Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, biện pháp kỹ thuật nhân giống và trồng cây Bát giác liên (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe) tại Sa Pa, Lào Cai

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

7
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án "Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, biện pháp kỹ thuật nhân giống và trồng cây Bát giác liên (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe) tại Sa Pa, Lào Cai" nhằm góp phần xác định được 1-2 mẫu giống Bát giác liên có năng suất, chất lượng dược liệu cao và đề xuất biện pháp kỹ thuật nhân giống, trồng cây Bát giác liên phù hợp tại Sa Pa, Lào Cai.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, biện pháp kỹ thuật nhân giống và trồng cây Bát giác liên (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe) tại Sa Pa, Lào Cai

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ PHẠM NGỌC KHÁNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC, BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÀ TRỒNG CÂY BÁT GIÁC LIÊN (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe) TẠI SA PA, LÀO CAI Chuyên ngành: Khoa học cây trồng Mã số: 9 62 01 10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2023 1
Công trình được hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS Ninh Thị Phíp 2. PGS.TS Phạm Thanh Huyền Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bát giác liên (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe) là loài cây thuốc quý hiếm thuộc chi Dysosma được sử dụng trong y học cổ truyền của Việt Nam để chữa rắn cắn, ung nhọt, và làm thuốc giải độc, tiêu phù (Đỗ Tất Lợi, 2004; Đỗ Huy Bích & cs., 2006). Những nghiên cứu về hóa học đã xác định trong thân ngầm và rễ của Bát giác liên có chứa podophyllotoxin (Nguyễn Thị Dung & cs., 2018) là hợp chất đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư (Tan & cs., 2018; Wang & cs., 2019; Karuppaiya & Tsay, 2019; Karuppaiya & Wu, 2020; Bui Van Thanh & cs., 2022). Do đó Bát giác liên là đối tượng cây dược liệu rất có tiềm năng để phát triển, tạo nguyên liệu bào chế thuốc theo hướng điều trị ung thư trên Thế giới (Feng & cs., 2022; Kousar & cs., 2022). Do tình trạng khai thác quá mức để sử dụng làm thuốc trong cộng đồng các dân tộc và khai thác với mục đích thương mại trong thời gian dài; đồng thời nạn chặt phá rừng, tập quán đốt nương làm rẫy, mở rộng diện tích đất canh tác tại nhiều nơi đã ảnh hưởng trực tiếp và thu hẹp môi trường sống của cây. Nên nguồn gen Bát giác liên trong tự nhiên ngày càng bị suy giảm rất nghiêm trọng, được đưa vào Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (2006), Sách đỏ Việt Nam (2007) với mức đánh giá nguy cấp (EN) và khuyến cáo bảo tồn nguyên vị, thu thập nguồn gen để nhân giống và bảo tồn ngoại vi (Ex situ) tại các cơ sở có chức năng để đảm bảo sự an toàn cho nguồn gen quý hiếm này. Hiện nay những nghiên cứu về đa dạng nguồn gen cũng như nhân giống và trồng trọt loài Bát giác liên (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe) còn rất ít, tập trung chủ yếu vào nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học của hoạt chất được chiết từ dược liệu. Xuất phát từ thực tiễn nêu trên, việc thực hiện nghiên cứu để cung cấp dẫn liệu khoa học về đặc điểm nông sinh học và nhân giống, trồng cây Bát giác liên phục vụ cho mục đích bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen quý này là hết sức cần thiết. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu góp phần xác định được 1-2 mẫu giống Bát giác liên có năng suất, chất lượng dược liệu cao và đề xuất biện pháp kỹ thuật nhân giống, trồng cây Bát giác liên phù hợp tại Sa Pa, Lào Cai. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Thu thập và đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống Bát giác liên, từ đó chọn ra được 1-2 mẫu giống có tiềm năng về năng suất và chất lượng tốt phục vụ công tác phát triển dược liệu Bát giác liên tại Sa Pa, Lào Cai; - Từ mẫu giống Bát giác liên đã chọn lọc:
+ Xác định được một số biện pháp kỹ thuật nhân giống hữu tính và nhân giống vô tính cây Bát giác liên; + Xác định được một số biện pháp kỹ thuật trồng cây Bát giác liên tại Sa Pa, Lào Cai. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu Các mẫu giống Bát giác liên được thu thập ở Việt Nam từ năm 2014 đến năm 2017 và trồng đánh giá tại Trung tâm nghiên cứu dược liệu Sa Pa. 1.3.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ năm 2017 đến năm 2022. 1.3.3. Địa điểm nghiên cứu - Đánh giá đặc điểm hình thái, sinh trưởng, phát triển, nhân giống và trồng cây Bát giác liên được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu dược liệu Sa Pa - Viện Dược liệu; - Nghiên cứu đặc điểm giải phẫu các bộ phận sinh dưỡng và sinh sản được thực hiện tại Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Trung tâm Tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu; - Nghiên cứu về phân loại cây Bát giác liên dựa trên trình tự gen ITS được thực hiện tại Bảo tàng Thiên Nhiên Việt Nam – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; - Nghiên cứu đa dạng di truyền các mẫu giống Bát giác liên được thực hiện tại Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam; - Đánh giá hàm lượng podophyllotoxin trong dược liệu Bát giác liên tại Khoa Hóa phân tích Tiêu chuẩn– Viện Dược liệu. 1.3.4. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá đặc điểm nông sinh học các mẫu giống Bát giác liên; - Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cây Bát giác liên; - Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật trồng cây Bát giác liên. 1.4. NHỮNG ĐÓP GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Từ 20 mẫu giống Bát giác liên (D.tonkinense) thu thập, đã xác định được các đặc điểm nông sinh học, đa dạng di truyền giữa các mẫu giống và tuyển chọn được mẫu giống Bát giác liên M11 thu tại Vị Xuyên – Hà Giang. Mẫu giống này có đặc điểm thân ngầm dạng chuỗi với các đốt hình trụ dẹt; thân khí sinh màu xanh nhạt, mặt trên phiến lá có vết loang hình đa giác màu nâu đỏ, tràng hoa màu đỏ đậm; có đặc điểm sinh trưởng phát triển tốt với năng suất dược liệu đạt 11,75 tạ/ha và hàm lượng hoạt chất podophyllotoxin cao (đạt 3,51%), phù hợp để phát triển sản xuất dược liệu tại Sa Pa, Lào Cai; - Xác định được một số biện pháp kỹ thuật nhân giống hữu tính Bát giác liên: sử dụng phương pháp thụ phấn chéo khác mẫu giống và cắt tỉa quả non, để lại 1-2 quả/cây;
