Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Khoa học Vật chất: Nghiên cứu tổng hợp hệ nano dendrimer poly(amidoamine) mang thuốc chống ung thư (carboplatin và oxaliplatin

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung Luận văn nghiên cứu tổng hợp hệ nanodendrimer PAMAM mang thuốc chống ung thư carboplatin (CAR) và oxaliplatin (OXA) nhằm giảm độ độc của thuốc đối với tế bào lành và cải thiện hiệu quả tiêu diệt tế bào ung thư nhờ tăng độ tan, tăng khả năng lưu trữ thuốc, định hướng thuốc tới đích thụ động. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Khoa học Vật chất: Nghiên cứu tổng hợp hệ nano dendrimer poly(amidoamine) mang thuốc chống ung thư (carboplatin và oxaliplatin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- HỒ MINH NHẬT NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ NANO DENDRIMER POLY(AMIDOAMINE) MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ (CARBOPLATIN VÀ OXALIPLATIN) Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử và tổ hợp Mã số: 9440125 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC VẬT LIỆU Thành phố Hồ Chí Minh – 2020
Công trình được hoàn thành tại: Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Những người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. NGUYỄN CỬU KHOA 2. PGS. TS. NGUYỄN NGỌC VINH Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, tổ chức tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ ngày tháng năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
MỞ ĐẦU Hiện nay ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Hóa trị là một trong các phương pháp điều trị, đặc biệt với ung thư di căn. Khi hóa trị thì cisplatin được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên, thuốc này tồn tại nhiều tác dụng phụ do độc tính cao và tiềm ẩn khả năng kháng thuốc của tế bào ung thư. Sau đó, carboplatin và oxaliplatin được sử dụng rộng rãi nhờ độ độc giảm hơn hẳn nhưng khả năng gây độc vẫn cao do tính chọn lọc và hướng đích kém. Nhằm khắc phục các nhược điểm trên, dendrimer poly(amidoamine) (PAMAM) với số nhóm chức bề mặt lớn và có hoạt tính hóa học cao, có thể được biến tính bằng các tác nhân hướng đích hoặc các phân tử thuốc tạo ra hệ chất mang thuốc giúp tăng hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, PAMAM có nhiều nhóm chức amin bề mặt sẽ tương tác với màng tế bào mang điện tích âm gây ra sự phá hủy tế bào khiến PAMAM có độ độc cao và hạn chế khả năng ứng dụng. Để khắc phục nhược điểm này thì biến tính các nhóm chức bề mặt của PAMAM với Poly(ethyleneglycol) (PEG), polyme mạch thẳng có tính tương hợp sinh học cao, không độc, không gây miễn dịch và tan tốt trong nước. Việc gắn PEG lên PAMAM còn làm tăng độ tan trong nước và thời gian tồn tại trong máu, giảm sự tích lũy trong gan và thận của PAMAM, làm tăng không gian nội phân tử giúp tăng khả năng nang hóa thuốc. PEG đóng vai trò như một cái nắp làm giảm tốc độ phóng thích thuốc của PAMAM, cải thiện khả năng thấm xuyên màng tế bào của PAMAM giúp hệ chất mang thâm nhập vào tế bào tốt hơn. Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất luận án: “Nghiên cứu tổng hợp hệ nano dendrimer poly(amidoamine) mang thuốc chống ung thư (carboplatin và oxaliplatin)”. 1
