Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang

1<br /> M<br /> <br /> ð U<br /> <br /> TÍNH C P THI T C A ð TÀI<br /> <br /> B nh cúm gia c m là m t b nh truy n nhi m c p tính có t c ñ lây<br /> lan nhanh, v i t l ch t cao trong ñàn gia c m nhi m b nh do các phân<br /> týp (subtype) c a nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thu c h<br /> Orthomyxoviridae gây ra. B nh gây thi t h i kinh t r t l n cho ngành<br /> chăn nuôi c a nhi u nư c trên th gi i, và có kh năng lây nhi m t ñ ng<br /> v t sang ngư i.<br /> B nh cúm gia c m do phân týp H5N1 xu t hi n l n ñ u tiên t i Vi t<br /> Nam năm 2003. Trong m t th i gian r t ng n, b nh ñã lây lan trên toàn<br /> b ñ t nư c, hàng tri u gia c m b ch t và tiêu h y, gây thi t h i r t l n<br /> cho n n kinh t qu c dân; và t ñó ñ n nay b nh x y ra liên t c tr thành<br /> m t v n ñ d ch t ph c t p c n gi i quy t t i nư c ta.<br /> Virus cúm A/H5N1 có h gen luôn bi n ñ i, tái t h p bi n ch ng và<br /> thay ñ i c u trúc kháng nguyên ñ thích ng gây b nh. Trình t nucleotide h<br /> gen là cơ s ñ xác l p m i quan h ngu n g c ti n hóa c a các bi n ch ng<br /> virus cúm A/H5N1. K t qu gi i mã h gen là ngu n d li u cung c p thông<br /> tin v ngu n g c xu t x , s ti n hóa c a virus, giúp phát hi n nh ng bi n<br /> ch ng m i trong qu n th virus cúm gia c m.<br /> Thông qua vi c gi i mã h gen, so sánh, phân tích trình t nucleotide<br /> và amino acid có th xác ñ nh nh ng vùng gen thư ng bi n ñ i, vùng gen<br /> n ñ nh làm cơ s d li u gen h c và protein h c c a các ch ng H5N1<br /> xu t hi n t nh ng năm ñ u tiên t i nư c ta làm cơ s l a ch n lo i<br /> vaccine thích h p trong công tác phòng ch ng d ch cúm gia c m.<br /> ð có thêm ngu n gen c a virus cúm A/H5N1 lưu hành t i Vi t Nam, t<br /> ñó làm cơ s d li u cho nh ng nghiên c u v gen/h gen c a virus cúm<br /> A/H5N1 và nghiên c u s n xu t các ch ph m sinh h c th h m i ng d ng<br /> trong ch n ñoán và phòng b nh, chúng tôi ti n hành ñ tài: Nghiên c u h<br /> gen c a virus cúm A/H5N1 phân l p t gà nuôi t i H u Giang.<br /> M C TIÊU C A ð TÀI<br /> <br /> (1) Gi i mã ñư c toàn b h gen g m 8 phân ño n c a m t ch ng<br /> virus cúm A/H5N1 t gà nuôi t i H u Giang.<br /> (2) Phân tích ñư c m t s ñ c ñi m sinh h c phân t c a h gen<br /> nh m thu ñư c thêm d li u làm cơ s cho nghiên c u vaccine<br /> phòng b nh hi u qu .<br /> <br /> 2<br /> Ý NGHĨA KHOA H C C A ð TÀI<br /> <br /> - ðây là lu n án nghiên c u khá ñ y ñ , có h th ng v sinh h c phân<br /> t h gen virus cúm A/H5N1 gà nuôi t i H u Giang.<br /> - Lu n án là tài li u tham kh o t t ph c v cho gi ng d y và nghiên<br /> c u khoa h c v virus cúm A/H5N1.<br /> Ý NGHĨA TH C TI N C A ð TÀI<br /> <br /> - K t qu nghiên c u c a ñ tài giúp hi u bi t thêm v tính ña d ng<br /> c a virus cúm. Trên cơ s ñó góp ph n xây d ng phương pháp ch n ñoán<br /> và l a ch n vaccine phòng b nh phù h p.<br /> - K t qu nghiên c u c a ñ tài góp ph n làm sáng t thêm m i quan<br /> h ngu n g c ph h c a virus cúm A/H5N1 phân l p trong nh ng năm<br /> ñ u tiên d ch xu t hi n vùng ñ ng b ng sông C u Long.<br /> NH NG ðÓNG GÓP M I C A ð TÀI<br /> <br /> (1) Gi i trình t và nghiên c u hoàn ch nh, có h th ng h gen c a<br /> m t ch ng virus cúm A/H5N1 thu c th ñ c l c cao (HPAI) phân l p t<br /> gà t i H u Giang năm 2005 (ký hi u ch ng là CkHG4) trong ñ t d ch<br /> cúm gia c m l n ñ u tiên xu t hi n t Vi t Nam.