hạt giống mới thu hoạch từ quả chín được tách bỏ lớp áo hạt, đãi sạch, để ráo và gieo hạt tươi cho tỷ lệ mọc mầm cao. Xác định một số biện pháp kỹ thuật nhân giống vô tính bằng đoạn hom thân ngầm gồm 3 đốt được cắt tại vị trí đầu thân ngầm vào thời vụ tháng 5. Đồng thời xác định rễ cây có thể hình thành chồi bất định sau khi tách khỏi thân ngầm và xây dựng biện pháp kỹ thuật nhân giống vô tính bằng hom rễ, với thời vụ giâm hom vào tháng 5, hom dài 15 cm được cắt tại vị trí cuối rễ; ngâm hom rễ trong dung dịch BA 10 ppm trong 2 giờ, vớt ra để ráo trong 1 giờ sau đó ngâm trong dung dịch GA3 175 ppm trong 2 giờ sau đó đem giâm cho tỷ lệ hom bật mầm cao nhất; - Xây dựng được biện pháp kỹ thuật trồng sản xuất dược liệu Bát giác liên với thời vụ trồng cho tỷ lệ cây sống cao vào tháng tháng 11, cây được trồng với mật độ 62.000 cây/ha (tương ứng khoảng cách trồng 40 x 40 cm), lượng phân bón thích hợp gồm 20 tấn phân hữu cơ hoai mục + 70 kg N + 140 kg P2O5 + 70 kg K2O và chế độ che sáng phù hợp cho cây là 60%. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học - Bổ sung và cung cấp những thông tin khoa học mới, có giá trị về đặc điểm nông sinh học, đa dạng di truyền và trình tự gen vùng ITS của nguồn gen Bát giác liên giúp sử dụng đúng loài và góp phần vào công tác chọn tạo giống có năng suất, chất lượng; - Là tài liệu tham khảo có giá trị phục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu về cây dược liệu nói chung và cây Bát giác liên nói riêng. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp dẫn liệu khoa học mới có giá trị về mẫu giống Bát giác liên M11 có tiềm năng về năng suất và chất lượng; khả năng nhân giống hữu tính bằng hạt, nhân giống vô tính bằng hom thân ngầm, hom rễ; kỹ thuật nhân giống và trồng trọt sơ bộ cho cây Bát giác liên góp phần bảo tồn, khai thác và và phát triển có hiệu quả nguồn gen Bát giác liên. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY BÁT GIÁC LIÊN Bát giác liên là tên gọi của các loài cây thuộc chi Dysosma Woodson có nguồn gốc ở Việt Nam và Trung Quốc. Đã có 9 loài thuộc chi Dysosma Woodson được ghi nhận, với 8 loài đặc hữu tại Trung Quốc; D. villosa là loài mới nhất mới được phát hiện tại tỉnh Quý Châu (Trung Quốc) (Wang & cs., 2019). Tại Việt Nam, hiện mới ghi nhận 1 loài Bát giác liên có tên khoa học D. tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe (syn: Podophyllum tonkinense Gagnep.) mọc hoang tại một số tỉnh miền núi phía Bắc, được thu hái củ (thân ngầm) và rễ để làm thuốc (Phạm Hoàng Hộ, 1997; Đỗ Tất Lợi, 2004, Nguyễn Tiến Bân và & cs., 2007). Có những quan điểm khác nhau về loài Bát giác liên tại Việt Nam, trong đó Shaw & cs. (2002) cho rằng loài D. tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe phân bố ở Việt Nam là đồng danh
của loài D. versipellis, trong khi Ying & cs. (2011) lại cho rằng loài đó là đồng danh của loài D. difformis phân bố ở Trung Quốc. Điều này đặt ra thực tiễn phải nghiên cứu về phân loại để xác định chính xác loài Bát giác liên đang được thu hái trong tự nhiên để làm dược liệu ở nước ta. Do đó, bên cạnh phương pháp so sánh hình thái là phương pháp truyền thống trong phân loại thực vật thì việc kết hợp với phương pháp sinh học phân tử - giải trình tự gen của loài Bát giác liên để giám định loài là cần thiết. Theo y học cổ truyền tại Trung Quốc cũng như Việt Nam, dược liệu Bát giác liên được sử dụng làm thuốc chữa rắn cắn, ung nhọt, giải độc, tiêu phù (Đỗ Tất Lợi, 2004; Đỗ Huy Bích & cs., 2006). Nghiên cứu y học hiện đại cho thấy thân rễ và rễ rễ của các loài thuộc chi Dysosma Woodson có chứa các chất có tác dụng sinh học cao; trong đó podophyllotoxin và các dẫn xuất của chúng có tác dụng ức chế tế bào ung thư, ức chế virus, và chữa viêm khớp. Ngoài ra, các hợp chất khác như kaempferol, quercetin, quercitrin và rutin có tác dụng ức chế virus, vi khuẩn, kháng viêm, chống oxi hóa (Man & cs., 2012; Zhang & cs., 2014; Wang & cs., 2019; Karuppaiya & Tsay, 2019; Karuppaiya & Wu, 2020; Bui Van Thanh & cs., 2022). Do khai thác quá mức và môi trường sống của cây bị thu hẹp nên nguồn gen Bát giác liên trong tự nhiên đã ngày càng bị suy giảm, trở nên cạn kiệt. Bởi vậy việc bảo tồn nguyên vị, thu thập nguồn gen bảo tồn ngoại vi (Ex situ), nghiên cứu nhân giống và trồng trọt cây Bát giác liên là rất cấp thiết. 2.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC SINH SẢN VÀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC LOÀI THUỘC CHI BÁT GIÁC LIÊN Trong công tác chọn tạo và sản xuất giống thì việc nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản của từng loại cây trồng rất quan trọng. Là cơ sở để đưa ra được phương thức chọn giống và biện pháp duy trì đặc tính của giống đã chọn tạo. Đồng thời là cơ sở để thực hiện biện pháp nhân giống, tạo nguồn cây giống chất lượng phục vụ sản xuất. Nghiên cứu về đặc điểm sinh học sinh sản cho thấy ở chi Dysosma Woodson có hiện tượng tự bất hợp trong phương thức sinh sản hữu tính của chúng. Khi nghiên cứu về đặc điểm sinh sản của loài D. versipellis, Qiu & cs. (2005), Guan & cs. (2010) đều cho biết rằng chúng có hiện tượng tự bất hợp, khi mà các thử nghiệm bao hoa bằng túi vải và thụ phấn bổ sung bằng chính hạt phấn của hoa đó thì đều cho thấy các hoa theo dõi hoàn toàn không đậu quả. Tuy nhiên khi giao phấn khác cây thì tỷ lệ đậu quả của các hoa có thể đạt đến 62,7%. Gong & cs. (2015) khi theo dõi đặc điểm sinh sản của loài D. pleiantha cũng cho biết rằng chúng có hình thức tự bất hợp trong sinh sản hữu tính, tương tự với loài D. versipellis. Như vậy hiện tượng tự bất hợp chính là nguyên nhân tỷ lệ đậu quả rất thấp trong tự nhiên của các loài Bát giác liên. Đặc điểm sinh sản hữu tính của của chúng đã phát triển theo hướng bắt buộc giao phấn khác cây, thậm chí khác quần
thể thì quá trình thụ tinh mới có thể xảy ra để hình thành hạt để duy trì nòi giống. Đây cũng là nguyên nhân căn bản của mức độ đa dạng di truyền nguồn gen Bát giác liên trong các nghiên cứu. Trong đó mức độ đa dạng di truyền trong cùng một quần thể rất thấp, hầu hết các cá thể trong cùng một quần thể có cùng một kiểu gen do hình thức sinh sản vô tính chiếm ưu thế. Trái lại, giữa các quần thể khác nhau, đặc biệt là các quần thể cách xa về mặt địa lý lại có mức độ đa dạng di truyền cao (Qiu & cs., 2005; Zong & cs., 2008; Guan & cs., 2010; Gong & cs., 2015). Thông qua nghiên cứu này, các tác giả cũng đã đưa ra khuyến cáo cần phải thực hiện bảo tồn nguyên vị; trong trường hợp thực hiện bảo tồn chuyển vị phải đảm bảo thu thập được các cá thể từ tất cả các vùng phân bố để giữ được đa dạng di truyền của các loài Bát giác liên. Trong đánh giá đa dạng di truyền thì phương pháp chỉ thị phân tử, sử dụng phản ứng PCR với các chỉ thị ISSR và RAPD được sử dụng phổ biến và đã được áp dụng để đánh giá đa dạng di truyền của nguồn gen Bát giác liên. 2.3. BIỆN PHÁP NHÂN GIỐNG, TRỒNG CÂY DƯỢC LIỆU VÀ CHI BÁT GIÁC LIÊN 2.3.1. Nhân giống hữu tính Nhân giống hữu tính là phương pháp được áp dụng phổ biến và không thể thay thế để đảm bảo hiệu quả trong sản xuất đối với