Mục tiêu Nghiên cứu tổng hợp hệ nanodendrimer PAMAM mang thuốc chống ung thư carboplatin (CAR) và oxaliplatin (OXA) nhằm giảm độ độc của thuốc đối với tế bào lành và cải thiện hiệu quả tiêu diệt tế bào ung thư nhờ tăng độ tan, tăng khả năng lưu trữ thuốc, định hướng thuốc tới đích thụ động. Nội dung nghiên cứu - Tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G4.0 từ tâm ethylendiamin - Biến tính PAMAM (2 thế hệ chẵn G3.0 và G4.0 và 1 thế lệ lẻ G3.5) bằng PEG 4.000K với 4 tỉ lệ: 1:4; 1:8; 1:16 và 1:32. - Đánh giá cấu trúc và độ chuyển hóa của các hệ PAMAM biến tính PEG. - Đánh giá khả năng mang thuốc chống ung thư carboplatin và oxaliplatin trên 3 hệ G3.0-PEG, G3.5-PEG và G4.0-PEG. - Phân tích cấu trúc của phức chất giữa hệ PAMAM- PEG[CAR], PAMAM-PEG[OXA] và đánh giá hiệu suất mang thuốc carboplatin và oxaliplatin của hệ chất mang. - Khảo sát tương hợp sinh học của hệ PAMAM-PEG. - Khảo sát độc tính tế bào của các hệ PAMAM-PEG[CAR] và PAMAM-PEG[OXA] trên ba dòng tế bào: ung thư tử cung HeLa, ung thư phổi A549 và ung thư vú MCF-7. Ý nghĩa khoa học của luận án - Biến tính PAMAM (hai thế hệ chẵn G3.0 và G4.0 và một thế lệ lẻ G3.5) bằng PEG với các tỉ lệ khác nhau để tạo hệ chất mang thuốc định hướng đến tế bào ung thư. - Các hệ chất mang PAMAM-PEG tăng khả năng mang thuốc chống ung thư carboplatin và oxaliplatin (tăng hiệu suất nang hóa). 2
- Các hệ chất PAMAM-PEG mang thuốc chống ung thư carboplatin và oxaliplatin có khả năng nhả thuốc chậm và ổn định (dưới 50% sau 24 giờ) trong điều kiện in vitro. - Các hệ chất mang PAMAM-PEG và các phức PAMAM- PEG[CAR], PAMAM-PEG[OXA] giảm độc tính của thuốc chống ung thư carboplatin và oxaliplatin đồng thời vẫn thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả đối với sự phát triển của tế bào ung thư (trên 3 dòng tế bào: ung thư tử cung HeLa, ung thư phổi A549 và ung thư vú MCF-7). Đóng góp mới của luận án Sử dụng vật liệu PAMAM-PEG mang hai thuốc chống ung thư (carboplatin và oxaliplatin) và khảo sát tính chất mang, nhả thuốc, tương hợp sinh học, độc tính tế bào (trên ba dòng ung thư: vú, phổi, tử cung). Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu sử dụng trong luận án bao gồm: - Phương pháp tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G4.0: phản ứng alkyl hóa (phản ứng Michael) và phản ứng amid hóa; - Phương pháp biến tính PAMAM bằng PEG (thế hệ chẵn bằng mPEG-NPC và thế lệ lẻ bằng mPEG-NH2) - Phương pháp nang hóa; - Phương pháp phóng thích thuốc; - Phương pháp khảo sát độ tương hợp sinh học trên dòng tế bào L929; - Phương pháp khảo sát độc tính tế bào trên ba dòng tế bào ung thư: ung thư tử cung HeLa, ung thư phổi A549 và ung thư vú MCF-7. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Phần tổng quan gồm 25 trang trình bày các nội dung: - Tổng quan về bệnh ung thư và phương pháp hóa trị - Thuốc chống ung thư dạng phức platin - Hệ chất mang nano và dendrimer PAMAM - Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM Phần thực nghiệm gồm 25 trang trình bày các nội dung: - Phương pháp tổng hợp dendrimer PAMAM - Phương pháp biến tính PAMAM bằng PEG - Phương pháp nang hóa và phóng thích thuốc - Phương pháp khảo sát độ tương hợp sinh học trên dòng tế bào L929 và độ độc trên 3 dòng tế bào ung thư (ung thư vú MCF-7, ung thư phổi A549 và ung thư tử cung Hela). - Hóa chất và thiết bị, dụng cụ nghiên cứu CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Tổng hợp PAMAM dendrimer đến thế hệ G4.0 3.1.1. Tổng hợp PAMAM dendrimer đến thế hệ G2.5 3.1.1.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) Phổ 1H-NMR của các PAMAM dendrimer từ G-0.5 đến G2.5 có những proton với độ chuyển dịch hóa học điển hình như các công trình đã công bố: -CH2CH2N< (a) tại δH = 2,6 ppm; -CH2CH2CO- (b) tại δH = 2,8-2,9 ppm; -CH2CH2CONH- (c) tại δH = 2,3-2,4 ppm; - CH2CH2NH2 (d) tại δH = 2,7- 2,8 ppm; -CONHCH2CH2N- (e) tại δH = 3,2-3,4 ppm; -CH2CH2COOCH3- (g) tại δH = 2,4-2,5 ppm và - COOCH3 (h) tại δH = 3,7 ppm. Điều này minh chứng cấu trúc sản phẩm PAMAM dendrimer từ G-0.5 đến G2.5 là đúng và phù hợp với cấu tạo theo lý thuyết. 4