<br /> (2) ðã phân tích ñ c ñi m gen h c h gen/gen c a ch ng CkHG4, bao<br /> g m trình t nucleotide/amino acid, c u trúc, ñ ng nh t/tương ñ ng; so<br /> sánh v i các ch ng trong vùng và th gi i.<br /> (3) ðã làm sáng t m i quan h ph h , ngu n g c và tương quan<br /> gen/h gen c a virus cúm A/H5N1 cư ng ñ c dòng Qu ng ðông (ch ng<br /> CkHG4), góp ph n hi u bi t thêm v virus cúm A/H5N1 gây b nh và<br /> ñóng góp d li u cho ñ i chi u v i các vaccine s d ng t i Vi t Nam.<br /> (4) ðã kh o sát và xác ñ nh ñư c các c p m i s d ng có hi u qu ñ<br /> thu nh n và gi i trình t h gen c a virus cúm A/H5N1 thu c nh ng phân<br /> dòng l n ñ u tiên xu t hi n và hi n còn lưu hành t i Vi t Nam.<br /> B C C C A LU N ÁN: lu n án g m 159 trang (không k ph n ph<br /> l c), chia thành các ph n như sau: M ñ u (3 trang), Chương 1: T ng<br /> quan tài li u (52 trang), Chương 2: N i dung, nguyên li u và phương<br /> pháp nghiên c u (14 trang), Chương 3: K t qu nghiên c u và th o lu n<br /> (66 trang), K t lu n và ki n ngh (2 trang), Các công trình ñã công b liên<br /> quan ñ n lu n án (1 trang), Tài li u tham kh o (21 trang). Lu n án có 31<br /> b ng bi u, 28 hình minh h a. T ng s tài li u tham kh o là 170, g m 32<br /> tài li u ti ng Vi t, 138 tài li u ti ng Anh (có 3 trang web).<br /> <br /> 3<br /> CHƯƠNG 1<br /> T NG QUAN TÀI LI U<br /> 1.1 ð I CƯƠNG V B NH CÚM GIA C M<br /> <br /> Cúm gia c m (avian influenza) là b nh truy n nhi m c p tính, do<br /> nhóm virus cúm A, thu c h Orthomyxoviridae gây ra. ðây là nhóm virus<br /> có biên ñ ch r ng, ñư c phân chia thành nhi u phân týp khác nhau d a<br /> trên kháng nguyên HA và NA có trên b m t capsid c a h t virus. Nhóm<br /> virus cúm A có 16 phân týp HA (t H1 ñ n H16) và 9 phân type NA (t<br /> N1 ñ n N9).<br /> D ch cúm gia c m do virus cúm A phân týp H5N1 th ñ c l c cao<br /> xu t hi n vùng Qu ng ðông, Trung Qu c năm 1996 và ñã lan ra hơn 60<br /> nư c trên th gi i châu Á, châu Âu và châu Phi, ñư c ch ng minh là có<br /> kh năng lây nhi m t ñ ng v t sang ngư i. B nh cúm gia c m A/H5N1<br /> l n ñ u tiên xu t hi n t i Vi t Nam vào cu i năm 2003, t ñó ñ n nay<br /> b nh x y ra liên t c, ñang là v n ñ d ch t ph c t p do xu t hi n nhi u<br /> phân dòng virus m i và là d ch b nh c n ph i gi i quy t t i nư c ta.<br /> 1.2. H GEN C A VIRUS CÚM A<br /> <br /> H gen virus cúm A là RNA s i ñơn âm, bao g m 8 phân ño n gen riêng<br /> bi t mang tên t 1-8, mã hoá cho 11 protein khác nhau c a virus g m: PB2,<br /> PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2).<br /> Các phân ño n 1, 2 và 3 là nh ng phân ño n mã hoá t ng h p các<br /> enzym trong ph c h p polymerase (RNA transcriptase) c a virus, có ñ<br /> dài n ñ nh và có tính b o t n cao bao g m:<br /> - Phân ño n 1 (gen PB2) mã hoá t ng h p protein enzym PB2, có<br /> kích thư c 2341 bp.<br /> - Phân ño n 2 (gen PB1) cũng có kích thư c 2341 bp, mã hoá t ng<br /> h p enzym PB1.<br /> - Phân ño n 3 (gen PA) là phân ño n gen b o t n cao, mã hoá t ng<br /> h p protein enzym PA, có kích thư c 2233 bp.<br /> Các phân ño n 4 và 6 mã hoá cho các protein (HA và NA) b m t<br /> capsid c a virus, có tính kháng nguyên ñ c trưng theo t ng ch ng virus<br /> cúm A, bao g m:<br /> - Phân ño n 4 (gen HA) có ñ dài thay ñ i tùy theo t ng ch ng virus<br /> cúm A ( A/H1N1 là 1778 bp, H9N1 là 1714 bp, H5N1 là kho ng<br /> 1704 - 1707 bp). ðây là gen ch u trách nhi m mã hoá t ng h p protein<br /> HA - kháng nguyên b m t c a virus cúm.