Tóm tắt luận án Tiến sĩ Kỹ thuật môi trường: Nghiên cứu tác dụng ức chế của cao chiết cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Kützing trong các thủy vực nước ngọt

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ô nhiễm môi trường nước, đặc biệt hiện tượng phú dưỡng kéo theo sự bùng phát sinh khối VKL với việc giải phóng độc tố microcystin đã nhận được nhiều sự quan tâm, nghiên cứu trong thời gian gần đây. Sử dụng cao chiết từ thực vật để kiểm soát bùng nổ sinh khối VKL thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống được áp dụng trước đây.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Kỹ thuật môi trường: Nghiên cứu tác dụng ức chế của cao chiết cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Kützing trong các thủy vực nước ngọt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ********************** PHẠM THANH NGA NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ CỦA CAO CHIẾT CÂY MẦN TƯỚI (EUPATORIUM FORTUNEI TURCZ.) LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN LAM ĐỘC MICROCYSTIS AERUGINOSA KUTZING TRONG CÁC THỦY VỰC NƯỚC NGỌT Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường Mã số: 9.52.03.20 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hà Nội - 2019
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI Học viện khoa học và công nghệ Hướng dẫn khoa học: Hướng dẫn 1. GS.TS. Đặng Đình Kim Hướng dẫn 2. TS. Lê Thị Phương Quỳnh Phản biện 1: ........................................................................ Phản biện 2: ........................................................................ Luận án đã được bảo vệ trước Hội đồng cấp cơ sở tại Viện Công nghệ Môi trường vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin - Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ô nhiễm nguồn nước mặt là đặc biệt nghiêm trọng khi nhiều nơi trên thế giới người dân không có nước sạch để sử dụng cho ăn uống và sinh hoạt kéo theo tỉ lệ tử vong và bệnh tật gia tăng vì sử dụng nguồn nước không đạt yêu cầu. Nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến ô nhiễm nguồn nước mặt như xả trực tiếp các nguồn nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt mà không qua xử lý hoặc lạm dụng quá mức phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp để nâng cao sản lượng lương thực đáp ứng sự gia tăng dân số thế giới trong những thập kỉ gần đây. Hậu quả dẫn đến gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu là nitơ và photpho) trong các thủy vực gây nên hiện tượng phú dưỡng mà kéo theo là “tảo nở hoa” hoặc “nở hoa của nước”. Sự nở hoa của nước bản chất là sự phát triển ồ ạt của Vi khuẩn lam (VKL) và vi tảo, có khả năng sản sinh ra độc tố tại các thủy vực, kéo theo sự nhiễm độc và cái chết của thủy hải sản, động vật nuôi, động vật hoang dã và con người. Sự nở hoa của nước thường gây ra những tác động xấu lên môi trường như làm đục nước, tăng giá trị pH, giảm hàm lượng oxy hòa tan, tăng độc tố đặc biệt là độc tố microcystin do VKL tiết ra. Kết quả điều tra ở các thủy vực nước ngọt cho thấy trong các loài VKL độc gây hiện tượng nở hoa nước thì Microcystis aeruginosa chiếm đến 90% và sản sinh ba loại độc tố nguy hiểm là độc tố gan (hepatotoxins), độc tố thần kinh (neurotoxins) và gây dị ứng da. Điều nghiêm trọng là tần suất xuất hiện các loài VKL độc ngày càng tăng liên quan đến sức khỏe con người và động vật nuôi, động vật hoang dã do sử dụng nguồn nước có VKL độc. Do đó ngăn ngừa và giảm thiểu sự phát triển bùng nổ của VKL độc là vấn đề quan trọng cần phải được quan tâm. Các phương pháp xử lý ô nhiễm môi trường