Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) (họ La đơn (Iridaceae))

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:12

Thêm vào BST

Báo xấu

103
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) (họ La đơn (Iridaceae))” với mục tiêu làm sáng tỏ thành phần hoá học và hoạt tính sinh học (đặc biệt là hoạt tính kháng viêm), nhằm nâng cao giá trị sử dụng và khai thác có hiệu quả nguồn hoạt chất quý giá từ hai cây thuốc dân gian này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) (họ La đơn (Iridaceae))

24 1 A (BS-3), irigenin (BS-4), irilin D (BS-7), tectoridin (BS-9) và tectorigenin 4’-O-β-D- I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN glucoside (BS-10); 3 hợp chất flavonoid là rhamnocitrin (BS-6), kaempferol-3-O-β-D- 1. Đặt vấn đề glucopyranoside (BS-11) và isoquercetin (BS-12); và 4 hợp chất khác là acetovanillone Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, được thiên (BS-5), daucosterol (BS-8), 24E-stigmasta-5,22-dien-3β-ol (BS-13), axit myristic (BS- nhiên ưu đãi nên có thảm thực vật phong phú và đa dạng, với khoảng hơn 14.000 loài 14). Trong số đó, 4 hợp chất là: acetovanillone (BS-5), kaempferol-3-O-β-D- thực vật bậc cao. Trong đó, có khoảng gần 4.000 loài được sử dụng làm thuốc chữa bệnh glucopyranoside (BS-11), isoquercetin (BS-12) và axit myristic (BS-14) là các hợp chất trong y học cổ truyền. Nước ta có nền y học cổ truyền hết sức đa dạng và đặc sắc, với bề lần đầu được phân lập từ loài này. Hai hợp chất tectorigenin và tectoridin là thành phần dày hàng nghìn năm lịch sử, nền y học dân tộc cũng không ngừng phát triển qua các thời chính trong thân rễ thực vật này. kỳ đó. Nhiều bài thuốc, vị thuốc có tác dụng tốt trên lâm sàng nhưng chưa được nghiên 2. Về nghiên cứu hoạt tính sinh học cứu sâu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý và độc tính. Nghiên cứu để khai thác, kế 2.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm của các dịch chiết cho thấy chỉ có cặn chiết thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là vấn đề có ý nghĩa ethyl acetat (EB-Et) của củ sâm đại hành, cặn chiết ethyl acetat (BS-Et) và cặn nước (BS- khoa học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta. W) của thân rễ xạ can có hoạt tính kháng viêm theo đường uống với mức độ ức chế khối Trong chương trình sàng lọc các cây thuốc có hoạt tính kháng viêm từ nguồn dược viêm tương ứng là 52,12%, 70%, 64,26%. Tất cả các cặn chiết củ sâm đại hành và thân rễ liệu Việt Nam, chúng tôi đã phát hiện thấy các cây thuốc họ La dơn có hoạt tính kháng xạ can không thể hiện hoạt tính khi thử nghiệm theo đường bôi. viêm khá tốt. Ngoài ra, chúng còn có một số hoạt tính khác như: kháng nấm, kháng 2.2 Lần đầu tiên nghiên nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ khuẩn, độc tế bào, chống oxy hoá... Trong đó, đáng chú ý nhất là hai loài Belamcanda tế bào tua DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của 14 hợp chất phân lập chinensis (L.) DC. (xạ can) và Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb. (sâm đại hành). Đây là được từ củ sâm đại hành. Kết quả cho thấy có 4 hợp chất: (2S) dihydroeleutherinol-8-O- hai cây thuốc mới chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, chưa có nhiều các nghiên β-D-glucopyranoside (EB-1), hongconin (EB-4), eleutherine (EB-5), và isoeleutherin cứu về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh học cả ở Việt Nam và trên thế giới. (EB-6) có hoạt tính tốt ức chế sự sản sinh các cytokine IL-12 p40 (với giá trị IC50 từ Trong y học dân gian, cây xạ can thường được sử dụng để chữa viêm họng, viêm amidan, 0,1±0,08→5±0,4 µM) và IL-6 (với giá trị IC50 từ 1,7±0,1→8,7±0,3 µ M) từ tế bào tua đau cổ, ho và khó thở do nhiều đờm, chữa sốt, tắc tia sữa… Còn cây sâm đại hành (DCs) sinh ra từ tủy xương. Kết quả này cho thấy có thể sử dụng các hợp chất này như là thường được dùng để trị thiếu máu, vàng da, hoa mắt, nhức đầu, mệt mỏi, ho ra máu, cầm các chất kháng viêm tiềm năng trong tương lai. máu, ho, ho lao… 2.3 Đã đánh giá hoạt tính kháng viêm và độ an toàn của tectorigenin là hoạt chất Vì vậy đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài sâm chính phân lập được từ thân rễ xạ can. đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) - Tác dụng kháng viêm, giảm đau: (họ La dơn (Iridaceae))” với mục tiêu làm sáng tỏ thành phần hoá học và hoạt tính sinh Tectorigenin có tác dụng giảm đau rõ rệt nhất ở liều 100 mg/kg cân nặng chuột nhắt. học (đặc biệt là hoạt tính kháng viêm), nhằm nâng cao giá trị sử dụng và khai thác có Với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin có tác dụng chống viêm cấp và hiệu quả nguồn hoạt chất quý giá từ hai cây thuốc dân gian này. viêm mạn. 2. Đối tượng nghiên cứu và nội dung của luận án - Độc tính cấp tính của tectorigenin đã được xác định với giá trị LD50 là (1,78 ± 0,13) Đối tượng nghiên cứu của luận án là củ cây sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) g/kg P. Urb.) và thân rễ cây xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.). - Độc tính bán trường diễn: tectorigenin với các liều thử 100 mg/kg cân nặng và 300 Nội dung chính của luận án là: mg/kg cân nặng, cho chuột ống thuốc liên tục 28 ngày không làm ảnh hưởng đến cân 1. Điều chế và đánh giá hoạt tính kháng viêm các cặn chiết của củ sâm đại hành và thân nặng, không làm thay đổi chức phận tạo máu và chức năng gan, thận so với lô chứng. rễ xạ can. KIẾN NGHỊ 2. Chiết tách và phân lập các hợp chất từ 2 loài thực vật này. Nghiên cứu thành phần hoá học của cặn chiết n-hexane của hai loài xạ can và sâm đại 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập. hành. 4. Đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập được. Nghiên cứu hợp chất mới EB-1 (hợp chất kháng viêm tiềm năng) cùng một số hợp 3. Những đóng góp mới của luận án chất khác để tạo sản phẩm mới. 3.1 Từ củ sâm đại hành đã phân lập và xác định cấu trúc hoá học của 14 hợp chất là: (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1), eleutherinol (EB-2), eleutherinoside A (EB-3), hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5), isoeleutherin (EB-6), eleuthoside C (EB-7), eleutherineoside C (EB-8), eleutherinoside B (EB-9), (R)-7-acetyl- 3,6-dihydroxy-8-methyltetralone (EB-10), eleuthoside A (EB-11), eleuthoside B (EB- 12), eleutherinoside D (EB-13) và 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) từ củ sâm đại hành. Trong đó, (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1) là
2 23 hợp chất mới và hợp chất 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) lần đầu được Protein N14 46,29±0,98 46,13±0,96 47,36 ± 1,11 > 0,05 phân lập từ loài này. toàn phần 3.2 Từ thân rễ xạ can đã phân lập và xác định cấu trúc hoá học của 14 hợp chất là: (g/L) N28 43,89±2,27 44,98±1,54 44,49±2,61 > 0,05 irisflorentin (BS-1), tectorigenin (BS-2), iristectorigenin A (BS-3), irigenin (BS-4), p: so với lô chứng; Lô thử 1: 100 mg tectorigenin/kg P; Lô thử 2: 300 mg acetovanillone (BS-5), rhamnocitrin (BS-6), irilin D (BS-7), daucosterol (BS-8), tectorigenin/kgP tectoridin (BS-9), tectorigenin 4’-O-β-D-glucoside (BS-10), kaempferol-3-O-β-D- + Kết quả bảng 4.24 cho thấy: tại ba thời điểm nghiên cứu, không thấy có sự khác glucopyranoside (BS-11), isoquercetin (BS-12), 24E-stigmasta-5,22-dien-3β-ol (BS-13) biệt về thông số AST, ALT cholesterol toàn phần và protein toàn phần giữa các lô chuột và axit myristic (BS-14). Trong đó 4 hợp chất: acetovanillone (BS-5), kaempferol-3-O-β- thực nghiệm (p>0,05). D-glucopyranoside (BS-11), isoquercetin (BS-12) và axit myristic (BS-14) lần đầu được + Kết quả quan sát đại thể mô bệnh học gan