Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. hại lạc tại Nghệ An

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án bổ sung những thông tin mới về tuyển chọn sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum được phân lập từ vùng đất trồng lạc để phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An. Kết quả luận án là tài liệu phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và phục vụ sản xuất.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. hại lạc tại Nghệ An

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------------  ---------- HỒ THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NẤM ĐỐI KHÁNG Trichoderma PHÒ NG TRỪ BỆNH MỐC VÀNG DO NẤ M Aspergillus flavus Link. HẠI LẠC TẠI NGHÊ ̣ AN CHUYÊN NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ: 62.62.01.12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017
Công trình hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: 1. GS.TS. VŨ TRIỆU MÂN 2. PGS. TS. NGUYỄN VĂN VIẾT Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại hội đồng đánh giá luận án cấp Viện họp tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 201 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao được dùng làm thực phẩm và xuất khẩu. Ở nước ta vùng Bắc Trung Bộ có diện tích trồng lạc lớn nhất so với 24 tỉnh thành trồng lạc trong cả nước, chiếm 22,5% tổng diện tích trồng và 21,6% tổng sản lượng lạc trên cả nước. Diện tích trồng lạc ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa tương ứng là 16200 ha chiếm 8,1%; 16000 ha chiếm 8,0%; 12800 ha chiếm 6,4% tương ứng so với cả nước. Sản lượng lạc ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa là 37300 tấn chiếm 8,3%; 36900 tấn chiếm 8,2%; 23600 tấn tương ứng, chiếm 5,2% cả nước (Tổng cục thống kê, 2015). Bệnh mốc vàng hại lạc do nấm Aspergillus flavus Link. gây ra là đối tượng hại có ý nghĩa kinh tế quan trọng với cây lạc. Nấm A. flavus có khả năng sinh độc tố aflatoxin, có thể gây ung thư và một số bệnh nguy hiểm trên người và động vật. Các nghiên cứu về nấm A.flavus và sự hình thành aflatoxin trên lạc và các sản phẩm từ lạc trên thế giới được tiến hành toàn diện và hệ thống, với gần 2000 công trình được xuất bản (Mehan et al. 1991). Lê Văn Giang cs. (2011), khảo sát trên 60 mẫu lạc ở Nghệ An, có 59 mẫu (98,30%) bị nhiễm nấm A. flavus, trong đó 30 mẫu (50,0%) sinh độc tố aflatoxin từ 2 – 100 ppb và 10 mẫu (16,67%) vượt quá tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế. Đây chính là mối nguy hại cho sức khỏe đối với người sử dụng những sản phẩm lạc này. Nghiên cứu của Torres et al. (2014) đã tóm tắt những tiến bộ gần đây ở các quốc gia trồng lạc trên thế giới về các phương pháp ngăn ngừa ô nhiễm aflatoxin trên lạc. Trong đó, tập trung chủ yếu vào các chiến lược trước thu hoạch, nhấn mạnh đến các hướng nghiên cứu cần tập trung trong tương lai bao gồm: chọn tạo giống lạc kháng nấm, kiểm soát sinh học và sử dụng ozon để giảm ô nhiễm aflatoxin trên lạc. Tại Việt Nam nghiên cứu phòng trừ nấm mốc A. flavus đã có một số thành công. Bên cạnh các biện pháp canh tác và bảo quản được áp dụng để phòng chống bệnh, các tác giả Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu năm 2010-2011 đã phân lập, tuyển chọn được các dòng nấm A. flavus TH97, DA2 không sinh độc tố dùng trong phòng trừ các dòng nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin. Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ đã tuyển chọn thành công giống lạc L17 có khả năng kháng nấm A.flavus (Nguyễn Văn Thắng, 2010). Chúng ta đã nghiên cứu và ứng dụng thành công các chế phẩm sản xuất từ nấm Trichoderma chống các bệnh thối rễ, chết ẻo… do các nấm Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii gây ra. Mặc dù vậy, hướng nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ nấm mốc A. flavus nhằm giảm thiểu độc tố aflatoxin trên lạc cũng như các cây trồng khác chưa được quan tâm. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. hại lạc tại Nghệ An” đã được tiến hành nhằm tuyển chọn và ứng dụng được nấm đối kháng Trichoderma trong phòng trừ bệnh mốc vàng hại lạc. 2. Mục đích và yêu cầu 2.1. Mục đích Tuyển chọn được các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc Aspergillus flavus hại cây lạc trồng tại Nghệ An và xây dựng được quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng.