nhiều loài cây dược liệu có hệ số nhân bằng hạt cao và hạt có tỷ lệ nảy mầm tốt như Đương quy Nhật Bản, Cát cánh, Bạch truật, Bạch chỉ, Ngưu bàng.... Đây cũng là phương pháp nhân giống tối ưu được áp dụng cho các loài cây dược liệu quý, có giá trị cao như Nhân sâm Hàn Quốc - Panax ginseng (Lee & cs., 2018), Nhân sâm Mỹ - Pannax quinquefolius (Schluter & Punja, 2020), Tam thất Bắc- Panax notoginseng (Guo & cs., 2010) và Sâm tam thất - Panax pseudoginseng (Jamir et al., 2016). Tiêu chí quan trọng nhất để đánh giá hiệu quả của nhân giống hữu tính là tỷ lệ nảy mầm của hạt. Những yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ nảy mầm của hạt trong nhân giống là bản chất của hạt giống gồm cấu trúc hạt và chất dự trữ trong hạt và đặc tính sinh lý (sự ngủ nghỉ của hạt); các yếu tố ngoại cảnh quan trọng như ẩm độ, nhiệt độ, hàm lượng ôxy trong quá trình hạt nảy mầm. Đối với các loài Bát giác liên thuộc chi Dysosma Woodson, do tỷ lệ đậu quả rất thấp nên lượng hạt thu được để nhân giống rất ít. Tang & cs. (2008) đã thu hạt giống của loài D. versipellis để làm vật liệu nhân giống invitro, hạt nảy mầm trong môi trường MS + BA 1,0 mg/l + IBA 0,5 mg/l + GA3 4,0 mg/l với tỷ lệ nảy mầm đạt 72,4%. Do các loài Bát giác liên đều có hiện tượng tự bất hợp, yêu cầu giao phấn để có thể thu được hạt nên thế hệ cây con sẽ có sự phân li cao về mặt di truyền. Bởi vậy, phương pháp nhân giống hữu tính nên được sử dụng để tạo vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống. Để tạo nguồn cây giống trồng trọt nên sử dụng phương pháp nhân giống vô tính.
2.3.2. Nhân giống vô tính Nhân giống vô tính là phương pháp được áp dụng để nhân giống đối với những loài cây dược liệu không ra hoa kết hạt hoặc tỷ lệ kết hạt thấp, hạt có tỷ lệ nảy mầm thấp, cây con có sức sống kém, phân li mạnh về các tính trạng hình thái và chất lượng dược liệu làm ảnh hưởng đến hiệu quả sản xuất dược liệu. Tùy từng loại cây dược liệu khác nhau mà lựa chọn biện pháp nhân giống vô tính phù hợp như giâm hom, chiết cành, ghép hoặc nuôi cấy in vitro. Đối với biện pháp giâm hom, hom thân, cành là bộ phận sử dụng phổ biến nhất đối với các loài cây dược liệu như Đinh lăng, Cà gai leo, Lá khôi... Bên cạnh đó có thể sử dụng hom rễ làm vật liệu nhân giống như các loài Đan sâm (Sheng, 2007) Mâm xôi (Hussain & cs.,. 2016) hoặc hom thân rễ như loài Podophyllum hexandrum (Nadeem & cs., 2000; Kharkwal & cs., 2008), Tam thất - Panax pseudoginseng (Jamir &cs., 2016). Trong giâm hom, các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả giâm hom như thời vụ giâm, vị trí cắt lấy hom, kích thước của hom và nồng độ của chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các loài Bát giác liên, hiện nay những nghiên cứu về phương pháp nhân giống vô tính đã sử dụng thân rễ làm vật liệu nhân giống và áp dụng biện pháp nuôi cấy mô tế bào. Chưa có nghiên cứu sử dụng rễ cây Bát giác liên để làm vật liệu nhân giống. 2.3.3. Kỹ thuật trồng trọt Cho đến nay, chưa có quy trình kỹ thuật trồng các loài Bát giác liên thuộc chi Dysosma Woodson. Tuy nhiên, một số nghiên cứu về trồng trọt các loài thuôc chi Podophyllum L (có quan hệ gần gũi với chi Dysosma Woodson) của Silva (2000) Maqbool (2011). Bộ Y học cổ truyền của Ấn Độ (AYUSH, 2016) đã xây dựng quy trình kỹ thuật trồng trọt cho cây P. hexandrum để phục vụ sản xuất nguyên liệu dược sử dụng trong nước và xuất khẩu như sau: - Lựa chọn vùng trồng: Cây ưa bóng, đất giàu mùn, phát triển tốt dưới tán rừng tại các khu vực có kiểu khí hậu ôn đới và khí hậu phụ núi cao. - Kỹ thuật trồng trọt: Đất được cày bừa kỹ và xử lý sạch cỏ dại. Sử dụng phân hoai mục với lượng 10 tấn/ha. Su khi trồng cần tưới giữ ẩm cho cây. Sau 4 tuần trồng tiến hành làm cỏ lần đầu và đảm bảo vườn sạch cỏ để giảm cạnh tranh dinh dưỡng khi cây còn nhỏ. PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu là các mẫu giống Bát giác liên được thu thập tại một số tỉnh phía Bắc và Kon Tum được trình bày ở bảng 3.1 Các dạng phân bón được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: Đạm ure (46%N), supe lân (16% P2O5), kali clorua (60% K2O)… Dụng cụ và hóa chất trong các nội dung nghiên cứu về trình tự gen ITS được cung cấp bởi Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam – Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; dụng cụ và hóa chất trong các nội dung nghiên cứu về đa dạng di truyền được cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật– Học viện Nông nghiệp Việt Nam; các dụng cụ và hóa chất dùng trong
nghiên cứu giải phẫu, đánh giá hàm lượng podophyllotoxin trong dược liệu Bát giác liên được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên dược liệu, Khoa Hóa phân tích Tiêu chuẩn – Viện Dược liệu. Bảng 3.1. Đặc điểm của các mẫu giống Bát giác liên Ký hiệu Mã số Đặc điểm Nơi thu mẫu Vị trí thu mẫu mẫu giống Lá có 6-8 thùy nông, màu xanh 20º53'38,63''B, D.ĐB01 M1 Đà Bắc, Hòa Bình đậm 105º12'35,74''Đ Lá có 6-8 thùy sâu, màu xanh đậm, 14º43'56,00''B, D.NH01 M2 Ngọc Hồi, Kon Tum có vân nâu đỏ ở mặt trên lá 107º32'25,86''Đ Lá có 5-6 thùy nông, màu xanh 22º18'15,69''B, D.SH01 M3 Sìn Hồ, Lai Châu nhạt 103º13'47,85''Đ Lá có 5-6 thùy nông, màu xanh 22º18'24,87''B, D.SH02 M4 Sìn Hồ, Lai Châu nhạt 103º15'51,85''Đ Lá có 7-8 thùy nông, màu xanh 22º17'49,74''B, D.SP01 M5 Sa Pa, Lào Cai nhạt 103º56'19,94''Đ Lá có 5-6 thùy nông, màu xanh 22º36'35,74''B, D.BH01 M6 Bắc Hà, Lào Cai nhạt, có vân nâu đỏ ở mặt trên lá 104º15'18,71''Đ Lá có 5-6 thùy nông, màu xanh 22º36'26,67''B, D.BH02 M7 Bắc Hà, Lào Cai nhạt, có vân nâu đỏ ở mặt trên lá 104º15'39,25''Đ Lá có 6-8 thùy nông, màu xanh 21º32'56,46''B, D.TY03 M8 Trấn Yên, Yên Bái đậm 104º40'34,61''Đ Lá có 5-6 thùy nông, màu xanh 21º33'58''B, D.VC01 M9 Văn Chấn, Yên Bái đậm 104º40'03,79''Đ Lá có 5-6 thùy nông, màu xanh 21º58'40,52''B, D.TC01 M10 Tủa Chùa, Điện Biên nhạt 103º22'55,58''Đ Lá có 7-8 thùy nông, màu xanh 22º58'4,0''B, D.VX02 M11 Vị Xuyên, Hà Giang đậm, có vân nâu đỏ ở mặt trên lá 104º53'10,23''Đ Lá có 7-10 thùy nông, màu xanh Chiêm Hóa, Tuyên 22º15'59,30''B, D.CH01 M12 đậm, có vân nâu đỏ ở mặt trên lá Quang 105º17'12,88''Đ Lá có 7-8 thùy nông, màu xanh Chiêm Hóa, Tuyên 22º07'29,24''B, D.CH02 M13 đậm, có vân nâu đỏ ở mặt trên lá Quang 105º26'6,65''Đ Lá có 7-8 thùy nông, màu xanh Na Hang, Tuyên 22º18'22,57''B, D.NHg03 M14 đậm, có vân nâu đỏ ở mặt trên lá Quang 105º15'55,30''Đ Lá có 7-8 thùy nông, màu xanh 22º58'910''B, D.VX01 M15 Vị Xuyên, Hà Giang đậm, có vân nâu đỏ ở mặt trên lá 104º52'946''Đ Lá có 7-8 thùy nông, màu xanh Tràng Định, Lạng 22º12'33,34''B, D.TrD01 M16 đậm, có vân nâu đỏ ở mặt trên lá Sơn 106º26'23,50''Đ Lá có 7-8 thùy nông, màu xanh Nguyên Bình, Cao 22º40'23,03''B, D.NB01 M17 đậm Bằng 105º48'44,13''Đ Lá có 7-8 thùy nông, màu xanh Võ Nhai, Thái 21º48'59,47''B, D.VN01 M18 đậm Nguyên 105º55'23,00''Đ Lá có 7-8 thùy nông, màu xanh 21º27'50,58''B, D.TD01 M19 Tam Đảo, Vĩnh Phúc đậm 105º35'41,16''Đ Lá có 7-8 thùy nông, màu xanh 21º04'15,36''B, D.BV01 M20 Ba Vì, Hà Nội đậm 105º21'57,44''Đ 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống Bát giác liên - Đánh giá các đặc điểm hình thái, giải phẫu, giám định tên khoa học và đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu giống Bát giác liên.
