS-A, 150×4,6mm, 5µm) có kích thước chiều dài cột ngắn hơn tăng sự đa dạng, phù hợp với nhiều điều kiện thực tế và hơn nữa có thể rút ngắn hơn được thời gian sắc ký. Đặc biệt là các điều kiện sắc ký đã khảo sát ở Mục 3.3.1.1 vẫn được giữ nguyên. Pha động gồm MeOH, H3PO4 0,025 M, pH 3 (điều chỉnh bằng trietyl amin), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, nhiệt độ lò cột 30oC. Cặp bước sóng kích thích và phát xạ (λex/λem) tương ứng: 280/445 nm đối với NOR, CIP; 290/500 nm đối với LEV, MOXI. 3.3.1.2. Xử lý mẫu nước tiểu Dựa vào diện tích píc thu được với từng yếu tố khảo sát, lựa chọn điều kiện tối ưu cho quy trình xử lý mẫu, khảo sát bằng phương pháp đơn biến. Từ các kết quả khảo sát, xác định được quy trình phân tích mẫu nước tiểu xác định các FQL bằng hai phương pháp có sơ đồ tiến hành như sau: a)Phương pháp chiết lỏng – lỏng Lấy chính xác 0,5 ml mẫu nước tiểu ↓ Thêm 5,0 ml dung môi diclometan/MeOH (8:2) ↓ Lắc xoáy bằng votex 2000 vòng/phút, 3 phút ↓ Ly tâm 15 phút ↓ Hút chính xác 2,0 ml dịch nổi ↓ Cô đuổi bằng thiết bị cô quay chân không, 45oC ↓ Hòa tan bằng 2,0 ml dung môi MeOH:HCl 0,1M (1:1) ↓ HPLC Hình 3.39. Sơ đồ quy trình định lượng FQL trong nước tiểu – xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng 17
b) Phương pháp chiết pha rắn Cột Oasis HLB, 500mg 6mL Hoạt hóa cột: 3,0 mL MeOH, 3,0 mL nước, 6,0 mL đệm phosphat pH 3 1,0 mL nước tiểu 5,0 mL nước Rửa giải bằng 5,0 mL Diclometan Làm bay hơi dung môi của dung dịch thu được ở 40 - 45 oC Hòa tan bằng 2,0 ml dung môi MeOH :HCl 0.1M (1 :1), lọc qua màng lọc 0.45µm HPLC Hình 3.40. Sơ đồ quy trình định lượng FQL trong nước tiểu – xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn 3.3.2.3. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích a) Phương pháp chiết lỏng –lỏng Độ đặc hiệu: Kết quả trên sắc ký đồ mẫu nước tiểu trắng Hình 3.39 không xuất hiện pic lạ trùng vào vị trí thời gian lưu của mẫu thử có nồng độ FQL là 1,0 µg/ml (b). 18