Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài luận án đã xác định được bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Việt Nam do phytoplasma gây ra. Phytoplasma hại sắn tại Việt Nam thuộc 2 nhóm gồm 16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ CHUYÊN NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ: 62 62 01 12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2016
Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. HÀ VIẾT CƢỜNG 2. TS. TRỊNH XUÂN HOẠT Phản biện 1: PGS.TS. NGÔ BÍCH HẢO Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 2:PGS.TS. NGUYỄN KIM VÂN Hội Khoa học Kỹ thuật Bảo vệ thực vật Việt Nam Phản biện 3:TS. HÀ MINH THANH Viện Bảo vệ thực vật Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) được trồng nhiều ở các tỉnh phía nam Việt Nam với các vùng trồng tập trung, đem lại nguồn thu nhập cho người dân, góp phần ổn định tình hình kinh tế - xã hội. Sắn đã trở thành 1 trong 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng, có giá trị kinh tế cao của Việt Nam và là một trong những loại cây trồng được ưu tiên phát triển trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Ở nước ta trong những năm gần đây, trên cây sắn xuất hiện một loại bệnh mới được gọi là bệnh chổi phù thuỷ (hay bệnh chổi rồng) với biểu hiện triệu chứng đặc trưng do bị nhiễm phytoplasma, như cây mọc nhiều chồi phụ ở ngọn và phần thân chính, lá biến vàng. Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, năng suất giảm 10 - 30%, hàm lượng tinh bột giảm 20 - 30% (Nguyên Khê, 2011). Ở các khu vực tiến hành trồng lại hay trồng mới thuộc các tỉnh Đông Nam Bộ, bệnh chổi phù thuỷ sắn vẫn xuất hiện, gây quan ngại cho nông dân và chính quyền địa phương. Do nguyên nhân gây bệnh chưa được xác định chính xác nên việc quản lý bệnh gặp nhiều lúng túng. Ở một số vùng trồng sắn, nông dân đã tiến hành thử nghiệm các loại thuốc trừ nấm để xử lý hom và phun cho cây sắn khi xuất hiện bệnh chổi phù thuỷ. Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả phòng chống bệnh. Cây sắn bị nhiều bệnh gây hại khác nhau, trong đó có bệnh phytoplasma. Bệnh phytoplasma hại sắn đã được ghi nhận ở một số vùng trồng sắn trên thế giới như quần đảo Wallis-Futuna, Uganda, Cuba, một số nước thuộc châu Mỹ và châu Á. Phytoplasma gây hại trên cây sắn xác định được liên quan đến bệnh biến vàng lá, bệnh chổi phù thuỷ và bệnh da cóc. Ở Brazil, tại một số vùng trồng sắn thuộc phía đông bắc nước này, tỷ lệ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ lên đến 85% và làm giảm năng suất củ đến 70% (Flôres et al., 2013), thậm chí năng suất củ giảm sút đến 90% cũng đã được ghi nhận (Lozano, 1992). Phytoplasma là một tác nhân đặc biệt gây bệnh trên cây trồng. Con đường lan truyền của phytoplasma ngoài tự nhiên là qua nhân giống vô 1
tính và qua côn trùng môi giới. Do phytoplasma không nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo nên chẩn đoán và phân loại nhóm tác nhân gây bệnh này chủ yếu dựa trên phân tích một số vùng gen, quan trọng nhất là gen mã hóa 16S RNA ribosome (Bertaccini et al., 2014). Trên thế giới, phytoplasma gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác nhau và số lượng bệnh mới do phytoplasma gây ra tăng theo từng năm (Bertaccini et al., 2014). Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh phytoplasma trên cây trồng còn hạn chế. Các kết quả điều tra cơ bản trước đây đều chưa phát hiện ra bệnh phytoplasma ở Việt Nam. Gần đây, dựa trên đánh giá triệu chứng và chẩn đoán phân tử, nguyên nhân gây bệnh chồi cỏ mía và trắng lá mía đã được xác định là do phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013). Phòng chống hiệu quả bệnh cây nói chung và bệnh chổi phù thuỷ hại sắn nói riêng phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó, đầu tiên là phải xác định chính xác tác nhân gây bệnh và các đặc điểm sinh học của bệnh. Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn là một bệnh mới ở Việt Nam nên cần phải thực hiện nghiên cứu về bệnh, đặc biệt tại các tỉnh trọng điểm có dịch ở Đông Nam Bộ. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Chẩn đoán và phân loại được phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá được một số đặc điểm sinh học chính như tính gây bệnh và khả năng lan truyền của chúng. 1.3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Phytoplasma gây hại trên cây sắn, tập trung vào lĩnh vực chẩn đoán, phân loại và một số đặc điểm sinh học. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thủy hại sắn ở Đông Nam Bộ, xác định nguyên nhân phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn. Nghiên cứu biện pháp chẩn đoán xác định, phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn và khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn ở điều kiện chậu vại trong nhà lưới. 1.3.3. Địa điểm thời gian nghiên cứu Điều tra đồng ruộng, thu thập mẫu được thực hiện tại một số tỉnh Đông Nam Bộ gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình 2
Phước và Tây Ninh; một số tỉnh khác bao gồm Phú Thọ, Yên Bái, Quảng Ngãi và Kon Tum. Các nghiên cứu liên quan tới xác định đặc điểm sinh học được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc; nghiên cứu chẩn đoán, phân loại phytoplasma hại sắn thực hiện tại Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới. Thời gian thực hiện các thí nghiệm trong đề tài từ năm 2011 đến năm 2014. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đề tài đã xác định được bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Việt Nam do phytoplasma gây ra. Phytoplasma hại sắn tại Việt Nam thuộc 2 nhóm gồm 16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A). Riêng mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 (KM360166) ở Yên Bái thuộc nhóm 16SrI nhưng nằm trong nhóm phụ hoàn toàn mới, chưa được công bố. Áp dụng thành công kỹ thuật nhuộm mô cây bằng DAPI để phát hiện phytoplasma hại sắn tại Việt Nam. Thiết kế thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu để xác định phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn tại Đông Nam Bộ. Đề xuất được quy trình chẩn đoán phytoplasma hại sắn cho một số tỉnh Đông Nam Bộ. Cung cấp dẫn liệu khoa học về một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra. Xác định được con đường lan truyền chính của bệnh là qua nhân giống vô tính đã bị nhiễm bệnh. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Đã xác định được phytoplasma là nguyên nhân gây bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ, phân loại được phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc 2 nhóm 16SrI và 16SrII. Đã ứng dụng thành công các kỹ thuật để chẩn đoán, phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn như kính hiển vi điện tử, kỹ thuật nhuộm mô cây DAPI, kỹ thuật PCR lồng, kỹ thuật RFLP, kỹ thuật LAMP-PCR. Xác định được con đường lan truyền của phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn tại Đông Nam Bộ là chủ yếu qua nhân giống vô tính. 3
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Xác định được phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn, cũng như xác định được con đường lan truyền chủ yếu của phytoplasma hại sắn đã góp phần đưa ra biện pháp quản lý bệnh chổi phù thuỷ một cách có hiệu quả trong điều kiện sản xuất tại một số tỉnh Đông Nam Bộ. Biện pháp quan trọng nhất để quản lý bệnh là phát hiện bệnh sớm và sử dụng giống sạch bệnh. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. CÂY SẮN Cây sắn có nguồn gốc vùng nhiệt đới của châu Mỹ và được trồng cách đây 5.000 - 7.000 năm trước Công nguyên (Allem, 2002). Về phân loại, cây sắn có tên khoa học là Manihot esculenta Crantz, thuộc chi Manihot, họ Euphorbiaceae (Howeler et al., 2013). Sắn có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn gia súc và lương thực - thực phẩm. Củ sắn chứa nhiều tinh bột nên thường được chế biến thành bột sắn khô. Trong củ sắn tươi có chứa đến 80% hàm lượng carbonhydrate, canxi (50 mg/100 g), phốtpho (40 mg/100 g), vitamin (25 mg/100 g) và các chất dinh dưỡng khác. Lá sắn là một nguồn cung cấp protein, có chứa nhiều axít amin cần thiết nhưng thiếu lysine, methionine và tryptophan (Ravindran, 1992). Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của toàn thế giới trong giai đoạn 10 năm từ năm 1999 đến năm 2009 đều tăng, các chỉ số này vào năm 1999 lần lượt là 16,85 triệu ha; 10,09 tấn/ha và 170,01 triệu tấn, đến năm 2009 các chỉ số này là 18,92 triệu ha; 12,36 tấn/ha và 233,80 triệu tấn (FAOSTAT, 2014). Năng suất sắn củ tươi bình quân của thế giới đạt 12,38 tấn/ha vào năm 2009. Ấn Độ là nước có năng suất sắn cao nhất thế giới (34,36 tấn/ha), kế tiếp là Thái Lan (22,68 tấn/ha) và Indonesia (18,74 tấn/ha). Thái Lan là nước xuất khẩu sắn khô lớn nhất, chiếm 77% sản lượng xuất khẩu của thế giới trong năm 2005. Nước xuất khẩu sắn khô lớn thứ hai là Việt Nam (13,6%), tiếp theo là In-đô-nê-xi-a (5,8%) và Costa Rica (2,1%) (FAOSTAT, 2014). 4
Theo số liệu của Tổng cục Thống kê (2014), diện tích cây sắn ở Việt Nam vào năm 1995 có khoảng 277,4 nghìn ha với sản lượng là 2211,5 nghìn tấn; các chỉ số này đến năm 2012 lần lượt là 551,9 nghìn ha và 9735,4 nghìn tấn. Năm 2011, diện tích trồng sắn là cao nhất (558,4 nghìn ha), với sản lượng cũng cao nhất (9897,9 nghìn tấn). 2.2. PHYTOPLASMA HẠI THỰC VẬT Hiện nay, về phân loại, tất cả phytoplasma được xếp vào chi ‘Candidatus Phytoplasma’ (‘Ca. Phytoplasma’), bộ Acholeplasmatales, lớp Mollicutes, ngành Firmucutes (IRPCM, 2004; Hogenhout et al., 2008). Dựa trên cơ sở so sánh chuỗi gen mã hóa 16S RNA ribosome, các loài thuộc chi ‘Ca. Phytoplasma’ được xếp vào 33 nhóm phả hệ khác nhau (ký hiệu từ 16SrI đến 16SrXXXIII). Phytoplasma là tác nhân gây bệnh nhiễm hệ thống, giới hạn trong mạch phloem, nên truyền qua nhân giống vô tính như ghép, củ giống, hom giống, thân ngầm, là con đường lan truyền quan trọng, có thể được xem là quan trọng nhất đối với các loài cây được nhân giống vô tính. Tuy nhiên, phytoplasma không truyền được qua tiếp xúc cơ học vì khi phytoplasma được đưa vào tế bào biểu bì hoặc nhu mô thì chúng cũng không có khả năng di chuyển xuống tế bào ống rây của mạch phloem (Lee et al., 2000; Christensen et al., 2005; Duduk and Bertaccini, 2006). Tơ hồng (Cuscutas spp.) là loại thực vật không có diệp lục ký sinh trên thực vật. Vì có đặc điểm ký sinh khá đặc biệt nên tơ hồng có thể truyền dễ dàng phytoplasma và do đó thường được sử dụng như một loại vector hiệu quả để truyền phytoplasma sang cây thí nghiệm (Přibylová and Špak, 2013). Phytoplasma không được xem là tác nhân gây bệnh truyền qua hạt (Lee et al., 2000). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, phytoplasma có thể phát hiện thấy ở vỏ hạt nhưng không thể truyền sang cây con (Faghihi et al., 2011). Các nghiên cứu lan truyền đã chứng tỏ côn trùng chích hút là môi giới quan trọng nhất của các bệnh phytoplasma nhiễm trên cây trồng từ hạt. Tất cả các loài côn trùng môi giới của phytoplasma đều thuộc bộ Hemiptera. Các loài côn trùng thuộc bộ Hemiptera có hành vi chích hút 5
khá đa dạng, có nhóm chích hút ở mạch phloem, có nhóm chích hút ở mạch xylem. Do phytoplasma chỉ giới hạn ở mạch phloem nên chỉ nhóm côn trùng chích hút ở loại mô này mới có khả năng truyền chúng (Wilson and Weintraub, 2007). Hiện có ít nhất 102 loài côn trùng chích hút bộ Hemiptera đã được xác định là côn trùng môi giới của phytoplasma, phần lớn thuộc họ Rầy xanh (Cicadellidae). Phytoplasma không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo nên chẩn đoán loại tác nhân gây bệnh này khá phức tạp. Chính vì vậy, đối với bệnh phytoplasma, ngoài triệu chứng, nhiều biện pháp chẩn đoán khác thường được sử dụng gồm 2 nhóm chính là (i) chẩn