Tóm tắt luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu cải thiện khả năng mang thuốc chống ung thư cisplatin của chất mang nano dendrimer

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài "Nghiên cứu cải thiện khả năng mang thuốc chống ung thư cisplatin của chất mang nano dendrimer" là tổng hợp hệ vật liệu nano mang thuốc trên nền dendrimer (PAMAM) biến tính với PNIPAM và PAA tương hợp sinh học nhằm cải thiện hiệu quả mang thuốc Cisplatin.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu cải thiện khả năng mang thuốc chống ung thư cisplatin của chất mang nano dendrimer

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN NGỌC HÒA NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ CISPLATIN CỦA CHẤT MANG NANO DENDRIMER Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử và tổ hợp Mã số: 9 44 01 25 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU TP. HỒ CHÍ MINH – 2020
Công trình được hoàn thành tại: Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: GS. TS. Nguyễn Cửu Khoa Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. Trần Ngọc Quyển Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam 1
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Dendrimer lần đầu tiên được tổng hợp từ năm 1970-1990 bởi hai nhóm khác nhau (Buhleier và cộng sự; Tomalia và cộng sự). Các dendrimer được kiểm soát rất chặt chẽ về cấu trúc và có các nhóm chức bề mặt có thể biến tính rất dễ dàng tùy thuộc vào mục đích sử dụng. Các dendrimer được thiết kế để vận chuyển thuốc nhằm gia tăng dược động học và phân phối sinh học của thuốc cũng như tăng cường khả năng hướng đích của thuốc. Dendrimer tương tác với các phân tử thuốc bằng cách hấp phụ trên bề mặt, bằng các tương tác tĩnh điện hoặc liên kết với các nhóm chức bề mặt bằng liên kết hóa trị hoặc bằng cách bao gói thuốc vào các khoang trống của dendrimer. Các khoang trống bên trong thường có tính chất kỵ nước, cho phép tương tác với các loại thuốc hòa tan kém. Với số lượng lớn các nhóm chức trên bề mặt của dendrimer (như amine -NH2 và nhóm carboxylate -COO-) cho phép gắn lượng lớn các loại thuốc khác nhau bằng tương tác tĩnh điện và vận chuyển chúng đến đích. Cisplatin từ lâu được dùng trong điều trị lâm sàng các loại bệnh ung thư do khả năng gây chết tế bào ung thư của thuốc. Tùy thuộc vào loại tế bào và nồng độ Cisplatin sẽ gây độc tế bào. Ngoài ra, Cisplatin làm tổn thương các khối u thông qua việc tác động lên hiệu ứng gây chết tế bào apoptosis theo các phương thức khác nhau. Mặt khác, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Cisplatin gây ra nhiều tác dụng phụ như thần kinh, độc tính với thận hoặc ức chế tủy xương. Hơn nữa, Cisplatin liên kết với protein và enzyme có thể gây ra việc điều chỉnh cơ chế sinh hóa của chúng. Quá trình điều trị ung thư bằng Cisplatin cũng dẫn tới các tế bào ung thư có thể trở nên kháng Cisplatin và làm giảm khả năng điều trị của thuốc. Nhiều cơ chế kháng Cisplatin đã được nghiên cứu bao gồm những thay đổi trong sự hấp thụ tế bào, tràn dịch thuốc, tăng giải độc, ức chế quá trình chết tế bào apoptosis và tăng sửa chữa DNA. Để giảm thiểu việc kháng thuốc Cisplatin cũng như giảm độ gây độc tế bào của Cisplatin nhiều giải pháp đã được nghiên cứu và đã chứng minh tính hiệu quả trong điều trị bệnh ung thư. Một trong các giải pháp đó là việc sử dụng các PAMAM dendrimer làm chất mang thuốc Cisplatin. Kế thừa và phát triển các nội dung mà nhóm nghiên cứu tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đã và đang thực hiện, trong nội dung nghiên cứu của luận án này, chúng tôi sẽ tiếp tục cải thiện khả năng mang thuốc Cisplatin của PAMAM dendrimer trên cơ sở tăng cường nhóm chức bề mặt của dendrimer nhằm tăng khả năng mang thuốc Cisplatin của hệ chất mang này. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Tổng hợp hệ vật liệu nano mang thuốc trên nền dendrimer (PAMAM) biến tính với PNIPAM và PAA tương hợp sinh học nhằm cải thiện hiệu quả mang thuốc Cisplatin. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Điều chế các dẫn xuất của PAMAM dendrimer: (PAMAM dendrimer - Poly(N-isopropylacrylamide), PAMAM dendrimer - Poly acrylic acid). - Đánh giá cấu trúc và độ chuyển hóa. - Đánh giá khả năng mang thuốc Cisplatin của các hệ chất mang PAMAM dendrimer và các hệ chất mang PAMAM dendrimer đã được tạo dẫn xuất bao gồm PAMAM dendrimer - Poly(N-isopropylacrylamide), PAMAM dendrimer - Poly acrylic acid. - Phân tích cấu trúc của phức chất giữa hệ chất mang - Cisplatin và đánh giá hiệu suất mang thuốc Cisplatin của hệ chất mang - Thử độc tính tế bào của PAMAM dendrimer và một số dẫn xuất của PAMAM dendrimer. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu dendrimer 1.1.1. Khái niệm và phân loại Khái niệm dendrimer được Donald A. Tomalia và cộng sự đưa ra đầu tiên vào năm 1985. Dendrimer được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa là nhánh cây. Từ đó đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc, tính chất, phương pháp tổng hợp và ứng dụng của dendrimer trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Dendrimer là một nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có nhiều tính chất ưu việt hơn so với polymer mạch thẳng. Cấu tạo phân tử dendrimer gồm ba phần (hình 1.1) Hình 1.1. Cấu tạo phân tử Dendrimer - Một lõi (nhân hoặc core) ở trung tâm của dendrimer bao gồm (i) một nguyên tử hoặc một phân tử có ít nhất hai nhóm chức giống nhau; (ii) nhánh, phát ra từ lõi, được lặp đi lặp lại và có nhiệm vụ liên kết nhóm ngoài cùng với nhân; và (iii) nhiều nhóm bên ngoài (nhóm anion, cation, nhóm trung tính, các nhóm ưa nước hay kỵ nước) còn gọi là nhóm bề mặt hoạt động. Dendrimer, đặc biệt là PAMAM dendrimer với cấu trúc không gian có nhiều khoảng trống bên trong và các nhóm chức hoạt động amine, ester nằm phía bên ngoài là nền tảng cho việc hình thành các hệ chất mang thuốc chống ung thư đa chức năng hướng đích đến tế bào ung thư theo cơ chế hướng đích thụ động và hướng đích chủ động. 1.1.2. Tính tương hợp sinh học của dendrimer Các dendrimer đã được xem như là chất mang thông minh do chúng có khả năng mang thuốc vào nội bào, vượt qua các rào cản sinh học, lưu thông trong cơ thể trong thời gian cần thiết để gây ra một hiệu ứng lâm sàng và nhắm tới các mục tiêu cụ thể. Độc tính của dendrimer chủ yếu gây ra bởi nhóm bề mặt của nó. Nhóm amine (-NH2) bề mặt của PAMAM và PPI dendrimer gây độc tính và chứng huyết tan (hemolysis) tùy theo nồng độ của chúng trong khi nhóm ngoài cùng là các nhóm trung tính hoặc anion có độc tính thấp hơn hoặc không độc. Để tăng tính tương hợp sinh học và khả năng hướng đích cũng như giảm độc tính của dendrimer PAMAM với tế bào nhưng vẫn giữ được những đặc tính nổi bật của PAMAM dendrimer với vai trò chất mang, một trong những giải pháp được đưa ra là tiến hành biến tính bề mặt PAMAM dendrimer bằng cách tạo liên kết với các cấu tử khác không có khả năng tích điện nhằm gia tăng tính tương hợp sinh học và hướng đích của hệ chất mang PAMAM dendrimer. 1.2. Thuốc chống ung thư chứa Cisplatin 1.2.1. Tính chất của Cisplatin 3
Cisplatin, còn được gọi là cis-diamminedichloroplatinum (II), là phức chất có cấu trúc tứ diện với ion trung tâm là Pt. Cisplatin được M. Peyrone tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1844 và cấu trúc hóa học của nó được Alfred Werner chứng minh vào năm 1893. Tuy nhiên, cho đến những năm 1960 giới khoa học mới bắt đầu quan tâm đến việc sử dụng hợp chất này trong việc điều trị ung thư sau. Cisplatin đã được chú ý đặc biệt vì nó cho thấy hoạt tính chống ung thư ở nhiều khối u bao gồm ung thư buồng trứng, tinh hoàn và khối u rắn ở đầu và cổ. Các đặc tính gây độc tế bào của Cisplatin cũng đã được biết đến vào những năm 1960 và đến cuối những năm 1970 nó đã được xem như một thành phần quan trọng trong việc điều trị hệ thống các tế bào mầm ung thư. Đây là hợp chất của Pt (II) đầu tiên được FDA chấp thuận trong điều trị ung thư vào năm 1978. Điều này đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học đến các hợp chất của Pt (II) và các kim loại khác như là những thuốc chống ung thư tiềm năng. Tuy nhiên, do tính kháng thuốc và các phản ứng phụ đáng kể của Cisplatin, phác đồ điều trị kết hợp Cisplatin với các loại thuốc ung thư khác đã được áp dụng và được xem như là phương pháp điều trị mới cho nhiều loại bệnh ung thư ở người. CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu Các hóa chất được cung cấp từ các hãng Acros, Sigma Aldrich, Merck với chất lượng cao và phù hợp mục đích sử dụng cho tổng hợp hóa học và phân tích. Thiết bị được sử dụng bao gồm: Tủ sấy, bể siêu âm, máy khuấy từ gia nhiệt, tủ sấy chân không, Máy cô quay chân không Eyala, bể gia nhiệt memmert, máy đông khô chân không tại TT Công nghệ Việt Đức, trường ĐH Công nghiệp Thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh. Quan sát hình thái, kích thước mẫu (TEM) được chụp bằng máy JEOL JEM 1400 ở 140 KV, Nhật Bản. Phân tích quang phổ hồng ngoại FTIR trên máy Equinox 55 Bruker. HPLC đo bằng máy Agilent 1260, Hoa Kỳ. Phổ 1H-NMR đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500. Hàm lượng Pt được đo trên máy ICP-MS-7700x/Agilent (VILAS). Đánh giá độc tế bào đo tại PTN-SHPT- BM Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Phương pháp thực nghiệm 2.2.1. Tổng hợp PAMAM dendrimer đến thế hệ G4.5 từ tâm ethylenediamine (EDA) Quá trình tổng hợp PAMAM dendrimer thế hệ G4.5 qua 11 giai đoạn (hình 2.1), bắt đầu giai đoạn tổng hợp thế hệ G-0.5 từ ethylenediamine (EDA) phản ứng với methyl acrylate (MA) và thực hiện lần lượt đến các thế hệ kế tiếp G0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5, G3.0, G3.5, G4.0 và G4.5. Cấu trúc và khối lượng phân tử các sản phẩm tạo thành được xác định bằng phổ 1H-NMR. 2.2.2. Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với Cisplatin Cisplatin hòa tan trong H2O và khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng trong môi trường khí N2. PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 được điều chỉnh đến pH 7-8 bằng HCl. Nhỏ từ từ dung dịch PAMAM dendrimer vào dung dịch Cisplatin, khuấy liên tục 24 giờ và đánh siêu âm 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong môi trường khí N2. Sản phẩm được lọc bằng túi thẩm tách và đông khô để thu được dạng bột. 2.2.3. Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5 với Cisplatin PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 được thủy phân bằng NaOH để tạo ra các nhóm chức bề mặt - - COO và thực hiện phản ứng tạo phức được thực hiện như mục 2.2.2. 2.2.4. Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5 với Cisplatin đã được thủy phân 4