3.1.1.2. Phổ khối lượng (MS) So sánh khối lượng phân tử của PAMAM dendrimer tổng hợp với lý thuyết cho thấy hệ số sai lệch trung bình là 0,09% (Bảng 3.1). Bảng 3.1. Khối lượng phân tử của PAMAM tổng hợp với lý thuyết Thế hệ Khối phổ Khối lượng theo lý Hệ số sai lệch PAMAM (m/z) thuyết (m/z) (%) G-0.5 405,2015 404,45 0,18 G0.0 517,3634 516,68 0,13 G0.5 1.205,6128 1.205,39 0,02 G1.0 1.429,9832 1.429,85 0,01 G1.5 2.806,4471 2.807,28 0,03 PAMAM dendrimer G2.0 trở lên không xác định được giá trị m/z. Điều này được công bố trong nghiên cứu của Schwartz và Hood. Nguyên nhân của việc không xác định được khối lượng phân tử của PAMAM thế hệ cao có thể do các PAMAM này khó đạt được giá trị lý thuyết bởi hiệu ứng lập thể. Trong số các phương pháp có thể dùng để xác định trọng lượng phân tử của dendrimers như MALDI-TOFMS, quang phổ khối ion hóa ion dương ESI-MS và thẩm thấu gel sắc ký GPC thì chỉ áp dụng đối với dendrimer thế hệ nhỏ hoặc đòi hỏi một số điều kiện nghiêm ngặt để thực hiện. 1H-NMR cho thấy là kỹ thuật hữu ích để xác định trọng lượng phân tử và đối với PAMAM thì 1H-NMR cho kết quả có độ chính xác tương đối cao. Phổ 1H-NMR và phổ MS đã chứng minh sản phẩm PAMAM dendrimer có cấu trúc đúng theo lý thuyết. 3.1.2. Tổng hợp PAMAM dendrimer thế hệ G3.0, G3.5 và G4.0 Sản phẩm tổng hợp dạng chất rắn màu vàng, hút ẩm mạnh, dễ tan trong nước và metanol. Cấu trúc sản phẩm PAMAM G3.0, G3.5 và G4.0 xác định với phổ UV-Vis, phổ FT-IR, phổ 1H-NMR. Dữ liệu 5
phổ 1H-NMR dùng để tính toán khối lượng phân tử PAMAM G3.0, G3.5 và G4.0. Hình thái kích thước hạt được khảo sát bằng TEM, DLS và thế zeta. 3.1.2.1. Phổ UV-Vis, phổ FT-IR và phổ 1H-NMR Phổ UV-Vis của PAMAM G3.0, G3.5 và G4.0 có vân hấp thụ đặc trưng ở bước sóng 280 – 285 nm, tương ứng với sự hấp thụ của nhóm amin bậc 3 trong cấu trúc của PAMAM G3.0, G3.5 và G4.0. Các PAMAM có nhiều nhóm amin bậc 3 hơn như PAMAM G3.5 thể hiện cường độ hấp thụ mạnh hơn. Phổ 1H-NMR (Bảng 3.2) cho thấy các tín hiệu đặc trưng của PAMAM G3.0, G3.5 và G4.0. Bảng 3.2. Các tín hiệu đặc trưng trên phổ 1H-NMR của PAMAM G3.0, G3.5 và G4.0 Đơn vị tính: δH (ppm) PAMAM (a) (b) (c) (d) (e) (f) G3.0 2,80-2,83 2,37-2,40 2,60-2,61 3,26-3,30 2,73-2,76 G3.5 2,78-2,85 2,39-2,42 2,57-2,63 3,27-3,37 2,47-2,50 3,69-3,73 G4.0 2,83-3,00 3,20-3,28 2,73-2,83 3,56-3,70 3,28-3,37 Phổ FT-IR các sản phẩm PAMAM dendrimer G3.0, G3.5 và G4.0 trong khoảng 4.000 cm-1 đến 500 cm-1 có tín hiệu PAMAM G3.0 và G4.0 tại 3.410 – 3.265 cm-1 của nhóm amin bậc 2 (-NH-); 1.652 – 1.645 cm-1 của C=O (liên kết amid) và 1.556-1.552 cm-1 của liên kết N-H. PAMAM G3.5 có các vân hấp thụ của nhóm –OH trên axit cacboxylic bề mặt tại 3.415 – 3.265 cm-1, và 1.730 cm-1 của nhóm C=O (axit). Đây là tín hiệu điển hình của PAMAM G3.0, G3.5 và G4.0. Từ phổ 1H-NMR, phổ FT-IR và phổ UV-Vis có thể khẳng định cấu trúc của PAMAM dendrimer các thế hệ G 3.0, G3.5 và G 4.0 đã được tổng hợp thành công. 6