chuột sau 28 ngày uống thuốc như sau: ở phân lập từ cây xạ can. cả 2 lô thuốc thử và lô chứng mặt gan nhẵn, mật độ bình thường, màu đỏ, không có sung 3.3 Đã xác định được cặn chiết ethyl axetat (BS-Et), cặn nước (BS-W) của thân rễ xạ can huyết, không có dấu hiệu tổn thương. và cặn ethyl axetat (EB-Et) của củ sâm đại hành có hoạt tính kháng viêm theo đường - Đánh giá chức năng thận uống với phần trăm ức chế khối viêm tương ứng là 52,12%, 70%, 64,26%. Kết quả định lượng creatinin ở các lô chuột thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.4 Là công trình đầu tiên nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh các cytokine gây viêm 4.25. từ tế bào tua DC sinh ra từ tuỷ xương bị kích thích bởi LPS của 14 hợp chất phân lập Bảng 4.25. Ảnh hưởng của tectorigienin đến thông số creatinin huyết thanh của được từ củ sâm đại hành. Hợp chất mới EB-1 và các hợp chất EB-4, EB-5 và EB-6 ức chuột thực nghiệm chế khá tốt sự sản sinh các cytokine IL-12 p40 (với giá trị IC50 từ 0,1±0,08→5±0,4 Chỉ số Thời điểm Lô chứng Lô thử 1 Lô thử 2 p µg/mL) và IL-6 (với giá trị IC50 từ 1,7±0,1→8,7±0,3 µg/mL). Gợi ý cho thấy có thể sử nghiên cứu nghiên cứu (n = 10) (n = 10) (n = 10) dụng các hợp chất này như là các chất kháng viêm tiềm năng trong tương lai. 3.5 Đã đánh giá tác dụng kháng viêm, giảm đau và độ an toàn của hợp chất chính Creatinin N14 399,94±10,26 368,26 ± 15,41 354,65±29,44 > 0,05 tectorigienin phân lập được từ thân rễ xạ can. (µmol/L) N28 417,54±12,38 419,83 ± 5,46 431,98±7,45 > 0,05 - Tác dụng kháng viêm, giảm đau: Tectorigenin có tác dụng giảm đau rõ rệt nhất ở liều p: so với lô chứng; Lô thử 1: 100 mg tectorigenin/kg P; Lô thử 2: 300 mg 100 mg/kg cân nặng chuột nhắt. Với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin có tectorigenin/kgP tác dụng chống viêm cấp và viêm mạn. Kết quả bảng 4.25 cho thấy: sau 2 tuần và 4 tuần uống thuốc liên tục, hàm lượng - Độc tính cấp tính của tectorigenin được xác định với giá trị LD50 là (1,78±0,13) g/kg P. creatinin trong máu chuột không có sự thay đổi khác biệt so với lô chứng (p>0,05). - Độc tính bán trường diễn: tectorigenin với các liều thử 100 mg/kg cân nặng và 300 Quan sát đại thể mô bệnh học thận chuột sau 28 ngày uống thuốc cho thấy thận ở mức mg/kg cân nặng, cho chuột ống thuốc liên tục 28 ngày không làm ảnh hưởng đến cân bình thường, mật độ chắc bình thường, màu đỏ thẫm, mặt nhẵn, màu đỏ, không thấy đám nặng, không làm thay đổi chức phận tạo máu và chức năng gan, thận và mô bệnh học so sung huyết và đám tổn thương. với lô chứng. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chỉ số creatinin không có sự khác biệt so với lô 4. Bố cục của luận án chứng, chứng tỏ tectorigienin không ảnh hưởng đến chức năng lọc của cầu thận. Kết quả Luận án gồm 148 trang với 27 bảng số liệu, 125 hình, 159 tài liệu tham khảo và 62 này phù hợp với hình ảnh cấu trúc vi thể của thận. phụ lục. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan (30 trang), Chương KẾT LUẬN 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (5 trang), Chương 3: Thực nghiệm (26 trang), 1. Về thành phần hoá học Chương 4: Kết quả và thảo luận (82 trang), Kết luận (2 trang), Các công trình đã công bố 1.1 Từ củ sâm đại hành đã phân lập và xác định được cấu trúc của 14 hợp chất là: (1 trang), Tài liệu tham khảo (17 trang). (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1), eleutherinol (EB-2), II. NỘI DUNG LUẬN ÁN eleutherinoside A(EB-3), hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5), isoeleutherin (EB-6), Mở đầu: đề cập đến tính thực tiễn, ý nghĩa khoa học, tính thời sự, mục tiêu và nhiệm vụ eleuthoside C (EB-7), Eleutherineoside C (EB-8), eleutherinoside B (EB-9), (R)-7- của luận án. acetyl-3,6-dihydroxy-8-methyltetralone (EB-10), eleuthoside A (EB-11), eleuthoside B CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN (EB-12), eleutherinoside D (EB-13), 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14). Trên cơ sở nghiên cứu tài liệu, chương này đề cập đến tình hình nghiên cứu hoá học Trong số đó, (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1) là hợp chất mới và hoạt tính sinh học của loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và loài xạ và hợp chất 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) lần đầu được phân lập từ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.), khái niệm về viêm và một số hợp chất phenolic loài này. thực vật có hoạt tính kháng viêm. 1.2 Từ thân rễ loài xạ can đã phân lập và xác định được cấu trúc của 14 hợp chất gồm: 7 hợp chất isoflavonoid là irisflorentin (BS-1), tectorigenin (BS-2), iristectorigenin
22 3 Chuột ở các lô thí nghiệm đều tăng cân rõ rệt sau 2 tuần và 4 tuần uống thuốc CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (ptr/s 0,05). 2011 và thân rễ cây xạ can thu vào tháng 1 đến tháng 3 năm 2010 tại Lạng Sơn. - Ảnh hưởng lên chức năng tạo máu 2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp Kết quả định lượng các thông số huyết học: số lượng hồng cầu (HC), nồng độ mỏng điều chế, sắc ký cột (CC) pha thường và pha đảo. hemoglobin (Hb), tỷ lệ hematocrit (HCT), số lượng tiểu cầu (PLT) và số lượng bạch cầu 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất: kết hợp giữa các thông số vật lý với các (BC), tại các thời điểm sau khi cho uống thuốc 14 ngày (N14) và sau khi uống thuốc 28 phương pháp phổ hiện đại như: phổ khối lượng, phổ khối phân giải cao, phổ cộng hưởng ngày (N28) được trình bày ở bảng 4.23. từ hạt nhân 1D, 2D NMR. Bảng 4.23. Ảnh hưởng của tectorigienin trên các thông số huyết học của chuột thực 2.4 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học: nghiệm Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vivo của các cặn chiết: Chỉ số nghiên Thời điểm Lô chứng Lô thử 1 Lô thử 2 - Theo đường bôi: theo phương pháp của Mrudula Kale (2007), Jaijoy K (2010). p cứu nghiên cứu (n = 10) (n = 10) (n = 10) - Theo đường uống: theo phương pháp của Miklos Gabor (2009). N14 8,16 ± 0,21 7,92 ± 0,33 6,87 ± 0,57 > 0,05 Nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC (dendritic HC (1012/L) cells) sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS (lipopolysaccharide) của các hợp N28 7,99 ± 0,27 8,38 ± 0,22 8,51 ± 0,21 > 0,05 Hb N14 13,35 ± 0,36 12,14 ± 0,49 11,34 ± 1,00 > 0,05 chất phân lập được từ cây sâm đại hành: được tiến hành tại Viện CN sinh học Hàn (g/100mL) N28 13,34 ± 0,31 12,56 ± 0,43 13,17 ± 0,39 > 0,05 Quốc, các hợp chất được thử nghiệm ở các nồng độ 50,0; 25,0; 12,5 và 6,3 µM, dịch HCT N14 37,59 ± 1,11 35,57 ± 1,49 32,72 ± 2,16 > 0,05 huyền phù được thu hoạch sau 16 giờ kích thích, phát hiện nồng độ murine IL-12p40, IL- (%) N28 37,89 ± 1,29 37,20 ± 1,13 38,28 ± 0,88 > 0,05 6 và TNF-α bằng máy ELISA. N14 716,56± 31,88 721,00±40,46 694,60±47,05 > 0,05 Nghiên cứu tác dụng dược lí in vivo và độ an toàn của tectorigenin phân lập được từ PLT thân rễ cây xạ can N28 812,20± 38,41 792,90±35,59 793,78± 33,35 > 0,05 - Nghiên cứu tác dụng kháng viêm, giảm đau của tectorigenin thực hiện tại bộ môn Dược BC N14 1,95 ± 0,20 1,80 ± 0,15 1,64 ± 0,21 > 0,05 lí, trường đại học Dược Hà Nội theo các phương pháp chuẩn thường qui. (109/L) N28 1,58 ± 0,19 1,99 ± 0,22 1,48 ± 0,11 > 0,05 - Nghiên cứu độ an toàn của tectorigienin được tiến hành tại bộ môn Dược lí, Viện Kiểm Tại cả 3 thời điểm nghiên cứu, không thấy có sự biến đổi về số lượng hồng cầu, hàm nghiệm thuốc trung ương: độc tính cấp, độc tính bán trường diễn được đánh giá theo lượng hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, số lượng tiểu cầu và số lượng bạch cầu giữa các lô phương pháp của OECD. thực nghiệm (p > 