đoán trực tiếp phytoplasma trong tế bào bằng hiện vi điện tử hoặc nhuộm mô bằng thuốc nhuộm huỳnh quang; và (ii) chẩn đoán gián tiếp bằng các phân tích phân tử như phản ứng trùng hợp chuỗi acid nucleic (polymerase chain reaction, PCR), giải trình tự... Để phòng chống bệnh phytoplasma gây hại trên cây trồng, các biện pháp sau thường được áp dụng trong sản xuất: i) Chọn giống chống bệnh, sử dụng cây sạch bệnh; ii) Nhổ bỏ, tiêu hủy tàn dư cây bệnh, kết hợp với vệ sinh đồng ruộng; iii) Không vận chuyển, trao đổi hom giống từ các vùng bị bệnh đến các vùng chưa bị bệnh, hay vùng trồng mới. Tổ chức sản xuất và kiểm tra giống sạch bệnh trước khi trồng; iv) Tiêu diệt côn trùng môi giới truyền bệnh (nếu có) và trong một số trường hợp, có thể xử lý hom giống bằng nước nóng hoặc hơi nước nóng. 2.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH PHYTOPLASMA HẠI SẮN Bệnh phytoplasma hại sắn được phát hiện thấy tại nhiều vùng trên thế giới như vùng Wallis-Futuna, Uganda, Cuba; một số nước thuộc châu Mỹ như Bra-xin, Cô-lôm-bia, Costa Rica, Peru, Panama, Venezuela; một số nước thuộc châu Á như Việt Nam, Thái Lan, Cam-pu-chia và Trung Quốc. Phytoplasma hại sắn xác định được liên quan đến bệnh chổi phù thuỷ (Frison and Feliu, 1991; Davis et al., 2005; Alvarez et al., 2013; Flôres et al., 2013; Alvarez et al., 2014), bệnh biến vàng lá (Arocha et al., 2009a, 2009b) và bệnh da cóc (Alvarez et al., 2009; Souza et al., 2014; Oliveira et al., 2014). 6
Cho đến hiện nay, có 3 dạng triệu chứng bệnh do phytoplasma hại sắn trên thế giới đã được mô tả, bao gồm: i) Bệnh chổi phù thuỷ (witches’ broom), ii) Bệnh biến vàng lá (yellowing), iii) Bệnh da cóc (frog skin). Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn được ghi nhận lần đầu ở các bang Ceara, Pernambuco, Sao Paula thuộc Brazil và phía nam Mê-hi- cô. Lúc đó, tác nhân gây bệnh được xác định là do phytoplasma gây ra (Costa and Kitajima, 1972); bệnh được xác định lan truyền qua hom giống nhưng không lan truyền qua tiếp xúc cơ học. Hiện nay trên thế giới, phytoplasma hại sắn được phân loại vào 8 nhóm khác nhau dựa trên giải trình tự vùng gen 16S RNA ribosome. Các nhà khoa học, các chuyên gia về bệnh cây tại Trung tâm Nông nghiệp nhiệt đới Quốc tế (CIAT), Đại học Bologna (I-ta-li-a), và các nước khác như Bra-xin, Cuba, Cô-lôm-bi-a, Ốt-xtrây-li-a,...đều xác định nguyên nhân gây bệnh là phytoplasma hại sắn được dựa chủ yếu vào kỹ thuật sinh học phân tử; việc xác định một số đặc trưng sinh học của bệnh vẫn còn rất hạn chế, trong 43 năm qua (từ năm 1972 đến 2015), việc xác định loài côn trùng có khả năng lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn vẫn chưa được tìm thấy. 2.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU BỆNH PHYTOPLASMA HẠI THỰC VẬT Ở VIỆT NAM Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh phytoplasma gây hại trên cây trồng vẫn còn rất ít. Nghiên cứu ở mức giải trình tự gen đầu tiên đối với phytoplasma là một nghiên cứu của các nhà khoa học Anh và Mỹ thực hiện trên cây xoan ta (Melia azedarach) bị bệnh biến vàng thu thập tại Huế năm 2003. Đến nay, một số phytoplasma được xác định ở mức giải trình tự gen do các nhà nghiên cứu Việt Nam thực hiện, phát hiện tác nhân gây bệnh chồi cỏ mía, bệnh trắng lá mía đều do phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013); bệnh diệp hóa cây vừng, bệnh chổi phù thuỷ đậu tương và một số bệnh trên một số loài cây khác do phytoplasma gây ra (Nguyễn Đức Thành và cs., 2012, 2013, 2014). 7