3.1.2.2. Tính toán phân tử khối PAMAM bằng 1H-NMR Khối lượng phân tử được tính dựa vào giá trị tích phân của tín hiệu (c) và (d) của PAMAM G3.0, (a) và (d) của PAMAM G3.5 và PAMAM G4.0 trên phổ 1H-NMR ứng với số proton ở vị trí đặc trưng của PAMAM G3.0 G3.5 và G4.0. Kết quả tính toán của PAMAM G3.0, G3.5 và G4.0 sai lệch so với lý thuyết lần lượt là 5,54%, 8,90% và 14,44%; phù hợp với hiệu suất phản ứng (90%) nêu trên. 3.1.2.3. Hình thái PAMAM Kết quả đo kích thước hạt bằng TEM và DLS cho thấy các hạt PAMAM dendrimer có dạng hình cầu, độ đồng đều cao và các hạt đều không quá 10 nm. Bảng 3.3. Kích thước hạt trung bình của PAMAM G3.0, G3.5, G4.0 PAMAM DLS (nm) TEM (nm) G3.0 5,9 ± 1,1 3,09 ± 0,02 G3.5 6,6 ± 1,8 5,68 ± 0,06 G4.0 3,9 ± 0,1 4,04 ± 0,05 Kích thước hạt trung bình của PAMAM G3.0 nhỏ hơn PAMAM G3.5 phù hợp với lý thuyết, cho thấy khi sự tăng kích thước của PAMAM thế hệ sau so với thế hệ trước. PAMAM G4.0 có kích thước nhỏ hơn PAMAM G3.5 có thể vì cùng số lượng 64 nhóm bề mặt nhưng khác nhóm chức (PAMAM G4.0 là amin và PAMAM G3.5 là cacboxylat) nên PAMAM G4.0 có hiện tượng nếp gấp ngược do lực hấp dẫn giữa các nhóm chức bề mặt giảm, kéo theo độ trật tự thấp, các nhánh dendrimer gập vào trong khiến cấu trúc dendrimer co lại, làm giảm không gian bên trong của dendrimer. Hiện tượng này được De Gennes và Hervet công bố. PAMAM G3.5 bị trương nở nhờ các nhóm cacboxylat tương tác với nước nên kích thước DLS của PAMAM G3.5 lớn hơn PAMAM G4.0. 7
3.1.2.4. Thế zeta Thế zeta trung bình PAMAM dendrimer G 3.0 là 44,63 ± 0,31 mV, PAMAM dendrimer G3.5 là -48,7 ± 0,1 mV và PAMAM dendrimer G4.0 là 24,13 ± 0,15 mV. Kết quả này phù hợp với lý thuyết và minh chứng cho sự tổng hợp thành công PAMAM G3.0, G3.5 và G4.0. PAMAM thế hệ chẵn G3.0 và G4.0 với nhóm amin bề mặt mang điện tích dương có thế zeta dương điện và PAMAM thế hệ lẻ G3.5 với nhóm cacboxylat mang điện tích âm có thế zeta âm điện. PAMAM G4.0 có nhiều nhóm amin hơn PAMAM G3.0 (64 nhóm so với 32 nhóm) và do hiện tượng nếp gấp ngược nên có thế zeta ít dương điện hơn do các nhóm amin co lại vào trong. Kết quả đo thế zeta còn cho thấy hệ có độ bền cao (thế zeta trên 20 mV hoặc dưới -20mV). Nguyên nhân do các lực đẩy tĩnh điện cùng với cấu tạo hệ hình cầu theo mô hình lý thuyết của DLVO. 3.1.3. Hiệu suất phản ứng tổng hợp PAMAM dendrimer Các số liệu và hiệu suất của phản ứng tổng hợp PAMAM dendrimer G-0.5 đến G4.0 chi tiết theo Bảng 3.4. Nhìn chung, hiệu suất của các phản ứng tổng hợp PAMAM dendrimer từ G-0.5 đến G4.0 khá cao, trên 70 %. Bảng 3.4. Hiệu suất của phản ứng tổng hợp PAMAM dendrimer Thế hệ Khối lượng lý Khối lượng Hiệu suất PAMAM thuyết (mLT, g) thực (mTT, (%) g) G3.0 42,2590 37,7565 89 G3.5 67,8653 61,7586 91 G4.0 35,3382 30,6938 87 3.2. Biến tính PAMAM dendrimer bằng mPEG Theo nhiều kết quả nghiên cứu đã công bố thì mPEG biến tính với PAMAM các thế hệ G3.0, G3.5 hay G4.0 có khối lượng phân tử 8
trong khoảng từ 4.000 Da đến 5.000 Da là phù hợp trong các khảo sát làm hệ mang thuốc vì khối lượng phân tử nhỏ hơn sẽ không hiệu quả trong mục đích che phủ bề mặt amin độc tính của PAMAM thế hệ chẵn còn khối lượng phân tử lớn hơn thì sẽ làm cho PEG cồng kềnh và có hiệu ứng lập thể dẫn đến khó khăn trong quá trình tổng hợp. Bên cạnh đó, nghiên cứu sử dụng mPEG (PEG được metoxy hóa ở một nhánh và nhánh còn lại là glycol) để lai hóa với bề mặt PAMAM. Điều này đảm bảo không có hiện tượng cùng một phân tử mPEG sẽ lai hóa với 2 PAMAM ở hai nhánh glycol của PEG và sản phẩm thu được là đồng nhất như mục đích nghiên cứu đã đặt ra. Ngoài ra, nhằm tạo phản ứng kết hợp tốt hơn giữa mPEG với nhóm amin bề mặt của các dendrimer PAMAM thì mPEG được hoạt hóa trước khi phản ứng. mPEG hoạt hóa với NPC để phản ứng với PAMAM thế hệ chẵn G3.0 và G4.0 thông qua các liên kết uretan. PAMAM thế hệ lẻ G3.5 với mPEG hoạt hóa với NH2. Sản phẩm mPEG-NPC thu được ở trạng thái chất rắn màu trắng, dạng bột mịn, tan tốt trong nước; mPEG- NH2 là chất rắn dạng xốp màu trắng, tan tốt trong nước. PAMAM-PEG ở trạng thái chất rắn, màu trắng, dạng xốp, dễ tan trong nước. 3.2.1. Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) Phổ UV-Vis sản phẩm PAMAM G 3.0-PEG, G4.0-PEG có tín hiệu tại khoảng 280 – 285 nm sụt giảm, là vân hấp thụ đặc trưng của nhóm amin bậc 3 trong cấu trúc của PAMAM G3.0, G4.0; có thể vì sự tồn tại các phân tử PEG có độ hấp thụ ở vùng 280 – 285 nm thấp. Phổ UV-Vis của PAMAM-PEG G3.5 trong khoảng bước sóng 280 – 285 nm gần như biến mất có thể do hàm lượng sản phẩm thấp và bị ảnh hưởng bởi sự hấp thụ các thành phần khác trong sản phẩm. 9
3.2.2. Phổ hồng ngoại (FT-IR) Đối với phổ FT-IR của PAMAM G3.0-PEG và G4.0-PEG cho thấy mũi hấp thụ đặc trưng cho dao động của nhóm C-H và C-O trên phân tử PEG và sự mất đi tín hiệu dao động của sản phẩm trung gian mPEG-NPC. Phổ FT-IR của PAMAM G3.5-PEG có sự xuất hiện mũi hấp thụ mạnh đặc trưng của mPEG. Cụ thể, phổ FT-IR của các dẫn xuất PAMAM-PEG G3.0 G3.5, G4.0 xuất hiện tín hiệu tại 2.888 cm-1 và 1.108 cm-1 đặc trưng cho dao động của nhóm C-H và C-O trên phân tử mPEG và mất đi tín hiệu dao ⃛ O ở 1.469 cm-1 (so với phổ FT-IR của sản phẩm động của nhóm N− mPEG-NPC). Do đó, phổ FT-IR đã góp phần chứng minh quá trình gắn mPEG lên PAMAM G3.0, G3.5, G4.0 thành công. 3.2.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của mPEG-NPC có các tín hiệu đặc trưng tại δH = 3,34 ppm (a), δH = 3,80 – 3,35 ppm (b), δH = 3,83 – 3,82 ppm (c), δH = 4,46 – 4,44 ppm (d), δH = 7,47 – 7,45 ppm (e), và δH = 8,33 – 8,31 ppm (f). Phổ 1H-NMR của PAMAM G3.0-PEG, PAMAM G3.5-PEG và PAMAM G4.0-PEG xuất hiện các tín hiệu này đặc trưng cho PAMAM G3.0, G3.5 và G4.0. Khi so sánh với phổ 1H-NMR của mPEG-NPC với PAMAM G3.0-PEG và PAMAM G4.0-PEG có tín hiệu ở δH = 7,47 – 7,45 ppm và δH = 8,33 – 8,31 ppm của nhóm p-nitrophenolat biến mất trên phổ của các dẫn xuất PAMAM G3.0-PEG, PAMAM G4.0-PEG và có sự thay đổi về độ dịch chuyển hóa học ở vị trí (d) từ δH = 4,46 – 4,44 ppm ở mPEG-NPC sang δH = 4,27 ppm. Độ chuyển dịch này đặc trưng cho –NHCOO-CH2-CH-, các tín hiệu còn lại tại a, b và c không 10
có sự khác biệt đáng kể. Điều này chứng tỏ mPEG đã gắn thành công lên PAMAM dendrimer G3.0, G4.0. Ngoài ra, số lượng liên hợp thực tế mPEG trên PAMAM có thể được xác định bằng phổ 1H-NMR. Do cấu trúc đối xứng nên mỗi proton trong các phân tử có một số xác định và tỷ lệ proton trong cấu trúc của dendrimer PAMAM bằng tỷ lệ tích phân của tín hiệu cộng hưởng trong phổ 1H-NMR. Số nhóm mPEG liên hợp PAMAM G3.0 ở tỉ lệ 4:1 là 3,96; 8:1 là 7,78 và 16:1 là 11,07, tương ứng tỉ lệ là 99%, 97% và 69%. Số nhóm mPEG càng cao thì khả năng liên hợp giảm được giải thích do hiệu ứng lập thể. So sánh phổ của mPEG-G3.5 với phổ của mPEG-NH2 cho thấy sự vắng mặt của các tín hiệu cộng hưởng (e) –CO-O-CH3- ở khoảng 3,46 ppm, góp phần minh chứng cho sự tổng hợp thành công. 3.2.4. Hình thái PAMAM biến tính PEG Ảnh TEM có hình cầu, kích thước không quá 50 nm. Kết quả đo kích thước hạt trung bình trên ảnh TEM của PAMAM G3.0-PEG là 27,15 ± 0,16 nm, PAMAM G3.5-PEG là 22,69 ± 0,40 nm và PAMAM G4.0-PEG là 22,70 ± 0,39 nm. Kết quả đo DLS của PAMAM-PEG cho thấy kích thước hạt của PAMAM biến tính PEG lớn hơn PAMAM tương ứng. Kết quả này khẳng định một lần nữa cho việc gắn thành công mPEG lên PAMAM. Bảng 3.5. Kích thước hạt (DLS) PAMAM G3.0-PEG theo tỉ lệ PEG Tỉ lệ PAMAM G3.0-PEG 1:8 1:12 1:16 Kích thước (nm) 32,6 ± 0,9 34,9 ± 1,5 35,7 ± 0,7 PAMAM-PEG có kích thước lớn hơn PAMAM vì nhóm PEG gắn vào đã bao phủ bề mặt dendrimer làm tăng kích thước hạt (Bảng 3.6). 11