0,05). CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM - Đánh giá chức năng gan Chương này mô tả chi tiết các quá trình chiết, phân lập các hợp chất và đánh giá các Kết quả định lượng các thông số AST (aspartat aminotransferase), ALT (alanin amino hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập được. transferase), cholesterol toàn phần, protein toàn phần tại các thời điểm N14, N28 được Quy trình phân lập các hợp chất từ củ sâm đại hành trình bày trong bảng 4.24. Cặn EB/Et Bảng 4.24. Ảnh hưởng của tectorigienin đến các thông số AST, ALT, SKC, SiO2, gradient HX:Aceton (40:1 -1:1) cholesterol toàn phần và protein toàn phần. Chỉ số Thời điểm Lô chứng Lô thử 1 Lô thử 2 p nghiên cứu nghiên cứu (n = 10) (n = 10) (n = 10) EB-A EB-B EB-C EB-D SKC, SiO2 SKC, SiO2 ALT N14 176,28±9,38 156,75±7,11 155,13±7,54 > 0,05 CHCl3:Aceton 10:1) HX:Aceton (5:1) (U/L) N28 194,58±17,27 173,91±18,61 209,41±22,02 > 0,05 EB-14 (10mg) EB-B1 EB-B2 EB-B3 EB-B4 AST N14 59,68 ± 4,79 64,74±3,15 64,80±5,93 > 0,05 SKC, YMC RP-18, SKC, YMC RP-18 (U/L) N28 75,04 ±3,99 82,66±5,48 74,09±7,90 > 0,05 MeOH:H2O (6:1) MeOH:H2O (3:1) Cholesterol N14 1,88±0,10 2,06±0,11 2,05 ± 0,12 > 0,05 EB-2 EB-10 EB-4 EB-5 EB-6 toàn phần (12mg) (8mg) (5mg) (9mg) (15mg) (mmol/L) N28 2,04±0,14 1,79±0,13 1,76 ± 0,10 > 0,05 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat của củ sâm đại hành
4 21 Cặn EB-W Lô thử uống 313,48±40,52 56,49±5,01 SKC, Dianion HP-20P, MeOH (0%, 25%, 50%, tectorigienin liều p3/10,05 Ghi chú: px/y: mức độ tin cậy của lô x so với lô y EB-E EB-F EB-G EB-H EB-K SKC, SiO 2 Từ bảng 4.20 ta thấy tectorigienin thể hiện rõ tác dụng chống viêm mạn khi cân khối SKC, LH-20 MeOH CHCl3:MeOH:H 2O (5:1:0,15) lượng u hạt lúc ướt và lúc khô. Tỷ lệ ức chế u hạt của tectorigienin tương đối cao, khi cân ướt là 35,67%, khi cân khô là 43,54%. Tác dụng chống viêm của tectorigienin liều 60 EB-G1 EB-G2 EB-G3 SKC, YMC RP-18 EB-1 EB-3 mg/kg cân nặng tương đương với tác dụng chống viêm của prednisolon liều 5 mg/kg cân SKC, YMC RP-18 Aceton:H2O (1:2) MeOH:H2O (1:1) (5mg) (9mg) nặng. b. Nghiên cứu về tính an toàn của tectorigienin EB-11 (19mg) * Độc tính cấp EB-7 EB-8 EB-12 EB-13 (12mg) (15mg) (9mg) (14mg) Đã tiến hành nghiên cứu độc tính cấp của tectorigenin ở 5 mức liều khác nhau. Số EB-9 lượng chuột chết ở các lô thử cụ thể được trình bày trong bảng 4.21. (8mg) Bảng 4.21 Kết quả theo dõi động vật thí nghiệm Mức Liều thử Số chuột chết/ Số chuột chết/ Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn nước của củ sâm đại hành % chết liều (g mẫu thử/kg chuột) sống thực tế sống kỳ vọng Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành 1 1,0 0/10 0/21 0,00 Hợp chất EB-1 (1) 25 Chất bột màu vàng nhạt; [α ] D –58,1 (MeOH, c = 0,3); ESI-MS m/z 419 [M‒H]–; 2 1,5 4/6 4/11 26,67 HR-ESI-MS m/z 455,1126 [M+Cl]– (C21H24O9Cl, 455,1114), m/z 419,1338 [M‒H]– 3 2,0 7/3 11/5 68,75 (C21H23O9, 419,1348), m/z 257,0818 [M‒Glc]– (C15H13O4, 257,0819). 4 2,5 8/2 19/2 90,48 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,87 (1H, ddq, J=4,0; 6,1; 12,0, H-2); 2,57 5 3,0 10/0 29/0 100,00 (1H, dd, J=4,0; 16,8, Hb-3); 2,62 (1H, dd, J=12,0; 16,8, Ha-3); 6,85 (1H, s, H-6); 6,67 Từ kết quả trên theo công thức tính của Behrens đã xác định được độc tính cấp của (1H, s, H-7); 6,45 (1H, s, H-9); 1,46 (1H, d, J=6,1, 2-Me); 2,45 (1H, s, 5-Me); 4,93 (1H, tectorigienin với giá trị LD50 = (1,78 ± 0,13) gam/kg chuột. d, J=7,2, H-1′); 3,40 (1H, H-2′); 3,47 (1H, H-3′); 3,31 (1H, d, J=8,5, H-4′); 3,42 (1H, H- * Độc tính bán trường diễn 5′); 3,62 (1H, dd, J=5,6; 12,2, Hb-6′); 3,83 (1H, dd, J=2,2; 12,2, Ha-6′). - Về tình trạng chung: 13 C-NMR (125 MHz, CD3 OD) δ (ppm): 163,4 (C-1); 78,0 (C-2); 45,9 (C-3); 194,3 Trong thời gian thử nghiệm, chuột ở cả 3 lô hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, mắt (C-4); 114,6 (C-4a); 137,6 (C-5); 124,2 (C-6); 141,4 (C-6a); 103,6 (C-7); 161,4 (C-8); sáng, lông mượt, ăn uống bình thường, phân khô, nước tiểu bình thường. Không thấy 103,5 (C-9); 158,7 (C-10); 109,9 (C-10a); 20,7 (2-Me); 23,3 (5-Me); 101,7 (C-1′); 74,8 biểu hiện đặc biệt ở cả 3 lô chuột trong suốt thời gian nghiên cứu. Tiến hành cân chuột (C-2′); 78,0 (C-3′); 71,4 (C-4′); 78,3 (C-5′); 62,5 (C-6′). trước, trong và lúc kết thúc thí nghiệm. Mức độ tăng cân của chuột so với trước khi uống Thuỷ phân hợp chất EB-1 thuốc tại các thời điểm nghiên cứu như sau: Hoà tan hợp chất EB-1 trong dung dịch HCl 0,1 N (dioxane/H2O, 1:1, v/v, 1,0 ml) rồi Bảng 4.22. Ảnh hưởng của tectorigienin đến mức độ tăng cân của chuột (%) đun cách thuỷ ở 800C trong 3h. Sau đó, dung dịch axit được trung hoà bởi Ag2CO3, và Thời điểm Lô chứng Lô thử 1 Lô thử 2 p dung môi được loại bỏ triệt để bởi khí N2, sau đó chiết với CHCl3 được lớp CHCl3 và lớp nghiên cứu (n = 10) (n = 10) (n = 10) nước. Lớp CHCl3 đem tiến hành sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dung môi CHCl3- 25,98 ± 0,63 25,94±0,29 MeOH (8:1, v/v) thu được hợp chất EB-1a. N0 24,00 ± 0,53 >0,05 ptr/s < 0,01 ptr/s < 0,01 Lớp nước được làm khô kiệt bởi khí N2, phần cặn hoà tan trong 0,1 ml pyridine khô 28,75 ± 0,64 28,38±0,51 rồi thêm vào đó este L-cysteine methyl hydrochloride trong pyridin (0,06 M, 0,1 mL). N14 26,40 ± 0,52 >0,05 ptr/s < 0,01 ptr/s < 0,01 Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 600C trong 2 giờ rồi bổ sung thêm 0,1 ml dung 33,76 ± 0,97 31,24±0,68 dịch trimethylsilylimidazole và tiếp tục gia nhiệt đến 600C trong 1,5 giờ. Sản phẩm sau N28 27,96 ± 0,79 ptr/s < 0,01 ptr/s < 0,01 >0,05 khi được làm khô được phân bố với n-hexan (0,1 ml) và H2O (0,1 ml), lớp n-hexan được p: so với lô chứng ptr/s: so với thời điểm N0 phân tích bằng sắc ký khí GC (cột SPB-1 (0,25 mm×30 m), detector FID, nhiệt độ cột Ghi chú: N0: lúc bắt đầu dùng thuốc; N14: thời gian dùng thuốc sau 14 ngày; N28: thời 2100C, nhiệt độ tiêm 2700C, nhiệt độ detector 3000C, khí mang He (2,0 ml/phút)). Thời gian dùng thuốc sau 28 ngày gian lưu của peak được phát hiện ở 14,11 phút. Với những điều kiện trên thì peak của
20 5 Tác dụng chống viêm cấp của tectorigienin được đánh giá qua tác dụng ức chế khả đường chuẩn D-glucose và L-glucose có thời gian lưu tương ứng là 14,11 và 14,26 phút. năng gây phù bàn chân chuột cống bằng carragenin, với liều thử nghiệm là 60 mg Do đó, có thể xác định được gốc đường của EB-1 là D-glucose. tectorigienin/kg cân nặng chuột cống (mức liều này tương đương với 100 mg Hợp chất EB-1a 25 tectorigienin/kgP chuột nhắt). Kết quả được trình bày tại bảng 4.18 và 4.19. Chất bột màu vàng nhạt; [α ] D –38,3 (MeOH, c = 0,3); HR-ESI-MS m/z 257,0810 ‒ Bảng 4.18 Tác dụng chống viêm cấp của tectorigienin [M-H] (C15H13O4, 257,0819). 1 Tỉ lệ phù chân chuột tại các thời điểm nghiên cứu H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,88 (1H, H-2); 2,72 (1H, dd, J=3,7; 16,8, Hb- Lô thí nghiệm ∆V1% ∆V3% ∆V4% ∆V5% ∆V7% ∆V24% 3); 2,80 (1H, dd, J=12,0; 16,8, Ha-3); 6,90 (1H, s, H-6); 6,48 (1H, d, J=2,2, H-7); 6,35 Lô 1 (1H, d, J=2,2, H-9); 1,60 (1H, d, J=6,1, 2-Me); 2,59 (1H, s, 5-Me). 13 (Chứng trắng) 12,24±1,67 40,27±2,72 46,62 ± 2,7146,9 ± 1,94 62,4±2,20 20,1± 1,66 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 163,8 (C-1); 77,9 (C-2); 46,0 (C-3); 194,0 NaCMC 1% (C-4); 113,7 (C-4a); 137,3 (C-5); 123,3 (C-6); 141,7 (C-6a); 102,6 (C-7); 162,0 (C-8); Lô 2 4,69 ± 0,80 12,7± 1,19 22,9 ± 1,13 25,3±1,17 34,7±1,91 11,3±1,35 102,9 (C-9); 158,9 (C-10); 108,3 (C-10a); 20,8 (2-Me); 23,4 (5-Me). (Chứng+) Hợp chất EB-2 (2) Indomethacin p2/1 > 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 >0,05 Chất bột màu trắng, mp.>310oC, C15H12O4, ESI-MS m/z 257 [M+H]+. 