Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu biến tính dendrimer polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học (PEG và Pluronic) ứng dụng mang thuốc

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

82
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu tổng hợp chất mang thuốc trên cơ sở biến tính dendrimer PAMAM bằng polymer tương hợp sinh học (Pluronic, Polyethylene glycol), với mục tiêu làm giảm độc tính của PAMAM (tăng tính tương hợp sinh học) và tăng khả năng mang thuốc của PAMAM.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu biến tính dendrimer polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học (PEG và Pluronic) ứng dụng mang thuốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---------------- NGUYỄN THỊ TRÂM CHÂU NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH CÁC DENDRIMER POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYMER TƯƠNG HỢP SINH HỌC (PEG VÀ PLURONIC) ỨNG DỤNG MANG THUỐC Chuyên ngành: VẬT LIỆU CAO PHÂN TỬ VÀ TỔ HỢP Mã số : 62.44.01.25 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU TP. Hồ Chí Minh – 2016
Công trình được hoàn thành tại: Phòng Vật liệu hóa dược, Viện Khoa học vật liệu ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Những người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. NGUYỄN CỬU KHOA 2. TS. TRẦN NGỌC QUYỂN Phản biện 1: Phản biện 2: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện tổ chức tại Viện Khoa học vật liệu ứng dụng, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam, Số 1, Mạc Đĩnh Chi, Q.1, TP. Hồ Chí |Minh vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện Quốc gia Việt nam, Thư viện Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
GIỚI THIỆU 1. MỞ ĐẦU Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã không ngừng nghiên cứu để tìm ra những vật liệu mới nhằm phục vụ cho nhu cầu của cuộc sống. Công nghệ nano ra đời đã đáp ứng được nhu cầu cấp thiết này. Trong những năm gần đây, các nanopolymer được tập trung nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y dược. Dendrimer là một trong những nanopolymer được nghiên cứu nhiều nhất bởi cấu trúc hình cầu có nhiều khoảng trống bên trong có thể được ứng dụng làm chất mang thuốc, protein và phân phối gen. Ngày càng có nhiều loại thuốc đang được sử dụng phải đối mặt với các vấn đề về độ hòa tan, tác dụng sinh học, độ hấp thụ kém và thời gian tồn trữ ngắn. Ngoài ra, các thuốc đặc trị có rất nhiều tác dụng phụ. Đặc biệt thuốc chống ung thư không những gây độc với tế bào ung thư mà còn gây độc đối với cả các tế bào lành. Nhiều báo cáo khoa học chỉ ra rằng việc đóng gói các loại thuốc điều trị ung thư vào các hệ chất mang polymer hay nanopolymer đã nâng cao đáng kể độ tan trong nước và độ ổn định lưu trữ thuốc, giúp tăng cường hoạt động chống khối u và giảm tác dụng phụ của thuốc. Dendrimer PAMAM là một trong những chất mang nanopolymer có thể làm việc như một công cụ hữu ích cho việc phân phối các loại thuốc, cũng như liệu pháp gen và hóa trị [14, 22, 35, 44, 53, 68, 74-76]. Tuy nhiên, có một nhược điểm của dendrimer PAMAM là gây ra độc tính trong máu và ly giải tế bào do tương tác mạnh mẽ của các nhóm -NH2 ở trên bề mặt PAMAM với màng tế bào, dẫn đến sự phá vỡ màng tế bào, đồng nghĩa là diệt tế bào [44, 53, 79, 88]. Để giải quyết vấn đề này, các nhóm -NH2 trên bề mặt dendrimer PAMAM được biến tính bằng các polymer tương hợp sinh học, làm triệt tiêu điện tích dương của các nhóm amine trên hoặc ngăn chặn sự tiếp xúc giữa các nhóm -NH2 với màng tế bào giúp giảm độc tính, tạo ra khả năng tương tác sinh học cao của chất mang, từ đó nâng cao hiệu quả mang thuốc và điều trị [14, 35, 80, 83]. Ngoài ra việc biến tính bề mặt PAMAM cũng có thể làm tăng khả năng mang thuốc của PAMAM. Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu biến tính dendrimer polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học (PEG và Pluronic) ứng dụng mang thuốc”. 2. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN Nghiên cứu tổng hợp chất mang thuốc trên cơ sở biến tính dendrimer PAMAM bằng polymer tương hợp sinh học (Pluronic, Polyethylene glycol), với mục tiêu làm giảm độc tính của PAMAM (tăng tính tương hợp sinh học) và tăng khả năng mang thuốc của PAMAM. Trang 3