Khi tăng thế hệ PAMAM từ G3.0-PEG lên G3.5-PEG thì kích thước hạt trung bình tăng, điều này cho thấy khi sự tăng kích thước của các PAMAM thế hệ sau so với thế hệ trước, phù hợp với lý thuyết. Bảng 3.6. Kích thước hạt trung bình PAMAM-PEG G3.0, G3.5, G4.0 PAMAM DLS (nm) TEM (nm) G3.0 5,9 ± 1,1 3,09 ± 0,03 G3.0-PEG 32,6 ± 0,9 27,15 ± 0,16 G3.5 6,6 ± 1,8 5,68 ± 0,06 G3.5-PEG 40,3 ± 0,9 22,69 ± 0,40 G4.0 3,98 ± 0,06 4,04 ± 0,05 G4.0-PEG 30,3 ± 1,8 22,70 ± 0,39 PAMAM G4.0-PEG có kích thước nhỏ hơn PAMAM G3.0- PEG có thể do hiện tượng nếp gấp ngược của PAMAM. PAMAM G3.5-PEG có nhóm cacboxylat nên có sự tương tác của nhóm cacboxylat với nước (môi trường pH=7,4) dẫn đến sự trương nở của PAMAM G3.5-PEG và kích thước của PAMAM G3.5-PEG lớn hơn PAMAM G4.0.-PEG. 3.2.5. Thế zeta Thế zeta minh chứng cho sự thay đổi điện tích của hệ chất mang PAMAM sau khi biến tính với PEG, tác nhân không mang điện. PAMAM G3.0-PEG có thế zeta trung bình là 26,30 ± 0,44 mV, giảm so với PAMAM G3.0 (44,63 ± 0,31 mV) vì nhóm mPEG gắn vào đã bao phủ các nhóm chức amin trên bề mặt dendrimer, làm giảm điện tích dương của dendrimer. Tương tự đối với PAMAM G3.5- PEG có thế zeta trung bình là -0,53 ± 0,35 mV tăng so với PAMAM G3.5 (-48,7 ± 0,10 mV) do mPEG gắn vào đã bao phủ các nhóm chức cacboxylat trên bề mặt dendrimer PAMAM thế hệ lẻ G3.5 làm giảm điện tích âm của dendrimer. Trường hợp PAMAM G4.0-PEG thế zeta tăng so với PAMAM G4.0 có thể giải thích do mPEG gắn vào dendrimer nên các 12
nhóm amin bị đẩy ra phía ngoài dẫn đến thế zeta của PAMAM G4.0- PEG dương điện hơn PAMAM G4.0 (46,53 ± 0,06 mV so với 24,13 ± 0,15 mV). 3.3. Khảo sát khả năng nang hóa Hiệu suất nang hóa thuốc (%) của PAMAM-PEG mang thuốc platin là tỷ lệ trọng lượng của thuốc platin được mang trong các hạt PAPAM-PEG so với lượng thuốc platin ban đầu, xác định thông qua lượng thuốc platin không được nang hóa bằng phương pháp HPLC (Bảng 3.7). Định lượng thuốc platin từ đường chuẩn của nồng độ thuốc platin đã biết. Thuốc platin tự do được sử dụng làm mẫu đối chứng. Hệ PAMAM-PEG sử dụng là hệ PAMAM-PEG tỉ lệ 1:8 vì hiệu suất lai hóa trên 90% so với các hệ tỉ lệ cao hơn như 1:16 hay 1:32 chỉ khoảng 70% do hiệu ứng lập thể. Bảng 3.7. Hiệu suất nang hóa DLE, DLC DLE (%) DLC(%) PAMAM G3.0-PEG[CAR] 83,98 ± 0,24 7,75 ± 0,02 PAMAM G3.0-PEG[OXA] 85,31 ± 0,23 7,86 ± 0,02 PAMAM G4.0-PEG[CAR] 84,56 ± 0,52 7,80 ± 0,04 PAMAM G4.0-PEG[OXA] 86,41 ± 0,78 7,95 ± 0,07 PAMAM G3.5-PEG[CAR] 85,37 ± 0,34 7,87 ± 0,03 PAMAM G3.5-PEG[OXA] 77,63 ± 0,20 7,20 ± 0,02 Hệ PAMAM-PEG tỉ lệ 1:4 không được chọn do số lượng lai hóa thấp sẽ làm nhóm amin trên bề mặt PAMAM thế hệ chẵn như PAMAM G3.0 và G4.0 còn nhiều và có khả năng gây độc cũng như khả năng mang thuốc thấp khiến cho việc lai hóa với PEG không thực sự hiệu quả như mong đợi. 13
3.3.1. Đường chuẩn định lượng carboplatin và oxaliplatin bằng HPLC Tín hiệu của carboplatin xuất hiện tại thời gian lưu 2,3 phút. Đường chuẩn định lượng carboplatin có r2 = 0,9998; phương trình hồi quy tuyến tính y = 5804x – 9523,3. Tín hiệu của oxaliplatin xuất hiện tại thời gian lưu 1,9 phút. Đường chuẩn định lượng oxaliplatin có r2 = 0,9997; phương trình hồi quy tuyến tính y = 9275.2x – 5835.2. 3.3.2. Kết quả nang hóa thuốc carboplatin với PAMAM-PEG Sản phẩm PAMAM-PEG mang thuốc carboplatin thu được ở trạng thái rắn màu trắng ngà, dạng hạt nhỏ. Khả năng nang hóa thuốc carboplatin khá cao khi ở tỉ lệ thuốc bằng 10% chất mang thì khả năng mang thuốc DLC trên 7,7% (w/w) và hiệu suất nang hóa thuốc DLE trên 83,9%. 