1 liều 10mg/kgP H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,19 (1H, s, H-6); 6,56 (1H, Lô 3 1,6 ± 0,85 18,6 ± 2,66 23,5 ± 2,84 19,7±2,62 20,4±2,77 7,6±2,05 s, H-7); 6,58 (1H, s, H-9); 2,37 (1H, s, 2-Me); 2,71 (1H, s, 5-Me); 10,05 (1H, s, 8-OH); tectorigienin liều p3/1 > 0,05 p3/1 > 0,05 p3/1 > 0,05 p3/1 < 0,05 p3/1 < 0,05 p3/1 > 0,05 10,15 (1H, s, 10-OH). 13 60mg/kgP p3/2 > 0,05 p3/2 > 0,05 p3/2 > 0,05 p3/2 > 0,05 p3/2 > 0,05 p3/2 > 0,05 C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,8 (C-1a), 163,5 (C-2); 112,1 (C-3); 178,6 Ghi chú: px/y: so sánh lô x và lô y. (C-4); 116,3 (C-4a); 134,4 (C-5); 124,8 (C-6); 138,7 (C-6a); 102,9 (C-7); 156,9 (C-8); Như vậy, với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin thể hiện tác dụng 101,2 (C-9); 159,3 (C-10); 107,2 (C-10a); 19,4 (2-Me); 23,0 (5-Me). chống viêm rõ nhất là sau 5-7 giờ gây viêm. Hợp chất EB-3 (3) Bảng 4.19 Tỷ lệ % ức chế phù chân chuột của tectorigienin so với lô chứng trắng Chất bột màu trắng, mp. 175-1760C, C21H22O9, ESI-MS m/z 417 [M-H]¯ . 1 H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,27 (1H, s, H-6); 6,89 (1H, Lô 1 giờ 2 giờ 4 giờ 5 giờ 7 giờ 24 giờ d, J=2,1 Hz, H-7); 6,66 (1H, d, J=2,1 Hz, H-9); 2,35 (1H, s, 2-Me); 2,70 (1H, s, 5-Me); Lô chứng dương uống 4,98 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,24 (1H, t, J=7,6 Hz, H-2′); 3,36 (1H, m, H-3′); 3,19 (1H, 61,69 68,39 50,86 46,31 44,32 43,89 indomethacin liều 10mg/kg t, J=8,3 Hz, H-4′); 3,28 (1H, m, H-5′); 3,69 (1H, dd, J=1,2; 11,4 Hz, Ha-6′); 3,49 (1H, dd, Lô thử tectorigienin liều J=5,5; 11,4 Hz, Hb-6′). 86,93 53,77 49,58 58,04 67,32 62,27 13 60mg/kg C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,3 (C-1a), 163,7 (C-2); 112,1 (C-3); 178,5 Từ bảng 4.19 cho thấy tỷ lệ ức chế phù chân chuột của tectorigienin liều 60mg/kg cân (C-4); 117,1 (C-4a); 134,7 (C-5); 125,5 (C-6); 138,1 (C-6a); 101,5 (C-7); 158,5 (C-8); nặng khá cao và tương đương với tỷ lệ ức chế phù chân chuột của indomethacin liều 10 103,1 (C-9); 156,5 (C-10); 108,7 (C-10a); 19,5 (2-Me); 23,0 (5-Me); 100,0 (C-1′); 73,2 mg/kg cân nặng. Tỷ lệ ức chế cao nhất ở thời điểm 1 giờ sau gây viêm là 86,93%. Thậm (C-2′); 77,1 (C-3′); 69,6 (C-4′); 76,7 (C-5′); 60,6 (C-6′). chí, tỷ lệ ức chế phù chân chuột của tectorigienin liều 60 mg/kg cân nặng hầu như cao Hợp chất EB-4 (4) hơn tỷ lệ ức chế phù chân chuột của indomethacin ở các thời điểm 1 giờ, 4 giờ và 5 giờ Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp. 175-176oC, C16H16O5, ESI-MS m/z 289 sau khi gây viêm. [M+H]+. 1 * Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của tectorigienin H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,49 (1H, q, J=7,0 Hz, H-1); 4,69 (1H, q, Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của tectorigienin trên mô hình gây u J=7,0 Hz, H-3); 8,04 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,38 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 7,01 (1H, t, hạt thực nghiệm bằng amian được thể hiện trong bảng 4.20. J=8,0 Hz, H-8); 1,64 (3H, d, J=7,0 Hz, 1-Me); 1,53 (3H, d, J=7,0 Hz, 3-Me); 4,07 (3H, s, Bảng 4.20 Tác dụng chống viêm mạn của tectorigienin trên mô hình gây u hạt thực 9-OMe); 12,82 (1H, s, 5-OH). 13 nghiệm bằng viên amian C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 67,4 (C-1); 69,5 (C-3); 202,9 (C-4); 153,4 (C- MTB ướt % ức chế MTB khô % ức chế 5); 118,1 (C-6); 125,4 (C-7); 109,1 (C-8); 155,7 (C-9); 139,4 (C-10); 121,0 (C-11); 107,8 Lô (mg) khi cân ướt (mg) khi cân khô (C-12); 126,0 (C-13); 119,6 (C-14); 17,4 (CH3-1); 16,3 (CH3-3); 56,4 (OCH3-9). Lô chứng trắng uống Hợp chất EB-5 (5) 487,33±65,87 - 100,06±12,92 - NaCMC 1% Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp. 175-1770C, C16H16O4, ESI-MS m/z 273 Lô chứng dương uống 280,05±24,43 55,48±5,20 [M+H]+. 42,53 44,55 prednisolon liều 5mg/kg p2/1
6 19 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,36 (3H, d, J=6,5 Hz, 3-CH3); 1,54 (3H, d, Bảng 4.16 Ảnh hưởng của tectorigienin lên số cơn đau quặn J=6,5 Hz, 1-CH3); 2,20 (1H, dd, J=10,1; 18,1 Hz, 4-Hß); 2,75 (1H, dd, J=2,1; 18,1 Hz, 4- Thời gian Số cơn đau quặn Hα); 3,60 (1H, m, H-3); 3,96 (3H, s, 9-OCH3); 4,85 (1H, q, J=6,5 Hz, H-1); 7,27 (1H, d, Mẫu thử 0–5 phút 5-10 phút 10-15 phút 15–20 phút 20–25 phút 25–30 phút J=7,5 Hz, H-8); 7,64 (1H, dd, J=8,0; 8,5 Hz, H-7), 7,73 (1H, d, J=8,5 Hz, H-6). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 70,2 (C-1); 68,7 (C-3); 29,8 (C-4); 183,9 (C- Lô 1 (Chứng trắng) 5); 117,7 (C-6); 134,5 (C-7); 118,9 (C-8); 159,3 (C-9); 183,7 (C-10); 148,6 (C-11); 139,9 dung dịch NaCl 10 ± 0,61 18 ± 0,47 18,1±0,39 13,77±0,35 14± 0,28 11,3± 0.32 (C-12); 133,9 (C-13); 120,2 (C-14); 20,7 (1-CH3); 21,2 (3-CH3); 56,4 (9-OCH3). 0,9%) Hợp chất EB-6 (6) Lô 2 (Chứng +) 5,25± 0,54 11 ± 0,43 9,75±0,45 7,5 ± 0,22 7,25 ± 0,26 6,87 ± 0,24 Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp 174-175oC, C16H16O4, ESI-MS m/z 273 aspirin liều p2/1> 0,05 p2/1< 0,05 p2/1< 0,05 p2/1< 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1< 0,05 [M+H]+. 240 mg/kgP 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,35 (3H, d, J=6,0 Hz, 3-CH3); 1,53 (3H, d, Lô 3 8,2 ± 0,27 15,4 ± 0,29 11,7±0,33 10,3 ± 0,28 7,9 ± 0,36 6,3 ± 0,26 J=7,0 Hz, 1-CH3); 2,24 (1H, dd, J=10,1; 16,0 Hz, 4-Hß); 2,71 (1H, dd, J=3,5 Hz, 18,5 tectorigienin liều p3/1 > 0,05 p3/1 > 0,05 p3/1< 0,05 p3/1 < 0,05 p3/1 < 0,05 p3/1 < 0,05 Hz, 4-Hα); 3,98 (1H, m, H-3); 4,01 (3H, s, 9-OCH3); 5,02 (1H, q, J=6,5 Hz, H-1); 7,28 50 mg/kgP p3/4 > 0,05 p3/4 < 0,05 p3/4 0,05 p3/4 > 0,05 p3/4 > 0,05 (1H, d, J=7,5 Hz, H-8); 7,65 (1H, t, J=7,5 Hz, H-7); 7,74 (1H, d, J=7,5 Hz, H-6). Lô 4 5,57 ± 0,49 11,1 ± 0,33 7,14±0,54 8,4 ± 0,33 7,14 ± 0,40 6,0 ± 0,28 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 67,4 (C-1); 62,4 (C-3); 29,5 (C-4); 182,7 (C- tectorigienin liều p4/1>0,05 p4/10,05 p4/2>0,05 p4/2 > 0,05 (C-12); 134,0 (C-13); 119,6 (C-14); 19,7 (1-CH3); 21,5 (2-CH3); 56,4 (9-OCH3). Hợp chất EB-7 (7) Lô 5 7,77 ± 0,32 13,0 ± 0,27 12,1±0,20 10,2±0,25 7,5 ± 0,35 5,5 ± 0,17 Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O14, ESI-MS m/z 599 [M+H]+. tectorigienin liều p5/1 >0,05 p5/1 < 0,05 p5/1 < 0,05 p5/1 < 0,05 p5/1 < 0,05 p5/1 < 0,05 1 200 mg/kgP p5/4 >0,05 p5/4 > 0,05 p5/4 < 0,05 p5/4 > 0,05 p5/4 > 0,05 p5/4 > 0,05 H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 5,02 (1H, q, J=6,2 Hz, H-1); 3,42 (1H, H-3); 2,68 (1H, dd, J=11,7; 16,5 Hz, Hb-4); 3,00 (1H, Ha-4); 8,07 (1H, d, J=8,9 Hz, H-6); 7,28 Ghi chú: px/y: mức độ tin cậy của lô x so với lô y (1H, dd, J=7,6; 8,9 Hz, H-7); 6,86 (1H, d, J=7,6 Hz, H-8); 1,49 (1H, d, J=6,2 Hz, 1-Me); Tectorigenin thể hiện tác dụng giảm số cơn đau quặn rõ rệt ở cả 3 liều đã thử. Với liều 1,23 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 3,99 (1H, s, 9-OMe); 9,60 (1H, s, 10-OH); 4,51 (1H, d, 50 mg/kg cân nặng, tectorigenin bắt đầu thể hiện tác dụng từ giai đoạn thứ 3 của quá J=8,3 Hz, H-1′); 3,37 (1H, H-2′); 3,15 (1H, H-3′); 3,24 (1H, H-4′); 3,21 (1H, H-5′); 3,55 trình nghiên cứu (10-15 phút sau khi gây đau bằng acid acetic). Khi dùng liều 100 mg/kg (1H, dd, J=5,5; 11,0 Hz, Hb-6′); 3,91 (1H, dd, J=1,4; 11,0 Hz, Ha-6′); 4,12 (1H, d, J=8,3 và liều 200 mg/kg cân nặng, tectorigenin có tác dụng giảm đau sau 5 phút sau khi tiêm Hz, H-1ʺ); 2,92 (1H, H-2ʺ); 3,10 (1H, H-3ʺ); 3,03 (2H, H-4ʺ, H-5ʺ); 3,39 (1H, Hb-6ʺ); acid acetic và tác dụng này vẫn còn thể hiện rõ tại thời điểm 30 phút sau khi gây đau. 3,61 (1H, br d, J=11,6 Hz, Ha-6ʺ). Bảng 4.17 Ảnh hưởng của tectorigienin đến tỷ lệ giảm đau của các lô uống thuốc so với 13 C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 70,0 (C-1); 69,0 (C-3); 33,1 (C-4); 140,5 (C- lô không uống thuốc qua các giai đoạn 5); 115,5 (C-6); 125,7 (C-7); 104,2 (C-8); 155,9 (C-9); 146,3 (C-10); 120,5 (C-11); 129,6 Liều Tỷ lệ giảm đau (%) ở các giai đoạn (C-12); 128,3 (C-13); 113,1 (C-14); 21,8 (1-Me); 21,7 (3-Me); 56,4 (9-OMe); 105,3 (C- dùng 0-5 5-10 10-15 15-20 20-25 25-30 Lô 1′); 74,1 (C-2′); 75,1 (C-3′); 69,9 (C-4′); 76,6 (C-5′); 68,6 (C-6′); 103,1 (C-1ʺ); 73,7 (C- (mg/kg) phút phút phút phút phút phút 2ʺ); 76,7 (C-3ʺ); 70,0 (C-4ʺ); 76,9 (C-5ʺ); 61,1 (C-6ʺ). Lô chứng dương Hợp chất EB-8 (8) 240 47,50 40,00 46,17 45,56 48,21 39,34 uống aspirin Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O14, ESI-MS m/z 599 [M+H]+. 