nước gây ra bởi VKL độc đã được nghiên cứu và áp dụng từ những phương pháp cơ học đơn giản như hớt váng, che sáng hay pha loãng nước hồ đến các phương pháp lý - hóa như dùng sóng siêu âm, sử dụng ánh sáng cực tím, hoặc sử dụng các hợp chất hóa học diệt tảo, các hợp chất có tính oxi hóa cao, các kim loại và nano kim loại. Những phương pháp này bên cạnh những ưu điểm dễ thấy như hiệu quả tác động nhanh, rõ rệt trong thời gian ngắn nhưng còn tồn tại những hạn chế như tốn kém kinh phí triển khai hoặc gây ra sự ô nhiễm môi trường thứ cấp, tác động không chọn lọc lên các loài sinh vật do đó gây suy giảm đa dạng sinh học đặc biệt sử dụng hóa chất sau một thời gian quan sát thấy hiện tượng nhờn thuốc và vì thế chúng bị hạn chế triển khai ở quy mô thực tế. Do đó phương pháp sinh học, đặc biệt dùng các cao chiết có nguồn gốc thực vật để ức chế sinh trưởng VKL đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu vì tính hiệu quả và thân thiện với môi trường. Cây Mần tưới Eupatorium fortunei Turcz, thuộc họ Cúc (Asteraceae) là loài cây cỏ lâu năm, được sử dụng trong dân gian như một loại thuốc chữa bệnh và được chứng minh hoạt tính kháng khuẩn trong nhiều nghiên cứu khác nhau. Năm 2013, Nguyễn Tiến Đạt và cộng sự đã tiến hành khảo sát và so sánh hoạt tính diệt VKL độc M. aeruginosa của nhiều loại cao chiết từ các loài thực vật khác nhau tại Việt Nam cho thấy cao chiết cây Mần tưới có hiệu quả nhất để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam độc. Kết luận này được khẳng định bởi các công bố của Phạm Thanh Nga trong những năm tiếp theo. Tuy nhiên đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu khảo sát hoạt tính diệt VKL độc của cao chiết cây Mần tưới. Từ những lý do trên đề tài luận án tiến sỹ: “Nghiên cứu tác dụng ức chế của cao chiết cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Kützing trong các thủy vực nước ngọt” đã được lựa chọn để thực hiện. Luận án có tính chất kế thừa kết quả của những nghiên cứu trước, tuy nhiên sẽ giải quyết nhiều vấn đề còn tồn tại. 2. Mục tiêu của luận á n Tạo được cao chiết thực vật ức chế hiệu quả sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa 3. Nhiệm vụ của luận á n - Xây dựng quy trình tạo cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn, các chất sạch phân lập từ cây Mần tưới.
2 Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết tổng Mần tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái. - Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết phân đoạn etyl axetat và cao chiết phân đoạn nước Mần tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái. - Nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của 07 hợp chất hóa học được phân lập từ cây Mần tưới. - Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng cao chiết để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam trong các mẫu nước hồ tự nhiên. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án - Ô nhiễm môi trường nước, đặc biệt hiện tượng phú dưỡng kéo theo sự bùng phát sinh khối VKL với việc giải phóng độc tố microcystin đã nhận được nhiều sự quan tâm, nghiên cứu trong thời gian gần đây. Sử dụng cao chiết từ thực vật để kiểm soát bùng nổ sinh khối VKL thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống được áp dụng trước đây. Kết quả của luận án cung cấp cơ sở khoa học, chứng minh tính khả thi khi áp dụng cao chiết thực vật như một hoạt chất ức chế và diệt chọn lọc VKL độc để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL độc. 5. Đóng góp mới của luận án - Phân lập được 02 chất mới (7,8,9 - trihydroxythymol và 8,10-didehydro-7,9-trihydroxythymol) và đánh giá tác động của 02 chất này lên M. aeruginosa trong dải nồng độ từ 1,0 µg/mL đến 50 µg/mL với hiệu quả ức chế sinh trưởng ghi nhận từ 39,1÷41,2 % và 20,0 – 25,0 %, tương ứng sau 72 giờ. - Bước đầu ghi nhận khả năng ức chế sinh trưởng M. aeruginosa ≥ 90% tại nồng độ 500 µg/mL ở quy mô phòng thí nghiệm và hiệu quả trên 60 % quy mô ngoài trời với mẫu nước hồ tự nhiên. Độc tính của cao chiết tổng etanol Mần tưới đối với Daphnia magna và Lemna minor ghi nhận là thấp hơn so với M. aeruginosa. 