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất nghiên cứu Các giống sắn KM94, KM419 và SM937-26. Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR, máy huỳnh quang, máy li tâm để bàn, máy cắt tiêu bản, cân điện tử, bể nhiệt. Hóa chất dùng trong phản ứng PCR. Hóa chất dùng trong phản ứng LAMP-PCR. Các hóa chất khác: agarose, chloroform/isoamyl alcohol (24/1), glutaraldehyde,…có nguồn gốc từ các hãng Wako (Nhật Bản), Fermentas (Đức). 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu  Viện Bảo vệ thực vật, Bắc Từ Liêm, thành phố Hà Nội.  Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội.  Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc - xã Hưng Thịnh, huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai. 3.1.3. Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ năm 2011 đến năm 2014. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn. - Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR. - Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn. - Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn. - Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra. 3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phát hiện phytoplasma trên sắn bằng kính hiển vi điện tử truyền qua trên máy JEOL 1010 và nhuộm với DAPI. - DNA tổng số được tách chiết bằng CTAB theo tài liệu mô tả của Doyle and Doyle (1990). Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp được 8
thực hiện theo tài liệu của Deng and Hiruki (1991), Lee et al. (1994), Schneider et al. (1995), Gundersen and Lee (1996). - Tinh chiết sản phẩm PCR dùng QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. - Phân tích RFLP thực hiện mô phỏng bằng chương trình pDRAW32. - Sử dụng các phần mềm tin sinh học như ClustalW2, BioEdit 7.0. Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining trong MEGA 5.0. - Các mồi LAMP-PCR được thiết kế sử dụng phần mềm Primer Explorer V4. Các mồi LAMP-PCR thiết kế gồm CWB-F3, CWB-B3, CWB-FIP, CWB-BIP, CWB-F-loop, CWB-B-loop được tổng hợp bởi hãng Macrogen (Hàn Quốc). 3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu thu thập được xử lý trong Microsoft Office Excel. Số liệu thí nghiệm được tính toán, xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai bằng chương trình IRRISTAT 4.0. PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. PHÁT HIỆN PHYTOPLASMA HẠI SẮN BẰNG HIỂN VI ĐIỆN TỬ, NHUỘM MÔ VÀ PCR 4.1.1. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng hiển vi điện tử Việc sử dụng hiển vi điện tử truyền qua được thực hiện vào hai đợt trong năm 2011 nhằm phát hiện phytoplasma trên cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ tại vùng Đông Nam Bộ. Đợt 1 (tháng 4 năm 2011) thử nghiệm 3 mẫu cây sắn giống KM94 bị bệnh chổi phù thuỷ được thu thập trên đồng và 1 mẫu cây sắn khỏe. Đợt 2 (tháng 11 năm 2011) thử nghiệm 2 mẫu cây sắn giống KM94 bị bệnh chổi phù thuỷ được thu thập trên đồng và 1 mẫu cây sắn khỏe. Kết quả hiển vi điện tử chỉ quan sát, phát hiện được các thể phytoplasma với dạng hình tròn, hình oval với kích thước từ 108 - 199 nm trong tế bào tế bào ống rây của mạch phloem cây sắn biểu hiện triệu 9
chứng bệnh chổi phù thuỷ nhưng không thấy sự hiện diện của chúng trong tế bào ống rây của mạch phloem cây sắn không bị bệnh. Ngoài ra, không phát hiện thấy tác nhân gây bệnh nào khác trong tế bào ống rây của mạch phloem cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ và cây không bị bệnh. Phương pháp hiển vi điện tử đã xác định sự có mặt của phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch phloem cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ tại các tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu và Đồng Nai thuộc Đông Nam Bộ. 4.1.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô Kỹ thuật nhuộm mô bằng DAPI được thực hiện vào tháng 02 năm 2014 dựa theo tài liệu mô tả của Andrade and Arismendi (2013) nhằm phát hiện phytoplasma trên giống sắn KM94 bị bệnh chổi phù thuỷ (4 mẫu) và giống sắn KM94 không bị bệnh (4 mẫu). Kết quả thí nghiệm nhuộm mô cây bằng kỹ thuật DAPI đã phát hiện được các thể phytoplasma trong mẫu cây bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ nhưng không phát hiện thấy trên mẫu cây khỏe. Kỹ thuật này dễ áp dụng, thực hiện đơn giản và ít tốn kém, tuy nhiên, kỹ thuật nhuộm DAPI không định danh được tác nhân gây bệnh là phytoplasma. 