50 18,00 16,00 35,40 25,24 43,57 44,41 1 H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 5,21 (1H, q, J=6,8 Hz, H-1); 4,11 (1H, m, H- Lô thử uống 100 44,29 39,22 60,56 38,82 48,98 47,06 3); 2,46 (1H, dd, J=11,0; 17,2 Hz, Hb-4); 3,50 (1H, Ha-4); 7,90 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); tectorigienin 7,31 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 6,85 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 1,56 (1H, d, J=6,8 Hz, 1-Me); 200 22,22 29,09 33,13 25,81 46,03 47,06 1,32 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 4,03 (1H, s, 9-OMe); 4,79 (1H, H-1′); 3,51 (1H, H-2′); Tectorigenin có tác dụng giảm đau với tỷ lệ % ức chế số cơn đau khá cao, cao nhất là 3.16 (1H, H-3′); 3,57 (1H, H-4′); 3,52 (1H, H-5′); 3,94 (1H, dd, J=4,8; 11,7 Hz, Hb-6′); tectorigenin liều 100mg/kg cân nặng ở giai đoạn thứ 3 (10-15 phút), tỷ lệ giảm đau lên 3,95 (1H, Ha-6′); 3,95 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 3,30 (1H, H-2ʺ); 3,22 (1H, H-3ʺ); 3,30 đến 60,56%. Với liều 100mg/kg cân nặng, tectorigenin có khả năng giảm số cơn đau tốt (1H, H-4ʺ); 3,30 (1H, m, H-5ʺ); 3,55 (1H, dd, J=6,2; 12,4 Hz, H-6aʺ); 3,53 (1H, dd, hơn so với liều 50 mg/kg cân nặng và liều 200 mg/kg cân nặng. Ở tất cả các giai đoạn và J=2,8; 12,4 Hz, H-6bʺ) . với liều này, tectorigenin có tác dụng ức chế tương đương với aspirin liều 240mg/kg cân 13 nặng. C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 69,8 (C-1); 64,4 (C-3); 62,4 (C-4); 141,8 (C- 5); 117,0 (C-6); 126,7 (C-7); 105,2 (C-8); 157,2 (C-9); 147,0 (C-10); 121,0 (C-11); 127,3 * Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của tectorigienin
18 7 (C-12); 130,3 (C-13); 114,4 (C-14); 19,5 (1-Me); 22,2 (3-Me); 56,9 (9-OMe); 105,2 (C- 1′); 75,5 (C-2′); 74,7 (C-3′); 71,2 (C-4′); 77,3 (C-5′); 70,8 (C-6′); 103,8 (C-1ʺ); 74,7 (C- 2ʺ); 77,3 (C-3ʺ); 71,2 (C-4ʺ); 77,3 (C-5ʺ); 62,4 (C-6ʺ). Hợp chất EB-9 (9) Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O15, ESI-MS m/z 615 [M+H]+. 1 H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 5,1 (1H, q, J=6,8 Hz, H-1); 4,2 (1H, m, H-3); Kaempferol-3-O-β-D- Isoquercetin (BS-12) 4,10 (1H, dd, J=11,0; 17,2 Hz, H-4); 8,24 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,37 (1H, t, J=8,0 Hz, Tectorigenin 4’-O-β-D- glucopyranoside (BS-11) Lần đầu tiên phân lập H-7); 6,98 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 1,63 (1H, d, J=6,8 Hz, 1-Me); 1,06 (1H, d, J=6,2 Hz, glucopyranoside (BS-10) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can 3-Me); 4,07 (1H, s, 9-OMe); 4,07 (1H, H-1′); 3,22 (1H, H-2′); 3,30 (1H, H-3′); 3,25 (1H, được từ cây xạ can H-4′); 3,29 (1H, H-5′); 3,30 (1H, dd, J=4,8; 11,7 Hz, Hb-6′); 3,41 (1H, Ha-6′); 3,62 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 3,11 (1H, H-2ʺ); 3,16 (1H, H-3ʺ); 3,22 (1H, H-4ʺ); 3,29 (1H, m, H- 5ʺ); 3,30 (1H, dd, J=6,2, 12,4 Hz, H-6aʺ); 3,33 (1H, dd, J=2,8; 12,4 Hz, H-6bʺ) . 13 C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 69,9 (C-1); 67,0 (C-3); 62,6 (C-4); 144,0 (C- 5); 117,7 (C-6); 127,0 (C-7); 106,2 (C-8); 157,6 (C-9); 148,0 (C-10); 120,8 (C-11); 128,0 (C-12); 130,4 (C-13); 116,2 (C-14); 17,8 (1-Me); 21,0 (3-Me); 56,9 (9-OMe); 106,2 (C- Axit myristic (BS-14) 1′); 77,3 (C-2′); 75,0 (C-3′); 71,2 (C-4′); 77,8 (C-5′); 71,8 (C-6′); 104,2 (C-1ʺ); 75,4 (C- 24E-stigmasta-5,22- Lần đầu tiên phân lập 2ʺ); 77,6 (C-3ʺ); 71,6 (C-4ʺ); 77,7 (C-5ʺ); 62,6 (C-6ʺ). dien-3β-ol (BS-13) được từ cây xạ can Hợp chất EB-10 (10) 4.2.2 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm Bột vô định hình màu trắng, C13H14O4, ESI-MS m/z 233 [M-H]¯ . 1 Hợp chất tectorigenin đã được phân lập từ thân rễ xạ can với hàm lượng tương đối lớn H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 2,52 (1H, dd, J=8,2; 16,5 Hz; Haq-2); 2,82 và là thành phần chính trong cây xạ can. Nhằm định hướng tạo cơ sở để phát triển, khai (1H, dd, J=3,4; 16,5 Hz, Heq-2); 4,22 (1H, m, H-3); 2,89 (1H, dd, J=7,5; 15,8 Hz, Haq- thác và sử dụng hợp chất này có hiệu quả, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sâu hơn về 4); 3,14 (1H, dd, J=3,4; 15,8 Hz, Heq-4); 6,60 (1H, s, H-5); 2,40 (3H, s, 8-CH3); 2,42 tác dụng dược lý (hoạt tính kháng viêm, giảm đau) và độ an toàn của tectorigenin trên (3H, s, 7-CH3). 13 động vật thực nghiệm. C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 199,3 (C-1); 50,0 (C-2); 66,8 (C-3); 40,4 (C- 4.2.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm các cặn chiết thân rễ xạ can 4); 114,7 (C-5); 158,8 (C-6); 132,2 (C-7); 140,4 (C-8); 124,9 (C-8a); 147,1 (C-4a); 19,2 Với hoạt tính kháng viêm theo đường bôi, cả 4 cặn chiết: methanol, hexan, etyl axetat (8-CH3); 208,4 (C=O); 32,6 (7-CH3). và cặn nước của mẫu nghiên cứu đều không có khả năng ức chế khối viêm cục bộ theo Hợp chất EB-11 (11) đường bôi so với đối chứng Dexamethasone. Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C20H22O9, ESI-MS m/z 407 [M+H]+. 1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm theo đường uống cho thấy có 2 mẫu H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 6,05 (1H, q, J=6,6 Hz, H-1); 8,16 (1H, s, H- ức chế được trên 50,0 % thể tích khối viêm so với đối chứng âm (không sử dụng hoạt 4); 7,60 (1H, d, J=8,3 Hz, H-5); 7,47 (1H, t, J=8,3 Hz, H-6); 7,11 (1H, d, J=8,3 Hz, H-7); chất), đó là cặn chiết etyl axetat (BS-Et) và cặn chiết nước (BS-W) với % ức chế khối 1,70 (1H, d, J=6,6, 1-Me); 3,99 (1H, s, 8-Ome); 4,99 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,60 (2H, viêm tương ứng là 70,0% và 64,26%. Chất đối chứng dương Indomethacine có hoạt tính H-2′, Ha-6′); 3,10 (1H, m, H-3′); 3,39 (1H, t, J=9,3 Hz, H-4′); 3,47 (1H, t, J=9,3 Hz, H- ổn định và ức chế được 64,59% khối viêm. 5′); 3,68 (1H, dd, J=2,1; 11,7 Hz, Hb-6′). 13 4.2.2.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học và độ an toàn của tectorigenin phân lập C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 80,9 (C-1); 172,3 (C-3); 124,0 (C-4); 123,7 được từ thân rễ xạ can (C-5); 128,4 (C-6); 109,8 (C-7); 157,4 (C-8); 147,9 (C-9); 140,7 (C-10); 125,9 (C-11); a. Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm, giảm đau của tectorigenin 139,3 (C-12); 124,0 (C-13); 19,4 (1-Me); 56,1 (8-OMe); 106,2 (C-1′); 76,0 (C-2′); 77,8 * Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của tectorigienin (C-3′); 71,6 (C-4′); 78,3 (C-5′); 62,4 (C-6′). Tác dụng giảm đau của tectorigenin được tiến hành trên chuột nhắt theo phương Hợp chất EB-12 (12) pháp gây đau bằng acid acetic. Kết quả được trình bày tại bảng 4.16 và 4.17. Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C26H32O14, ESI-MS m/z 569 [M+H]+. 1 H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 6,12 (1H, q, J=6,9, H-1); 8,15 (1H, s, H-4); 7,60 (1H, d, J=7,6 Hz, H-5); 7,46 (1H, t, J=7,6 Hz, H-6); 7,10 (1H, d, J=7,6 Hz, H-7); 1,68 (1H, d, J=6,9 Hz, 1-Me); 3,98 (1H, s, 8-OMe); 4,98 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,60 (1H, dd, J=7,6; 8,9 Hz, H-2′); 3,47 (1H, t, J=8,9 Hz, H-3′); 3,56 (1H, H-4′); 2,32 (1H, H- 5′); 3,67 (1H, dd, J=4,9; 11,0 Hz, Hb-6′); 4,00 (1H, dd, J=2,0; 11,0 Hz, Ha-6′); 4,16 (1H,