- Đánh giá các đặc điểm sinh trưởng, năng suất và hàm lượng podophyllotoxin của dược liệu các mẫu giống Bát giác liên 3.2.2. Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống cây Bát giác liên Sau khi đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống bát giác liên, chọn mẫu giống có năng suất và chất lượng dược liệu tốt để tiếp tục nghiên cứu cho các thí nghiệm tiếp sau: - Nghiên cứu biện pháp chăm sóc nâng cao khả năng đậu quả và kỹ thuật nhân giống hữu tính cây Bát giác liên - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ giâm hom, vị trí cắt hom, kích thước hom và nồng độ GA3 đến khả năng nhân giống Bát giác liên bằng giâm hom thân ngầm và giâm hom rễ 3.2.3. Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật trồng cây Bát giác liên - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ, khoảng cách trồng, lượng phân bón và chế độ che sáng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Bát giác liên. 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp nghiên cứu các thí nghiệm 3.3.1.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học của một số mẫu giống Bát giác liên a. Đánh giá đặc điểm nông sinh học và giám định tên khoa học * Thí nghiệm 1: Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống Bát giác liên Vật liệu thí nghiệm: 20 mẫu giống Bát giác liên (M1-M20). - Phương pháp bố trí thí nghiệm và theo dõi: Các mẫu giống Bát giác liên được trồng dưới giàn che giảm ánh sáng 60%. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ, 3 lần nhắc lại tại khu thí nghiệm Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Sa Pa; thời gian tháng 1/2017. Giám định tên khoa học của các mẫu giống bằng biện pháp so sánh hình thái, kết hợp với chỉ thị DNA (so sánh trình tự gen vùng ITS của các mẫu giống M12, M8, M3 với trình tự gen của các loài thuộc chi Dysosma đã được công bố trên Genbank) * Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hình thức thụ phấn đến sự đậu quả và chất lượng hạt giống Bát giác liên Thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu đánh giá đặc điểm sinh sản hữu tính và hiện tượng tự bất hợp ở cây Bát giác liên bằng biện pháp thụ phấn bổ sung bằng hạt phấn trên cùng hoa (TP2), hạt phấn từ hoa khác nhau trên cùng cây (TP3,TP4) và hạt phấn từ hoa khác cây (TP5, TP6), so sánh với hoa nở tự nhiên không được thụ phấn bổ sung (TP1). Thời gian thực hiện: thí nghiệm thực hiện năm 2018. Thí nghiệm được thực hiện theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ, 3 lần nhắc lại trên mẫu giống M11, mỗi công thức thí nghiệm đánh dấu và theo dõi 30 hoa. Trong thí nghiệm, cây Bát giác liên được trồng theo kỹ thuật trồng bảo tồn tại Trung tâm nghiên cứu dược liệu Sa Pa với khoảng cách trồng 40 cm x 30 cm; lượng phân bón (tính cho 1 ha) gồm 20.000 kg phân hữu cơ hoai mục + 50 kg N + 100 kg P2O5 + 50 kg K2O; cây được trồng dưới giàn che bằng lưới đen với mức che sáng 60%. b. Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử, sử dụng phản ứng PCR * Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ DNA của các mẫu nghiên cứu sử dụng trong phản ứng PCR
Thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên lựa chọn dải nồng độ DNA bao gồm các nồng độ 50, 100 và 150 ng/µl với nộng độ mồi cố định là 1µM. Lựa chọn băng điện di lên đặc hiệu, sáng rõ nét nhất với nồng độ DNA tối ưu tương ứng. *Thí nghiệm 4: Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ mồi sử dụng trong phản ứng PCR Thực hiện thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với dải nồng độ mồi 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1,0 µM. Lựa chọn băng điện di đặc hiệu, sáng rõ nét nhất với nồng độ mồi tối ưu ương ứng. 3.3.1.2. Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nâng cao khả năng đậu quả và kỹ thuật nhân giống hữu tính Bát giác liên * Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng phân bón kali và biện pháp cắt tỉa đến sự hình thành quả và chất lượng hạt giống Bát giác liên Thí nghiệm 2 nhân tố, được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCD). Nhân tố thứ 1 gồm 4 chế độ phân bón P0 – Nền (20 tấn phân hữu cơ hoai mục + 1000 kg NPK 5:10:3. Tương đương 50kg N + 100kg P2O5 + 50kg K2O), P1 (Nền + 30kg K2O), P2 (Nền + 60kg K2O), P3 (Nền + 90kg K2O). Nhân tố thứ 2 gồm 4 chế độ cắt tỉa quả CT0 (Không cắt tỉa quả - Đối chứng), C1 (Cắt tỉa, để lại 1 quả/ cây), C2 (Cắt tỉa, để lại 2 quả/ cây), C3 (Cắt tỉa, để lại 4 quả/cây). Tất cả các cây trong thí nghiệm khi có hoa nở được thụ phấn bổ sung bằng hạt phấn từ hoa khác cây. Đối với chế độ phân bón: nền được bón lót toàn bộ vào giai đoạn làm đất trồng cây. Các công thức bón bổ sung phân kali (P1, P2 và P3), chia đôi lượng phân kali và bón vào thời điểm cây xuất hiện cành mang hoa và thời điểm hoa tàn. * Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian bảo quản hạt đến sự nảy mầm của hạt Bát giác liên Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 3 lần nhắc lại gồm 3 thời gian bảo quản hạt (BQ1 – bảo quản 1 tháng, BQ2 – bảo quản 2 tháng, BQ3 – bảo quản 3 tháng), đối chứng với hạt không bảo quản, gieo ngay sau khi thu hạt (BQ0). Hạt được tách từ quả chín hoàn toàn (vỏ quả màu vàng chanh), loại bỏ lớp áo hạt, rửa sạch và để ráo nước, không phơi hạt. Công thức BQ0 hạt được gieo ngay (không bảo quản); các công thức còn lại, hạt tươi sau khi để ráo được chứa trong túi PE hàn mép và lưu trong điều kiện nhiệt độ 4-5C. 3.3.1.3. Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống vô tính Bát giác liên bằng giâm hom thân ngầm và giâm hom rễ Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD), 3 lần nhắc lại, 30 hom trong mỗi lần nhắc. Thí nghiệm được thực hiện dưới giàn cao 2,2m, che bằng lưới đen với mức che giảm ánh sáng 60%. Yếu tố phi thí nghiệm đồng nhất ở các công thức: Sau khi cắt, hom được giâm trong đất; khi giâm hom thân ngầm đặt cách nhau 10 cm (hom thân ngầm hướng mầm lên trên; hom rễ đặt nằm ngang), sau đó phủ kín bằng lớp đất dày 1-2 cm. * Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ giâm đến khả năng nhân giống cây Bát giác liên bằng hom thân ngầm Thí nghiệm gồm 6 công thức TV1 đến TV6 tương ứng với thời vụ giâm hom vào 15/1, 15/3, 15/5, 15/7, 15/9 và 15/11. Yếu tố phi thí nghiệm đồng nhất, hom gồm 2 đốt được cắt tại vị trí đầu mầm.
* Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí cắt hom đến khả năng nhân giống cây Bát giác liên bằng thân ngầm Thí nghiệm gồm 3 công thức tương ứng với 3 vị trí cắt hom V1 (Hom cắt tại vị trí đầu thân ngầm), V2 (Hom cắt tại vị trí giữa thân ngầm), V3 (Hom cắt tại vị trí cuối thân ngầm). Yếu tố phi thí nghiệm đồng nhất, hom được cắt và giâm vào thời vụ tháng 1. * Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của số đốt hom thân ngầm đến khả năng nhân giống Bát giác liên Thí nghiệm gồm 4 công thức tương ứng với hom 1 đốt (Đ1), hom 2 đốt (Đ2), hom 3 đốt (Đ3) và hom gồm 4 đốt (Đ4). Yếu tố phi thí nghiệm đồng nhất, hom được cắt và giâm vào thời vụ tháng 1. * Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ giâm đến khả năng nhân giống cây Bát giác liên bằng hom rễ - Thí nghiệm gồm 6 công thức TV1 đến TV6 tương ứng với thời vụ giâm hom vào 15/1, 15/3, 15/5, 15/7, 15/9 và 15/11. Yếu tố phi thí nghiệm đồng nhất, hom rễ dài 10 cm được cắt tại vị trí cuối rễ. * Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh huởng của vị trí cắt hom rễ đến khả năng nhân giống Bát giác liên - Thí nghiệm gồm 3 công thức tương ứng với 3 vị trí cắt hom (V1: Vị trí cắt hom đầu rễ, V2: Vị trí cắt hom giữa rễ, V3: Vị trí cắt hom cuối rễ). Yếu tố phi thí nghiệm đồng nhất, rễ được cắt thành các đoạn hom dài 10 cm. * Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ dài hom rễ đến khả năng nhân giống Bát giác liên - Thí nghiệm gồm 6 công thức tương ứng với các độ dài hom 1 cm (D1), 3 cm (D2), 5 cm 9D3), 10 cm (D4), 15 cm (D5) và hom cả rễ dài 30 cm (D6). Yếu tố phi thí nghiệm đồng nhất, hom cuối rễ được cắt thành các đoạn theo kích thước thí nghiệm, riêng công thức D6 để nguyên cả rễ. * Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ xử lý GA3 đến khả năng nhân giống cây Bát giác liên bằng rễ Thí nghiệm gồm 21 công thức tương ứng với các nồng độ GA3 từ 25 ppm đến 1.500ppm. Yếu tố phi thí nghiệm đồng nhất, hom cuối rễ dài 10 cm được ngâm trong dung dịch BA 10 ppm trong 2 giờ, vớt ra để ráo và ngâm trong dung dịch GA3 ở các nồng độ thí nghiệm trong thời gian 2 giờ sau đó vớt ra để ráo và giâm hom trong đất. * Thí nghiệm 14: Đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của loại cây giống Bát giác liên Thí nghiệm gồm 3 loại cây giống từ hạt (C1), từ thân rễ (C2) và từ rễ (C3). Diện tích mỗi ô thí nghiệm là 10m2, khoảng cách trồng 40 x 30 cm, nền phân bón 20 tấn phân hữu cơ hoai mục + 50kg N + 100 kg P2O5 + 50kg K2O. 3.3.1.4. Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật trồng cây Bát giác liên Các thí nghiệm về trồng trọt gồm thời vụ, khoảng cách, chế độ che sáng là thí nghiệm 1 nhân tố, riêng thí nghiệm phân bón là thí nghiệm 2 nhân tố. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu khố ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD), 3 lần nhắc lại, 5m2/lần nhắc. Cây được trồng dưới giàn
cao 2,2m, che bằng lưới đen (thí nghiệm 15, 16, 17 mức che sáng của lưới đen là 60%). Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ trồng đến sinh trưởng và năng suất dược liệu Bát giác liên Thí nghiệm gồm 5 thời vụ trồng: 15/10 (TV1) (ĐC), 15 11 (TV2), 15/12 (TV3), 15/ 1 (TV4), 15/ 2 (TV5). Lượng phân bón gồm 20 tấn phân chuồng + 50kg N + 100 kg P2O5 + 50kg K2O; khoảng cách trồng 40x30 cm. Thí nghiệm 16: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ khoảng cách trồng đến sinh trưởng và năng suất dược liệu Bát giác liên Thí nghiệm gồm 3 mật độ khoảng cách trồng: 8,3 vạn cây/ha (40x30 cm – MĐ1), 6,2 vạn cây/ha (40x40 cm - MĐ2) và 5,0 vạn cây/ha (40x50 cm - MĐ3). Cây được trồng cây theo các mật độ của thí nghiệm vào tháng 10. Lượng phân bón 20 tấn phân chuồng + 50kg N + 100 kg P2O5 + 50kg K2O. Thí nghiệm 17: Nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng phân bón đến sinh trưởng, năng suất và chất lượng dược liệu Bát giác liên Thí nghiêm 2 nhân tố được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD). Trong đó nhân tố 1là 2 tỷ lệ phân N: P2O5: K2O gồm T1 (1N: 1P2O5: 1K2O) và T2 (1N: 2P2O5: 1K2O) và nhân tố phụ là 3 lượng phân đạm gồm N1 (30kg), N2 (50 kg) và N3(70 kg). Diện tích của 1 ô thí nghiệm là 5m2. Cây được trồng vào tháng 10 với lượng phân bón theo thí nghiệm trên nền 20 tấn phân hữu cơ. Khoảng cách trồng 40 x 30cm. Cây được trồng dưới giàn che bằng lưới đen với độ che sáng 60%. Thí nghiệm 18: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ che sáng đến sinh trưởng năng suất và chất lượng dược liệu Bát giác liên Thí nghiệm thực hiện với mức che sáng 30%; 60% và 90% và không che sáng. Diện tích mỗi ô thí nghiệm là 10m2, khoảng cách trồng 40 x 30 cm, nền phân bón 20 tấn phân hữu cơ hoai mục + 50kg N + 100 kg P2O5 + 50kg K2O. 3.3.2. Phương pháp lấy mẫu, phân tích và xử lý số liệu * Chỉ tiêu về đặc điểm hình thái - Hình thái lá, thân rễ, hoa quả hạt của các mẫu giống Bát giác liên. * Chỉ tiêu về nhân giống - Nhân giống hữu tính: + Tỷ lệ mọc mầm (%) = tổng số hạt mọc mầm/ tổng số hạt gieo x 100. + Tỷ lệ hình thành cây con (%) = tổng số cây con/ tổng số hạt gieo x 100. - Nhân giống vô tính bằng hom thân rễ và hom rễ: + Tỷ lệ bật mầm (%) = tổng số hom bật mầm/ tổng số hom giâm x 100. + Tỷ lệ hình thành cây con (%) = tổng số cây con/ tổng số hom giâm x 100. *Chỉ tiêu theo dõi về sinh trưởng của cây giống Năng suất cá thể (g/cây) Năng suất lý thuyết (tạ/ha) thu hoạch dược liệu sau 3 năm trồng.