6. Bố cục của luận án Ngoài phần ở đầu và kết luận, luận án gồm 3 chương, danh mục tài liệu tham khảo và phần phụ lục Chương 1. Tổng quan vấn đề nghiên cứu Trình bày về hiện tượng phú dưỡng và bùng phát sinh khối vi khuẩn lam độc trong các thủy vực nước ngọt. Các phương pháp dược áp dụng để kiểm soát “tảo nở hoa” Chương 2. Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu Trình bày đối tượng nghiên cứu, các phương pháp nghiên cứu và mô tả thực nghiệm Chương 3. Kết quả và thảo luận CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Công thức cấu tạo các chất sạch được phân lập từ cây Mần tưới Eupatorium fortunei Tại Việt Nam, Mần tưới cùng nhiều loài thực vật khác đã được khảo sát ảnh hưởng ức chế lên sinh trưởng của M. aeruginosa và C. vulgaris [2, 3]. Kết quả thực nghiệm cho thấy những ưu điểm nổi bật của cao chiết tổng Mần tưới so với các loài thực vật khác đó là khả năng ức chế chọn lọc lên VKL độc M. aeruginosa và tảo lục C. vulgaris. Hiệu suất tổng hơp cao chiết tổng methanol, cao chiết tổng nước của Mần tưới tương ứng được trình bày trong bảng 3.1 Bảng 3.1. Hiệu suất tạo cao chiết tổng trong các dung môi khác nhau Hiệu suất tạo cao chiết tổng từ Mần tưới Dung Môi (g cao chiết/100g mẫu thực vật khô) Etanol 9,17 Metanol 12,75 W (Nước) 7,75
3 Bảng 3.2. Hiệu suất tạo cao chiết phân đoạn từ cao chiết tổng etanol Mần tưới Hiệu suât (%) từ cao chiết tổng Cao chiết phân đoạn etanol Mần tưới Cao chiết phân đoạn n-hexan 18,97 Cao chiết phân đoạn etyl axetate 16,10 Cao chiết phân đoạn nước (W) 60,27 Hình 3.1. Quy trình phân lập các hợp chất sạch từ từ cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới
4 Bảng 3.3. Hiệu suất phân lập các chất sạch từ Mần tưới Tỉ lệ mg chất sạch/100 g cao chiết STT Hợp chất phân đoạn etyl axetat Mần tưới 1. EfD5.1 71,69 2. EfD14.1 20,80 3. EfD1.8 13,34 4. EfD10.1 4,56 5. EfD10.3 3,91 6. EfD4.7 2,61 7. EfD4.8 1,56 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hai chất EfD4.7 và EfD4.8: STT EfD4.7 EfD4.8 δH (m, J in Hz) δC δH (m, J in Hz) δC 1 140.1 - 143.6 2 6.79 (1H, d, 2.0) 116.3 6.82 (1H, d, 2.0) 115.1 3 - 156.8 - 155.8 4 - 133.5 - 127.8 5 7.20 (1H, d, 7.5) 129.5 7.12 (1H, d, 7.5) 131.1 6 6.81 (1H, dd, 7.5, 120.5 6.80 (1H, dd, 7.5, 2.0) 119.0 2.0) 7 4.52 (2H, s) 64.9 4.55 (2H, s) 64.8 8 - 76.9 - 149.3 9 3.76 (1H, d, 11.0) 72.4 4.39 (2H, s) 65.8 3.65 (1H, d, 11.0) 10 1.58 (3H, s) 26.1 5.41 (1H, d, 2.0), 114.8 5.20 (1H, d, 2.0) 2 chất mới Chất rắn màu trắng; []D24 = +0,2 (c 0.1, MeOH). HR-ESI-MS (positive): m/z 221,0783 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết 221,0790 cho công thức C10H14NaO4). Trên phổ 1 H NMR của hợp chất EfD4.7 xuất hiện tín hiệu đặc trưng của vòng thơm dạng ABX [δH 6,79 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 7,20 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5), and 6,81 (1H, dd, J = 7,5, 2,0 Hz, H-6)], một nhóm methyl bậc 4 tại δH Hình 3.2. Hợp chất 7,8,9- 1,58 (3H, s, H-10). Ngoài ra còn có các tín hiệu của proton ở trihydroxythymol (EfD4.7) vùng trường trung bình δ H 4,57; 3,74 và 3,65.