8 17 d, J=8,3 Hz, H-1ʺ); 3,12 (1H, dd, J=7,6; 8,3 Hz, H-2ʺ); 3,25 (1H, H-3ʺ); 3,21 (1H, t, penta-substituted và một nhóm methoxyl tại δ 3,87 (3H, s, OCH3-6). Tín hiệu doublet J=8,2 Hz, H-4ʺ); 3,17 (1H, H-5ʺ); 3,55 (1H, dd, J=4,1; 11,7 Hz, Hb-6ʺ); 3,81 (1H, dd, doublet tại δ 6,84 (2H, dd, J = 8,5; 1,5 Hz, H-3′, 5′) và 7,35 (2H, dd, J = 8,5; 1,5 Hz, H- J=2,1; 11,7 Hz, Ha-6ʺ). 2′, 6′) dự đoán nhóm thế của vòng thơm là para-substitued, 13 C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 81,1 (C-1); 172,3 (C-3); 124,2 (C-4); 109,8 Phổ 13C-NMR của BS-2 chỉ ra tín hiệu của 16 nguyên tử cacbon, gồm một nhóm (C-5); 128,4 (C-6); 123,7 (C-7); 157,5 (C-8); 147,8 (C-9); 140,8 (C-10); 126,0 (C-11); methoxyl và 15 cac bon của khung isoflavone, các tín hiệu này đã được xác nhận thêm 139,3 (C-12); 124,1 (C-13); 19,2 (1-Me); 56,1 (8-OMe); 106,0 (C-1′); 76,2 (C-2′); 77,4 qua phổ DEPT 90, DEPT 135 và HSQC. Thêm vào đó, trên phổ ESI MS pic ion phân tử (C-3′); 71,1 (C-4′); 78,0 (C-5′); 69,0 (C-6′); 104,3 (C-1ʺ); 75,1 (C-2ʺ); 76,6 (C-3ʺ); 71,7 [M-H]+ của BS-2 xuất hiện tại m/z 299 hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử (C-4ʺ); 78,0 (C-5ʺ); 62,9 (C-6ʺ). C16H12O6. Hợp chất EB-13 (13) Khi so sánh với tài liệu tham khảo, tất cả dữ liệu phổ của chất BS-2 đồng nhất với các Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C26H34O14, ESI-MS m/z 571 [M+H]+. dữ liệu phổ của 4′,5,7-trihydroxy-6-methoxyisoflavone hay tectorigenin vì vậy chất BS-2 1 H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 5,33 (1H, q, J=6,2 Hz, H-1); 5,03 (1H, d, được xác định là tectorigenin. J=13,1 Hz, Hb-3); 5,40 (1H, q, J=13,1 Hz, Ha-3); 8,03 (1H, d, J=8,2 Hz, H-5); 7,31 (1H, t, J=8,2 Hz, H-6); 6,91 (1H, d, J=8,2 Hz, H-7); 1,45 (1H, d, J=6,2 Hz, 1-Me); 3,99 (1H, s, 8-OMe); 4,53 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1′); 3,30 (2H, H-2′, H-5′); 3,08 (1H, m, H-3′); 3,20 (1H, H-4′); 3,56 (1H, dd, J=6,2, 11,0 Hz, Hb-6′); 3,95 (1H, d, J=11,0 Hz, Ha-6′); 4,11 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 2,94 (1H, m, H-2ʺ); 3,01 (2H, H-3ʺ, H-4ʺ); 3,20 (1H, H-5ʺ); 3,38 (1H, dd, J=4,8; 11,0 Hz, Hb-6ʺ); 3,62 (1H, dd, J=5,5; 11,0 Hz, Ha-6ʺ). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 78,3 (C-1); 70.6 (C-3); 137,6 (C-4); 115,7 Hình 4.18d Cấu trúc của hợp chất BS-2 (Tectorigenin) (C-5); 125,8 (C-6); 104,6 (C-7); 156,2 (C-8); 143,8 (C-9); 124,8 (C-10); 130,9 (C-11); Bảng 4.13 Bảng tổng hợp các hợp chất BS-1→BS-14 phân lập được từ thân rễ cây 130,4 (C-12); 114,9 (C-13); 20,1 (1-Me); 56,2 (8-OMe); 104,6 (C-1′); 73,8 (C-2′); 76,6 xạ can (C-3′); 69,9 (C-4′); 75,2 (C-5′); 68,7 (C-6′); 103,2 (C-1ʺ); 73,5 (C-2ʺ); 76,8 (C-3ʺ); 69,9 (C-4ʺ); 76,3 (C-5ʺ); 61,0 (C-6ʺ). Hợp chất EB-14 (14) Chất bột màu trắng, mp.>310oC, C15H10O5, ESI-MS m/z 271 [M+H]+. 1 H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 2,61 (3H, s, 8-CH3 ); 6,40 (1H, d, J=2,7 Hz, H-2); 6,94 (1H, d, J=2,7 Hz, H-4); 6,80 (1H, d, J=2,7 Hz, H-7); 7,31 (1H, d, J=2,7 Hz, Irisflorentin (BS-1) Tectorigenin (BS-2) Iristectorigenin A (BS-3) H-5); 13 C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 166,2 (C-1); 109,3 (C-2); 165,3 (C-3); 108,2 (C-4); 113,3 (C-5); 163,0 (C-6); 125,6 (C-7); 146,6 (C-8); 189,5 (C-9); 184,1 (C-10); 111,6 (C-9a); 135,8 (C-4a); 138,3 (C-10a); 124,3 (C-8a); 24,2 (8-CH3). Irigenin (BS-4) Acetovanillone (BS-5) Lần đầu tiên phân lập Rhamnocitrin (BS6-) được từ cây xạ can Irilin D (BS-7) Daucosterol (BS-8) Tectoridin (BS-9)
16 9 Kết quả cho thấy hợp chất mới EB-1 và 3 hợp chất đã biết khác là EB-4, EB-5, và Quy trình phân lập các hợp chất từ thân rễ xạ can EB-6 thể hiện hoạt tính ức chế sự sản sinh IL-12p40 ở nồng độ 25 µM. Do vậy các hợp Cặn BS-EtOAc chất này được tiếp tục lựa chọn để làm các thử nghiệm tiếp theo ở nồng độ 6,3 đến 50,0 SKC, SiO2, gradient µM. SB203580 được sử dụng làm đối chứng dương, chất này ức chế sự sản sinh của IL- CHCl3:MeOH (99:1 -50:50) 12 p40, IL-6 và TNF-α với giá trị IC50 tương ứng là 5,2±0,1, 3,5±0,1 và 7,5±0,2 µM (Bảng 4.12). F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 Bảng 4.12 Hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành trên tế SKC, SiO2 bào tua sinh ra từ tủy xương được kích thích bởi LPS SKC, SiO2, SKC, SiO2 CHCl3:MeOH (20:1) HX:EtOAC 10:1 CHCl3:MeOH BS-2 IC50 (480 mg) BS-14 IL-12 p40 (µg/mL) IL-6 (µg/mL) TNF-α (µg/mL) (15 mg) F5.1 F5.2 F5.3 Cặn chiết methanol 0,1 ± 0,05 16,2 ± 0,3 >50 BS-13 F3.2 F3.3 SKC MeOH:CHCl3 (15:1) SB203580a) 2,5 ± 0,1 1,7 ± 0,2 3,6 ± 0,2 (5 mg) F3.1 Hợp chất IL-12 p40 (µM) IL-6 (µM) TNF-α (µ M) SKC, SiO2 CHCl3:MeOH (15:1) Kết tinh lại MeOH F5.2.1 BS-4 (8 mg) EB-1 1,0 ± 0,1 5,0 ± 0,2 >50 SKLMĐC RP18 BS-1 BS-5 EB-4 5,0 ± 0,4 8,7 ± 0,3 61,2 ± 1,5 (8 mg) (9 mg) MeOH:H2O (7:3) EB-5 0,1 ± 0,08 1,7 ± 0,1 39,6 ± 2,0 BS-3 (20 mg) EB-6 0,2 ± 0,1 2,6 ± 0,4 >50 SB203580a) 5,2 ± 0,1 3,5 ± 0,2 7,5 ± 0,2 F7 F6 a) đối chứng dương SKC, RP18 1.SKC, RP18, MeOH:H2O (1:1) Kết quả cho thấy các hợp chất EB-1, EB-4, EB-5, EB-6 và cặn chiết EB-Me ức chế MeOH:H2O (4:6) 2.SKLMĐC, RP18, MeOH:H2O (6:4) sự sản sinh IL-12 p40 được kích thích bởi LPS với giá trị IC50 từ 0,1±0,08 µM đến 5,0±0,4 µM. Các hợp chất EB-1, EB-5 và EB-6 cũng ức chế sự sản sinh IL-6 với giá trị BS-6 (10 mg) BS-9 (42 mg) F7.1 F7.2 F7.3 IC50 từ 1,7±0,1 µM đến 5,0±0,2 µM. Tuy nhiên, chỉ có hai hợp chất EB-4 và EB-5 có BS-7 (5 mg) BS-8 (12 mg) hoạt tính ức chế ở mức độ trung bình sự sản sinh TNF-α với giá trị IC50 tương ứng là 61,2±1,5 µM và 39,6± 2,0 µM. Các hợp chất (–)-hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5) và Hình 3.4 Sơ đồ phần lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat cây xạ can isoeleutherin (EB-6) được phân lập từ cây Eleutherine americana cũng ức chế sự sản sinh nitric oxide ở dòng tế bào đại thực bào ở chuột RAW 264,7 được hoạt hóa bởi LPS. Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của cây E. bulbosa được Cặn BS/W (4,7gam) công bố. Như vậy, hợp chất mới EB-1 và 3 hợp chất đã biết EB-4, EB-5 và EB-6 phân SK cột, CH2Cl2 : MeOH (4:1) lập từ củ sâm đại hành đã thể hiện hoạt tính ức chế sự sản sinh của TNF-α, IL-6 và IL-12 p40 trong tế bào DCs được kích thích bởi LPS. Kết quả nghiên cứu này cho thấy các hợp E1 E5 chất trên có thể được sử dụng như là chất kháng viêm tiềm năng trong tương lai. E2 E3 E4 4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI XẠ CAN SK cột CHCl3: MeOH : H2 O (80:18:2) SK cột RP 18 4.2.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ thân rễ cây xạ can Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc 14 hợp chất E4.2 E4.3 phân lập được từ thân rễ xạ can, trong đó có 4 hợp chất BS-5, BS-11, BS-12 và BS-14 BS- 11 (12 mg) BS-12 (11 mg) E4.1 SKLMĐC RP 18 lần đầu được phân lập từ cây xạ can và 2 hợp chất có hàm lượng lớn là tectoridin và MeOH: H2O (5:5) tectorigienin. Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất BS-10 (7 mg) tectorigienin (BS-2): Chất BS-2 phân lập được dạng tinh thể màu vàng nhạt, điểm chảy 235-236°C. Sự có Hình 3.5 Sơ đồ phần lập các hợp chất từ cặn nước cây xạ can mặt của khung isoflavon trong phân tử chất BS-2 được dự đoán qua phổ hấp thụ tử ngoại Hằng số vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất phân lập được từ cây xạ can UV tại λmax 259, 320nm. Phổ 1H-NMR của BS-2 chỉ ra sự có mặt một singlet tại δ 7,99 Hợp chất BS-1 (15) (1H, s) là của proton H-2, các tín hiệu singlet khác tại δ 6,41 (1H, s) dự đoán vòng A là Bột màu vàng nhạt, mp. 168-169oC, C20H18O8, ESI-MS m/z 385 [M-H]¯ .