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU LUẬN ÁN 1. Tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G5.0 từ tâm ethylenediamine (EDA). 2. Nghiên cứu biến tính 4 thế hệ dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 bằng các Polyethylene glycol 4000 (PEG4K), Polyethylene glycol 6000 (PEG6K), Polyethylene glycol 10000 (PEG10K), Polyethylene glycol 12000 (PEG12K). 3. Nghiên cứu biến tính 4 thế hệ dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 bằng các Pluronic P123, Pluronic F68, Pluronic F127 và Pluronic F108. 4. Nghiên cứu tổng hợp dendrimer PAMAM G4.0-F127 với các tỷ lệ mol PAMAM/F127 khác nhau. 5. Nghiên cứu hiệu quả nang hóa thuốc chống ung thư 5-Fluorouracil (5-FU) của các chất mang nano PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic. 6. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-Fluorouracil của hệ dendrimer PAMAM G4.0- PEG6K/5-FU trong in vitro với môi trường đệm PBS (pH=7.4). 7. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-Fluorouracil của hệ dendrimer PAMAM G4.0- P123/5-FU và PAMAM G4.0-F127/5-FU trong in vitro với môi trường đệm PBS (pH=7.4). 8. Nghiên cứu độc tính tế bào ung thư vú MCF-7 và nguyên bào sợi (Fibroblast) đối với các hệ chất mang nano dendrimer PAMAM, PAMAM-PEG, PAMAM-Pluronic, PAMAM- PEG/5-FU và PAMAM-Pluronic/5FU. 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN - Tổng hợp và biến tính các thế hệ dendrimer PAMAM với các polymer tương hợp sinh học PEG và Pluronic nhằm tạo ra hệ chất mang thuốc có tính tương hợp sinh học và khả năng mang thuốc cao. - Việc nghiên cứu biến tính PAMAM bằng các polymer PEG và Pluronic với các khối lượng phân tử khác nhau làm cơ sở khoa học cho điều kiện phản ứng gắn kết số lượng mạch PEG hay Pluronic khác nhau lên phân tử PAMAM tạo các hệ PAMAM biến tính có kích thước nano khác nhau và có khả năng mang thuốc khác nhau, đặc biệt thuốc chống ung thư 5- FU. - Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm chế tạo ra hệ mang thuốc “thông minh” hướng tới đích trên cơ sở PAMAM. 5. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN (1) Về mặt tổng hợp PAMAM-Pluronic: - Đã nghiên cứu tổng hợp và biến tính thành công các dendrimer PAMAM thế hệ G2.0; G3.0; G4.0; G5.0 với các Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau (P123; F68; F127; F108). - Trong đó, Pluronic mạch càng dài càng khó gắn kết với PAMAM hơn. Trang 4
(2) Về mặt so sánh nang hóa thuốc trong chất mang PAMAM-PEG và PAMAM- Pluronic thì PAMAM G4.0-PEG và PAMAM G4.0-Pluronic có khả năng nang hóa thuốc tốt hơn cả. Trong đó, PAMAM-Pluronic nang hóa thuốc kỵ nước 5-FU tốt hơn PAMAM-PEG tương ứng. (3) Khả năng mang thuốc của PAMAM-P123> PAMAM-F127> PAMAM-F108 > PAMAM-F68 chịu ảnh hưởng giá trị HLB hơn là ảnh hưởng của mạch cấu trúc. 6. BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án có 169 trang với 30 bảng, 102 hình, 8 đồ thị. Ngoài phần mở đầu (2 trang), kết luận (3 trang), danh mục các công trình công bố (2 trang) và tài liệu tham khảo (14 trang), phụ lục(15 trang), luận án được chia thành 3 chương như sau: Chương 1: Tổng quan 41 trang Chương 2: Thực nghiệm 26 trang Chương 3: Kết quả và biện luận 66 trang Trang 5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Giới thiệu về dendrimer và cụ thể dendrimer polyamidoamine (PAMAM), các phương pháp tổng hợp, các tính chất và ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y- dược. Giới thiệu các phương pháp mang thuốc của PAMAM, ý nghĩa của việc mang thuốc, đặc biệt mang thuốc chống ung thư (ví dụ 5-Flourouracil) bằng cách thụ động và chủ động. Các phương pháp biến tính trên bề mặt của PAMAM bằng các tác nhân tương hợp sinh học như polyethyleneglycol (PEG) hay Pluronic nhằm làm tăng tính tương hợp sinh học, tăng khả năng mang thuốc của PAMAM. Tổng quan một số công trình nghiên cứu trong lĩnh vực tổng hợp, biến tính PAMAM làm hệ mang thuốc chống ung thư. Nhìn chung trong những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu về biến tính dendrimer PAMAM bằng polymer tương hợp sinh học. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng phương pháp hoạt hóa Pluronic, PEG bằng NPC và khống chế bằng tỷ lệ mol 1:1 (Pluronic/PEG : NPC) và sử dụng xúc tác (pyridine) hay dung môi (benzene) trong quá trình phản ứng. Nhược điểm của phương pháp này là dễ xảy ra khả năng Pluronic hay PEG bị hoạt hóa cả hai đầu bằng NPC và kết quả có thể Pluronic hay PEG liên kết cả 2 đầu vào PAMAM, tạo lớp màng bao phủ bề mặt PAMAM và ngăn cản một phần thuốc không đi vào khoảng trống trong cấu trúc PAMAM [67, 110, 124]. Mặt khác, chưa thấy công bố nào sử dụng một hệ Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau để biến tính chuỗi các thế hệ PAMAM, nhằm xây dựng một hệ thống về sự ảnh hưởng cấu trúc dendrimer PAMAM các thế hệ, cấu trúc Pluronic các loại đến mức độ biến tính, độc tính tế bào và hiệu quả nang hóa thuốc. Vì vậy trong công trình nghiên cứu của luận án này, chúng tôi tập trung biến tính dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 bằng 4 loại PEG và 4 loại Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau để xây dựng tính hệ thống về mức độ biến tính và khả năng mang thuốc của các nanopolymer. Trang 6
CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu của luận án là các hóa chất tinh khiết của các hãng Sigma–Aldrich, Acros Organics (Mỹ), Merck (Đức), Amresco (Hàn Quốc). Thiết bị và dụng cụ chính được sử dụng như máy đông khô chân không FDU-2100 Eyela (Nhật Bản) tại Viện Công nghệ hóa học, Viện HLKH&CN VN; máy JEOL JEM 1400 (Nhật Bản) chụp hình TEM, tại Trường Đại học Bách Khoa, TP. HCM; máy phân tích quang phổ hồng ngoại FTIR Equinox 55 Bruker (Đức), tại Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện HLKH&CN VN; máy sắc ký gel GPC Agilent 1260 (Hoa Kỳ); sắc ký lỏng HPLC đo bằng máy Agilent 1260 (Hoa Kỳ); Phân tích dòng chảy tế bào đo tại PTN-SHPT- BM Di truyền tại Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Sử dụng phương pháp divergent để tổng hợp nano-dendrimer PAMAM các thế hệ. Sử dụng phương pháp phổ 1H NMR, FTIR và GPC để xác định thành phần cấu trúc và khối lượng phân tử của PAMAM các thế hệ và PAMAM biến tính với các polymer tương hợp sinh học. Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM để khảo sát hình thái của sản phẩm PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic. Sử dụng các phương pháp nhuộm SRB, nhuộm MTT và nhuộm huỳnh quang FDA/EB để đánh giá độc tính tế bào in vitro. Sử dụng UV-Vis và HPLC để đánh giá khả năng mang và nhả thuốc của PAMAM- PEG/5-FU và PAMAM-Pluronic/5-FU. Sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy tế bào để đánh giá tương hợp sinh học của các loại hydrogel và hydrogel composite tổng hợp. 2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.3.1. Tổng hợp PAMAM dendrimer đến thế hệ G5.0 từ core ethylenediamine (EDA) Quá trình tổng hợp PAMAM dendrimer thế hệ G5.0 qua 12 giai đoạn, bắt đầu từ giai đoạn tổng hợp thế hệ G -0.5 xuất phát bởi core ethylenediamine (EDA) lần lượt đến các thế hệ ké tiếp G0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5, G3.0, G3.5, G4.0, G4.5 và G5.0 (hình 2.1). Trang 7
Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer các thế hệ 2.3.2. Tổng hợp biến tính dendrimer PAMAM các thế hệ G2.0; G3.0; G4.0; và G5.0 với các PEG 4000 (PEG4K); PEG 6000 (PEG6K); PEG 10000 (PEG10K) và PEG 12000 (PEG12K). Để kết nối PEG vào phân tử dendrimer PAMAM với các nhóm NH2 trên bề mặt thông qua ba giai đoạn, cần thiết phải sử dụng pnitrophenyl chloroformate (NPC) và tyramine (TA) tạo chất trung gian. Cấu trúc của sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC, NPC-PEG-TA và của sản phẩm PAMAM-PEG được xác định qua các kết quả phân tích phổ 1H-NMR, FTIR, GPC và hình ảnh TEM. 2.3.3. Tổng hợp biến tính dendrimer PAMAM các thế hệ G2.0; G3.0; G4.0; và G5.0 với các Pluronic P123; F68; F127 và F108. Tương tự PEG và cấu trúc của sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC, NPC-Plu-TA và của sản phẩm PAMAM-Pluronic được xác định qua các kết quả phân tích phổ 1H-NMR, FTIR, GPC và hình ảnh TEM. 2.3.4. Tổng hợp chất mang nano PAMAM G4.0-F127 với các tỷ lệ mol PAMAM G4.0: F127 khác nhau 2.3.5. Nang hóa thuốc chống ung thư 5-Fluorouracil (5-FU) lên các loại dendrimer PAMAM- PEG và PAMAM-Pluronic 2.3.6. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM-PEG/5-FU, PAMAM-Pluronic/5- FU và 5-FU 2.3.7. Xác định độc tính tế bào của các chất mang nano Độc tính các hệ chất mang nano được xác định lên tế bào ung thư vú MCF-7 và nguyên bào sợi (Fibroblast). Trang 8
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. TỔNG HỢP PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN THẾ HỆ G5.0 3.1.1. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS Phổ khối lượng MS là phương pháp hiệu quả để xác định khối lượng phân tử các polymer. Hình 3.1. Phổ MS của dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G2.0 Phổ MS chứng minh sản phẩm từ G-0.5 đến G 2.0 đúng với cấu trúc sản phẩm, phù hợp với lý thuyết (Hình 3.1 và bảng 3.1). Bảng 3.1. Khối lượng phân tử các dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS Thế hệ Lý thuyết MS CTPT PAMAM MLT MMS Hiệu số sai lệch (%) G-0.5 C18H32O8N2 407 405 0,02 G0.0 C22H48O4N10 517 517 0,00 G0.5 C54H96O20N10 1212 1206 0,06 G1.0 C62H128O12N26 1430 1428 0,02 G1.5 C126H224O44N26 2823 2808 0,15 G2.0 C142H288O28N58 3256 3259 0,03 G2.5 C270H480O92N58 6045 * G3.0 C302H608O60N122 6909 * G3.5 C558H992O188N122 12489 * G4.0 C622H1248O124N250 14215 * G5.0 C1262H2528O252N506 28826 * (*: Không xác định được) Trang 9
Tuy MS là phương pháp hiệu quả để xác định khối lượng phân tử, nhưng với các dendrimer có khối lượng phân tử lớn từ G2.5 (M = 6049) trở đi thì MS không xác định được. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của nhóm Schwartz [98] và Hood [46]. Cho nên 1H-NMR có thể là phương pháp hiệu quả để theo dõi, đánh giá khối lượng phân tử và độ chuyển hóa của dendrimer và đặc biệt là các dendrimer [25, 29, 49, 58, 73, 112-113] và đặc biệt là các dendrimer ở thế hệ (G) lớn [47, 69]. 3.1.2. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR Độ dịch chuyển hóa học cho các proton đặc trưng trong dendrimer PAMAM đã được ghi nhận theo nhiều báo cáo trước [38, 88-89, 98, 102, 106, 119, 124]. Trong kết quả phổ 1H-NMR tương ứng với proton điển hình trong cấu trúc dendrimer: - CH2CH2N< (a) tại δH = 2.6 ppm; -CH2CH2CO- (b) tại δH = 2.8-2.9 ppm; - CH2CH2CONH- (c) tại δH = 2.3-2.4 ppm; -CH2CH2NH2 (d) tại δH = 2.7-2.8 ppm; - CONHCH2CH2N- (e) tại δH = 3.2-3.4 ppm; -CH2CH2COOCH3- (g) tại δH = 2.4-2.5 ppm và -COOCH3 (h) tại δH = 3,7 ppm. Dưới đây là kết quả 1H-NMR của dendrimer PAMAM các thế hệ (Hình 3.2). [74] 1 H-NMR PAMAM G-0.5: tại δH = 2.497 ppm (a), δH = 2.756-2.784 ppm (b), δH = 2.386- 2.454 ppm (g) và δH = 3.628-3.702 ppm (h). 1 H-NMR PAMAM G0.0: tại δH = 2.561-2.573 ppm (a), δH = 2.771-2.815 ppm (b), δH = 2.373-2.400 ppm (c), δH = 2.728-2.753 ppm (d) và δH = 3.246-3.336 ppm (e). 