3.3.2.1. Phổ FT-IR Phổ hồng ngoại FT-IR của PAMAM-PEG[CAR] gần tương tự PAMAM-PEG, tuy nhiên có sự tăng cường độ ở khoảng số sóng 3.400 cm-1 của liên kết N-H và 1.600 cm-1 của liên kết C=O đối với PAMAM-PEG[CAR] thế hệ chẵn G3.0 và G4.0. 3.3.2.2. Ảnh TEM Ảnh TEM của các hệ PAMAM-PEG[CAR] cho thấy kích thước hạt không quá 50 nm và kích thước này tăng so với các hệ PAMAM-PEG. Điều này có thể lý giải do khi hệ mang thuốc carboplatin thì carboplatin chiếm giữ vào khoang trống của dendrimer làm tăng kích thước hệ. Cụ thể, khi mang thuốc carboplatin, hệ PAMAM G3.0 – PEG tăng kích thước từ 27,15 nm lên 30,30 nm; hệ PAMAM G3.5 – PEG và PAMAM G4.0 – PEG tăng mạnh kích thước từ 22,70 nm lên 36,04 nm và 30,70 nm. Thế hệ G3.5 và G4.0 có nhiều nhóm chức bề 14
mặt hơn (gấp đôi) so với thế hệ G3.0 nên các hạt thuốc có thể chiếm các khoang trống và bề mặt của PAMAM. Như vậy hiện tượng nếp gấp ngược được giảm bớt nhờ các hạt thuốc xâm chiếm. Bên cạnh đó, thuốc còn có thể xâm chiếm các PEG khiến polyme này dãn nở ra thêm. Tất cả các yếu tố này khiến cho hệ mang thuốc tăng kích thước đáng kể so với hệ mang trước đó. 3.3.2.3. Thế zeta Thế zeta cho thấy sự thay đổi đáng kể trên điện tích của hệ PAMAM-PEG khi mang carboplatin. Đối với thế hệ G3.0 thì điện tích giảm dần (G3.0 là 44,63 mV, G3.0-PEG là 26,30 mV và G3.0-PEG[CAR] là 0,2 mV). Nguyên nhân có thể do carboplatin và PEG che phủ các nhóm amin bề mặt của dendrimer dẫn đến điện tích dương giảm. Trái ngược lại, thế hệ G4.0 tăng mạnh điện tích (G4.0 là 24,13 mV, G4.0-PEG là 46,53 mV và G4.0-PEG[CAR] là 62,60 mV). Nguyên nhân có thể do thế hệ G4.0 có hiện tượng nếp gấp ngược nên các nhóm amin bị gấp vào phía trong khoang dendrimer và carboplatin chiếm chỗ trong khoang của dendrimer và PEG làm dendrimer mở rộng, đẩy các nhóm amin ra phía ngoài dẫn đến điện tích dương tăng. Trong khi đó, thế hệ G3.5 có thế zeta thay đổi không đáng kể sau khi mang thuốc (từ -0,53 mV thành -0,63 mV). Mặc dù thế hệ G3.0 và G3.5 không còn thế zeta giá trị cao (trên 20 mV và dưới -20 mV) khiến cho hệ không còn lực đẩy tĩnh điện mạnh giữa các hạt nhưng hệ vẫn giữ được khả năng bền do có PEG là tác nhân đóng vai trò làm bền hệ. 3.3.3. Kết quả nang hóa thuốc oxaliplatin với PAMAM-PEG Sản phẩm PAMAM-PEG mang thuốc oxaliplatin thu được ở trạng thái rắn màu trắng ngà, dạng hạt nhỏ. Khả năng nang hóa thuốc 15
oxaliplatin khá cao khi ở tỉ lệ thuốc bằng 10% chất mang thì khả năng mang thuốc DLC đạt trên 7,2% (w/w) và hiệu suất nang hóa thuốc DLE trên 77,6%. 3.3.3.1. Phổ FT-IR Phổ FT-IR của PAMAM-PEG[OXA] có các tín hiệu tương tự PAMAM-PEG[CAR] và PAMAM-PEG, tuy nhiên có sự tăng cường độ ở khoảng số sóng 1.600 cm-1 của liên kết C=O ở PAMAM- PEG[OXA] thế hệ chẵn là G3.0 và G4.0. 3.3.3.2. Ảnh TEM Ảnh TEM của các hệ PAMAM-PEG[OXA] cho thấy kích thước hạt tăng so với các hệ PAMAM-PEG. Hệ oxaliplatin thế hệ chẵn G3.0 và G4.0 có kích thước hạt gẩn với hệ carboplatin thế hệ chẵn G3.0 và G4.0. Ngược lại, hệ oxaliplatin thế hệ lẻ G3.5 có kích thước tăng mạnh so với hệ carboplatin. Các hệ PAMAM-PEG mang oxaliplatin có kích thước tăng khi mang oxaliplatin do các phân tử oxaliplatin có khuynh hướng tương tác giữa các phân tử oxaliplatin qua liên kết hydro tạo nên hiện tượng kết tụ các phân tử oxaliplatin chiếm các khoang trống trong dendrimer làm tăng kích thước của hệ. 3.3.3.3. Thế zeta Thế zeta của hệ PAMAM-PEG G4.0 mang oxaliplatin tăng độ dương điện do các phân tử oxaliplatin chiếm các khoảng trống của dendrimer nên đẩy các nhóm amin ra phía ngoài, mặt khác các phân tử oxaliplatin hấp phụ tĩnh điện do nhóm cacboxylat trên phân tử oxaliplatin liên kết tĩnh điện với các nhóm amin trên bề mặt của PAMAM thế hệ chẵn do đó hệ PAMAM-PEG G4.0 tăng điện tích dương khi mang thuốc oxaliplatin (Bảng 3.8). 16