4.1.3. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR 4.1.3.1. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR lồng với cặp mồi R16F2n/R16R2 Đầu tiên, phản ứng PCR lồng được thực hiện dùng 2 tổ hợp mồi là P1/P7 (bước 1) và R16F2n/R16R2 (bước 2). P1/P7 - R16F2n/R16R2 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1200 bp Hình 4.1. Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp mồi P1/P7-R16F2n/R16R2 M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 18: các mẫu thử nghiệm; Kích thước sản phẩm PCR được chỉ rõ bằng mũi tên 10
Kết quả kiểm tra PCR cho thấy 35/57 (61,4%) mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ thu tại 7 tỉnh gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Quảng Ngãi, Đồng Nai, Kon Tum, Bình Phước, Phú Thọ và Yên Bái đều tạo sản phẩm PCR với kích thước mong muốn ~1,2 kb (hình 4.1). Các mẫu thử này đều là gân lá của cây sắn nhiễm bệnh, trong khi đó, các mẫu thử là lõi thân chính, vỏ thân chính, vỏ củ và lá ngọn của cây sắn nhiễm bệnh đều không tạo sản phẩm PCR trên bản điện di (22/57 mẫu thử, chiếm 38,6%). 4.1.3.2. Phát hiện phytoplasma bằng kỹ thuật PCR lồng với cặp mồi R16mF2/R16mR1 Một thí nghiệm PCR bổ sung nhằm phát hiện phytoplasma trên các mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ được thu thập tại một số tỉnh khác nhau trong đó có các tỉnh thuộc Đông Nam Bộ. Phản ứng PCR lồng được thực hiện dùng 2 tổ hợp mồi là P1/P7 (bước 1) và R16mF2/R16mR1 (bước 2) cũng được sử dụng nhằm phát hiện phytoplasma gây hại trên cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ. Kết quả kiểm tra PCR lồng dùng hai cặp mồi P1/P7 - R16mF2/R16mR1 trên 26 mẫu sắn bệnh cho thấy 20/26 (76,9%) mẫu thử đã tạo sản phẩm PCR với kích thước mong muốn ~1,4 kb. Cần chú ý là có 14 mẫu kiểm tra trong thí nghiệm này (gồm các mẫu: BRVT-01, BRVT-02, BRVT-03, QNg-01, QNg-02, QNg-03, ĐN-01, ĐN-02, ĐN- 03, KT-01, KT-02, KT-03, YB-01 và YB-02) đều là các mẫu đã được kiểm tra với 2 cặp mồi P1/P7-R16F2n/R16R2 ở trên. Nghiên cứu của phần này, dựa trên cả các kỹ thuật chẩn đoán truyền thống cũng như PCR, đã lần đầu tiên xác định được sự có mặt của phytoplasma trong cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ ở Việt Nam, đặc biệt ở vùng trồng sắn trọng điểm bị dịch bệnh chổi phù thuỷ tại Đông Nam Bộ. Kết quả kiểm tra PCR cũng gợi ý có sự đa dạng về trình tự gen mã hóa 16S RNA ribosome của các phytoplasma nhiễm trên các mẫu này. 4.2. ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHYTOPLASMA HẠI SẮN 4.2.1. Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR Trong tổng số 83 sản phẩm PCR từ 67 mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ thu tại 8 tỉnh được giải trình tự, cuối cùng thu được 19 mẫu có chất lượng trình tự tốt. Tìm kiếm trình tự tương đồng trên Ngân hàng 11
Gen bằng phần mềm BLAST cho thấy tất cả 19 mẫu này có trình tự trùng khớp với trình tự gen mã hóa 16S RNA ribosome của phytoplasma gây bệnh cây. Do đó, khẳng định nguyên nhân gây bệnh chổi phù thuỷ sắn tại Việt Nam là do phytoplasma gây ra. Ngoài ra, kết quả giải trình tự và tìm kiếm BLAST cũng cho thấy các mồi chung P1, P7, R16F2n, R16R2, R16mF2 và R16mR2 có tính đặc hiệu cao trong chẩn đoán bệnh phytoplasma trên sắn tại Việt Nam. Trình tự của 19 mẫu này có độ dài phù hợp, đủ để phân tích định danh dựa trên so sánh trình tự, phân tích đa hình RFLP và phả hệ, do vậy đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen. 4.2.2. Kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP Phân tích RFLP mô phỏng (virtual RFLP) là công cụ phân loại và định danh rất hữu hiệu đối với phytoplasma. Kỹ thuật này được thực hiện bởi một số phần mềm như pDRAW32 cho phép so sánh mô hình cắt của 1 bộ gồm 17 enzym cắt giới hạn khác nhau trên trình tự gen mã hóa 16S RNA ribosome (Lee et al., 