* Phương pháp lấy mẫu Chọn mẫu để theo dõi theo phương pháp đường chéo, mỗi ô thí nghiệm chọn 10 cây. *Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được phân tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm IRRISTAT 5.0. Đồ thị được vẽ bằng phần mềm Excel. Phân tích thành phần chính PCA sử dụng phần mềm R. Sử dụng chương trình NTSYS 2.1 đánh giá sự đa dạng di truyền. PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC CÁC MẪU GIỐNG BÁT GIÁC LIÊN 4.1.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và xác định tên khoa học các mẫu giống Bát giác liên Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu cho thấy 20 mẫu giống Bát giác liên thu thập được có sự đồng nhất cao về cấu trúc của cây, các đặc điểm hình thái, giải phẫu của các cơ quan sinh dưỡng, cơ quan sinh sản và thời gian các giai đoạn sinh trưởng trong năm; chỉ có sự khác biệt về độ lớn và màu sắc của các bộ phận. Tất cả các mẫu giống Bát giác liên đã thu thập đều có hiện tượng bất hợp trong hình thức sinh sản hữu tính và thực hiện biện pháp thụ phấn bổ sung bằng hạt phấn từ hoa khác cây, khác mẫu giống để có thể thu được hạt giống. Bằng phương pháp hình thái so sánh kết hợp giải trình tự vùng gen ITS và so sánh với các loài thuộc chi Dysosma đã khẳng định rằng loài Bát giác liên ở Việt Nam có tên khoa học Dysosma tonkinense (Gagnep.) M.Hiroe là một loài riêng biệt, không là đồng danh của loài Dysosma versipellis và Dysosma difformis theo quan điểm của Shaw (2002) và Ying et al., (2011). Hình 4.1. Sơ đồ cây phả hệ dựa trên trình tự gen ITS được thiết lập thông qua phân tích gen của loài Bát giác liên ở Việt Nam và các loài khác thuộc chi Dysosma Woodson và họ Berberidaceae
4.1.2. Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống Bát giác liên Kết quả đánh giá đa dạng di truyền 20 mẫu giống Bát giác liên bằng chỉ thị ISSR cho thấy giữa các mẫu giống Bát giác liên có sự đa dạng di truyền cao, với hệ số tương đồng di truyền trung bình là 0,69 (dao động từ 0.59 (D.BH02 với D.DB01) đến 0.85 (D.TC01 với D.VC01 và D.CH01 với D.VX02)). Ở mức độ tương đồng di truyền là 69% thì 20 mẫu giống Bát giác liên chia thành 4 nhóm. Hình 4.2. Sơ đồ quan hệ di truyền của 20 mẫu giống Bát giác liên được phân tích bằng chỉ thị ISSR Hình 4.3. Sơ đồ quan hệ di truyền của 20 mẫu giống Bát giác liên được phân tích bằng chỉ thị RAPD Sơ đồ quan hệ di truyền của 20 mẫu giống Bát giác liên sử dụng phương pháp phân nhóm UPGMA dựa trên dữ liệu khi được đánh giá bằng chỉ thị RAPD cho thấy rằng: tại mức tương đồng di truyền 79%, 20 mẫu gống Bát giác liên được chia thành 4 nhóm. Nhóm I bao gồm 5
mẫu giống D.DB01, D.NH01, D.SH01, D.SH02 and D.SP01; nhóm II bao gồm 12 mẫu giống: D.VX01, D.TrD01, D.VC01, D.TC01, D.VX02, D.CH01, D.CH02, D.NHg03, D.NB01, D.VN01, D.TD01, D.BV01; nhóm III gồm 2 mẫu giống D.BH01, D.BH02 và nhóm IV chỉ có 1 mẫu giống D.TY03. 4.1.3. Năng suất và hàm lượng podpphyllotoxin của các mẫu giống Bát giác liên Trong 20 mẫu giống Bát giác liên, mẫu giống M13 có năng suất dược liệu cao nhất (11,96 tạ/ha) trong khi mẫu giống M11 có hàm lượng podophyllotoxin cao nhất (3,51%). Bảng 4.1. Năng suất và hàm lượng podophyllotoxin của các mẫu giống Bát giác liên Năng suất cá Năng suất lý Năng suất thực Hàm lượng Mẫu giống thể (g/cây) thuyết (tạ/ha) thu (tạ/ha) podophyllotoxin M1 18,93 11,74 9,56 0,70 ± 0,01 M2 17,53 10,87 8,92 0,60 ± 0,02 M3 15,88 9,85 8,15 0,83 ± 0,02 M4 14,08 8,73 7,08 0,95 ± 0,01 M5 15,20 9,42 7,62 0,76 ± 0,02 M6 15,67 9,72 7,89 0,79 ±0,01 M7 16,42 10,18 8,22 0,89 ± 0,01 M8 18,88 11,71 9,43 0,12 ± 0,01 M9 18,30 11,35 9,13 0,62 ± 0,02 M10 15,42 9,56 7,65 0,71 ± 0,03 M11 23,08 14,31 11,75 3,51 ± 0,03 M12 23,30 14,45 11,83 2,23 ± 0,02 M13 23,58 14,62 11,96 1,15 ± 0,02 M14 21,30 13,21 10,31 1,08 ± 0,01 M15 20,85 12,93 10,35 1,03 ± 0,02 M16 18,62 11,54 9,25 1,27 ± 0,03 M17 18,02 11,17 9,08 2,43 ± 0,03 M18 21,43 13,29 10,31 1,56 ± 0,03 M19 20,92 12,97 10,26 0,95 ± 0,01 M20 20,77 12,88 10,29 1,08 ± 0,02 LSD 0.05 2,3 1,9 1,1 CV% 5,7 5,2 5,4 4.2. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY BÁT GIÁC LIÊN 4.2.1. Nghiên cứu nâng cao tỷ lệ đậu quả và nhân giống hữu tính cây Bát giác liên 4.2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ phân bón và tỉa định quả đến tỷ lệ đậu quả và chất lượng hạt giống Bát giác liên Việc bón bổ sung phân kali kết hợp với tỉa quả có hiệu quả đối với việc nâng cao tỷ lệ đậu quả và nâng cao chất lượng hạt giống Bát giác liên, trong đó bón bổ sung phân kali với lượng 60