Bảng 3.8: Thế zeta của PAMAM, PAMAM-PEG, PAMAM- PEG[CAR], PAMAM-PEG[OXA] các thế hệ G3.0, G3.5 và G4.0 Zeta (mV) Hệ G3.0 Hệ G4.0 Hệ G3.5 PAMAM 44,63 ± 0,31 24,13 ± 0,15 -48,7 ± 0,1 PAMAM-PEG 26,30 ± 0,44 46,53 ± 0,06 -0,53 ± 0,35 CAR 34,90 ± 0,75 58,87 ± 0,35 0,80 ± 0,17 OXA 0,20 ± 0,17 62,60 ± 0,26 -0,63 ± 0,06 Trái lại, PAMAM-PEG G3.0 khi mang oxaliplatin giảm độ dương điện do cấu trúc không gian của oxaliplatin lớn nên có khuynh hướng chiếm các khoang trống của PEG làm cho polyme này che phủ các nhóm amin trên bề mặt của PAMAM làm giảm điện tích dương. 3.4. Khảo sát phóng thích Carboplatin và Oxaliplatin 3.4.1. Khảo sát phóng thích thuốc Carboplatin Các kết quả cho thấy, cả 3 loại chất mang thuốc carboplatin đều có khả năng phóng thích thuốc chậm, lượng thuốc được phóng thích dưới 50% sau 24 giờ. Tuy nhiên PAMAM G3.0-PEG nhả thuốc nhanh hơn, đạt 41,23% sau 24 giờ, PAMAM G3,5-PEG và G4.0-PEG nhả thuốc ít hơn, chỉ đạt lần lượt là 9,25% và 12,53%. Điều này có thể giải thích do thế hệ dendrimer tăng thì tương tác kỵ nước của dendrimer và thuốc tăng nên thế hệ dendrimer càng lớn khả năng phóng thích thuốc càng chậm. Hệ chất mang PAMAM G3.5-PEG phóng thích carboplatin chậm hơn PAMAM G4.0-PEG có thể giải thích do tương tác tĩnh điện. Carboplatin hấp phụ trên bề mặt hệ chất mang PAMAM-PEG qua tương tác tĩnh điện, thế hệ PAMAM chẵn, nhóm amin trên bề mặt PAMAM tương tác tĩnh điện với nhóm cacboxylat của carboplatin, thế hệ PAMAM lẻ, nhóm cacboxylat trên bề mặt PAMAM tương tác với nhóm amin của carboplatin. Tương tác tĩnh điện của nhóm amin của 17
carboplatin và nhóm cacboxylat của PAMAM G3.5 thuận lợi về mặt không gian hơn tương tác tĩnh điện của nhóm cacboxylat trên carboplatin với nhóm amin trên bề mặt PAMAM G4.0 vì cấu trúc không gian của carboplatin. 3.4.2. Khảo sát phóng thích thuốc Oxaliplatin Các kết quả cho thấy, cả 3 loại chất mang thuốc oxaliplatin đều có khả năng phóng thích thuốc chậm, lượng thuốc được phóng thích dưới 50% sau 24 giờ. Tuy nhiên, PAMAM G3.5-PEG phóng thích thuốc nhanh hơn, đạt 28,80% sau 24 giờ, PAMAM G3.0-PEG và G4.0-PEG phóng thích thuốc ít hơn, chỉ đạt lần lượt là 8,89% và 6,54%. Điều này có thể giải thích do PAMAM thế hệ chẵn có các nhóm bề mặt là các nhóm amin nên tương tác tĩnh điện với nhóm COO- của thuốc do đó PAMAM G3.0-PEG và G4.0-PEG phóng thích thuốc ít hơn PAMAM G3.5-PEG. PAMAM G4.0-PEG phóng thích oxaliplatin chậm hơn PAMAM G3.0-PEG vì PAMAM G4.0-PEG có nhiều khoang trống trong dendrimer để giữ oxaliplatin hơn PAMAM G3.0-PEG và khi tăng thế hệ dendrimer thì tương tác kỵ nước của dendrimer và oxaliplatin tăng nên PAMAM G4.0-PEG phóng thích oxaliplatin chậm hơn PAMAM G3.0-PEG. Ngoài ra PAMAM G4.0-PEG có nhiều nhóm amin hơn PAMAM G3.0-PEG nên liên kết tĩnh điện của PAMAM G4.0-PEG và oxaliplatin lớn hơn PAMAM G3.0-PEG và oxaliplatin. PAMAM G4.0-PEG phóng thích oxaliplatin chậm hơn PAMAM G3.5-PEG được giải thích do tương tác tĩnh điện của oxaliplatin và PAMAM. Nhóm amin trên bề mặt PAMAM thế hệ chẵn tương tác tĩnh điện với nhóm cacboxylat của oxaliplatin; nhóm cacboxylat trên bề mặt PAMAM thế hệ lẻ tương tác với nhóm amin 18