2000). Có 9 enzym cắt AluI, BfaI, HaeIII, HpaII, KpnI, MseI, RsaI, Sau96I và TaqI cho kết quả sai khác, phân biệt rõ ràng giữa các mô hình cắt của phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (12/25 mẫu) so với nhóm 16SrII (11/25 mẫu), so với nhóm 16SrIIII (1/25 mẫu) và so với nhóm 16SrXV (1/25 mẫu). Enzym KpnI, MseI RsaI và được coi là enzym khóa để phân biệt các nhóm phytoplasma khác nhau. Đối với mô hình cắt của phytoplasma thuộc nhóm 16SrI, enzym KpnI tạo ra 3 vạch băng có kích thước khoảng 42, 188 và 473 bp trên bản điện di. Còn enzym MseI tạo ra 5 vạch băng có kích thước khoảng 41, 45, 56, 265 và 288 bp trên bản điện di; enzym RsaI tạo ra 6 vạch băng có kích thước khoảng 16, 44, 55, 73, 131 và 336 bp đối với các trình tự thuộc nhóm 16SrI sai khác hẳn so với nhóm 16SrII, 16SrIII và 16SrXV. Dựa trên mức tương đồng di truyền của các mẫu, mối quan hệ di truyền của các mẫu cũng được xác định dùng phần mềm NTSYSpc với khoảng cách di truyền được xác định theo phương pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng (unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA) (hình 4.2). 12
Dựa trên mô hình cắt của các mẫu, mức tương đồng di truyền của 26 mẫu đã được xác định dựa trên phân tích hệ số tương đồng của Nei and Li (1979). Hình 4.2. Cây đƣợc vẽ theo phƣơng pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng (UPGMA) Kết quả phân tích cho thấy 9 mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam, BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17 ĐN-34, BP-01, ĐN- 02 và YB-02, có hệ số tương đồng gần gũi nhất với 2 mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (mã truy cập M30790 và AY787139), từ 77% đến 100%. Trên cây phả hệ, cả 9 mẫu này cũng phân nhóm với 2 mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrI-A và 16SrI-B. Phân tích cũng cho thấy 9 mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam, BRVT-02, QNg-19.2, BR-5, BR-7.2, BR-9.1, T7-ĐN, T11-QNg, T18-TN và T19-BRVT, có hệ số tương đồng gần gũi nhất với 2 mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrII, nhóm phụ 16SrII-A (mã truy cập JQ957931 và L33765), với giá trị từ 94% đến 100%. Tương tự, trên cây 13
phả hệ, cả 9 mẫu trên phân nhóm rõ ràng với 2 mẫu phytoplasma nhóm 16SrII, nhóm phụ 16SrII-A. Đáng chú ý, mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 ở Yên Bái mặc dù có quan hệ gần gũi với các mẫu nhóm 16SrI nhưng có hệ số tương đồng khá thấp với các mẫu phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI, từ 63% đến 78%. Phân tích đã cho thấy mẫu YB-01 thuộc một nhóm phụ mới trong nhóm 16SrI. Như vậy, phân tích RFLP mô phỏng dùng 17 enzym cắt giới hạn đã xác định phytoplasma hại sắn tại Việt Nam gồm ít nhất 2 nhóm, 16SrI và 16SrII. 4.3. ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHYTOPLASMA HẠI SẮN 4.3.1. Kết quả định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide Ngoài phân tích RFLP mô phỏng, tiến hành so sánh mức đồng nhất trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome của 26 mẫu phytoplasma thử nghiệm. Kết quả phân tích cho thấy 9 mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam, BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17 ĐN-34, BP-01, ĐN- 02 và YB-02, có mức đồng nhất trình tự nucleotide gần gũi nhất với 2 mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (mã truy cập M30790 và AY787139), với giá trị từ 98% đến 100%. Phân tích cũng cho thấy 9 mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam, BRVT-02, QNg-19.2, BR-5, BR-7.2, BR-9.1, T7-ĐN, T11-QNg, T18-TN và T19-BRVT, có mức đồng nhất trình tự nucleotide gần gũi nhất với 2 mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrII, nhóm phụ 16SrII-A (mã truy cập JQ957931 và L33765), với giá trị từ 99% đến 100%. 4.3.2. Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide 4.3.2.1. Phân tích phả hệ các nhóm phytoplasma hại sắn Nhằm hiểu rõ hơn mối quan hệ của các mẫu phytoplasma hại sắn với các phytoplasma khác, phân tích phả hệ dựa trên trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome đã xác định được. Đầu tiên, quan hệ phả hệ của 19 mẫu trong nghiên cứu này được phân tích với đại diện của 28 nhóm phytoplasma được ghi nhận cho tới nay (hình 4.3). 14