Cisplatin được thủy phân trước bằng AgNO3 để chuyển về dạng monoaqua [cis-(NH2)2PtCl(H2O)] và diaqua [cis-(NH2)2Pt(H2O)2] và khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng trong môi trường khí N2. PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 được thủy phân bằng NaOH và cho từ từ vào dung dịch Cisplatin đã thủy phân, khuấy liên tục 24 giờ và đánh siêu âm 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong môi trường khí N2. Sản phẩm được lọc bằng túi thẩm tách và đông khô để thu được dạng bột. Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer 2.2.5. Biến tính PAMAM dendrimer G 3.0 với Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) PNIPAM với nhóm chức đầu cuối -COOH được kích hoạt bằng pnitrophenyl chloroformate (NPC) và N-Hydroxysuccinimide (NHS) sau đó cho phản ứng với các nhóm -NH2 trên bề mặt của PAMAM dendrimer G 3.0, khuấy liên tục trong 24 giờ. Sản phẩm được lọc bằng túi thẩm tách và đông khô để thu được dạng bột. Đánh giá cấu trúc và độ chuyển hóa bằng phổ 1H-NMR. 2.2.6. Tổng hợp PAMAM dendrimer G 3.5-PNIPAM Sản phẩm PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM còn các nhóm -NH2 chưa phản ứng sẽ được cho phản ứng với methyl acrylate trong môi trường khí N2 trong 96h để tạo ra PAMAM dendrimer G 3.5-PNIPAM. Đánh giá cấu trúc và độ chuyển hóa bằng phổ 1H-NMR. 2.2.7. Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM với Cisplatin Thực hiện phản ứng tạo phức giữa PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM với Cisplatin tương tự như mục 2.2.4. 2.2.8. Biến tính PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với poly (acrylic acid) (PAA) PAA được kích hoạt bằng 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) sau đó đem phản ứng với các nhóm chức bề mặt -NH2 của PAMAM dendrimer G3.0, G4.0. Sản phẩm được lọc bằng túi thẩm tách và đông khô để thu được dạng bột. Đánh giá cấu trúc và độ chuyển hóa bằng phổ 1H-NMR. 2.2.9. Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.0-PAA với Cisplatin Thực hiện phản ứng tạo phức giữa PAMAM dendrimer G3.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.0-PAA với Cisplatin tương tự như mục 2.2.4. 2.2.10. Bước đầu thử nghiệm khả năng nang hóa và giải phóng thuốc 5-FU của phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin 5
5-FU được hòa tan trong nước khử ion (DI) sau đó được cho từ từ vào dung dịch chứa PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin. Đánh siêu âm trong 1h và khuấy đều dung dịch trong 24h ở nhiệt độ phòng. Sản phẩm được lọc bằng túi thẩm tách và đông khô để thu được dạng bột. Sử dụng phương pháp HPLC để đánh giá khả năng nang hóa và giải phóng thuốc 5-FU của hệ chất mang. 2.2.11. Xác định hàm lượng Cisplatin trong các sản phẩm bằng ICP-MS Phép đo ICP được thực hiện trên hệ thống ICP-MS-7700x/Agilent. Hàm lượng Pt được xác định dựa trên khối phổ Pt 195, nội chuẩn Luterium khối phổ 175. 2.2.12. Khảo sát giải phóng thuốc in vitro Tiến hành khảo sát khả năng giải phóng thuốc ra khỏi các hệ chất mang theo thời gian tại môi trường đệm pH 7,4 và pH 5,5. 2.2.13. Động học và dược động học giải phóng thuốc Chọn lựa mô hình động học giải phóng thuốc Cisplatin dựa trên các mô hình động học phổ biến như mô hình bậc 0, bậc 1, Higuchi, Kormeyer-Peppas, Hixson-Crowell. Mô hình động học phù hợp nhất với sự giải phóng thuốc được chọn lựa dựa theo tiêu chuẩn AIC (tiêu chuẩn thông tin Akaike) và R2hc (R2 hiệu chỉnh) được tính toán bằng phần mềm R. Dự đoán mô hình dược động học và tính toán các thông số dược động học của hệ chất mang Cisplatin. 2.2.14. Kiểm tra độc tính tế bào in vitro Sử dụng phương pháp nhuộm SRB để đánh giá độc tính tế bào trên các dòng tế bào ung thư phổi NCI- H460 và dòng tế bào ung thư vú MCF-7. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tổng hợp PAMAM Dendrimer các thế hệ G-0.5 đến G4.5 Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR Độ dịch chuyển hóa học cho các proton đặc trưng trong dendrimer PAMAM đã được ghi nhận theo nhiều báo cáo trước. Trong kết quả phổ 1H -NMR tương ứng với proton điển hình trong cấu trúc dendrimer: - CH2CH2N< (a) tại δH = 2,60 ppm; -CH2CH2CO- (b) tại δH = 2,80-2,90 ppm; -CH2CH2CONH- (c) tại δH = 2,30 - 2,40 ppm; -CH2CH2NH2 (d) tại δH = 2,70 -2,80 ppm; -CONHCH2CH2N- (e) tại δH = 3,20 - 3,40 ppm; -CH2CH2COOCH3- (g) tại δH = 2,40 - 2,50 ppm và -COOCH3 (h) tại δH = 3,70 ppm. Kết quả 1H-NMR của dendrimer PAMAM các thế hệ như sau: 1 H-NMR PAMAM G-0.5: tại δH = 2,47 - 2,50 ppm (a), δH = 2,77-2,80 ppm (b), δH = 2,54 ppm (g) và δH = 3,68 ppm (h). 1 H -NMR PAMAM G0.0: tại δH = 2,56 - 2,57 ppm (a), δH = 2,77 - 2,82 ppm (b), δH = 2,37 - 2,40 ppm (c), δH = 2,71 -2,75 ppm (d) và δH = 3,25 - 3,27 ppm (e). 1 H -NMR PAMAM G0.5: tại δH = 2,54 -2,57 ppm (a), δH = 2,76 - 2,82 ppm (b), δH = 2,37 - 2,40 ppm (c), δH = 3,24 - 3,26 ppm (e), δH = 2,45 - 2,48 ppm (g) và δH = 3,66 ppm (h). 1 H -NMR PAMAM G1.0: tại δH = 2,59 - 2,60 ppm (a), δH = 2,80 -2,82 ppm (b), δH = 2,38 - 2,40 ppm (c), δH = 2,73 - 2,76 ppm (d) và δH = 3,26 - 3,28 ppm (e). 1 H -NMR PAMAM G1.5: tại δH = 2,58 - 2,59 ppm (a), δH = 2,78 - 2,86 ppm (b), δH = 2,39 - 2,42 ppm (c), δH = 3,27 - 3,29 ppm (e), δH = 2,47 -2,50 ppm (g) và δH = 3,69 ppm (h). 1 H -NMR PAMAM G2.0: tại δH = 2,57 - 2,59 ppm (a), δH = 2,77 -2,81 ppm (b), δH = 2,36 -2,38 ppm (c), δH = 2,68 -2,74 ppm (d) và δH = 3,24 - 3,27 ppm (e). 6