kg/ha (P2) bằng cách hòa với nước và tưới cách gốc 15-20 cm; đồng thời tỉa bớt quả, để lại 1-2 quả (C2) trên mỗi cây sẽ làm tăng tỷ lệ đậu quả và chất lượng hạt giống Bát giác liên. Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chế độ phân bón và tỉa định quả đến tỷ lệ đậu quả và chất lượng hạt giống Bát giác liên Tỷ lệ đậu Số hạt chắc/ Chiều dài Chiều rộng Chiều dày Khối lượng Tỷ lệ nảy CT quả (%) quả (hạt) hạt (mm) hạt (mm) hạt (mm) 1000 hạt (g) mầm (%) C0-ĐC 31,5 9,72 9,14 4,22 2,53 83,90 83,16 C1 100,0 18,87 9,36 4,25 2,89 97,40 85,87 P0 C2 100,0 17,56 9,30 4,28 2,83 96,24 85,22 C3 100,0 11,56 9,26 4,20 2,67 87,52 83,84 C0 47,7 13,50 9,23 4,30 2,75 93,14 86,04 C1 100,0 22,32 9,46 4,39 2,87 100,72 90,13 P1 C2 100,0 20,19 9,37 4,38 2,84 100,42 87,22 C3 100,0 15,69 9,30 4,32 2,77 94,12 85,39 C0 52,9 13,07 9,26 4,31 2,74 93,16 86,39 C1 100,0 23,41 9,48 4,50 2,88 104,48 90,88 P2 C2 100,0 20,57 9,44 4,40 2,84 101,11 89,66 C3 100,0 16,43 9,32 4,35 2,84 97,35 87,22 C0 15,7 10,50 9,24 4,20 2,76 90,57 83,25 C1 50,1 18,47 9,42 4,30 2,87 98,36 85,68 P3 C2 33,3 18,13 9,33 4,34 2,85 97,09 85,59 C3 16,7 10,96 9,22 4,21 2,78 90,54 84,56 P0 36,9 14,43 9,27 4,24 2,73 91,27 84,52 P1 86,3 17,87 9,34 4,35 2,81 97,10 87,19 P2 83,3 18,37 9,37 4,39 2,82 99,20 88,54 Trung P3 79,1 14,52 9,30 4,26 2,82 94,14 84,52 bình C0 82,9 11,65 9,22 4,26 2,69 90,19 84,46 C1 86,9 20,77 9,43 4,36 2,88 100,24 88,14 C2 88,2 19,11 9,36 4,35 2,84 98,72 86,93 C3 27,7 13,66 9,28 4,27 2,77 92,38 85,26 LSD0.05 C 0,29 0,92 0,08 0,08 0,06 2,61 0,05 LSD0.05 P 0,23 0,83 0,09 0,09 0,07 2,53 0,04 LSD0.05 C*P 0,46 1,65 0,17 0,16 0,13 5,06 0,08 CV% 3,6 6,1 2,1 2,5 2,8 3,2 4,5 Ghi chú: - Yếu tố I: P0-Nền: (20 tấn phân hữu cơ hoai mục + 50kg N + 100kg P2O5); P1: Nền + 30kg K2O; P2: Nền + 60kg K2O; P3: Nền + 90kg K2O. - Yếu tố II: C0: Không cắt tỉa quả; C1: Cắt tỉa, để lại 1 quả/ cây; C2: Cắt tỉa, để lại 2 quả/ cây; C3: Cắt tỉa, để lại 4 quả/cây. 4.2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến tỷ lệ nảy mầm của hạt và chất lượng cây giống Bát giác liên Hạt Bát giác liên có thời gian ngủ nghỉ ngắn, nên gieo ngay sau khi thu hoạch, không bảo quản (BQ0) sẽ cho tỷ lệ nảy mầm tốt nhất (đạt 84,4%). Việc kéo dài thời gian bảo quản
hạt từ 1 tháng (BQ1) đến 3 tháng (BQ3) mặc dù có tác động rút ngắn thời gian nảy mầm của hạt nhưng lại làm giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt giống. Bảng 4.3. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng nhân giống Bát giác liên Gieo-nảy Tỷ lệ hạt Tỷ lệ cây Công Gieo – xuất Chiều cao Số lá /cây mầm nảy mầm xuất vườn thức vườn (ngày) cây (cm) (lá) (ngày) (%) (%) BQ0 64 240 84,4 80,0 12,5 1,7 BQ1 57 240 72,2 67,8 12,1 1,7 BQ2 55 240 62,2 55,6 11,3 1,6 BQ3 50 240 51,1 44,4 10,9 1,5 LSD0,05 8,7 9,4 0,85 0,25 CV% 3,5 3,7 3,9 3,5 Ghi chú: BQ0 – Hạt gieo sau khi thu, không bảo quản; BQ1 – Bảo quản hạt 1 tháng; BQ2 – Bảo quản hạt 2 tháng; BQ3 – Bảo quản hạt 3 tháng. 4.2.2. Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống vô tính cây Bát giác liên 4.2.2.1. Nghiên cứu nhân giống vô tính cây Bát giác liên bằng biện pháp giâm hom thân ngầm a. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ giâm hom thân ngầm đến khả năng nhân giống cây Bát giác liên Thời vụ giâm hom thân ngầm Bát giác liên tốt nhất là tháng 5 (TV3). Tại thời vụ này, hom thân ngầm bật mầm sau 32-38 ngày và xuất vườn sau 82-88 ngày giâm. Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom thân ngầm đến khả năng nhân giống Bát giác liên Giâm - Giâm - Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ cây Chiều Bật Xuất hom bật Công thức hom ra xuất cao cây Số lá (lá) mầm vườn mầm rễ (%) vườn (%) (cm) (ngày) (ngày) (%) TV1 (ĐC) 45 ± 5 90 ±5 89,54b 81,62c 80,23c 15,46c 2,12a TV2 35 ± 3 85 ±3 98,92a 88,95b 86,37b 19,21ab 2,54a TV3 35 ± 3 85 ±3 97,75a 94,47a 92,36a 21,55a 2,63a TV4 40 ± 3 110 ±3 98,36a 91,16ab 90,05a 18,91b 2,56a TV5 60 ± 5 130 ±5 85,74c 75,34d 70,91c 15,72c 2,15a TV6 75 ±5 130 ±5 81,33d 71,54e 70,16c 13,54c 1,82a LSD0.05 3,31 3,23 3,31 3,23 2,14 CV(%) 5,2 4,7 5,2 4,7 5,6 Ghi chú: TV1-thời vụ giâm hom 15/1; TV2- thời vụ giâm hom 15/3; TV3-thời vụ giâm hom 15/5; TV4-thời vụ giâm hom 15/7; TV5-thời vụ giâm hom 15/9; TV6-thời vụ giâm hom 15/1. Các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự sai khác có ý nghĩa tiêu chuẩn LSD ở mức ý nghĩa α=0,05.