5 13 Phân tích dữ liệu phổ C NMR kết hợp với phổ HSQC nhận thấy có sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 10 cacbon, bao gồm 1 nhóm methyl (δC 26,1, C-10), 2 nhóm oxymethylene tại δC 64,9 (C-7) và 72,4 (C-9), 1 cacbon bậc 4 liên kết với oxy (δC 76,9, C-8) và một vòng thơm thế ABX [δC 140,1 (C-1); 116,3 (C-2); 156,8 (C-3); 133,5 (C-4); 129,5 (C-5); 120,7 (C-6)]. Các dữ liệu trên gợi ý hợp chất EfD4.7 có dạng khung thymol khá phổ biến trong chi Eupatorium. Thực tế các số liệu 1H và 13C-NMR của EfD4.7 rất tương đồng với số liệu đã công bố của hợp chất 8,9-dihydroxythymol, ngoại trừ sự xuất hiện của nhóm hydroxymethyl thay vì nhóm methyl tại C-7. Phân tích trên phổ hai chiều HMBC cũng đã chỉ ra các tương tác từ H-7 (δH 4,52) đến C-1, C-2 và C-6, từ H-9 (δH 3,76 và 3,65) đến C-4, C-8 và C-10, và từ H-10 (δH 1,58) đến C-4, C-8 và C-9. Như vậy có thể kết luận hợp chất EfD4.7 là 7,8,9-trihydroxythymol, một hợp chất mới lần đầu tiên được công bố. Chất rắn màu trắng. HR-ESI-MS (positive): m/z181.0864 [M + H] + (tính toán lý thuyết trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS 181,0865 cho công thức C10H13 O2).1 H NMR (500 MHz, CD 3OD) và 13 C NMR (125 MHz, CD3 OD) [Bảng 3.4]. Hợp chất EfD 4.8 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ 1 H và 13 C-NMR của EfD4.8 Hình 3.3. Hợp chất 8,10- rất tương đồng với phổ của EfD4.7 ngoại trừ sự xuất hiện didehydro-7,9- của 1 nhóm methylene ngoại vòng (δ C/δH 114,8/5,41 and dihydroxythymol(EfD4.8) 5,20) thay vì nhóm methyl C-10 như chất EfD4.7. Điều này cũng được khẳng định dựa vào số liệu phổ khối lượng phân giải cao. Công thức phân tử C10H13 O2 của EfD4.8 được xác định dựa trên pic ion phân tử tại m/z . Các tương tác HMBC cũng khẳng định cấu trúc của hợp chất EfD4.8
6 Hình 3.4. HSQC spectra of EfD4.7 Hình 3.5. HMBC of EfD4.7 Hình 3.6. HSQC spectra of EfD4.7 Hình 3.7. HMBC of EfD4.7
7 Cấu trúc 07 hợp chất phân lập được từ mẫu Mần tưới 1. Hợp chất 7,8,9- 2. Hợp chất 8,10-didehydro- 2. o-Caumaric acid trihydroxythymol (EfD4.7) 7,9-dihydroxythymol (EfD1.8) (EfD4.8) 3. 8,9,10- Trihydroxythymol 5. 4-(2- 6. Kaempferol (EfD10.3): (EfD5.1): hydroxyethyl)benzaldehyde (EfD10.1): 7. 10-Acetoxy-8,9- dihydroxythymol (EfD14.1) 3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng và diệt VKL độc, vi tảo của các cao chiết và chất sạch được phân lập 3.2.1. Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng VKL độc Microcystis aeruginosa TC3 của các cao chiết tổng Mần tưới 0.50 A Control - M.a B Mật độ quang, (λ= 680 nm) 0.50 Control- M.a Mật độ quang, (λ= 680 nm) E- Eth-200 E- Eth-500 0.40 E- Me-200 0.40 E- Me-500 E-W-200 E-W-500 0.30 CuSO4-1 CuSO4-5 0.30 0.20 0.20 0.10 0.10 0.00 0.00 T0 T3 T6 T10 T0 T3 T6 T10 Thời gian (ngày) Thời gian (ngày) Hình 3.8. Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B) lên sinh trưởng của M. aeruginosa tính theo mật độ quang (tại bước sóng 680 nm) Sự ức chế sinh trưởng của chủng M.aeruginosa được quan sát rõ nhất dưới ảnh hưởng của cao chiết etanol Mần tưới nồng độ 500 µg/mL với hiệu suất chế (IE) tính theo mật độ quang là 91,50 % cao hơn so với các cao chiết methanol (IE là 78,50) và cao chiết nước (IE là 61,72 %) (p