1 H -NMR PAMAM G2.5: tại δH = 2,57 - 2,64 ppm (a), δH = 2,84 - 2,86 ppm (b), δH = 2,40 -2,42 ppm (c), δH = 3,27 -3,30 ppm (e), δH = 2,48 - 2,46 ppm (g) và δH = 3,68 - 3,69 ppm (h). 1 H -NMR PAMAM G3.0: tại δH = 2,61 - 2,62 ppm (a), δH = 2,80 -2,83 ppm (b), δH = 2,38 - 2,40 ppm (c), δH = 2,74 - 2,76 ppm (d) và δH = 3,26 -3,29 ppm (e). 1 H -NMR PAMAM G3.5: tại δH = 2,57 -2,64 ppm (a), δH = 2,84-2,85 ppm (b), δH = 2,38 -2,43 ppm (c), δH = 3,27 -3,37 ppm (e), δH = 2,48 -2,51 ppm (g) và δH = 3,69 ppm (h). 1 H -NMR PAMAM G4.0: tại δH = 2,59 -2,62 ppm (a), δH = 2,80 -2,83 ppm (b), δH = 2,39 – 2,40 ppm (c), δH = 2,74 – 2,76 ppm (d) và δH = 3,26 -3,28 ppm (e). 1 H -NMR PAMAM G4.5: tại δH = 2,57 - 2.65 ppm (a), δH = 2,84 – 2,85 ppm (b), δH = 2,39 – 2,42 ppm (c), δH = 3,27 - 3.31 ppm (e), δH = 2,47 - 2.50 ppm (g) và δH = 3,69 ppm (h) Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của PAMAM Dendrimer các thế hệ So sánh tỷ lệ proton ở 2 vị trí (a), (e) trên phân tử dendrimer χLT) và tỉ lệ diện tích peak các proton ở 2 vị trí (a), (e) thể hiện trên phổ 1H-MNR (χNMR) chúng tôi lập được công thức tính khối lượng phân tử dendrimer thông qua phổ 1H-NMR như sau: 7
Trong đó: (e) (a) (e) SH(-CH2 -) , SH(-CH2 -) : Diện tích peak của các SH(-CH2 -) proton ở vị trí (e) và (a) xuất hiện trong phổ 1H- (a) χNMR SH(-CH2 -) NMR. M(NMR) = .MLT = (e) .MLT (e) (a) ∑ H(-CH2 -) , ∑ H(-CH2 -) : Tổng số proton ở vị trí (e) χLT ∑ H(-CH2 -) (a) và (a) tính trong công thức phân tử của PAMAM ∑ H(-CH2 -) Dendrimer. MLT : Khối lượng phân tử của Dendrimer tính theo lý thuyết. Kết quả tính toán như sau: Bảng 3.1. Kết quả tính toán KLPT Dendrimer theo 1H-NMR (e) (a) H(-CH2-) H(-CH2-) χLT M(LT) χNMR M(NMR) Sai lệch G-0.5 8 (vị trí b) 4 2 404 2,01 405,62 0,40% G0 8 4 2,00 517 1,99 515,02 0,32% G0.5 8 12 0,67 1205 0,67 1205,42 0,06% G1.0 24 12 2,00 1430 1,95 1396,18 2,36% G1.5 24 28 0,86 2808 0,81 2668,19 4,96% G2.0 56 28 2,00 3257 1,95 3181,78 2,30% G2.5 56 60 0,93 6012 0,90 5774,30 3,95% G3.0 120 60 2,00 6910 1,90 6556,70 5,11% G3.5 120 124 0,97 12420 0,92 11809,71 4,91% G4.0 248 124 2,00 14216 1,90 13510,97 4,96% G4.5 248 252 0,98 25237 0,90 23103,55 8,45% Các phân tử PAMAM dendrimer các thế hệ từ G-0.5 đến G4.5 đã được tổng hợp thành công và có cấu trúc tương đối đồng đều và ổn định nên có thể ứng dụng làm các chất mang thuốc. 3.2. Phổ FTIR các sản phẩm phức của PAMAM dendrimer với Cisplatin 3.2.1. Phổ FTIR PAMAM Dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 và phức G2.5-CisPt, G3.5-CisPt, G4.5- CisPt Phổ FTIR của PAMAM G2.5, G3.5 có một tín hiệu hấp thu có cường độ mạnh và một tín hiệu có cường độ trung bình yếu tại các vị trí 1731 cm-1, 1045 cm-1 (G2.5); 1736 cm-1, 1646 cm-1 (G3.5) tương ứng với νC=O, νC-O của nhóm chức ester. Một tín hiệu hấp thu có cường độ mạnh, mũi bầu rộng đặc trưng cho dao động của nối –OH tại 3294 cm-1 (G2.5); 3302 cm-1 (G3.5); 3426 cm-1 (G4.5), tín hiệu hấp thu của amide cũng nằm trong vùng này và bị tín hiệu của nối –OH che khuất. Tín hiệu đặc trưng cho dao động bất đối xứng của nhóm –CH2, CH3, tín hiệu đặc trưng cho dao động của nối –CH3 tại 2952 cm-1, 2832 cm-1 (G2.5); 2952 cm-1, 2830 cm-1 (G3.5), và tín hiệu dao động biến dạng ngoài mặt phẳng của nhóm CH3 tại 1360 cm-1 (G2.5), 1359 cm-1 (G3.5), 1399 cm-1 (G4.5). Các mũi với các tín hiệu dao động đặc trưng phù hợp với các nhóm có trong công thức của sản phẩm PAMAM dendrimer G2.5, 3.5, 4.5. So với PAMAM G2.5, 3.5, 4.5 phổ FTIR của các phức tương ứng PAMAM G2.5-Cisplatin, G3.5- Cisplatin, G4.5-Cisplatin cũng có các tín hiệu hấp thu tương tự. Tuy nhiên, cường độ của các tín hiệu hấp thu này có sự thay đổi khá rõ. Do trong quá trình tạo phức, phần lớn các nhóm ester ngoài cùng của PAMAM được chuyển thành COO- nên dao động νC=O, νC-O của nhóm ester có cường độ giảm xuống. Đồng thời, do dao dộng hóa trị bất đối xứng, đối xứng của nhóm COO- chồng lên tín hiệu amide I, amide II và δC-H của nhóm CH3 nên 8