<br /> - Phân ño n 6 (gen NA) là gen mã hóa t ng h p protein NA, kháng<br /> nguyên b m t capsid c a virus, có chi u dài thay ñ i theo t ng ch ng<br /> <br /> 4<br /> virus cúm A ( A/H1N1 là 1413 bp, A/H5N1 thay ñ i kho ng t 1350 1410 bp).<br /> Các phân ño n gen M, NP và NS mã hóa t ng h p các protein ch c<br /> năng khác nhau c a virus, có ñ dài tương ñ i n ñ nh gi a các ch ng<br /> virus cúm A, bao g m:<br /> - Phân ño n 5 (gen NP) mã hóa t ng h p nucleoprotein (NP), kích<br /> thư c kho ng 1565 bp.<br /> - Phân ño n 7 (gen M) có kích thư c kho ng 1027 bp, mã hoá cho<br /> protein ñ m (matrix protein) g m hai ti u ph n là M1 và M2 ñư c t o ra<br /> b i nh ng khung ñ c m khác nhau c a cùng m t phân ño n RNA.<br /> - Phân ño n 8 (gen NS) là gen mã hoá protein không c u trúc, có ñ<br /> dài n ñ nh nh t trong h gen c a virus cúm A, kích thư c kho ng 890 bp,<br /> mã hoá t ng h p hai protein là NS1 và NS2.<br /> Như v y, virus cúm A (c th : cúm A/H5N1) có h gen ñư c c u trúc<br /> t 8 phân ño n riêng bi t và không có gen mã hóa enzym s a ch a RNA,<br /> t o ñi u ki n thu n l i cho s xu t hi n các ñ t bi n ñi m trong các phân<br /> ño n gen/h gen qua quá trình sao chép nhân lên c a virus, ho c trao ñ i<br /> các phân ño n gen gi a các ch ng virus cúm ñ ng nhi m trên cùng m t t<br /> bào, r t có th d n ñ n thay ñ i ñ c tính kháng nguyên t o nên các ch ng<br /> virus cúm A m i.<br /> 1.3 M T S NGHIÊN C U V<br /> A/H5N1 T I VI T NAM<br /> <br /> SINH H C PHÂN T<br /> <br /> VIRUS CÚM<br /> <br /> Nghiên c u ñ c tính sinh h c phân t (ñ nh týp, bi n ñ i di truy n và gen<br /> h c ti n hoá) c a virus gây b nh cúm gia c m H5N1 ñư c các cơ quan<br /> nghiên c u c a Vi t Nam ti n hành ngay t nh ng tháng ñ u tiên x y ra d ch<br /> cúm gia c m cu i năm 2003. Các chu i gen giúp xác ñ nh phân týp H5, phân<br /> týp N1 và các gen c u trúc ñã ñư c Vi n Pasteur thành ph H Chí Minh,<br /> Vi n Công ngh Sinh h c, Vi n V sinh d ch t trung ương, Trung tâm ch n<br /> ñoán thú y trung ương, Vi n Thú y gi i mã và công b trên Ngân hàng gen.<br /> Các nhà khoa h c Vi t Nam k t h p nghiên c u v i các t ch c th<br /> gi i xây d ng các phương pháp ch n ñoán, phát hi n nhanh virus gây<br /> b nh, phân bi t cúm A v i các tác nhân gây tri u ch ng hô h p khác,<br /> cũng như phân bi t các phân týp HA và NA. Các phương pháp phát hi n<br /> nhanh virus cúm A/H5N1 và các phân týp khác bao g m vi c s d ng<br /> kháng nguyên ho c kháng th , ho c sinh h c phân t cũng ñã ñư c xây<br /> d ng. Các nhà khoa h c Vi t Nam ñã có nh ng ñóng góp nh t ñ nh trong<br /> lĩnh v c nghiên c u vaccine và mi n d ch. Nh ng ch ph m kháng nguyên,<br /> vaccine di truy n ngư c ho c vector tái t h p trên n n virus cúm A/H5N1<br /> c a Vi t Nam cũng ñã ñư c t o ra.<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> Nh ng k t qu nghiên c u v cúm A/H5N1 gia c m và ngư i trên<br /> n n virus cúm A/H5N1 c a Vi t Nam ñã và ñang làm sáng t thêm v<br /> m i quan h ti n tri n b nh h c lây nhi m, d ch t h c phân t , phát tri n<br /> ti n hoá và genotype, và kháng nguyên-mi n d ch-vaccine c a cúm gia<br /> c m t i Vi t Nam.