8 chlorophyll a, µg/L 8.00 A 8.00 Hàm lượng chlorophyll Control- M.a Control - M.a B E- Eth-200 7.00 E- Eth-500 Hàm lượng E- Me-200 E- Me-500 6.00 6.00 E-W-500 E-W-200 CuSO4-5 a, µg/L CuSO4-1 5.00 4.00 4.00 3.00 2.00 2.00 1.00 0.00 0.00 T0 T3 T6 T10 T0 T3 T6 T10 Thời gian (ngày) T h ờ i gi a n ( n gà y) Hình 3.9. Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B) lên sinh trưởng của M. aeruginosa tính theo hàm lượng chlorophyll a Trong khi đó tại mẫu thí nghiệm bổ sung cao chiết etanol và metanol nồng độ 500 µg/mL sinh khối VKL đều thấp hơn với mẫu đối chứng ở các thời điểm khảo sát T3, T6 và T10 (p
9 40.00 40.00 Mật độ tế bào x 105 Control- M.a C Control- Chlorella C Hàm lượng chlorophyll E-Ethanol-50 E-Ethanol -50 30.00 E-Ethanol-100 E-Ethanol-100 TB/mL 30.00 E-Ethanol-200 E-Ethanol-200 a, ug/L E-Ethanol-500 E-Ethanol-500 20.00 20.00 10.00 10.00 0.00 0.00 T0 T3 T6 T10 T0 T3 T6 T10 Thời gian (ngày) Thời gian (ngày) Hinh 3.10. Sinh trưởng của M.aeruginosa Hinh 3.11. Sinh trưởng của C. vulgaris dưới dưới tác dụng của cao chiết tổng etanol tác dụng của cao chiết tổng etanol Mần tưới Mần tướitính theo mật độ quang (A), tính theo mật độ quang (A), hàm lượng hàm lượng chlorophyll a (B) và mật độ chlorophyll a (B) và mật độ tế bào (C) tế bào (C) Kết quả nghiên cứu trong cả hai dải nồng độ 200 và 500 µg/L với hai phương pháp phân tích đánh giá sinh trưởng của VKL đều chứng minh cao chiết tổng etanol Cỏ lào thể hiện độc tính mạnh hơn đối với chủng M.aeruginosa so với cao chiết tổng etanol Mần tưới. Bảng 3.5 cho thấy cao chiết etanol Mần tưới thể hiện sự tác động có chọn lọc rõ rệt giữa hai đối tượng M.aeruginosa và C. vulgaris với các giá trị ức chế sinh trưởng lên C. vulgaris ghi nhận được đều thấp hơn M. aeruginosa ở cả ba phương pháp phân tích (p
10 8.00 Control - M.a B Hàm lượng Chlorophyll a , 8.00 Hàm lượng Chlorophyll a , Control- M.a A E- W 50 E- Ethyl 50 E- W 100 6.00 E- Ethyl 100 6.00 E- W 200 E- Ethyl 200 E- W 500 ug/L ug/L 4.00 E- Ethyl 500 4.00 2.00 2.00 0.00 0.00 T0 T3 T6 T10 T0 T3 T6 T10 Thời gian (ngày) Thời gian (ngày) Hình 3.13. Sinh trưởng của M.aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn ethyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) Mần tưới tính theo hàm lượng chlorophyll a Kết quả chỉ ra trong hình 3.12 và 3.13 bằng phương pháp đo mật độ quang và hàm lượng chlorophyll a đều phản ảnh xu hướng tương tự, chứng minh cao chiết phân đoạn etyl acetat ảnh hưởng mạnh hơn lên sinh trưởng của M.aeruginosa so với cao chiết phân đoạn nước sau 10 ngày thí nghiệm. Tại nồng độ 200 và 500 µg/mL cao chiết phân đoạn n ước ức chế nhẹ lên M.aeruginosa ghi nhận giá trị tại ngày T10 đo mật độ quang là 0,354 ± 0,015 và 0,199 ± 0,016, giá trị đo hàm lượng chlorophyll a tương ứng là 5,76 ± 0,38 và 3,96 ± 0,223 µg/L, thiết lập hiệu suất ức chế tương ứng lên sinh trưởng M.aeruginosa tại 200 µg/mL là 18-20% và tại 500 µg/mL là 45 -60%. Kết quả phân tích đối với cao chiết etyl axetat cho thấy hiệu quả ức chế rõ rệt tại nồng độ 200 và 500 µg/mL sau 10 ngày tác động lên M.aeruginosa, mật độ quang tương ứng là 0,102 ± 0,03; 0,031 ±0,001 và hàm lượng chlorophyll a là 1,78± 0,018 và 0,27 ± 0,019 µg/L, hiệu suất sinh trưởng cao nhất đạt trên 90% đối với công