1 H-NMR PAMAM G0.5: tại δH = 2.536-2.560 ppm (a), δH = 2.730-2.783 ppm (b), δH = 2.338-2.394 ppm (c), δH = 3.255-3.312 ppm (e), δH = 2.423-2.496 ppm (g) và δH = 3.631- 3.674 ppm (h). 1 H-NMR PAMAM G1.0: tại δH = 2.588-2.601 ppm (a), δH = 2.802-2.829 ppm (b), δH = 2.375-2.402 ppm (c), δH = 2.733-2.758 ppm (d) và δH = 3.258-3.270 ppm (e). 1 H-NMR PAMAM G1.5: tại δH = 2.567-2.654 ppm (a), δH = 2.778-2.848 ppm (b), δH = 2.391-2.419 ppm (c), δH = 3.266-3.368 ppm (e), δH = 2.472-2.499 ppm (g) và δH = 3.688 ppm (h). 1 H-NMR PAMAM G2.0: tại δH = 2.582-2.608 ppm (a), δH = 2.795-2.822 ppm (b), δH = 2.368-2.394 ppm (c), δH = 2.699-2.741 ppm (d) và δH = 3.250-3.328 ppm (e). 1 H-NMR PAMAM G2.5: tại δH = 2.536-2.631 ppm (a), δH = 2.748-2.858 ppm (b), δH = 2.390-2.417 ppm (c), δH = 3.261-3.331 ppm (e), δH = 2.473-2.499 ppm (g) và δH = 3.683- 3.688 ppm (h). 1 H-NMR PAMAM G3.0: tại δH = 2.605-2.618 ppm (a), δH = 2.804-2.831 ppm (b), δH = 2.379-2.404 ppm (c), δH = 2.735-2.760 ppm (d) và δH = 3.261-3.334 ppm (e). Trang 10
1 H-NMR PAMAM G3.5: tại δH = 2.570-2.634 ppm (a), δH = 2.780-2.846 ppm (b), δH = 2.393-2.419 ppm (c), δH = 3.268-3.369 ppm (e), δH = 2.475-2.501 ppm (g) và δH = 3.631- 3.689 ppm (h). 1 H-NMR PAMAM G4.0: tại δH = 2.550 ppm (a), δH = 2.770 ppm (b), δH = 2.352 ppm (c), δH = 2.746-2.758 ppm (d) và δH = 3.225-3.259 ppm (e). 1 H-NMR PAMAM G5.0: tại δH = 2.544 ppm (a), δH = 2.849 ppm (b), δH = 2.340 ppm (c), δH = 2.761 ppm (d) và δH = 3.239-3.251 ppm (e). Trang 11
Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM thế hệ G-0.5 đến G5.0 Theo kết quả phổ 1H-NMR, các peak đặc trưng của proton tại vị trí (a) và (e) luôn xuất hiện rõ ràng và không trùng lặp với bất kỳ peak khác, nên hai peak này được chọn sử dụng để tính toán đánh giá dendrimer PAMAM theo công thức tính khối lượng phân tử dendrimer thông qua phổ 1H-NMR như sau: S (e) , S (a ) : Diện tích H(  C H 2  ) H(  C H 2  ) S (e) peak của các proton ở vị trí (e) và (a) H(  C H 2  ) xuất hiện trong phổ 1H-NMR. H H S  (a ) H(  C H 2  ) , : Tổng số  NMR .M (LT)  (e) (a ) M ( NMR ) .M (LT) (  C H2  ) (  C H2  )  LT H (e) (  C H2  ) proton ở vị trí (e) và (a) tính trong công H (a ) (  C H2 ) thức phân tử dendrimer PAMAM. MLT: Khối lượng phân tử của dendrimer PAMAM theo lý thuyết được tính dựa vào công thức phân tử. Áp dụng công thức trên, khối lượng phân tử (KLPT) các dendrimer PAMAM được tính toán dựa vào phổ 1H-NMR không khác nhiều so với KLPT tính dựa vào công thức phân tử (Bảng 3.1). Cụ thể: Tính toán KLPT dendrimer PAMAM G-0.5: sử dụng giá trị diện tích peak của các proton tại vị trí b và a trong phổ 1H-NMR (peak b và a là 8,000 và 4,000; tương ứng NMR = Trang 12
8,000/4,000=2); tổng số proton tính trong công thức phân tử dendrimer PAMAM G-0.5 (peak b và a là 8 và 4, tương ứng LT =8/4=2). MNMR được tính như sau: Bảng 3.2. Khối lượng phân tử dựa trên 1H-NMR của PAMAM G-0.5 đến G5.0 Lý thuyết 1H-NMR Thế hệ e a Hiệu số sai PAMAM  H (CH 2 )  H (CH 2 ) LT MLT NMR MNMR lệch (%) G-0.5 8 (H ở vị trí b) 4 2 407 2,00 407 0,00 G0.0 8 4 2 517 1,99 514 0,03 G0.5 8 12 0.67 1212 0,67 1212 0,00 G1.0 24 12 2 1430 1,88 1344 0,87 G1.5 24 28 0.86 2823 0,85 2800 0,23 G2.0 56 28 2 3256 1,88 3061 1,95 G2.5 56 60 0.93 6045 0,88 5720 3,25 G3.0 120 60 2 6909 1,89 6529 3,80 G3.5 120 124 0.97 12489 0,93 11974 5,15 G4.0 240 120 2 14215 1,91 13575 6,40 G5.0 504 252 2 28826 1,95 28105 7,21 Khối lượng phân tử của PAMAM được tính trên phổ 1H-NMR thường nhỏ hơn từ 0-7% so với lý thuyết. Điều này cho thấy khối lượng dendrimer PAMAM tính được từ phổ 1H- NMR có độ sai lệch không lớn nên có thể dùng để xác định KLPT dendrimer PAMAM có trọng lượng phân tử lớn hơn trong khi phương pháp đo MS không xác định được. Phân tử PAMAM các thế hệ ≤ G5.0 đã được tổng hợp thành công và có cấu trúc tương đối hoàn chỉnh và ổn định nên có thể ứng dụng trong lĩnh vực y-dược. 3.2. TỔNG HỢP PAMAM-PEG 3.2.1. Kết quả phân tích 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC, NPC-PEG- TA, PAMAM và PAMAM-PEG Các hệ chất mang PAMAM-PEG (PAMAM G2.0-PEG4K, G2.0-PEG6K, G2.0- PEG10K, G2.0-PEG12K, G3.0-PEG4K, G3.0-PEG6K, G3.0-PEG10K, G3.0-PEG12K, G4.0- PEG4K, G4.0-PEG6K, G4.0-PEG10K, G4.0-PEG12K, G5.0-PEG4K, G5.0-PEG6K, G5.0- PEG10K, G5.0-PEG12K) được tổng hợp thông qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau: Trang 13