<br /> <br /> 2.5.3 Phương pháp ki m tra s n ph m RT-PCR<br /> S n ph m RT-PCR ñư c ki m tra b ng cách ñi n di 100-120V, 400<br /> mA trong 25-30 phút trên th ch agarose 1%. Ch th DNA s d ng trong<br /> nghiên c u là DNA th c khu n th Lamda, có kích thư c 43 kb, ñư c<br /> c t b ng enzym gi i h n HindIII.<br /> 2.5.4 Phương pháp dòng hóa<br /> S n ph m PCR/RT-PCR tinh s ch ñư c dòng hóa vào vector là pCR2.1<br /> hay pCR2.1TOPO (Invitrogen).<br /> 2.5.5 Phương pháp gi i trình t<br /> S n ph m gi i trình t sau khi tinh s ch, ñư c ñông khô và ñ c trình<br /> t trên máy t ñ ng ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (M ).<br /> 2.5.6 Phương pháp x lý s li u<br /> Trong nghiên c u này, chúng tôi x lý gi n ñ chromatogram c a<br /> chu i nucleotide thô b ng chương trình SeqEd1.03, sau ñó s d ng chương<br /> trình AsemblyLIGN1.9 ñ so sánh các chu i, phân tích thành ph n<br /> nucleotide và amino acid ho c các ñ c tính gen và polypeptide b ng h<br /> chương trình MacVector8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. Các<br /> chu i nucleotide hay amino acid ñư c s p x p và tính toán m c ñ tương<br /> ñ ng b ng chương trình GeneDoc 2.5; phân tích và xây d ng ph h b ng<br /> chương trình MEGA4.0.<br /> <br /> CHƯƠNG 2<br /> N I DUNG, NGUYÊN LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U<br /> 2.1 ð I TƯ NG NGHIÊN C U<br /> <br /> ð i tư ng nghiên c u c a ñ tài là virus cúm A/H5N1 t gà m c b nh<br /> cúm gia c m nuôi t i t nh H u Giang, Vi t Nam, phân l p năm 2005.<br /> 2.2 ð A ðI M VÀ TH I GIAN NGHIÊN C U<br /> <br /> ð tài ñư c ti n hành t i Vi n Công ngh sinh h c (Vi n Khoa h c<br /> và Công ngh Vi t Nam).<br /> Th i gian th c hi n ñ tài: t tháng 10/2005 ñ n tháng 10/2009.<br /> 2.3 N I DUNG NGHIÊN C U<br /> <br /> 2.3.1 Gi i trình t toàn b h gen ch ng virus cúm A/H5N1 (CkHG4)<br /> phân l p t gà H u Giang<br /> - Gi i trình t gen kháng nguyên HA và NA<br /> - Gi i trình t gen polymerase PB2, PB1 và PA<br /> - Gi i trình t các gen NP, M và NS<br /> 2.3.2 Phân tích so sánh thành ph n gen, m i quan h ngu n g c ph<br /> h ch ng CkHG4 v i các ch ng c a Vi t Nam và th gi i<br /> - Phân tích thành ph n nucleotide và amino acid.<br /> - Phân tích ñ ng nh t v nucleotide và tương ñ ng v amino acid.<br /> - Phân tích m i quan h ngu n g c ph h .<br /> 2.4 V T LI U NGHIÊN C U<br /> <br /> Nguyên li u nghiên c u là d ch khí qu n - ph qu n ch a virus cư ng<br /> ñ c cúm A/H5N1 thu nh n t gà b b nh t i H u Giang năm 2005 (ký hi u<br /> ch ng: A/Ck/Vietnam/HG4/2005(H5N1), vi t t t CkHG4). B nh ph m ñã<br /> ñư c vô ho t nhi t ñ 100oC trong 30 giây, ñ m b o an toàn sinh h c, b o<br /> qu n -20oC cho ñ n khi s d ng ñ tách RNA t ng s .<br /> 2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U<br /> <br /> 2.5.1 Phương pháp tách chi t RNA t ng s<br /> S d ng b sinh ph m QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN) ñ tách<br /> RNA t ng s theo hư ng d n c a nhà s n xu t.<br /> 2.5.2 Phương pháp RT-PCR<br /> Chúng tôi s d ng ph n ng RT-PCR m t bư c (QIAGEN) ñ thu<br /> nh n các phân ño n gen c a virus cúm A/H5N1.<br /> <br /> CHƯƠNG 3<br /> K T QU VÀ TH O LU N<br /> 3.1 K T QU GI I MÃ H GEN VIRUS CÚM A/H5N1 CH NG CkHG4<br /> <br /> 3.1.1 Gi i trình t gen H5 (HA)<br /> ð thu nh n gen kháng nguyên H5 (HA) c a ch ng CkHG4 chúng tôi s<br /> d ng phương pháp RT-PCR tr c ti p v i khuôn là RNA t ng s có ch a<br /> RNA h gen c a virus cúm A/H5N1.