cường độ của tín hiệu hấp thu tăng lên liên quan đến dao động kéo căng của N-H của Cisplatin. Kết quả này cho thấy có sự hình thành liên kết phối trí giữa ion Pt2+ với nhóm carboxylate -COO- của PAMAM dendrimer. Hình 3.2. Phổ FTIR của PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 và phức G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin, G4.5-Cisplatin 3.2.2. Phổ FTIR của phức PAMAM Dendrimer G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin Phổ FTIR của PAMAM dendrimer G3.0 và G3.0-Cisplatin; G4.0 và G4.0-Cisplatin cho thấy có sự dịch chuyển của peak do dao động biến dạng -NH của tại 1643 cm-1 thành 1639 cm-1 (G3.0, G3.0-Cisplatin); 1643 cm-1 thành 1642 cm-1 (G4.0, G4.0-Cisplatin). Điều này cho thấy có sự hình thành phức chất trên cơ sở liên kết phối trí giữa cation Pt2+ và các nhóm NH2 trên bề mặt của PAMAM dendrimer G3.0. Ngoài ra, phổ FTIR còn cho thấy sự suy giảm cường độ và dịch chuyển các peak của các dao động kéo căng đối xứng và bất đối xứng của nhóm -CH2 tại 2944 cm-1 và 2839 cm-1 của PAMAM dendrimer G3.0 thành 2944 cm-1 và 2899 cm-1 của phức G3.0-Cisplatin); tại 2944 cm-1 và 2839 cm-1 của PAMAM G4.0 thành 2975 cm-1 và 2884 cm-1 của phức G4.0-Cisplatin, peak hấp thu dạng mũi nhọn tại 3437 cm-1 (G3.0-Cisplatin) và 3427 cm-1 (G4.0- Cisplatin) liên quan đến dao động kéo căng của N-H của Cisplatin. 9
3.3. Phổ FTIR của phức G3.0-PAA với Cisplatin Hình 3.3. Phổ FTIR của PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 và phức G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin Phổ FTIR cho thấy sự dịch chuyển nhẹ các peak do dao động kéo căng bất đối xứng -COO chồng lên peak amide -NH của G3.0-PAA tại 1644 cm-1 và 1571 thành 1642 cm-1 và 1565 cm-1 đối với G3.0-PAA- Cisplatin. Các peak có cường độ thấp do dao động kéo và dao động uốn của -CH2 và CH-CO của G3.0-PAA tại 1454 cm-1 và 1409 cm-1 dịch chuyển tới 1453 cm-1 và 1406 cm-1 đối với G3.0-PAA-Cisplatin. Peak hấp thu mũi nhọn tại 3435 cm-1 liên quan đến dao động kéo căng của N-H của Cisplatin Kết quả phổ cho thấy có sự tương tác giữa cation Pt2+ với nhóm chức bề mặt -COO- của G3.0-PAA. 10
3.4. Phổ FTIR của phức G4.0-PAA-Cisplatin Hình 3.4. Phổ FTIR của G3.0-PAA và phức G3.0-PAA-Cisplatin Hình 3.5. Phổ FTIR của G4.0-PAA và phức G4.0-PAA-Cisplatin Phổ FTIR cho thấy sự dịch chuyển nhẹ các peak do dao động kéo căng bất đối xứng -COO chồng lên peak amide -NH của G4.0-PAA tại 1572 cm-1 thành 1564 cm-1 và 1635 cm-1 đối với G4.0-PAA-Cisplatin. Các peak có cường độ thấp do dao động kéo và dao động uốn của -CH2 và CH-CO của G4.0-PAA tại 1454 cm-1 và 1407 cm-1 thành 1447 cm-1 và 1400 cm-1 đối với G4.0-PAA-Cisplatin. Peak 3619 cm-1 liên quan đến dao động nối -O-H của nhóm -COOH của G4.0-PAA. Kết quả phổ cho thấy có sự tương tác giữa cation Pt2+ với nhóm chức bề mặt -COO- của G4.0-PAA. 3.5. Kết quả phổ 1H-NMR PAMAM G3.0 và G 3.5 biến tính với PNIPAM Quan sát phổ 1H-NMR của G3-PNIPAM (tỉ lệ mol 1:8) ta thấy ngoài các peak đặc trưng của PAMAM G3.0 thì còn có các peak đặc trưng của PNIPAM-COOH như là peak của nhóm –CH3 (f) ở vị trí từ 1,10-1,26 ppm, -(CH3)2CHNH- (l) ở vị trí 3,97 ppm. Ngoài ra diện tích peak của nhóm –CH2CH2CONH (c) cũng tăng từ 2,0 lên 2,68 ppm cho ta thấy có sự hình thành liên kết CO-NH của PAMAM G3.0 với nhóm –COOH của PNIPAM-COOH. Kết quả trên cho ta thấy việc tổng hợp chất mang nano nhạy nhiệt dendrimer đã thành công. 11
Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của chất mang nano G3.0-PNIPAM (tỉ lệ mol 1:8) Từ phổ 1H-NMR của G3-PNIPAM ta có thể tính được hiệu suất và số nhóm PNIPAM-COOH gắn lên PAMAM G3.0 bằng công thức: Trong đó: (a) (f) (f) SH(-CH2 -) , SH(-CH3 ) : Diện tích peak của peak (a) và peak (f) xuất hiện SH(-CH3 ) (a) trong phổ 1H-NMR SH(-CH2 -) (a) (f) %X = .100% ∑ H(-CH2 -), ∑ H(-CH3 ) : Tổng số proton tại vị trí peak (a) và (f) trong phân (f) ∑ H(-CH3 ) tử dẫn xuất của dendrimer tính theo lý thuyết. (a) ∑ H(-CH2 -) %X : Mức độ phản ứng amide hóa Theo công thức ta tính được %X là 15,12 % và số nhóm PNIPAM-COOH gắn lên PAMAM G3.0 là 4,84 nhóm (hiệu suất 96,8 %). Tính toán tương tự dựa trên các phổ 1H-NMR với các tỉ lệ mol G3.0: PNIPAM = 1:5 và 1:10, ta được kết quả ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Số nhóm PNIPAM gắn vào G3.0 và ước lượng KLPT Mẫu Số nhóm PNIPAM KLPT tính theo Nhiệt độ 1 H-NMR chuyển pha G3.0-PNIPAM (1:5) 3,34 30.605 37,5 oC G3.0-PNIPAM (1:8) 4,84 40.776 34 oC G3.0-PNIPAM (1:10) 7,00 55.880 33 oC Kết quả phân tích GPC đối với mẫu G3.0-PNIPAM (1:8) cho thấy KLPT của sản phẩm là 39.600 gần giống với kết quả tính toán dựa trên phổ 1H-NMR.Kết quả phổ 1H-NMR của của chất mang nano nhạy nhiệt G3.5-PNIPAM cho thấy ngoài các peak đặc trưng của PNIPAM-COOH, còn xuất hiện thêm các peak đặc trưng của PAMAM dendrimer ở thế hệ G3.5 như peak –COOCH3 (h) (3,73-3,78 ppm); peak – CONHCH2CH2N- (e) (3,26-3,36 ppm); peak –CH2CH2N (a) (2,57-2,63 ppm). Từ đó cho thấy có sự hình thành liên kết Hình 3.7. Kết quả GPC của G3.0- giữa nhóm –COOCH3 với nhóm amin bề mặt phân tử G3.0- PINIPAM (1:8) PNIPAM. Kết quả trên cho thấy việc tổng hợp nên chất mang nano nhạy nhiệt G3.5-PNIPAM đã thành công. 12
Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của G3.5-PNIPAM 3.6. Kết quả 1H-NMR PAMAM G3.0 biến tính với PAA Phổ 1H-NMR của G3.0-PAA cho thấy ngoài peak đặc trưng của PAMAM dendrimer G3.0 như: peak –CH2CH2N (a) (2,63ppm), peak –CONHCH2CH2N- (e) (3,30 ppm) còn có peak đặc trưng của acid polyacrylic >CHCOOH (b) (2,07 ppm) >CHCH2CH< (c) (1,61 ppm). Như vậy, có thể khẳng định có sự hình thành liên kết -CO-NH giữa nhóm -NH2 trên bề mặt của PAMAM dendrimer G3.0 với nhóm -COOH của PAA. Kết quả trên cho thấy đã tổng hợp thành công chất mang G3.0-PAA. Hình 3.9. Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G3.0 biến Hình 3.10. Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer tính với PAA (tỉ lệ mol 1:12) G 4.0 biến tính với PAA (tỉ lệ mol 1:16) Từ kết quả phổ 1H-NMR của G3.0-PAA, ta tính được số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 là 6,01 nhóm (hiệu suất 50,1%). Thực hiện phản ứng khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G3.0: PAA là 1:6 cho kết quả số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G3.0 là 5 nhóm (hiệu suất 83,3%). 3.7. Kết quả 1H-NMR PAMAM G4.0 biến tính với PAA Tương tự như hệ G3.0-PAA, kết quả phổ 1H-NMR cho thấy đã tổng hợp thành công chất mang G4.0- PAA. Từ kết quả phổ 1H-NMR của G4.0-PAA, ta tính được số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer G4.0 là 15,16 nhóm (hiệu suất 94,7%). Thực hiện phản ứng khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G4.0: PAA là 1:8 cho kết quả số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 là 7,28 nhóm (hiệu suất 91,0%). Tiến hành thực hiện thí nghiệm khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G4.0: PAA là 1: 24 nhưng phản ứng không thành công (xảy ra hiện tượng đóng rắn trong bình phản ứng). 13
3.8. Kết quả đo hàm lượng Pt 3.8.1. Kết quả đo hàm lượng Pt của phức PAMAM dendrimer thế hệ chẵn-Cisplatin Bảng 3.3. Hàm lượng Pt phức PAMAM thế Kết quả cho thấy, hiệu quả gắn Cisplatin thu hệ chẵn - Cisplatin (không thủy phân) được là khá cao so với kết quả nghiên cứu trước đó TT Tên mẫu %Cisplatin của nhóm nghiên cứu với kết quả hàm lượng 1 G3.0-Cisplatin 9,63  1,47 Cisplatin trong phức G2.5-Cisplatin và G3,5- 2 G4.0-Cisplatin 16,95  1,29 Kết quả được biểu diễn dưới dạng: trung bình  SD Cisplatin lần lượt là 10,33% và 2,3%. Sự khác biệt (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3 khá lớn là do chúng tôi tiến hành thủy phân trước 3.8.2. Kết quả đo hàm lượng Pt của phức Cisplatin với AgNO3. Bằng cách này, Cisplatin gần PAMAM dendrimer thế hệ lẻ– Cisplatin (không như được thủy phân hoàn toàn thành cation thủy phân) [Pt(NH3)2(H2O)]2+ nên hiệu quả gắn Cisplatin vào Bảng 3.4. Hàm lượng Pt phức PAMAM thế PAMAM dendrimer các thế hệ lẻ tăng lên rất nhiều. hệ lẻ - Cisplatin (không thủy phân) Khi thế hệ PAMAM dendrimer tăng lên thì số nhóm TT Tên mẫu %Cisplatin bề mặt cũng tăng và số phân tử Cisplatin gắn vào 1 G2.5-Cisplatin 15,89 ± 1,41 2 G3.5-Cisplatin 7,90 ± 1,92 PAMAM dendrimer cũng tăng lên. Tuy nhiên, so với 3 G4.5-Cisplatin 5,90 ± 0,68 sự gia tăng của nhóm bề mặt thì hiệu quả gắn Kết quả được biểu diễn dưới dạng: trung bình  SD (độ Cisplatin vào PAMAM sẽ giảm khi thế hệ dendrimer lệch chuẩn), số lần đo n=3 tăng. Kirkpatrick cho rằng khi thế hệ dendrimer càng Đối với các PAMAM dendrimer G lẻ hàm tăng thì việc chuyển các nhóm ngoài cùng của lượng Cisplatin bị giảm đi khi thế hệ dendrimer tăng. PAMAM dendrimer thành nhóm carboxylate càng Khả năng mang thuốc thấp của các PAMAM khó khăn và do hiệu ứng không gian tăng cũng làm dendrimer G lẻ thế hệ cao có thể được giải thích là giảm khả năng phản ứng của Cisplatin với các nhóm do sự cản trở không gian của các nhóm carboxylate amine và amide bên trong của PAMAM dendrimer. trên bề mặt, các nhóm này có xu hướng co cụm lại 3.8.4. Kết quả đo hàm lượng Pt của các dẫn đến giảm khả năng mang thuốc Cisplatin. Ngược phức G3.0-PAA-Cisplatin và G4.0-PAA- lại với các PAMAM dendrimer thế hệ lẻ, hàm lượng Cisplatin (thủy phân) Cisplatin trong PAMAM dendrimer thế hệ chẵn Bảng 3.6. Hàm lượng Pt trong phức G3.0-PAA- G4.0 tăng khoảng 1,7 lần so với PAMAM dendrimer Cisplatin (thủy phân) và G4.0-PAA-Cisplatin (thủy G3.0. phân) 3.8.3. Kết quả đo hàm lượng Pt của phức TT Tên mẫu %Cisplatin PAMAM thế hệ lẻ– Cisplatin (thủy phân) 1 G3.0-PAA-Cisplatin 12,93  1,60 Bảng 3.5. Hàm lượng Pt trong phức G2.5-Cisplatin, (1:6) G3.5-Cisplatin và G4.5-Cisplatin 2 G3.0-PAA-Cisplatin 13,89  1,39 (1:12) TT Tên mẫu %Cisplatin 3 G4.0-PAA-Cisplatin 20,22  1,44 1 G2.5-Cisplatin 28,99  2,01 (1:8) 2 G2.5-Cisplatin (SA) 31,82  1,39 4 G4.0-PAA-Cisplatin 40,44  1,29 3 G3.5-Cisplatin 30,23  1,29 (1:16) 4 G3.5-Cisplatin (SA) 33,01  1,56 Kết quả được biểu diễn dưới dạng: trung bình  SD 5 G4.5-Cisplatin 31,11  1,48 (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3 6 G4.5-Cisplatin (SA) 34,03  1,96 Hàm lượng Cisplatin tăng khi tăng tỉ lệ mol Kết quả được biểu diễn dưới dạng: trung bình  SD (độ của polymer nhạy pH Poly acrylic acid (PAA). So lệch chuẩn), số lần đo n=3; SA: có sử dụng siêu âm sánh hàm lượng Cisplatin trong G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin với G3.0-PAA-Cisplatin, G4.0- 14