Hình 4.3. Cây phả hệ xác định nhóm phytoplasma hại sắn đƣợc vẽ theo phƣơng pháp Neighbor-Joining  Trình tự của phytoplasma hại sắn ở Việt Nam xác định được trong nghiên cứu này. Giá trị bootstrap (%) được chỉ rõ ở gốc các nhánh. Tên của nhóm phytoplasma ở phía bên tay phải. 15
Kết quả phân tích phả hệ cho thấy có 10/19 (52,6%) mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam trong nghiên cứu này, BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17 ĐN-34, BP-01, ĐN-02, YB-01 và YB-02, phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap 97%) với tất cả 3 mẫu phytoplasma nhóm 16SrI gồm phytoplasma hại sắn (AY787139) ở Wallis - Futuna, hại cúc tây (NC_007716, M30790) ở Hoa Kỳ. Tương tự như kết quả phân tích RFLP mô phỏng ở trên, mẫu YB-01 hình thành một nhánh riêng biệt trong cụm nhóm 16SrI. Cả 9/19 (47,4%) mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam còn lại đã phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap 97%) với các đại diện của phytoplasma nhóm 16SrII gồm phytoplasma hại sắn tại Trung Quốc (JQ957931), hại lạc tại Đài Loan (L33765). Như vậy, phân tích phả hệ dựa trên trình tự cho kết quả tương tự với các phân tích RFLP mô phỏng và so sánh trình tự. Các mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam được xếp vào 2 nhóm phytoplasma gồm nhóm 16SrI và 16SrII trong hệ thống phân loại phytoplasma (Lee et al., 1998; Bertaccini et al., 2014). 4.3.2.2. Phân tích phả hệ nhóm phụ của phytoplasma thuộc nhóm 16SrI Tiếp theo, nhằm làm rõ hơn vị trí phân loại, xác định nhóm phụ của các mẫu phytoplasma nhóm 16SrI hại sắn, sử dụng 10 mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc nhóm 16SrI trong nghiên cứu này đã được phân tích với 29 mẫu đại diện của 16 nhóm phụ được xác định cho tới nay (hình 4.4). Kết quả phân tích phả hệ cho thấy, có 9/10 mẫu (90%) gồm BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17, ĐN-34, BP-01, ĐN-02 và YB-02, phân nhóm rõ rệt, cùng cụm với phytoplasma gây bệnh biến vàng cúc tây (M30790, EU215426, AY265210), lục hóa dừa cạn (HM590621), biến vàng gân báo xuân (HM590623), lục hóa cải dầu (HM590625), lục hóa cây anh thảo (HM590616) và chúng đều thuộc nhóm phụ B (16SrI-B). 16
Hình 4.4. Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI  Trình tự của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI ở Việt Nam. Tên viết tắt, mã truy cập trên Ngân hàng Gen nằm trong dấu ngoặc đơn 17
4.3.2.3. Phân tích phả hệ nhóm phụ của phytoplasma thuộc nhóm 16SrII Tiếp theo, nhằm làm rõ hơn vị trí phân loại, xác định nhóm phụ của các mẫu phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn, sử dụng 9 mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc nhóm 16SrII trong nghiên cứu này đã được phân tích với 9 mẫu đại diện của 5 nhóm phụ được xác định cho tới nay trong hệ thống phân loại phytoplasma của Lee et al. (1998), Bertaccini et al. (2014). Kết quả trình bày ở hình 4.5. Hình 4.5. Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII  Trình tự của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII ở Việt Nam. Tên viết tắt, mã truy cập trên Ngân hàng Gen nằm trong dấu ngoặc đơn Kết quả phân tích phả hệ cho thấy, tất cả 9/9 phytoplasma hại sắn của Việt Nam, gồm BRVT-02, QNg-19.2, BR-5, BR-7.2, BR-9.1, T7- ĐN, T11-QNg, T18-TN và T19-BRVT, đã phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap 99%) với các đại diện của phytoplasma nhóm 16SrII gồm phytoplasma hại sắn tại Trung Quốc (JQ957931), hại lạc tại Đài Loan (L33765), và chúng đều thuộc nhóm phụ A (16SrII-A). 18