10 15 1 H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 7,77 (1H, s, H-2); 6,56 (1H, s, H-8); 6,67 methylchroman-4-one có độ quay cực là [α ]D = +53,2. Điều này xác nhận hợp chất EB- (2H, s, H-2′, H-6′); 5,99 (2H, s, -O-CH2-O-); 4,00 (3H, s, OCH3-5); 3,81 (6H, s, OCH3-3′, 1a có cấu hình ở C-2 là S. Do vậy, hợp chất EB-1 được xác định là (2S) 5′), và 3,77 (3H, s, OCH3-4′). dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được 13 C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 56,0 (OCH3-3′, 5′); 60,6 (OCH3-4′); 60,9 phân lập từ thiên nhiên. (OCH3-5); 92,9 (C-8); 102,1 (-O-CH2-O-); 106,6 (C-2′, 6′); 113,4 (C-10); 125,4 (C-3); 127,3 (C-1′); 135,2 (C-6); 137,9 (C-4′); 141,5 (C-5); 150,8 (C-2); 152,8 (C-3′, 5′); 152,9 (C-7); 154,5 (C-9); và 175,3 (C-4). Hợp chất BS-2 (16) Tinh thể màu vàng, mp. 235-236oC, C16H12O6, ESI-MS m/z 299 [M-H]¯ 1 H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,87 (3H, s, OCH3-6); 6,41 (1H, s, H-8); 6,84 (2H, dd, J=8,5; 1,5Hz, H-3′, 5′); 7,35 (2H, dd, J=8,5; 1,5Hz, H-2′, 6′); và 7,99 (1H, s, H- 2). Hình 4.1d, h Cấu trúc của hợp chất EB-1a và EB-1 13 C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); 106,6 (C-10); 4.1.2 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm 116,2 (C-2′,6′); 123,1 (C-3); 124,1 (C-1′); 131,3 (C-3′, 5′); 132,7 (C-6); 154,4 (C-5); 4.1.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của các cặn chiết của củ sâm đại 154,7 (C-7); 154,8 (C-2); 158,5 (C-9); 158,6 (C-4′); và 182,4 (C-4). hành Hợp chất BS-3 (17) Với hoạt tính kháng viêm theo đường bôi, cả 4 cặn chiết methanol, n-hexan, ethyl Tinh thể màu vàng nhạt, mp. 237-238°C, C17H14O7, ESI-MS m/z 329 [M-H]¯ . axetat và cặn chiết nước của củ sâm đại hành đều không có khả năng ức chế khối viêm 1 H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3-6); 3,90 (3H, s, OCH3-3′); cục bộ theo đường bôi so với đối chứng Dexamethasone. 6,46 (1H, s, H-8); 6,88 (1H, d, J=8,0 Hz, H-2′); 6,96 (1H, dd, J=8,0; 2,0 Hz, H-6′); 7,14 Kết quả nghiên cứu theo đường uống cho thấy chỉ có cặn chiết etyl axetat (EB-Et) ức (1H, J=2,0Hz, H-5′); và 8,06 (1H, s, H-2). chế được trên 50,0 % thể tích khối viêm so với đối chứng âm (không sử dụng hoạt chất) 13 C-NMR (CD3 OD và CDCl3) δ (ppm): 56,4 (OCH3-3′); 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); với % ức chế khối viêm là 52,12%. Chất đối chứng dương Indomethacine có hoạt tính ổn 106,6 (C-10); 113,8 (C-5′); 116,1 (C-2′); 122,7 (C-6′); 123,5 (C-3); 124,2 (C-1′); 132,7 định và ức chế được 64,59% khối viêm. (C-6); 147,7 (C-4′); 148,6 (C-3′); 154,4 (C-5); 154,7 (C-7); 154,8 (C-2); 158,6 (C-9); và 4.1.2.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào 182,4 (C-4). tua DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của các hợp chất phân lập được Hợp chất BS-4 (18) từ củ sâm đại hành Bột màu vàng, mp. 184-185°C, C18H16O8, ESI-MS m/z 359 [M-H]¯ . Đầu tiên, chúng tôi đã sử dụng phương pháp nhuộm màu MTT để đánh giá ảnh hưởng 1 H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ: (ppm) 3,88 (3H, s, OCH3-4′); 3,89 (3H, s, OCH3-5′); đến khả năng sống sót của tế bào của 14 hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành. Sau 3,94 (3H, s, OCH3-6); 6,48 (1H, s, H-8); 6,68 (2H, dd, J=6,0; 2,0 Hz, H-2′, 6′); và 7,90 đó đã tiến hành thử hoạt tính ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC sinh (1H, s, H-2). ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại 13 C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 55,7 (OCH3-6); 60,3 (OCH3-4′); 60,4 hành. (OCH3-5′); 93,9 (C-8); 104,9 (C-10); 105,7 (C-2′); 109,4 (C-6′); 122,9 (C-3); 126,4 (C- 1′); 131,2 (C-6); 136,2 (C-4′); 149,8 (C-3′); 152,7 (C-5′); 152,8 (C-5); 153,2 (C-9); 153,3 (C-2); 156,7 (C-7); và 180,7 (C-4). Hợp chất BS-5 (19) Bột màu trắng, mp. 113oC, C9H10O3, ESI-MS m/z 167 [M+H]+. 1 H-NMR (CDCl3) δ (ppm): 2,56 (3H, s, CH3-8); 3,96 (3H, d, J=7,5Hz, OCH3-9); 6,06 (1H, s, OH); 6,94 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,54 (1H, dd, J=1,8; 8,0 Hz, H-7); và 7,53 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-3). 13 C-NMR (CDCl3) δ (ppm): 196,7 (C=O); 130,3 (C-2); 124,1 (C-3); 146,6 (C-4); 150,4 (C-5); 113,8 (C-6); 109,8 (C-7); 26,17 (CH3-8) và 56,12 (CH3-9). Hợp chất BS-6 (20) Tinh thể màu vàng, mp.221-223°C, C16H12O6, ESI-MS m/z 299 [M-H]+. 1 H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3); 6,54 (1H, s, H-8); 6,56 Hình 4.15 Tác dụng của hợp chất EB-1-EB-14 ở nồng độ 25,0 µm đến sự sản sinh IL- (1H, s, H-6); 6,93 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3′, 5′) và 7,82 (2H, d, J=9,0 Hz, H-2′, 6′). 12p40 từ tế bào tua DC được kích thích bởi LPS
14 11 13 Dưới đây trình bày phương pháp xác định cấu trúc hợp chất mới Dihydroeleutherinol- C-NMR (CD3OD) δ (ppm): 60,9 (OCH3-7); 92,1 (C-8); 104,3 (C-10); 115,6 (C- 8-O-β-D-glucopyranoside (EB1) được phân lập từ củ sâm đại hành: 3′,5′); 135,6 (C-3); 121,8 (C-1′); 129,5 (C-2’, 6’); 97,6 (C-6); 160,3 (C-5); 164,8 (C-7); 25 Hợp chất EB-1 thu được dưới dạng chất bột màu vàng nhạt; [α ] D –58,1 (MeOH, c = 147,4 (C-2); 156,3 (C-9); 159,5 (C-4′); và 176,8 (C-4). 0,3); phổ tử ngoại UV (MeOH) có các cực đại hấp thụ tại λmax (log ε) 223 (4,2), 261 (4,0) Hợp chất BS-7 (21) nm. Phổ hồng ngoại IR cho các đỉnh hấp thụ tại 3495 cm-1 đặc trưng cho tín hiệu của Dạng bột vô định hình màu vàng, C16H12O7, ESI-MS m/z 315 [M-H]+. nhóm –OH, 1640 cm-1 đặc trưng cho tín hiệu của nhóm C=O và 1610 cm-1 đặc trưng cho 1 H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3-6); 6,46 (1H, s, H-8); tín hiệu của C-O-C. 6,85 (2H, d, J = 2,0Hz, H-2′, 6′), 7,02 (1H, d, J =1,5 Hz, H-5′), và 8,01 (1H, s, H-2). Phổ ESI-MS cho pic ion cơ bản negative ở m/z 419 [M–H]–. Phổ phân giải cao HR- 13 C-NMR (CD3 OD và CDCl3 ) δ (ppm): 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); 106,6 (C-10); ESI-MS với pic ion cluster tại m/z 419,1338 [M–H]– (C21H23O9, 419,1342) phù hợp với 116,2 (C-2′); 117,3 (C-5′); 121,6 (C-1′); 123,5 (C-3); 124,2 (C-6′); 132,6 (C-6); 146,0 (C- công thức phân tử là C21H24O9. 3′); 146,5 (C-4′); 154,4 (C-5); 154,6 (C-7); 154,8 (C-2); 158,5 (C-9) và 182,4 (C-4). Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của hợp chất EB-1 cho thấy các tín hiệu sau: 1 nhóm Hợp chất BS-8 (22) methyl bậc ba ở δH 2,45 ppm, 1 nhóm methyl bậc hai ở δH 1,46 ppm (d, J=6,1 Hz), 3 Dạng bột màu trắng, mp. 285-286oC, C35H60O6, ESI-MS m/z 575 [M-H]¯ . 1 proton thơm singlet ở δH 6,45 ppm (s, H-9), δH 6,67 ppm (s, H-7) và δH 6,85 ppm (s, H-6), H-NMR (500MHz, DMSO-d6, TMS) δ (ppm): 0,77 (3H, s, CH3-18); 0,81 (3H, d, và proton anomeric ở δH 4,93 ppm (d, J=7,2 Hz, H-1'). J=7,0 Hz, CH3-27); 0,82 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-26); 0,83 (3H, t, J=7,0 Hz, CH3-29); 0,90 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất EB-1 cho thấy tín hiệu của 21 nguyên tử C, tín (3H, d, J=6,0 Hz, CH3-21); 0,96 (3H, s, CH3-19); 3,46 (1H, m, H-3); 5,33 (1H, d, J=5,0 hiệu cộng hưởng của 12 nguyên tử cacbon thơm hoặc olefin, 1 tín hiệu của nhóm Hz, H-6); 2,90 (1H, m, H-2′-glc); 3,02 (1H, m, H-4′-glc); 3,07 (1H, m, H-5′-glc); 3,12 cacbonyl ở δC 194,3 ppm (C-4), 5 tín hiệu của 5 nguyên tử cacbon ở δC từ 62,5 đến 78,3 (1H, m, H-3′-glc); 3,41 (1H, m, H-6′a-glc); 3,65 (1H, m, H-6′b-glc); 4,22 (1H, d, J=7,0 ppm và 1 tín hiệu của nguyên tử cacbon ở δC 101,7 ppm (C-1') thuộc phần đường Hz, H-1′-glc); 4,39 (1H, t, J=6,0 Hz, OH-6′-glc); 4,82 (1H, d, J=2,0 Hz, OH-4′-glc); 4,83 monosaccharide; 2 tín hiệu của hai nhóm methyl ở δC 20,7 ppm (2-Me) và 23,3 ppm (5- (1H, d, J=2,0 Hz, OH-2′-glc) và 4,85 (1H, d, J=5Hz, OH-3′-glc). Me). Phân tích các dữ liệu phổ trên cho thấy phần aglycone của EB-1 được xác định là 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6, TMS) δ (ppm): 11,7 (CH3-18); 19,0 (CH3 -27); dihydroeleutherinol (EB-1a) (hình 4.1d). 