thức thực nghiệm etyl axetat 500 µg/mL. 0.50 0.50 B Control- Chlorella A Control- Chlorella Mật độ quang, (Abs 680nm) Mật độ quang (Abs 680 nm) E-Ethyl -50 0.40 E-W-50 0.40 E-Ethyl-100 E-W-100 E-Ethyl-200 E-W-200 0.30 E-Ethyl -500 0.30 E-W-500 0.20 0.20 0.10 0.10 0.00 0.00 T0 T3 T6 T10 T0 T3 T6 T10 Thời gian (ngày) Thời gian (ngày) Hình 3.14. Sinh trưởng của C.vulgaris dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn ethyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước Mần tưới (B) tính theo mật độ quang
11 B A 60.00 60.00 Hàm lượng Chlorophyll a , Control- Chlorella Hàm lượng Chlorophyll Control- Chlorella 50.00 E- Ethyl -50 50.00 E- W-50 E- Ethyl-100 E- W-100 40.00 40.00 a, ug/L E- Ethyl-200 E- W-200 ug/L 30.00 30.00 E- W-500 20.00 20.00 10.00 10.00 0.00 0.00 T0 T3 T6 T10 T0 T3 T6 T10 Thời gian (ngày) Thời gian (ngày) Hình 3.15. Sinh trưởng của C.vulgaris dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn ethyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước Mần tưới (B) tính theo hàm lượng chlorophyll a So sánh với tác động lên sinh trưởng M.aeruginosa, đối với C.vulgaris các cao chiết thể hiện độc tố thấp hơn (p
12 3.2.4. Đánh giá tiềm năng kiểm soát bùng nổ sinh khối Microcystis aeruginosa của cao chiết Mần tưới trong vòng 72 giờ Mật độ quang (Abs 680nm ) Control. M.a Hình 3.16. Sinh 0.28 CuSO4-5 0.24 E-Ethanol 500 trưởng của chủng 0.20 E-Ethyl 500 M. aeruginosa 0.16 trong vòng 72 giờ 0.12 tác dụng của các 0.08 cao chiết Mần tưới 0.04 A. Tính theo mật 0.00 độ quang T0 T24 T48 T72 Thời gian (giờ) 3.50 Hàm lượng chlorophyll a, T0 T72 3.00 2.50 B. Tính theo hàm lượng µg/mL 2.00 chlorophyll a 1.50 1.00 0.50 0.00 Control CuSO4-5 E-Ethanol 500 E-Ethyl-500 25.00 T0 TB/mL T72 20.00 105 15.00 C. tính theo mật độ Mật độ tế bào × 10.00 tế bào 5.00 0.00 Control - Ma CuSO4-5 Ethanol-500 Ethyl- 500 Bảng 3.7. Hiệu quả ức chế sinh sinh trưởng của chủng M.aeruginosa dưới ảnh hưởng của CuSO4 CuSO4 5 µg/L và các cao chiết Mần tưới sau 72 giờ IE 72h IE (72h) IE% (72) Mẫu nghiên cứu OD Chla TB CuSO4-5 47,4 74,72 35,10 E-Ethanol 500 52,2 67,35 34,77 E-Ethyl-500 62,8 79,60 37,42
13 3.2.3. Đánh giá hoạt tính diệt Microcystis aeruginosa của các chất sạch 0.30 0 µg/mL 1 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 50 µg/mL Mật độ quang (Abs 680 nm) A 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 EfD 1.8 EfD 4.8 EfD 4.7 EfD 5.1 EfD 10.1 EfD 10.3 EfD 14.1 Mật độ tế bào × 105TB/mL 25.0 B 20.0 15.0 10.0 5.0 0.0 EfD1.8 EfD 4.8 EfD 4.7 EfD 5.1 EfD 10.1 EfD 10.3 EfD 14.1 Hình 3.16. Sinh trưởng của chủng M.aeruginosa dưới tác dụng của các chất sạch sau 72 giờ tính theo mật độ quang bước sóng 680 nm (A) và theo mật độ tế bào (B) EfD 5.1 có hiệu quả ức chế sinh trưởng cao nhất theo mật độ quang và mật độ tế bào là 45,6 và 49,0 %, tương đương với độc tính của CuSO4 nồng độ 5 µg/mL, tiếp theo là hợp chất 10-acetoxy- 8,9-dihydroxythymol (EfD 14.1) and 4-(2-hydroxyethyl) benzaldehyde (EfD 10.1) với giá trị IE tương ứng là 43,1 và 41,6 %; 43,0 % và 39,6 %. Hợp chất 8,10-didehydro-7,9-dihydroxytymol (EfD 4.8) có IE thấp hơn là 39,1% và 41,1%. Ngược lại hợp chất, 7,8,9-trihydroxythymol (EfD 4.7) và aglycone kaempferol (EfD 10.3) ức chế sinh trưởng kém lên M.aeruginosa với IE chỉ đạt từ 20-25 % tại cùng nồng độ và thời gian phơi nhiễm. 3.2.5. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc tế bào Microcystis aeruginosa và Chlorella vulgaris A B Hình 3.17. Cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M.aeruginosa TC3 (A) và CH.vulgaris (B) dưới kính hiển vi điện tử truyền qua