<br /> Plasmid tái t h p sau khi gi i trình t chúng tôi thu ñư c chu i gen H5<br /> (HA) g m 1707 nucleotide c a ch ng CkHG4 và ñăng ký trong Ngân hàng<br /> gen s EF051513.<br /> 3.1.2 Gi i trình t gen N1 (NA)<br /> DNA plasmid tái t h p ñư c gi i trình t , thu nh n chu i DNA c a<br /> gen N1 (NA) ch ng CkHG4 g m 1350 nucleotide và ñăng ký trong Ngân<br /> hàng gen s EF057803.<br /> 3.1.3 Gi i trình t gen PB2<br /> Phân ño n 1 c a h gen virus cúm A/H5N1 mã hóa cho protein PB2<br /> g m 759 amino acid. Do phân ño n 1 có kích thư c 2355 bp nên không<br /> th b ng m t ph n ng RT-PCR ñ nhân lên ñư c mà ph i th c hi n 2<br /> ph n ng RT-PCR thu 2 ño n l ng vào nhau. C p m i PB2F-PB2R1<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> ñư c s d ng ñ thu nh n ño n ñ u và c p m i PB2F3-PB2R dùng ñ thu<br /> nh n ño n sau c a phân ño n 1 (gen PB2). S n ph m cu i cùng g m 2<br /> ño n DNA: ph n ñ u c a phân ño n 1 có kích thư c kho ng 1kb (c p m i<br /> PB2F-PB2R1), và ph n sau c a phân ño n 1 có ñ dài kho ng 1,4 kb (c p<br /> m i PB2F3-PB2R).<br /> DNA plasmid tái t h p sau ñó ñư c gi i trình t , s p x p n i chu i và<br /> phân tích b ng các chương trình tin-sinh h c chuyên bi t, chúng tôi thu ñư c<br /> chu i DNA c a gen PB2 g m 2280 nucleotide.<br /> 3.1.4 Gi i trình t gen PB1<br /> Phân ño n 2 (gen PB1) c a ch ng CkHG4 ñư c nhân lên b ng ph n<br /> ng RT-PCR t ngu n khuôn RNA t ng s , b ng 2 ph n ng s d ng 2<br /> c p m i PB1F1-PB1R2 và PB1F3-PB1R3. Ph n ng RT-PCR v i c p<br /> m i PB1F1-PB1R2 cho ño n DNA s n ph m (ñ u phân ño n) có ñ dài<br /> 1,7 kb. K t qu ph n ng RT-PCR s d ng c p m i PB1F3-PB1R3 cho<br /> s n ph m 0,75 kb (cu i phân ño n), t ng ñ dài c a toàn b phân ño n 2<br /> kho ng 2,35 kb ñã ñư c thu nh n.<br /> Các DNA plasmid tái t h p ñư c gi i trình t và chu i DNA c a<br /> phân ño n 2 ch ng CkHG4 thu ñư c ch a toàn b gen PB1 g m 2274 bp.<br /> 3.1.5 Gi i trình t gen PA<br /> Phân ño n 3 (gen PA) ñư c nhân lên t ngu n khuôn RNA t ng s<br /> b ng các ph n ng RT-PCR s d ng các c p m i thi t k cho gen PA. S n<br /> ph m cu i cùng c a ph n ng RT-PCR b ng c p m i PAF-PAR là ph n<br /> ñ u c a phân ño n 3 có ñ dài kho ng 0,75 kb; v i c p m i PAF2-PAR2 là<br /> ph n gi a c a phân ño n có kích thư c kho ng 1,2 kb và v i c p m i<br /> PAF3-PAR3 là ph n sau c a phân ño n có ñ dài kho ng 0,73 kb; t ng ñ<br /> dài c a toàn b phân ño n 3 thu nh n ñư c là kho ng 2,23 kb.<br /> DNA plasmid tái t h p c a các clone ñư c gi i trình t và thu ñư c<br /> chu i DNA c a gen PA g m 2151 nucleotide.<br /> 3.1.6 Gi i trình t gen NP<br /> Phân ño n 5 ch a gen NP c a virus cúm A/H5N1 ch ng CkHG4<br /> ñư c nhân lên t ngu n khuôn RNA t ng s b ng ph n ng RT-PCR s<br /> d ng c p m i NPF-NPR.<br /> DNA plasmid tái t h p c a clone tương ng ñư c gi i trình t và<br /> chúng tôi thu ñư c chu i DNA c a phân ño n 5 ch ng CkHG4 ch a toàn<br /> b gen NP g m 1497 nucleotide.<br /> 3.1.7 Gi i trình t gen M<br /> DNA plasmid ch a gen M1 và M2 sau khi gi i trình t , chúng tôi thu<br /> ñư c chu i DNA c a phân ño n 7 g m 2 gen M1 (759 bp) và M2 (294<br /> bp).<br /> <br /> 3.1.8 Gi i trình t gen NS<br /> Phân ño n 8 ch a gen NS c a virus cúm A/H5N1 ch ng CkHG4<br /> ñư c nhân lên b ng ph n ng RT-PCR t ngu n khuôn RNA t ng s s<br /> d ng c p m i NSF1-NSR1.