2 2.2. Yêu cầu Tuyển chọn được các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm mốc Aspergillus flavus hại lạc tại Nghệ An. Xây dựng được quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Luận án bổ sung những thông tin mới về tuyển chọn sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum được phân lập từ vùng đất trồng lạc để phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An. Kết quả luận án là tài liệu phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và phục vụ sản xuất. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Sử dụng chế phẩm Trichoderma asperellum để phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An, không những làm giảm sự nhiễm nấm mốc A. flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn trên đồng ruộng và trong quá trình bảo quản, tăng hiệu quả kinh tế trong trồng lạc mà còn góp phần bảo vệ môi trường và đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng nghiên cứu Các loài nấm Trichoderma được phân lập từ các mẫu đất trồng lạc, sử dụng trong phòng trừ nấm A. flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc tại Nghệ An. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao và sản xuất chế phẩm sinh học Trichoderma có khả năng phòng trừ hiệu quả nấm mốc Aspergillus flavus trên cây lạc và ứng dụng rộng rãi cho vùng chuyên canh lạc tỉnh Nghệ An. 5. Những đóng góp mới của luận án - Là công trình nghiên cứu có hệ thống về sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum được phân lập từ vùng đất trồng lạc để chuyên phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An. - Ứng dụng thành công các kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào trình tự vùng gen ITS để định danh các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm mốc hại lạc A. flavus. - Đề xuất được quy trình sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma asperellum đạt nồng độ 5,3 × 109 bào tử/gam. Chế phẩm T. asperellum có tác dụng giảm sự nhiễm nấm mốc A. flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn trên đồng ruộng và giảm độc tố aflatoxin trong quá trình bảo quản đạt 92,08%, tăng hiệu quả kinh tế trong trồng lạc. 6. Cấu trúc của luận án Luận án dày 155 trang đánh máy vi tính khổ A4 với 37 bảng số liệu, 9 hình. Luận án gồm 5 phần: Mở đầu 3 trang; Tổng quan tài liệu 32 trang; Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 18 trang; Kết quả nghiên cứu và thảo luận 56 trang; Kết luận và kiến nghị 02 trang. Đã tham khảo 138 tài liệu bao gồm 40 tài liệu tiếng Việt và 97 tài liệu tiếng Anh, Phụ lục 21 trang.
3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Các xu hướng kiểm soát sinh học A. flavus sinh độc tố aflatoxin trên thế giới hiện nay với 3 hướng chính là: (i) Hướng nghiên cứu sử dụng Bacillus (B. pumilus, B. subtilis) (Munimbazi et al., 1998;…); (ii) Hướng nghiên cứu sử dụng các chủng A. flavus, A. parasiticus không sinh độc tố, đã có những thành công, đặc biệt là ở Hoa Kỳ, như chủng A. flavus AF36 (Cotty, 1994); (iii) Hướng nghiên cứu sử dụng nấm đối kháng Trichoderma đã có những thành công nhất định, đặc biệt ở Ấn Độ, như sử dụng 5 loài T. harzianum, T. viride, T. auroviride, T. longibrachiatum, T. hamatum kiểm soát sinh học A. flavus sinh độc tố aflatoxin (Reddy et al., 2010). 1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Cho đến nay ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số loại bệnh do nấm gây ra hại rễ cây trồng và ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma sản xuất phân hữu cơ sinh học nhưng hướng nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để làm giảm thiểu độc tố aflatoxin trên lạc cũng như các cây trồng khác chưa được quan tâm. Đã có các chế phẩm từ nấm Trichoderma chống được các loại nấm bệnh cây trồng gây bệnh thối rễ, chết yểu, xì mủ,… do các nấm bệnh gây nên (Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii, …) nhưng chưa có chế phẩm nào chuyên phòng trừ nấm A. flavus. Các nghiên cứu trong nước phòng trừ nấm mốc A. flavus sinh độc tố aflatoxin đã có thành công ở một số hướng như: dùng nấm A. flavus không sinh độc tố (chủng A. flavus TH97 của Nguyễn Thị Xuân Sâm, A. flavus DA2 của Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu; chọn tạo giống kháng nấm A. flavus như giống lạc D8 (hay L17) của Nguyễn Văn Thắng (Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ)...; ngoài ra kết hợp với các biện pháp canh tác và biện pháp bảo quản sau thu hoạch. 