19,7 (CH3-26); 11,73 (CH3-29); 18,6 (CH3 -21); 18,90 (CH3-19); 20,6 (C-11); 22,6 (C- Phổ HMBC của EB-1 cho thấy tương tác giữa H-2 (δH 4,87) với C-1a (δC 163,4), C- 28); 23,2 (C-15); 25,4 (C-23); 27,7 (C-16); 28,7 (C-25); 29,2 (C-2); 31,3 (C-7); 31,4 3 (δC 45,9), C-4 (δC 194,3), và 2-Me (δC 20,7); giữa H-3 (δH 2,57 và 2,62) với C-2 (δC (C-8); 33,3 (C-22); 35,4 (C-20); 36,2 (C-10); 36,8 (C-1); 38,3 (C-4); 39,2 (C-12); 41,8 78,0), C-4 (δC 194,3), và 2-Me (δC 20,7) gợi ý nhóm methyl và nhóm carbonyl tương ứng (C-13); 45,1 (C-24); 49,6 (C-9); 55,4 (C-17); 56,1 (C-14); 76,9 (C-3); 121,1 (C-6); ở vị trí C-2 và C-4 của vòng dihydropyrone. Mặt khác, trên phổ HMBC còn xuất hiện 140,4 (C-5); 60,1 (C-6′-glc); 70,1 (C-4′-glc); 73,3 (C-2′-glc); 76,4 (C-3′-glc); 76,7 (C- tương tác giữa 5-Me (δH 2,45 ppm) với C-4a (δC 114,6 ppm), C-5 (δC 137,6 ppm), và C-6 5′-glc); 100,7 (C-1′-glc). (δC 124,2 ppm); giữa H-7 (δH 6,67) với C-6 (δC 124,2), C-8 (δC 161,4), C-9 (δC 103,5), và Hợp chất BS-9 (23) C-10a (δC 109,9); giữa H-9 (δH 6,45) với C-7 (δC 103,6), C-8 (δC 161,4), C-10 (δC 158,7), Dạng bột, màu trắng, mp. 256-257oC, C22H22O11, ESI-MS m/z 463 [M+H]+ 1 và C-10a (δC 109,9). Những dữ kiện này chứng tỏ vị trí nhóm methyl và hai nhóm H-NMR (500 MHz, DMSO) δ (ppm): 8,43 (1H, s, H-2), 7,40 (2H, d, J = 8,5 Hz, hydroxyl tương ứng ở các vị trí C-5, C-8, và C-10. H-2′, H-6′), 6,83 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,88 (1H, s, H-8), 5,08 (1H, d, J = 7,5 Sự có mặt của một phân tử đường trong phân tử hợp chất EB-1 được khẳng định Hz, H-1ʺ), 3,73 (1H, d, J=7,5 Hz, Ha-6ʺ), 3,45 (1H, d, J=10,5 Hz, Hb-6ʺ), 3,36 (1H, m, H- thêm bằng việc thủy phân EB-1 trong môi trường axit thu được 1 đơn vị đường D- 2ʺ), 3,34 (1H, m, H-3ʺ), 3,19 (1H, m, H-4ʺ), 3,44 (1H, m, H-5ʺ), 3,80 (3H, s, OCH3). 13 glucose và aglycone EB-1a. Ngoài ra, vị trí của đường glucose ở C-8 được khẳng định C-NMR (125 MHz, DMSO) δ (ppm): 154,6 (C-2), 121,09 (C-3), 180,7 (C-4), thêm bởi tương tác giữa H-1' glc (δH 4,93) và C-8 (δC 161,4) trên phổ HMBC. 152,8 (C-5), 132,4 (C-6), 156,5 (C-7), 94,0 (C-8), 152,4 (C- 9), 106,44 (C-10), 122,04 Để xác định cấu hình tuyệt đối của C-2 trong phân từ hợp chất EB-1 chúng tôi đã (C-1′), 130,11 (C-2′, 6′), 115,05 (C-3′, 5′), 157,40 (C-4′), 100,17 (C-1ʺ), 73,11 (C-2ʺ), tiến hành ghi phổ CD của EB-1. Phổ CD của hợp chất EB-1 cho thấy hiệu ứng cotton 76,67 (C-3ʺ), 69,64 (C-4ʺ), 77,26 (C-5ʺ), 60,64 (C-6ʺ), 60,24 (OCH3). xung quanh 319 nm, tương tự như hợp chất (2S)-5-hydroxy-6,8-dimethoxy-2-methyl-4H- Hợp chất BS-10 (24) 2,3-dihydronaphtho[2,3-b]-pyran-4-one, điều này gợi ý cấu hình ở C-2 của EB-1 là cấu Dạng bột vô định hình màu vàng, C22H22O11, ESI-MS m/z 485 [M+Na]+ 1 hình S. H-NMR (500 MHz, DMSO) δH (ppm): 3,75 (3H, s, 6-OCH3), 6,87 (1H, s, H-8), Thêm vào đó để khẳng định thêm cấu hình của EB-1, chúng tôi đã xác định cấu hình 6,83 (2H, dd, J = 8,0, 1,5 Hz, H-3′, 5′), 7,38 (2H, dd, J = 8,0, 1,5 Hz, H-2′, 6′), 8,43 (1H, aglycone EB-1a bằng cách so sánh độ quay cực của EB-1a với hợp chất 2- s, H-2), 5,45 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1″), 3,32 (m, H-2″), 3,41 (m, H-3″), 3,34 (m, H-4″), 25 methylchroman-4-one và hợp chất (R)-dihydroeleutherinol ( [α ] D =+8,8). Độ quay cực 3,38 (m, H-5″), 3,44 (m, Ha-6″), and 3,65 (m, Hb-6″). 13 của EB-1a đo được là [α ] 25 D = –38,3, trong khi đó hợp chất (S) 5,7-dihydroxy-2- C-NMR (125 MHz, DMSO) δC (ppm): 154,7 (C-2), 121,0 (C-3), 180,8 (C-4), methylchroman-4-one có độ quay cực là [α ] D = –58,6 và hợp chất (R) 7-methoxy-2- 152,9 (C-5), 132,5 (C-6), 157,5 (C-7), 94,1 (C-8), 152,5 (C-9), 106,5 (C-10), 122,1 (C-
12 13 1′), 130,2 (C-2′), 115,1 (C-3′), 156,6 (C-4′), 115,1 (C-5′), 130,2 (C-6′), 100,2 (C-1″), 73,3 Bảng 4.9 Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập được từ cây sâm đại hành (C-2″), 76,7 (C-3″), 69,7 (C-4″), 77,3 (C-5″), 60,7 (C-6″), 60,3 (OCH3 -6). Me O Me O Hợp chất BS-11 (25) 5 4 6 4a Me O 5 4a 4 6 Dạng bột vô định hình màu vàng, C21H20O11, ESI-MS m/z 471 [M+Na]+ 7 6a 10a 1a O 2 Me 7 6a 10a 1a 2 1 O Me H-NMR (500 MHz, DMSO) δH (ppm): 5,45 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1″), 6,20 (1H, d, J = 10 10 GlcO OH 2,0 Hz, H-6), 6,43 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,88 (2H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-3′, H-5′) và O Me GlcO OH HO 8,03 (2H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-2′, H-6′). HO O HO HO O 13 HO C- NMR (125 MHz, DMSO) δC (ppm): 158,5 (C-2), 135,3 (C-3), 179,5 (C-4), 163,0 OH HO OH HO OH (C-5), 99,9 (C-6), 165,9 (C-7), 94,8 (C-8), 159,0 (C-9), 105,7 (C-10), 122,7 (C-1′), 132,3 Glc Glc (C-2′), 116,1 (C-3′), 161,5 (C-4′), 116,1 (C-5′), 132,3 (C-6′), 104,1 (C-1″), 75,7 (C-2″), Dihydroeleutherinol-8-O-β- Eleutherinoside A (EB3) 78,0 (C-3″), 71,3 (C-4″), 78.0 (C-5″), 62,6 (C-6″). D-glucopyranoside (EB1) Eleutherinol (EB2) Hợp chất BS-12 (26) (Chất mới) Dạng bột màu vàng, mp. 240-242oC, C21H20O12, ESI-MS m/z 487 [M+Na]+ OMe OH OMe O OMe O 1 H -NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 5,23 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1″), 6,15 (1H, d, O O O J = 2,0 Hz, H-6), 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,88 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′), 7,71 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′) và 7,56 (1H, d, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6′). Me Me Me(α) 13 C NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm): 158,4 (C-2), 135,6 (C-3), 179,4 (C-4), 162,9 OH O O H O H (C-5), 100,0 (C-6), 166,4 (C-7), 94,8 (C-8), 158,8 (C-9), 104,3 (C-10), 123,2 (C-1′), (–)-hongconin (EB4) Eleutherin (EB5) Isoeleutherin (EB6) 115,9 (C-2′), 145,8 (C-3′), 149,9 (C-4′), 117,5 (C-5′), 123,0 (C-6′), 104,4 (C-1″), 75,7 (C- OMe OH OMe OH OMe 9 OH 10 1 9 10 1 9 10 1 2″), 78,3 (C-3″), 71,1 (C-4″), 78,0 (C-5″), 62,5 (C-6″). 14 11 O 14 11 O 14 11 O Hợp chất BS-13 (27) 3 3 3 6 6 6 12 4 13 12 4 13 12 4 13 Me(α) 5 Me(β) 5 Me(α) 5 Bột vô định hình màu trắng, C29H48O, ESI-MS m/z 412 [M+Na]+ ODsac H ODsac H ODsac OH 1 HO O HO O HO O H -NMR (500 MHz, CD3OD) δH ppm: 3,51 (1H, tt, 11,0, 5,0, H-3), 5,35 (1H, brs, H- HO HO O O OH HO HO O O OH HO HO O O OH 6), 0,70 (3H, s, H-19), 5,13 (1H, m, H-20), 5,35 (1H, m, H-21), 0,83 (3H, t, 6,0, H-24), OH HO HO OH HO HO OH HO HO 0,79 (3H, d, 7,0, H-26), 0,82 (3H, d, 6.5, H-27), 0,80 (3H, d, 6,0, H-28), 1,03 (3H, s, 6,0, Dsac Dsac Dsac H-29). Eleuthoside C (EB7) Eleutherinoside C (EB8) Eleutherinoside B (EB9) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 11,2 (C-24), 11,7 (C-21), 18,4 (C-26), 18,8 (C- Me Me O OMe OGlc Me OMe ODsac Me 27), 20,4 (C-18), 20,5 (C-19), 20,6 (C-11), 23,7 (C-16), 24,8 (C-15), 28,3 (C-24), 31,0 8 1 O (C-20), 31,2 (C-8), 31,3 (C-7), 35,9 (C-25), 36,7 (C-12), 39,0 (C-1), 39,4 (C-2), 40,0 (C- O 9 O 10), 41,5 (C-13), 41,7 (C-24), 49,5 (C-9), 50,6 (C-4), 55,2 (C-14), 56,2 (C-17), 70,5 (C- 3 O O 6 5 4 HO O 3), 120,6 (C-6), 128,5 (C-22), 137,7 (C-23), 140,4 (C-5). HO OH HO HO O HO HO O O OH Hợp chất BS-14 (28) (R) 7-acetyl-3,6-dihydroxy- HO OH OH HO HO Chất bột màu trắng, mp. 53-54oC, C14H28O2, EI-MS m/z 228 [M]+. 8-methyltetral-1-one Glc Dsac 1 H -NMR (500 MHz, CD3 OD) δH ppm: 0,89 (t, H-1), 1,26 (m, H-2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, (EB10) Eleuthoside A (EB11) Eleuthoside B (EB12) 10, 11), 1,64 (m, H-12), 2,36 (t, H-13). OH O Me 13 OMe OH Me C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 180,62 (C-1), 34,20 (C-2), 24,74 (C-3), 29,72 H (C-4), 29,42 (C-5), 29,49 (C-6, 7, 8, 9, 10), 29,31 (C-11), 31,99 (C-12), 22,74 (C-13), 14,12 (C-14). O HO OH CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN O 4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH ODSac Deoxyerythrolaccin 4.1.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành Eleutherinoside D (EB13) (EB14) Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 14 hợp Lần đầu tiên phân lập chất phân lập được từ củ sâm đại hành, trong đó có hợp chất EB-1 là hợp chất mới và được từ cây sâm đại hành hợp chất EB-14 lần đầu được phân lập từ cây sâm đại hành.