<br /> DNA plasmid tái t h p sau ñó ñư c gi i trình t và thu nh n ñư c<br /> chu i DNA c a phân ño n 8 ch a 2 gen NS1 g m 678 bp và NS2 g m<br /> 366 bp.<br /> 3.2 PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PH N GEN, M I QUAN H NGU N<br /> G C PH H C A CH NG CkHG4 V I CÁC CH NG C A VI T NAM VÀ<br /> TH GI I<br /> <br /> 3.2.1 Phân tích gen H5<br /> 3.2.1.1 Phân tích thành ph n nucleotide và amino acid<br /> Trình t nucleotide và amino acid gen H5 c a ch ng CkHG4 ñư c so<br /> sánh v i 26 ch ng cúm A/H5N1 thu c phân dòng Qu ng ðông và phân<br /> dòng Phúc Ki n c a Vi t Nam và th gi i phân l p trong các năm 20032009. K t qu so sánh, phân tích cho th y:<br /> - Gen H5 c a virus cúm A/H5N1 ch ng CkHG4 có kích thư c 1707<br /> bp, mã hóa cho 568 amino acid, kh i ñ u b ng b mã ATG (methionine)<br /> và k t thúc b ng b mã TAA.<br /> - Chu i nucleotide và polypeptide gen H5 ch ng CkHG4 có cùng<br /> kích thư c v i gen tương ng c a các ch ng thu c phân dòng Qu ng<br /> ðông là 1707 bp và 568 amino acid so v i 1704 bp (thi u h t 3<br /> nucleotide) và 567 amino acid (thi u h t 1 amino acid) c a các ch ng<br /> phân dòng Phúc Ki n.<br /> - Ch ng CkHG4 có t ng c ng 363 v trí sai khác nucleotide v i các<br /> ch ng so sánh, ch y u là ñ t bi n ñ ng hoán (transition) (ñ t bi n x y ra<br /> gi a các base trong cùng nhóm purine hay pyrimidine v i nhau, gi a A và G<br /> ho c C và T).<br /> - Gen H5 c a ch ng CkHG4 có 15 v trí sai khác nucleotide v i h u<br /> h t các ch ng so sánh và 10 nucleotide sai khác so v i các ch ng cùng phân<br /> l p vùng H u Giang (th t 2-5) t i các v trí 159, 415, 445, 582, 676, 677,<br /> 933, 945, 1170 và 1494.<br /> Trong t ng s 363 sai khác v nucleotide c a ch ng CkHG4 v i các<br /> ch ng so sánh có m t s sai khác không làm thay ñ i amino acid, nhưng<br /> m t s sai khác ñã làm bi n ñ i b mã c a amino acid d n ñ n thay ñ i<br /> amino acid t i 104 v trí. Do ñó có th nh hư ng ñ n tính kháng nguyên mi n d ch và tính gây b nh c a các ch ng ñó.<br /> - Chu i polypeptide H5 c a ch ng CkHG4 có 5 v trí sai khác v<br /> amino acid v i t t c các ch ng so sánh t i các v trí: F11V, I242M,<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> R275K, T325N và V512A (B ng 3.1).<br /> - Thành ph n chu i polypeptide n i gi a HA1 và HA2 c a ch ng<br /> CkHG4 bao g m các amino acid RRRKK, và motif này không bi n ñ i<br /> qua các năm 2003–2009 h u h t các ch ng thu c phân dòng Qu ng<br /> ðông. các ch ng thu c phân dòng Phúc Ki n chu i n i này b xóa 1<br /> amino acid (K) do ñ t bi n m t ñi 3 nucleotide (AAG) trong trình t<br /> chu i n i c a gen H5.<br /> <br /> chu i protein H5 gi a h u h t các ch ng thu c phân dòng Qu ng ðông.<br /> Protein H5 c a các ch ng phân dòng Phúc Ki n ch có 6 v trí glycosyl<br /> hóa tương ng v i các ch ng phân dòng Qu ng ðông. ðã có s thay th<br /> amino acid S (v trí 171) thành N các ch ng phân dòng Phúc Ki n t i v<br /> trí th III (170 -172) ñ chuy n t motif NST các ch ng phân dòng<br /> Qu ng ðông t o thành motif NNT các ch ng phân dòng Phúc Ki n.