Hình 3.3. Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-NPC (a), NPC-PEG-TA (b), PAMAM-PEG (c) Phản ứng biến tính PAMAM (G2.0, G3.0, G4.0, G5.0) với nhiều PEG độ dài mạch carbon khác nhau (PEG4K, PEG6K, PEG10K, PEG12K) có các bước phản ứng, các phổ đồ 1 H-NMR tương tự nhau, nên ở đây chúng tôi sử dụng phổ đồ của phản ứng PAMAM với PEG4K làm ví dụ, còn phổ đồ của các PEG còn lại sẽ có ở phần phụ lục 4, 5, 6. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-PEG-NPC, NPC-PEG-TA, PAMAM-PEG đo trong dung môi CDCl3. Giai đoạn 1: Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC-PEG-NPC được thể hiện qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.4 và phụ lục 4). Phổ đồ có các tín hiệu của các proton có trong PEG như sau: tín hiệu δH = 3,40-3,79 ppm là proton của nhóm methylene (-OCH2- CH2O-) trên EO và tín hiệu của proton methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate ở δH = 4,44 ppm (-CH2-O-NPC). Sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi ở δH = 7,39 ppm và δH = 8,29 ppm là hai tín hiệu đặc trưng của proton nhóm NPC (-CH=CH-). Độ hoạt hóa PEG đạt trên 90% được tính từ tỷ lệ tích phân của proton thơm (NPC) và proton methylene (PEG). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu Park [64] và Nguyen [26]. Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của NPC-PEG4K- NPC Phổ đồ 1H-NMR của các NPC-PEG-NPC khác được thể hiện ở phụ lục 4 và cũng cho kết quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của NPC-PEG4K-NPC. Trang 14
Giai đoạn 2: Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC-PEG-TA được thể hiện qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.5 và phụ lục 5). Phổ đồ có các tín hiệu của các proton có trong PEG như sau: tín hiệu δH = 3,40-3,79 ppm là proton của nhóm methylene (-OCH2- CH2O-) trên EO của PEG. Proton methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate của NPC ở δH = 4,44 ppm (-CH2-O-NPC). Ngoài ra, còn xuất hiện thêm proton methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate của TA ở δH = 4,2 ppm (-CH2-O-TA). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Park [64] và Nguyen [26]. Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của NPC-PEG4K-TA Sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi ở δH=7,40 ppm và δH=8.29 ppm là hai tín hiệu đặc trưng của proton thơm của NPC (-CH=CH-). Phổ đồ xuất hiện tín hiệu ở δH = 6,78 ppm và δH = 7,02 ppm là tín hiệu proton liên hợp vòng thơm (-CH=CH-) của nhóm tyramine. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyen [26]. Khoảng 50% gốc NPC đã được thay thế bởi TA. Kết quả này thu được từ phép tính tỷ lệ tích phân của proton trên NPC và proton của TA. Phổ đồ 1H-NMR của các NPC-PEG-TA khác được thể hiện ở Phụ lục 5 và cũng cho kết quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của NPC-PEG4K-TA. Giai đoạn 3: Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của PAMAM và PAMAM-PEG được thể hiện qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.2, hình 3.6 và phụ lục 6). Các PAMAM-PEG sau khi tổng hợp đã thẩm tách bằng màng MWCO 3 ngày. Phổ đồ có tín hiệu các proton của PAMAM trong PAMAM-PEG (hình 3.6 và phụ lục 6) như: -CH2CH2N< tại δH = 2.6 ppm; -CH2CH2CO- tại δH = 2.8 ppm; -CONHCH2CH2N- tại δH = 3.3-3.4 ppm. Các tín hiệu này giống với tín hiệu các proton của PAMAM (hình 3.2). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Xiang Wang [119], Tran [78] và Zhuojun Gu [124]. Trang 15
Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của PAMAM G4.0-PEG4K Ngoài ra, trên phổ đồ hình 3.6 và phụ lục 6, không còn thấy xuất hiện hai tín hiệu đặc trưng proton thơm của NPC (-CH=CH-) ở δH=7,40 ppm và δH=8.29 ppm; chỉ thấy có sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi tại δH = 6,78 ppm và δH = 7,02 ppm là các tín hiệu đặc trưng proton liên hợp vòng thơm (-CH=CH-) của nhóm tyramine. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyen [26]. Phổ đồ 1H-NMR của các PAMAM-PEG khác được thể hiện ở phụ lục 6 và cũng cho kết quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của PAMAM G4.0-PEG4K. Điều này cho thấy sự thành công trong tổng hợp PAMAM-PEG. Sự thành công này sẽ được khẳng định thêm qua các kết quả FTIR, GPC và TEM. 3.2.2. Kết quả phân tích FTIR của PAMAM và PAMAM-PEG Dendrimer PAMAM và PAMAM-PEG có thể được xác định rõ ràng bởi quang phổ hồng ngoại FTIR. Hình 3.7. Phổ FTIR của PAMAM G4.0 (a) và PAMAM G4.0-PEG4K(b) Trang 16
Kết quả FTIR cho thấy độ chuyển dịch hóa học tại 3287 cm-1 là dao động đặc trưng cho nhóm amine bậc 1 (-NH2) và amine bậc 2 (-NH-) của PAMAM. Đồng thời tín hiệu này cũng xuất hiện trong quang phổ hồng ngoại của PAMAM-PEG với độ chuyển dịch hóa học 3423 cm-1, tín hiệu này đã được thay đổi mạnh, điều này phần nào cho thấy số lượng nhóm –NH2 đã giảm đáng kể. Bên cạnh đó, hình 3.7.a và 3.7.b xuất hiện tín hiệu peak 2942 cm-1 (hình 3.19.a) và 2888 cm-1- dao động hóa trị của nhóm methylene (-CH2-), và nhóm amide (HNC=O) được thấy tại tín hiệu 1644 cm-1 (hình 3.7.a) và 1648 cm-1 (hình 3.7.b). Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu mới trong phổ FTIR của PAMAM G4.0-PEG4K tại độ chuyển dịch 1113 cm-1 đặc trưng cho nhóm C-O-C của PEG [7]. Kết quả FTIR và 1H-NMR cho thấy NPC-PEG-TA đã được liên hợp với dendrimer PAMAM. Phổ FTIR của PAMAM-PEG khác được thể hiện ở phụ lục 7 và cũng cho kết quả tương tự như ở phổ IR của PAMAM G4.0-PEG4K. 3.2.3. Kết quả GPC của PAMAM-PEG Sự thành công trong quá trình tổng hợp PAMAM-PEG cũng đã được khẳng định bằng phép đo GPC. Trong đó, số nhóm liên hợp và tỷ lệ liên hợp được tính toán tương đối theo các công thức sau: Tính toán trên cơ sở kết quả GPC của các sản phẩm PAMAM-PEG được thống kê trên đồ thị 3.1 về mức độ và tỷ lệ biến tính của PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 với 4 loại polymer có khối lượng phân tử khác nhau PEG 4K, PEG 6K, PEG 10K, PEG 12K. Đồ thị 3.1. Tỷ lệ liên hợp của PAMAM-PEG Trang 17
Kết quả đồ thị 3.1 đã cho thấy các dendrimer PAMAM G4.0 có khả năng liên hợp cao hơn dendrimer PAMAM G2.0, G3.0 và G5.0. Mặt khác, trong cùng một thế hệ dendrimer PAMAM thì mức độ liên hợp của các PEG với PAMAM giảm dần theo sự tăng chiều dài mạch phân tử PEG (tăng khối lượng phân tử). Ngoài ra, đối với các PEG có khối lượng phân tử khác nhau thì các PEG có khối lượng phân tử càng lớn thì cấu trúc mạch phân tử càng dài, càng cồng kềnh gây cản trở không gian do đó khả năng liên hợp với các PAMAM cũng giảm theo sự tăng chiều dài mạch carbon trong phân tử PEG. 3.2.4. Kết quả TEM của PAMAM và PAMAM-PEG Các phân tử PAMAM và PAMAM-PEG có thể được quan sát thấy rõ trong TEM. Kết quả TEM cho thấy kích thước của PAMAM G4.0 là chỉ khoảng 4,5 nm (Hình 3.8.a), trong khi kích thước của PAMAM-PEG là 70-100 nm (Hình 3.8.b và hình 3.8.c). (a) (b) (c) Hình 3.8. Hình ảnh TEM của PAMAM G4.0 (a), PAMAM G4.0-PEG4K (b) và PAMAM G4.0-PEG6K (c) 3.3. TỔNG HỢP PAMAM-PLURONIC Trong tổng hợp PAMAM-Pluronic các thành phần cấu trúc của sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC, NPC-Plu-TA, PAMAM và PAMAM-Pluronic được xác định qua các kết quả phân tích phổ 1H-NMR, FTIR, GPC và TEM. 3.3.1. Qui trình tổng hợp các sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC, NPC-Plu-TA, PAMAM và sản phẩm PAMAM-Pluronic Qui trình tổng hợp PAMAM-Pluronic được thực hiện theo 3 giai đoạn (tương tự như qui trình tổng hợp PAMAM-PEG): Hình 3.9. Sơ đồ tổng hợp NPC-Plu-NPC (a), NPC-Plu-TA (b) và PAMAM-Pluronic (c) Trang 18