PAA-Cisplatin ta thấy sự có mặt của PAA làm tăng dendrimer sẽ tăng lên và làm tăng đáng kể khả năng hàm lượng Cisplatin. Điều này có thể giải thích do mang thuốc Cisplatin của các hệ chất mang (bảng PAA có nhiều nhóm -COOH nên tăng khả năng hình 3.8). Mặt khác, do liên kết giữa Pt2+ và nhóm amine thành liên kết phức chất Pt-COO- do đó tăng khả bề mặt -NH2 của các hệ chất mang PAMAM năng mang thuốc Cisplatin. dendrimer thế hệ chẵn (G3.0; G4.0) tương đối bền 3.9. So sánh khả năng mang thuốc và Cisplatin sẽ khó giải phóng ra khỏi các hệ chất Cisplatin của các hệ chất mang trong điều kiện mang này cho nên chúng tôi đã không tiến hành khảo không thủy phân và có thủy phân Cisplatin sát khả năng mang thuốc Cisplatin (thủy phân) của Bảng 3.7. Khả năng mang thuốc Cisplatin (không các PAMAM dendrimer có nhóm amine -NH2 bề thủy phân) của các hệ chất mang PAMAM mặt. Kết quả bảng 3.13 cũng cho thấy Cisplatin thủy dendrimer phân dễ dàng tạo phức với nhóm carboxylate - T Hệ chất mang Số nhóm chức % COOH trên bề mặt của các hệ chất mang. Hệ chất T bề mặt Cisplatin mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA (1:16) với số NH2 COOH 1 G2.5-COOH 0 32 15,89  1,41 nhóm chức bề mặt -COOH vượt trội (405 nhóm) so 2 G3.5-COOH 0 64 7,90  1,92 với các hệ chất mang khác mang được lượng thuốc 3 G4.5-COOH 0 128 5,90  0,68 Cispaltin lên tới 40,44%. 4 G4.0-PAA 49 405 19,06  1,44 Bảng 3.8. Khả năng mang thuốc Cisplatin (thủy (1:16) phân) của các hệ chất mang PAMAM dendrimer 5 G3.0-NH2 32 0 9,63  1,47 T Hệ chất Số nhóm chức % 6 G4.0-NH2 64 0 16,95  1,29 T mang bề mặt Cisplatin NH2 COO H Khả năng mang thuốc Cisplatin (không thủy 1 G2.5-COOH 0 32 31,82  1,39 phân) của các hệ chất mang PAMAM dendrimer 2 G3.5-COOH 0 64 33,01  1,56 được tóm tắt trong bảng 3.7. Kết quả cho thấy các hệ 3 G4.5-COOH 0 128 34,03  1,96 chất mang không mang được nhiều thuốc Cisplatin 4 G3.0-PAA 27 75 12,93  1,60 (1:6) so với các nghiên cứu trước đó. Tuy nhiên, nếu tiến 5 G3.0-PAA 26 90 13,89  1,39 hành thủy phân một cách triệt để Cisplatin bằng (1:12) AgNO3 để tạo thành dạng [Pt(NH3)2(H2O)n]2+ thì khả 6 G4.0-PAA 57 189 20,22  1,44 (1:8) năng tạo phức giữa Pt2+ của Cispaltin với nhóm bề 7 G4.0-PAA 49 405 40,44  1,29 mặt -COOH của các hệ chất mang PAMAM (1:16) 3.10. Thử nghiệm khả năng mang đồng thời hai thuốc 5-FU và Cisplatin của hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM Hệ chất mang G3.5-PNIPAM được tổng hợp từ PAMAM dendrimer G3.0 -PNIAM và carboxylate hóa các nhóm -COOCH3 ngoài cùng thành nhóm -COO- có khả năng tạo phức với Cisplatin. Hơn nữa, các nhóm PNIPAM nhạy nhiệt trên bề mặt của hệ chất mang thuộc loại polymer nhạy nhiệt có nhiệt độ tới hạn thấp (LCST, 320C). Ở điều kiện nhiệt độ dưới điểm LCST, PNIPAM trương nở cực đại trong dung dịch thuốc và mang các phân tử thuốc vào bên trong mạng của nó. Khi nhiệt độ tăng lên quá điểm LCST, mạch polymer co ngót lại thuốc được nhả ra bên ngoài môi trường. Trên cơ sở nguyên lý này, chúng tôi đã thực hiện việc mang thuốc 5-FU vào hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin. Kết quả nang hóa 30mg 5-FU vào 100 mg các hệ copolymer PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM và hệ phức chất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin như sau: 15
Bảng 3.9. Kết quả nang hóa 5-FU vào phức G3.5-PNIPAM-Cisplatin 5FU không nang hóa 5-FU nang hóa mg mg %DL % EE PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-5FU- 4.32  0.26 25.68  0.26 20.43  0.17 85.61  0.88 CisPt PAMAM dendrimer 3.73  0.29 26.27  0.29 20.81  0.18 87.57  0.97 G3.5-PNIPAM-5FU PNIPAM-CisPt-5FU 11.90  0.27 18.10  0.27 15.32  0.20 60.33  0.91 Kết quả được biểu diễn dưới dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3 Phức chất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin thể hiện khả năng nang hóa được 5-FU tạo thành hệ nano-gel nhạy nhiệt có khả năng mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU và Cisplatin. Phác đồ điều trị ung thư với Cispaltin thường kết hợp thêm các thuốc khác để làm tăng hoạt tính cũng như giảm tác dụng phụ của thuốc. Do đó, hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU và Cisplatin là một hệ mang thuốc chống ung thư đầy hứa hẹn. 3.11. Kết quả đo TEM, DLS và thế zeta Kích thước các hạt nano của phức PAMAM dendrimer hế hệ lẻ với Cisplatin tương đối đồng đều và nằm trong khoảng 5-10 nm (hình 3.11). Kết quả TEM cho thấy được kích thước của hạt PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM tồn tại trong dung dịch là 190 nm (hình 3.12). So với kích thuớc ban đầu của PAMAM dendrimer G3.0 (3-4 nm) thì kích thước của hạt PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM tăng lên rất nhiều và do đó sẽ làm tăng khả năng mang thuốc của hạt. Kích thước hạt của hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin trong dung dịch là 184 nm lớn hơn rất nhiều do polymer PNIPAM bao bọc phía bên ngoài hạt PAMAM dendrimer G3.5. Ảnh TEM (hình 3.13) của mẫu PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin cho thấy có khả năng Cisplatin tạo liên kết chéo với hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM. Hình 3.11. Ảnh TEM phức PAMAM dendrimer thế hệ lẻ - Cisplatin 16