14 A3 A6 A10 B3 B6 B10 C3 C6 C10 Hình 3.17. Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M. aeruginosa TC3 dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (A- cao chiết etanol, B- cao chiết etyl axetat, C- cao chiết nước, 3- sau 3 ngày, 6-sau 6 ngày, 10- sau 10 ngày. A3 A6 A10 B3 B6 B10
15 C3 C6 C10 Hình 3.18. Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc siêu hiển vi của tế bào C.vulgaris dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (A- cao chiết etanol, B- cao chiết ethyl axetat, C- cao chiết nước, 3- sau 3 ngày, 6-sau 6 ngày, 10- sau 10 ngày) Phân tích ảnh hưởng của các cao chiết đến siêu cấu trúc tế bào M. aeruginosa và C. vulgaris cho thấy tổn thương tế bào ở mức độ nghiêm trọng khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc tế bào, bản chất cao chiết và thời gian phơi nhiễm. Đặc biệt, cao chiết etyl axetat gây phân hủy nguyên sinh chất, phá hủy các bào quan và tạo ra cấu trúc rỗng bên trong tế bào, còn cao chiết etanol làm tế bào bị biến dạng co rút và thu nhỏ kích thước. 3.2. Kết quả đánh giá tính an toàn của cao chiết thực vật Mần tưới (ảnh hưởng lên một số sinh vật khác) 3.3.1. Ảnh hưởng của cao chiết đến giáp xác Daphnia magna Tỷ lệ chết Tỷ lệ sống 100% A Tỷ lệ sống chết sau 24 giờ 80% 60% 40% 20% 0% 0 100 200 240 280 320 360 400 100% Tỷ lệ sống /chết sau 48 giờ B 80% 60% 40% 20% 0% 0 100 200 240 280 320 360 400 Nồng độ cao chiết tổng etanol Mần tưới , µg/mL Hình 3.19. Tỷ lệ cá thể sống/chết của D.magna sau 24 giờ (A) và 48 giờ (B) phơi nhiễm với cao chiết tổng etanol Mần tưới
16 Tỷ lệ chết Tỷ lệ sống 100% A Tỷ lệ sống chết sau 24 giờ 80% 60% 40% 20% 0% 0 10 20 40 80 120 160 100% B Tỷ lệ sống chết sau 48 giờ 80% 60% 40% 20% 0% 0 10 20 40 80 120 160 Nồng độ cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới, µg/mL Hình 3.20. Tỷ lệ cá thể sống/chết của D.magna sau 24 giờ và 48 giờ phơi nhiễm với cao chiết etyl axetat Mần tưới Cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới thể hiện độc tính cao hơn so với cao chiết tổng etanol, sau 24 giờ phơi nhiễm tại nồng độ 160 µg/mL và sau 48 giờ tại 80 µg/mL thì đã gây chết 100 % các cá thể giáp xác nghiên cứu, trong khi đối với mẫu đối chứng thì tỷ lệ chết là 0% trong suốt quá trình thực nghiệm. Bảng 3.8. Giá trị LC50 của cao chiết tổng etanol Mần tưới tại 24 và 48 giờ Nồng độ cao chiết tổng etanol Nồng độ cao chiết phân đoạn Tỷ lệ chết (µg/mL) etyl axetat (µg/mL) 24 giờ 48 giờ LC/EC 1 71,40 37,0 7,80 1,80 LC/EC 5 102,80 59,2 13,20 3,20 LC/EC 10 125,00 76,0 17,60 4,40 LC/EC 15 142,40 90,0 21,20 5,40 L C/EC 50 247,80 183,2 47,40 13,60 LC/EC 85 431,20 373,4 105,80 34,20 LC/EC 90 491,60 442,0 128,00 42,40 LC/EC 95 596,80 567,2 169,60 58,60 LC/EC 99 859,20 885,8 287,80 107,40 Bảng 3.9. Giá trị DO và pH của mẫu phơi nhiễm cao chiết tổng etanol Mần tưới tại 0 và sau 48h Nồng độ tổng (mg/L) DO (T0) DO (T48) pH (T0) pH (T48) 0,00 7,77 7,72 7,78 7,42 100,00 7,76 7,52 6,87 7,54 200,00 7,82 7,40 6,57 7,56 240,00 7,85 7,57 6,07 7,57 280,00 7,92 6,83 6,18 6,76 320,00 7,86 6,72 6,17 6,55 360,00 7,86 7,34 6,15 7,14