1.3. Những tồn tại và vấn đề đề tài tập trung nghiên cứu Nghiên cứu Trichoderma phòng trừ A. flavus đang được quan tâm nghiên cứu trên thế giới, đặc biệt là Ấn Độ. Ở Việt Nam, cho đến nay mới chỉ có những công trình nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số loại bệnh do nấm gây ra hại rễ cây trồng như Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii…và ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma vào sản xuất phân hữu cơ sinh học. Việc nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để làm giảm thiểu độc tố aflatoxin trên lạc cũng như các cây trồng khác chưa được quan tâm. Vì vậy, nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát nấm A. flavus gây bệnh mốc vàng trên lạc, giảm thiểu được hàm lượng aflatoxin sẽ giúp nâng cao chất lượng nông sản, có ý nghĩa trong ứng dụng vào sản xuất lạc. CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu đất trồng lạc để phân lập Trichoderma; mẫu đất trồng lạc để đánh giá tỷ lệ nhiễm A. flavus; mẫu hạt lạc giống thu từ nhà dân; mẫu hạt lạc giống thu từ các chợ. - Chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma được sản xuất từ nguồn nấm Trichoderma asperellum (Tri.020(2).NC), lượng bào tử 5,3 × 109 bt/g. - Các loại môi trường nuôi cấy: PDA, WA 0,01%, CAM; hóa chất trong phân tích DNA các nguồn nấm Trichoderma.
4 2.2. Thiết bị và dụng cụ Tủ hấp khử trùng, buồng nuôi cấy vi sinh, tủ sấy, đĩa petri, ống nghiệm… 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Các nghiên cứu được tiến hành tại Nghệ An, phân tích DNA được thực hiện tại Trung tâm BIOTEC (Thái Lan). Thời gian nghiên cứu từ năm 2011 - 2015. 2.4. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thực trạng nhiễm nấm A. flavus trên hạt giống và đất trồng lạc tại Nghệ An. - Thu thập, phân lập và tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus hại lạc tại Nghệ An. - Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm Trichoderma phòng trừ A. flavus hại lạc tại Nghệ An. - Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ A. flavus hại lạc tại Nghệ An. 2.5. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực trạng nhiễm nấm A. flavus trên hạt giống và đất trồng lạc tại Nghệ An theo phương pháp của Lester W. Burgess (2009); Mathur S.B (2000), Lin và Dianese (1976); Hamed et al. (2004). Thu thập, phân lập, tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus hại lạc tại Nghệ An theo phương pháp của Rahman et al. (2009), Skidmore and Dickinson (1976) và Dennis et al. (1971). Định loại của các nguồn nấm Trichoderma đối kháng cao với A. flavus bằng công nghệ sinh học phân tử: Chiết xuất DNA: theo phương pháp Cirad Protocol, dùng cặp mồi vùng ITS rDNA, phản ứng PCR, tinh chiết sản phẩm PCR: bẳng bộ kít Aquick PCR Purification Kit, gửi sản phẩm PCR sang Macrogen (Seoul, Hàn Quốc) để giải trình tự gen, hoàn thiện lại trình tự gen bằng phần mền Bioedit. Căn chuỗi trình tự bằng phần mềm ClustalX 2.1. Dùng phần mềm trực tuyến chuyên cho nấm Trichoderma là TrichOKEY v. 2.0 để định danh loài. Dùng phần mềm MEGA v.6 để xây dựng cây phát sinh loài. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc: nghiên cứu môi trường nhân giống cấp 1, môi trường nhân giống cấp 2, môi trường nhân sinh khối và các tỷ lệ nước/cơ chất, chế độ đảo trộn cấp khí và chiếu sáng theo phương pháp thường quy trong bảo vệ thực vật và kế thừa các nghiên cứu trước của Trần Thị Thuần và cs. (1995), Nguyễn Hồng Tuyên và cs. (2013) và Trần Thị Thúy (2013). Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc trong điều kiện nhà lưới, đồng ruộng và trên mô hình theo phương pháp của Srilakshmi (2001), Thakur (2003) và Lester W. Burgess (2009), (Askew & Laing 1993) và Mathur S.B và Olga K., 2000. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thực trạng nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc và đất trồng lạc tại Nghệ An 3.1.1. Thành phần nấm hại hạt lạc tại Nghệ An năm 2012 Các mẫu hạt lạc đã được thu thập ở các huyện Nghi Lộc, Nam Đàn, Yên Thành, Diễn Châu, Hưng Nguyên, Anh Sơn và thành phố Vinh. Đã xác định được 6 loài nấm gây hại chính trên các mẫu lạc được thu thập: có 6 loài nấm thuộc 4 bộ gây hại chính trên hạt lạc Xuất hiện phổ biến là các loài nấm A. niger, A. flavus, và Penicillium sp.