Đồng thời, tại thời vụ này hom thân ngầm có tỷ lệ bật mầm và xuất vườn cao nhất, lần lượt là 94,47 % và 92,36%. Cây giống tại thời vụ này có đặc điểm sinh trưởng tốt với chiều cao cây đạt 21,55 cm và có 2,63 lá/cây. b. Nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí cắt hom thân rễ đến khả năng nhân giống Bát giác liên Trong các vị trí cắt lấy hom khác nhau, hom được lấy từ vị trí đầu mầm (VT1) có thời gian giâm hom nhanh nhất và đạt tỷ lệ hom bật mầm và tỷ lệ xuất vườn cao nhất, đạt 85,55% và 84,71%. Trong khi cây giống từ hom đầu mầm (VT1) và hom giữa thân ngầm (VT2) có đặc điểm sinh trưởng tương đương nhau. Bảng 4.5. Ảnh hưởng của vị trí cắt hom thân ngầm đến khả năng nhân giống Bát giác Giâm - Giâm - Vị trí Tỷ lệ Tỷ lệ hom Tỷ lệ cây Chiều Bật Xuất cắt hom ra bật mầm xuất vườn cao cây Số lá (lá) mầm vườn hom rễ (%) (%) (%) (cm) (ngày) (ngày) VT1 45 ± 5 90 ± 5 87,73a 85,55a 84,71a 18,35a 2,37a VT2 60 ± 3 120 ± 5 90,35a 83,26b 82,56b 20,32a 2,54a VT3 90 ± 5 150 ± 5 89,52a 58,73c 56,17c 15,47b 2,03b LSD0.05 2,9 2,15 2,04 1,02 0,20 CV(%) 5,4 5,9 6,1 5,2 4,6 Ghi chú: VT1: hom đầu mầm; VT2: hom giữa thân ngầm; VT3: hom cuối thân ngầm. Các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự sai khác có ý nghĩa tiêu chuẩn LSD ở mức ý nghĩa α=0,05. c. Nghiên cứu ảnh hưởng của số đốt hom thân ngầm đến khả năng nhân giống cây Bát giác liên Hom thân ngầm gồm 4 đốt (Đ4) và hom thân ngầm có 3 đốt (Đ3) có thời gian giâm hom tương đương nhau (giâm-xuất vườn là 77-83 ngày). Mặc dù hom 4 đốt có tỷ lệ hom ra rễ, hom bật mầm và hom xuất vườn cao hơn so với hom 3 đốt, nhưng chiều cao cây giống từ hom 3 đốt tương đương với cây từ hom 4 đốt. Đồng thời, việc sử dụng hom 4 đốt sẽ tốn nguyên liệu nhân giống, do đó nên sử dụng hom thân ngầm 2 hoặc 3 đốt để nhân giống là phù hợp nhất. Bảng 4.6. Ảnh hưởng của số đốt hom thân ngầm đến khả năng nhân giống Bát giác liên Giâm - Giâm - Tỷ lệ Tỷ lệ Chiều Tỷ lệ khối Tỷ lệ cây Công Bật Xuất hom hom bật cao Số lá lượng so xuất thức mầm vườn ra rễ mầm cây (lá) với hom 2 vườn (%) (ngày) (ngày) (%) (%) (cm) đốt (lần) Đ1 55 ± 5 125 ± 5 85,12d 79,25c 76,84c 14,73c 2,05c 0,5 Đ2 45 ± 3 90 ± 5 89,64c 87,46b 86,57b 18,12b 2,56b 1,0 Đ3 45 ± 3 80 ± 3 97,51b 89,55b 89,55b 21,41ab 2,77b 1,67 Đ4 40 ± 3 80 ± 3 100,0a 93,71a 93,71a 23,54a 3,13a 2,74 LSD0.05 2,14 3,25 CV(%) 5,8 5,2 Ghi chú: Đ1: hom đầu mầm,1 đốt ; Đ2: hom đầu mầm, 2 đốt; Đ3: hom đầu mầm, 3 đốt; Đ4: hom đầu mầm, 4 đốt. Các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự sai khác có ý nghĩa tiêu chuẩn LSD ở mức ý nghĩa α=0,05.
4.2.2.2. Nghiên cứu nhân giống vô tính cây Bát giác liên bằng biện pháp giâm hom rễ a. Nghiên cứu sự hình thành chồi bất định từ rễ Bát giác liên Rễ của cây Bát giác liên có thể hình thành nên các mầm bất định khi bị cắt rời khỏi cây mẹ. Do đó có thể sử dụng hom rễ cây Bát giác liên làm vật liệu nhân giống. b. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ giâm đến khả năng nhân giống Bát giác liên bằng hom rễ Trong các thời vụ giâm hom rễ cây Bát giác liên, thời vụ giâm hom vào tháng 5 (TV3) là tốt nhất với thời gian giâm hom ngắn nhất, đồng thời hom rễ có tỷ lệ bật mầm và tỷ lệ cây xuất vườn lớn nhất (đạt lần lượt là 83,76% và 81,3%), tiếp theo là thời vụ giâm hom vào tháng 3 (TV2). Các thời vụ giâm hom vào tháng 9 (TV5) và tháng 11 (TV6) có thời gian giâm hom lâu nhất và tỷ lệ hom bật mầm, xuất vườn cũng như đặc điểm sinh trưởng của cây giống kém hơn so với các thời vụ còn lại. Bảng 4.7. Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom rễ đến khả năng nhân giống Bát giác liên Giâm - Giâm - Tỷ lệ cây Tỷ lệ Tỷ lệ Chiều Công Bật Xuất xuất hom ra hombật cao cây Số lá (lá) thức mầm vườn vườn rễ (%) mầm (%) (cm) (ngày) (ngày) (%) TV1 258 ± 7 308 ± 7 75,95b 71,52b 67,64b 8,54b 1,51b TV2 214 ± 5 264 ± 5 78,73b 78,73ab 75,11ab 10,22a 1,83a TV3 160 ± 5 200 ± 5 83,76a 83,76a 81,39a 11,55a 1,92a TV4 180 ± 5 230 ± 5 76,71b 73,94b 71,52b 7,91b 1,75ab TV5 305 ± 7 335 ± 7 75,38b 62,37c 60,05c 7,56b 1,44b TV6 245 ± 7 275 ± 7 71,62c 70,35b 68,98b 8,03b 1,46b LSD0.05 5,22 5,81 1,3 0,25 CV(%) 3,1 3,9 3,5 4,5 Ghi chú TV1-thời vụ giâm hom 15/1; TV2- thời vụ giâm hom 15/3; TV3-thời vụ giâm hom 15/5; TV4-thời vụ giâm hom 15/7; TV5-thời vụ giâm hom 15/9; TV6-thời vụ giâm hom 15/1. Các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự sai khác có ý nghĩa tiêu chuẩn LSD ở mức ý nghĩa α=0,05. c. Nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí cắt hom rễ đến khả năng nhân giống Bát giác liên Hom rễ được cắt lấy tại các vị trí trên rễ đều có khả năng hình thành mầm bất định, nên đều có thể sử dụng để làm vật liệu nhân giống, Bảng 4.8. Ảnh hưởng của vị trí cắt hom rễ đến khả năng nhân giống Bát giác liên Vị trí Giâm - Giâm - Tỷ lệ Tỷ lệ Số Tỷ lệ Chiều cắt Bật Xuất hom bật cây xuất Số lá nhánh hom ra cao cây hom mầm vườn mầm vườn (lá) (nhánh) rễ (%) (cm) rễ (ngày) (ngày) (%) (%) R1 280 ± 7 335 ± 7 69,34c 67,76c 62,61c 8,09bc 1,25a 1,3a R2 260 ± 7 310 ± 7 77,16b 74,83b 72,32b 9,17b 1,45a 1,0b R3 235 ± 5 285 ± 5 82,47a 80,67a 78,96a 12,51a 1,54a 1,0b LSD0.05 5,12 4,64 4,15 1,58 0,35 0,2 CV(%) 4,4 3,5 4,2 4,0 3,8 3,5 Ghi chú R1-Hom đầu rễ; R2-Hom giữa rễ; R3-Hom cuối rễ. Các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự sai khác có ý nghĩa tiêu chuẩn LSD ở mức ý nghĩa α=0,05.