17 Bảng 3.10. Giá trị DO và pH của mẫu phơi nhiễm cao chiết etyl axetat Mần tưới tại 0 và sau 48h Nồng độ phân DO (T0) DO (T48) pH (T0) pH (T48) đoạn (mg/L) 0 7,77 7,42 7,77 7,42 10 7,87 7,51 7,78 7,49 20 7,85 7,44 7,70 7,44 40 7,88 6,88 7,65 7,37 80 7,83 6,44 7,52 7,17 120 7,86 6,92 7,44 7,15 160 7,85 7,72 7,29 7,03 3.3.2. Ảnh hưởng của cao chiết đến bèo tấm Lemna minor 500 Control-L.minor Control -L.minor 450 A 500 B CuSO4-5 E-Ethyl- 500 400 E- Eth-500 400 Số cánh bèo E-Ethyl- 200 350 Số cánh bèo 300 E-Eth-200 E-Ethyl- 100 300 E-Ethyl- 50 250 200 200 150 100 100 50 0 0 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T0 T1 T2 T3 T4 T5 Thời gian (ngày) Thời gian (ngày) Hình 3.21. Ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol (A) và cao chiết phân đoạn etyl axetat (B) Mần tưới lên tổng số cánh bèo L.minor A. Control B. CuSO4 C. E-Ethanol 200 D. E-Ethanol 500 Hình 3.22. Hình thái ngoài của cánh bèo L.minor sau 5 ngày phơi nhiễm cao chiết tổng ethanol Mần tưới Control- L.minor E-Ethyl 500 E-Ethyl 200 E-Ethyl 100 E-Ethyl 50
18 Hình 3.23. Hình thái ngoài của cánh bèo L.minor sau 5 ngày phơi nhiễm cao chiết tổng phân đoạn etyl axetat Mần tưới 60.0 60.0 Control-L.minor A Control - L.minor B Sinh khôi tươi (mg) Sinh khối tươi (mg) CuSO4-5 50.0 E-Ethyl- 500 50.0 E- Eth-500 E-Ethyl- 200 40.0 E-Eth-200 40.0 E-Ethyl- 100 E-Ethyl- 50 30.0 30.0 20.0 20.0 10.0 10.0 0.0 0.0 T0 T5 T0 T5 Hình 3.24. Sinh khối tươi của bèo L.minor dưới tác động của cao chiết tổng etanol (A) và cao chiết phân đoạn etyl axetat (B) tại thời điểm bắt đầu (T0) và sau 5 ngày (T5) Dưới ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol Mần tưới bèo L. minor vẫn gia tăng sinh khối theo thời gian. Ở công thức đối chứng, trọng lượng tươi gia tăng gấp hơn 3 lần sau 5 ngày phát triển với thời điểm ban đầu sinh khối tươi là 15,3 ± 2,7 mg và đạt giá trị 47,6 ± 2,66 mg tại ngày cuối. Sinh khối tươi với các mẫu E-Eth200, E-Eth500 và CuSO 4-5 tại ngày cuối lần lượt là 42,5 ±2,08; 35,6 ±2,69 và 6,20 ±0,41mg, cho hiệu quả ức chế tương ứng là 10,63; 25,18 và 86,93%. Đối với cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới hiệu quả ức chế ghi nhận từ 5,83 đến 10,87% tại nồng độ từ 50 đến 200 µg/mL. Khi tiếp xúc với cao chiết này ở nồng độ cao hơn bèo bị suy giảm khối lượng và chỉ đạt 9,0 ± 1,25 mg, tương ứng với hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết lên bèo là 77,76%. 0.70 A Chla Chlb Chl (a+b) Hàm lượng sắc tố quang hợp 0.60 0.50 (mg/gFW) 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 Control - L.minor CuSO4-5 E- Eth-500 E-Eth-200 B 0.70 Chla Chlb Chla + b 0.60 Hầm lượng sắc tố quang 0.50 hợp (mg/gFW) 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 Control- L.minor E-Ethyl- 50 E-Ethyl- 100 E-Ethyl- 200 E-Ethyl- 500 Hình 3.25 Hàm lượng sắc tố quang hợp của bèo L.minor dưới tác động của cao chiết etanol (A) và cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới (B) tại thời điểm bắt đầu (T0) và sau 5 ngày (T5)