Hình 3.12. Ảnh TEM của mẫu G3.0, PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM và DLS mẫu PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM Hình 3.13. Ảnh TEM mẫu PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin và DLS mẫu G3.5-PNIPAM- Cisplatin và mẫu PNIPAM-Cisplatin Hình 3.14. Ảnh TEM của PAMAM dendrimer G4.0 (A), G4.0-PAA Hình 3.15. Ảnh TEM của hệ (C) và DLS của PAMAM dendrimer G4.0 (B), G4.0-PAA (D) PAMAM dendrimer G3.0-PAA- Cisplatin và PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin 17
Ảnh TEM của PAMAM dendrimer G4.0 đã chứng minh sự hình thành các hạt nano hình cầu đồng nhất với đường kính khoảng 4,0 nm, gần giống với kết quả đo DLS là 7,8 ± 2,4nm. Kích thước hệ chất mang nano G4.0-PAA (28 nm) tăng gần 3,6 lần so với PAMAM dendrimer G4.0. Kích thước hạt cũng tăng lên rất nhiều khi mang thuốc Cisplatin. Để khảo sát độ ổn định của các hệ chất mang, thế zeta của các dung dịch chứa các hệ chất mang được đo ở các điều kiện khác nhau. Kết quả đo thế zeta của các hệ chất mang G3.0-PAA (tỉ lệ mol 1:12); G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:8) và G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:16) cho thấy thế zeta của các hệ chất mang này phụ thuộc vào giá trị pH của dung dịch. Các hệ chất mang tương đối ổn định ở pH trung tính và pH 7,4. Hệ G4.0-PAA tỉ lệ mol 1:16 dễ bị kết tụ ở pH 5,5 với ζ= 7,3 mV. Kết quả này cho thấy sự không ổn định của hạt dẫn đến khả năng hạt bị kết tụ và do kích thước hạt tăng nên hạt không thể khuếch tán vào hệ thống mạch bạch huyết nhưng lại gia tăng được việc tích tụ ở môi trường khối u pH 5,5 và lượng Cisplatin giải phóng cũng tăng do đó làm tăng khả năng diệt khối u của thuốc. Ở pH 7,4, G4.0-PAA tỉ lệ mol 1:16 có ζ= -58,6 mV cho thấy sự ổn định trong môi trường plasma nên làm tăng tính tuần hoàn thuốc trong hệ thống mạch máu và do đó tăng khả năng thuốc được vận chuyển đến các khối u. a) -13,9 mV b) -14,6 mV a) -58,6 mV b) -19,2 mV c) 19,0 mV c) 7,3 mV Hình 3.16. Thế zeta của hệ chất mang G3.0-PAA (tỉ lệ Hình 3.17. Thế zeta của hệ chất mang G4.0-PAA mol 1:12) tại a. pH 7,4; b. pH 7,0 và c. pH 5,5 (tỉ lệ mol 1:16) tại: a. pH 7,4; b. pH 7,0 và c. pH 5,5 100 a) -23,2 mV b) -17,2 mV Transmittance [%] 80 60 40 20 c) 14,1 mV 0 2 4 6 8 10 pH G3PAA 1:12 G4PAA 1:16 G4PAA 1:8 Hình 3.18. Thế zeta của hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ Hình 3.19. Độ tan của các hệ chất mang phụ thuộc lệ mol 1:8) tại: a. pH 7,4; b. pH 7,0 và c. pH 5,5 vào pH dung dịch 18
Điểm đục của các hệ chất mang khi thay đổi pH dung dịch cũng được xác định. Hình 3.19 cho thấy, độ hòa tan của các hệ G3.0-PAA 1:12, G4.0-PAA 1:8 và G4.0-PAA 1:16 phụ thuộc pH theo ba vùng pH: vùng pH thấp, vùng kết tủa (vùng trung gian) và vùng pH cao. Tại vùng trung gian pH 3,5 - 5,5 (hệ G4.0-PAA 1:16), pH 4,0 - 6,0 (hệ G3.0-PAA 1:12, G4.0-PAA 1:8) các hệ chất mang bị trung hòa điện tích pH dung dịch  pH đẳng điện và gây ra hiện tượng kết tụ các hệ chất mang này. 3.12. Kết quả và bàn luận khả năng giải phóng thuốc in vitro 3.12.1. Khả năng giải phóng thuốc của phức PAMAM thế hệ lẻ - Cisplatin (thủy phân) Bảng 3.10. Kết quả giải phóng thuốc in vitro của các phức PAMAM dendrimer: G2.5-Cisplatin, G3.5- Cisplatin và G4.5 - Cisplatin G2.5-Cisplatin G3.5-Cisplatin G4.5 - Cisplatin Thời %Cisplatin %Cisplatin %Cisplatin gian (giờ) pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 0 0 0 0 0 0 0 6 30,42  1,20 22,78  0,81 31,72  1,00 27,17  0,91 34,96  1,08 28,23  0,81 12 37,18  1,48 28,35  1,01 39,04  1,25 35,12  1,12 45,52  1,30 33,12  1,03 24 43,10  1,70 31,84  1,14 44,94  1,41 38,64  1,16 47,86 1,04 43,48  1,20 48 45,98  1,82 34,61  1,23 47,93  1,50 41,35  1,18 53,18  1,47 48,03  1,51 60 48,18  1,90 36,29  1,29 50,24  1,62 43,76  1,28 55,07  1,51 48,91  1,54 72 51,05  2,02 36,54  1,30 53,24  1,67 45,69  1,37 55,49  1,54 49,19  1,54 Kết quả phân tích phương sai 60% ANOVA cho thấy hàm lượng Cisplatin giải % Nhả thuốc Cisplatin 50% phóng khỏi hệ chất mang PAMAM 40% dendrimer phụ thuộc vào thời gian, pH khảo 30% sát và thế hệ dendrimer dùng làm chất 20% mang. Trong cùng một thế hệ PAMAM 10% dendrimer, lượng Cisplatin giải phóng ở pH 0% 5,5 cao hơn ở pH 7,4 và sự khác biệt này có 0 12 24 36 48 60 72 ý nghĩa về mặt thống kê. Sau 60 giờ lượng Thời gian (h) Cisplatin giải phóng không có sự khác biệt pH 5.5 (G2.5cis) pH 7.4 (G2.5cis) pH 5.5 (G3.5cis) đáng kể về mặt thống kê. pH 7.4 (G3.5cis) pH 5.5 (G4.5cis) pH 7.4 (G4.5cis) Cisplatin giải phóng thuốc trong môi trường acid đệm ABS pH 5,5 cao hơn Hình 3.20. Khảo sát giải phóng thuốc Cisplatin in vitro của hệ trong môi trường đệm PBS pH 7,4 có thể chất mang PAMAM G2.5, PAMAM G3.5 và PAMAM G4.5 được giải thích là do trong môi trường acid trong môi trường đệm PBS pH 7,4 và đệm ABS pH 5,5 các nhóm -COO- bề mặt của PAMAM dendrimer bị proton hóa chuyển thành dạng -COOH và làm giảm độ bền của phức PAMAM dendrimer thế hệ lẻ - Cisplatin. Lượng Cisplatin giải phóng trong 72 giờ khỏi hệ chất mang PAMAM G2.5, PAMAM G3.5 và PAMAM G4.5 lần lượt là 51,05%, 53,24% và 55,49%. 3.12.2. Khả năng giải phóng thuốc 5-FU và Cisplatin của hệ chất mang hai thuốc G3.5-PNIPAM- Cispaltin – 5FU 19