<br /> 3.2.1.2 Phân tích s ñ ng nh t v nucleotide và tương ñ ng v amino acid<br /> Trình t nucleotide gen H5 c a 27 ch ng cúm A/H5N1 so sánh<br /> ñư c ñưa vào chương trình GeneDoc2.5 ñ phân tích s ñ ng nh t<br /> (identity) v thành ph n nucleotide và tương ñ ng (homology) v amino<br /> acid. K t qu phân tích cho th y:<br /> 512 529<br /> V - So sánh gi a các ch ng vùng H u Giang v i nhau, t l ñ ng nh t<br /> I<br /> nucleotide và tương ñ ng amino acid bi n ñ ng ít (96-98%). M c ñ<br /> A<br /> I<br /> ñ A nhI t và tương ñ ng cao nh t là 98%, th p nh t là 96%.<br /> ng<br /> A<br /> I<br /> - So sánh các ch ng phân dòng Qu ng ðông v i nhau, t l ñ ng nh t<br /> A<br /> I<br /> vàAtương ñ ng bi n ñ ng r t l n, 91-99% v nucleotide và 87-100% v<br /> I<br /> A<br /> T<br /> amino acid, ch y u là do có s bi n ñ ng l n gi a các ch ng phân l p<br /> A<br /> I<br /> năm 2003-2007 v i 3 ch ng phân l p năm 2008-2009.<br /> A<br /> I<br /> A - So sánh các ch ng phân dòng Phúc Ki n v i nhau, t l ñ ng nh t<br /> I<br /> A<br /> I<br /> nucleotide bi n ñ ng r t l n (94-99%); tương t , t l tương ñ ng amino<br /> A<br /> I<br /> acid cũng ph n ánh ñúng m c ñ bi n ñ i l n (94-100%).<br /> A<br /> I<br /> A - T I l ñ ng nh t nucleotide và tương ñ ng amino acid c a các ch ng<br /> phân dòng Qu ng ðông so v i các ch ng phân dòng Phúc Ki n là r t th p,<br /> A<br /> I<br /> A<br /> T<br /> 90-96% v nucleotide và 88-96% v amino acid.<br /> S<br /> T<br /> 3.2.1.3 T<br /> Phân tích m i quan h ngu n g c ph h<br /> S<br /> A Gen hemagglutinin HA (H5) thu nh n t ch ng CkHG4 ñư c ñưa vào<br /> T<br /> A<br /> T<br /> phân tích ph h cùng v i 54 ch ng cúm A/H5N1 c a Vi t Nam và th<br /> A<br /> T<br /> gi Ai phân l p qua các năm 1996-2011 (Hình 3.1).<br /> T<br /> A Hình 3.1 cho th y, ch ng CkHG4 t p h p trong cùng m t nhóm v i<br /> T<br /> A<br /> các ch T cúm A/H5N1 phân l p phía Nam c a Vi t Nam giai ño n<br /> ng<br /> A<br /> T<br /> 2004-2007, ñó là: Ck-VN-DT-171-04 (DQ099759), Ck-VN-TG-023-04<br /> A<br /> T<br /> (DQ099758), Dk-VN-HG680F-05 (ISDN230184), Ck-VN-LA636-05<br /> A<br /> T<br /> (ISDN230180),<br /> Dk-VN-1231-05<br /> (CY029519),<br /> Dk-VN-1771-05<br /> (CY029551), Ck-VN-29-07 (CY029631); và m t s ch ng phân l p t<br /> Thái Lan là Ck-TL-NIAH7618-04 (AB450562), Ck-Uthaithani-05<br /> (FJ265572), Ck-TL-CU-354-08 (CY047457). ði u này cho phép nh n xét,<br /> có th các ch ng cúm A/H5N1 t gia c m H u Giang, ð ng Tháp, Ti n<br /> Giang, Long An, Sóc Trăng là có cùng ngu n g c và thu c nhóm di<br /> <br /> B ng 3.1: So sánh v trí sai khác amino acid c a chu i polypeptide H5<br /> gi a 27 ch ng virus cúm<br /> Ch ng<br /> <br /> Ch ng<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> 10<br /> 11<br /> 12<br /> 13<br /> 14<br /> 15<br /> 16<br /> 17<br /> 18<br /> 19<br /> 20<br /> 21<br /> 22<br /> 23<br /> 24<br /> 25<br /> 26<br /> 27<br /> <br /> 8<br /> F<br /> F<br /> F<br /> F<br /> F<br /> F<br /> L<br /> F<br /> F<br /> F<br /> F<br /> F<br /> F<br /> F<br /> F<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> I<br /> L<br /> L<br /> L<br /> F<br /> L<br /> L<br /> <br /> 11<br /> F<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> I<br /> T<br /> T<br /> V<br /> V<br /> V<br /> I<br /> I<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> <br /> 102<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> A<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> A<br /> A<br /> A<br /> A<br /> A<br /> A<br /> A<br /> A<br /> A<br /> A<br /> A<br /> A<br /> <br /> 110<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> V<br /> V<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> D<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> <br /> 140<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> N<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> N<br /> E<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> D<br /> <br /> 156<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> R<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> N<br /> R<br /> R<br /> T<br /> T<br /> S<br /> V<br /> V<br /> S<br /> N<br /> T<br /> T<br /> <br /> 171<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> S<br /> N<br /> D<br /> D<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> <br /> V trí sai khác v amino acid<br /> 191 228 242 243 275 279<br /> M<br /> R<br /> I<br /> E<br /> R<br /> T<br /> M<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> M<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> M<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> M<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> L<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> L<br /> K<br /> M<br /> E<br /> K<br /> A<br /> L<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> M<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> M<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> M<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> M<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> M<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> I<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> M<br /> R<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> L<br /> K<br /> M<br /> D<br /> K<br /> A<br /> L<br /> K<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> L<br /> K<br /> M<br /> E<br /> K<br /> T<br /> L<br /> K<br /> M<br /> D<br /> K<br /> A<br /> L<br /> K<br /> M<br /> D<br /> K<br /> A<br /> L<br /> K<br /> M<br /> D<br /> K<br /> A<br /> L<br /> K<br /> M<br /> D<br /> K<br /> A<br /> L<br /> K<br /> M<br /> D<br /> K<br /> A<br /> L<br /> K<br /> M<br /> D<br /> K<br /> A<br /> L<br /> K<br /> I<br /> D<br /> K<br /> T<br /> L<br /> K<br /> M<br /> D<br /> K<br /> A<br /> L<br /> K<br /> M<br /> D<br /> E<br /> A<br /> <br /> 285<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> L<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> V<br /> <br /> Ghi chú: Các ch ng ñư c ñánh s th t t 1 ñ n 5 là các ch ng phân l p<br /> vùng H u Giang, 1-18 là các ch ng thu c phân dòng Qu ng ðông, 19-27 là các<br /> ch ng thu c phân dòng Phúc Ki n.<br /> <br /> - Chu i polypeptide H5 c a ch ng CkHG4 và các ch ng so sánh có 7<br /> v trí glycosyl hóa, bao g m 5 v trí trên HA1 và 2 v trí trên HA2. Không<br /> có s khác bi t v các v trí liên quan ñ n kh năng glycosyl hóa c a<br /> <br /> 298<br /> I<br /> M<br /> M<br /> M<br /> M<br /> M<br /> M<br /> M<br /> M<br /> M<br /> M<br /> M<br /> M<br /> M<br /> V<br /> I<br /> M<br /> V<br /> I<br /> I<br /> M<br /> I<br /> I<br /> M<br /> M<br /> M<br /> M<br /> <br /> 325<br /> T<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> N<br /> <br /> 326<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> R<br /> K<br /> R<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> K<br /> <br />