Phổ 1H-NMR NPC-Plu-NPC, NPC-Plu-TA, PAMAM và PAMAM-Plu đo trong dung môi CDCl3. Kết quả phân tích 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC, NPC-Plu- TA, PAMAM và PAMAM-Pluronic (giống tại các sản phẩm PAMAM-PEG trên) cho thấy sản phẩm đã được tổng hợp và có cấu trúc như dự đoán. Kết quả này sẽ được khẳng định thêm qua các kết quả FTIR, GPC và TEM. 3.3.2. Tính toán và xác định độ chuyển hóa của các quá trình biến tính gắn các mạch Pluronic lên PAMAM Kết quả biến tính của các dendrimer PAMAM-Pluronic cũng cho kết quả tương tự như PAMAM-PEG. Thống kê kết quả GPC để đánh giá về mức độ và tỷ lệ biến tính của PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 với 4 loại Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau Pluronic P123, Pluronic F68, Pluronic F127 và Pluronic F108 được thể hiện trên đồ thị 3.2 Kết quả đồ thị 3.2 đã cho thấy các dendrimer PAMAM G4.0 có khả năng liên hợp cao hơn dendrimer PAMAM G2.0, G3.0 và G5.0. Mặt khác, trong cùng một thế hệ dendrimer PAMAM thì mức độ liên hợp của các Pluronic với PAMAM giảm dần theo sự tăng chiều dài mạch phân tử Pluronic (tăng khối lượng phân tử). Đối với các Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau thì các Pluronic có khối lượng phân tử càng lớn thì cấu trúc mạch phân tử càng dài, càng cồng kềnh gây cản trở không gian do đó khả năng liên hợp với các PAMAM cũng giảm theo sự tăng chiều dài mạch carbon trong phân tử Pluronic. Đồ thị 3.2. Tỷ lệ liên hợp của PAMAM-Pluronic 3.3.3. Kết quả TEM của PAMAM và PAMAM-Pluronic Kết quả TEM cho thấy kích thước của PAMAM G4.0 là chỉ khoảng 4,5 nm (Hình 3.8.a), Pluronic F127 15 nm (hình 3.10.a). Trong khi đó, kích thước của PAMAM-Pluronic là tăng đáng kể từ 60-150 nm (hình 3.10.b, hình 3.10.c, hình 3.10.d và hình 3.10.e), cụ thể: PAMAM-P123 có kích thước phân tử từ 60-100 nm, PAMAM-F68 90-130 nm, PAMAM- Trang 19
F127 100-150 nm và PAMAM-F108 120-180 nm. Kích thước này cũng rất phù hợp cho việc mang thuốc, đặc biệt mang thuốc chống ung thư. (a) (b) (c) (d) (e) Hình 3.10. Hình ảnh TEM của Pluronic F127 (a), PAMAM G4.0-P123 (b), PAMAM G4.0-F68 (c), PAMAM G4.0-F127 (d) và PAMAM G4.0-F108 (e) 3.4. TỔNG HỢP CHẤT MANG NANO PAMAM G4-F127 VỚI CÁC TỶ LỆ MOL KHÁC NHAU Quá trình biến tính PAMAM G4.0 bằng Pluronic F127 cũng được khảo sát với các tỷ lệ mol khác nhau (tỷ lệ mol PAMAM : Pluronic F127 = 1:8 ; 1:16; 1:32; 1:64). Kết quả cho thấy khả năng liên hợp của PAMAM G4.0 và Pluronic F127 tăng tương ứng với việc tăng tỷ lệ mol phản ứng: 25% (với tỷ lệ 1:8) < 31,25% (với tỷ lệ 1:16) < 34,38% (với tỷ lệ 1:32) < 42,19% (với tỷ lệ 1:64). 3.5. KHẢ NĂNG MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ 5-FLUOROURACIL CỦA CÁC CHẤT MANG NANO PAMAM BIẾN TÍNH 3.5.1. Phương pháp tính toán, xác định khả năng mang thuốc của PAMAM biến tính Để đánh giá hiệu quả mang thuốc, dựa vào kết quả HPLC nhằm xác định gián tiếp lượng thuốc 5-FU được mang trong các chất mang nano (PAMAM, PAMAM-PEG, PAMAM-Pluronic). Lượng 5-FU tự do, không được mang trong vật liệu chất mang nano được tính toán trực tiếp dựa trên phương trình đường chuẩn Y = 33,101x + 27,857 (R2 = 0,9993) được xây dựng với 5 nồng độ khác nhau, từ 20-100µg.mL-1 (phụ lục 1). Tỷ lệ hàm lượng 5-FU nang hóa trong các chất mang (EE% và DL%) được xác định gián tiếp thông qua kết quả đo HPLC và công thức sau, trong đó Wtotal 5-FU là lượng thuốc 5- FU ban đầu và lượng 5-FU không được tải trong chất mang là Wfree-5-FU [9, 68]. Trang 20