5 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc thu từ các chợ Nghệ An năm 2012 Đã tiến hành các đợt thu thập, phân lập nấm gây bệnh trên 245 mẫu hạt lạc từ các chợ khu vực Nghi Lộc và thành phố Vinh, để đánh giá mức độ nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc tại các chợ của khu vực này. Tỷ lệ mẫu hạt lạc nhiễm nấm A. flavus ở các chợ khá cao từ 28,6 – 51,4%, cao nhất là chợ Nghi Ân với số mẫu bị nhiễm chiếm đến 51,4%. Tỷ lệ mẫu hạt lạc nhiễm A. flavus thấp nhất ở chợ Quán Lau – Thành phố Vinh. Các chợ khu vực Nghi Lộc có tỷ lệ số mẫu nhiễm A. flavus khá cao và khá đều nhau giữa các chợ, từ 45,7 – 51,4 %. Các chợ trong khu vực thành phố Vinh: Chợ Ga, chợ Quang Trung, chợ Quán Lau, chợ Vinh có tỷ lệ nhiễm mẫu nhiễm nấm A. flavus thấp hơn Nghi Lộc từ 28,6 – 51,4%. 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc thu từ nông hộ Nghệ An năm 2012 Mẫu hạt lạc giống thu từ nông hộ có tỷ lệ nhiễm A. flavus từ 15,6 – 64,4%. Tại huyện Nghi Lộc, tỷ lệ mẫu lạc nhiễm A. flavus cao nhất ở xã Nghi Phong 64,4%, sau đó là Nghi Trung 60,0%. Các xã còn lại của Nghi Lộc như Nghi Ân, Nghi Trường và Nghi Long tỷ lệ hạt lạc nhiễm A. flavus thấp hơn chiếm từ 35,6 – 37,8%. Các xã Hưng Thông – Hưng Nguyên, Kim Liên – Nam Đàn và Diễn An – Diễn Châu có số mẫu lạc giống nhiễm nấm A. flavus từ 44,4 – 51,1 %. Thấp nhất ở Đỉnh Sơn – Anh Sơn với 15,6 % số mẫu bị nhiễm nấm A. flavus. 3.1.4. Thành phần nấm hại trong đất trồng lạc tại Nghệ An năm 2012 Thành phần nấm bệnh trong đất trồng lạc ở 3 xã Nghi Trường, Nghi Ân, Nghi Phong của huyện Nghi Lộc và vùng phụ cận vụ xuân năm 2012 gồm 11 loài thuộc 6 bộ và 6 họ khác nhau. Các loài nấm phổ biến là loài A. flavus gây bệnh mốc vàng, loài A. niger gây bệnh héo rũ gốc mốc đen, Penicillium sp. gây mốc xanh trên lạc. 3.1.5. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên đất trồng lạc của các điểm điều tra tại Nghệ An năm 2012 Đánh giá tỷ lệ nhiễm A. flavus trên 420 mẫu đất được thu từ các vùng trồng lạc Nghi Lộc, Hưng Nguyên, Nam Đàn, Diễn Châu, Quỳnh Lưu: Tỷ lê ̣ nhiễm A. flavus trên đấ t trồ ng la ̣c, chỉ từ 3,3-20,0%, ở các vùng luân canh lúa la ̣c tỷ lê ̣ mẫu đất nhiễm A. flavus thấ p. Điề u kiê ̣n gieo trồ ng và giai đoa ̣n phát triể n của la ̣c cũng ảnh hưởng đế n tỷ lê ̣ nhiễm A. flavus trong đấ t. Mẫu đấ t thu đươ ̣c trên vùng đấ t cát pha như Nghi Lô ̣c, Hưng Nguyên và Quỳnh Lưu vào giai đoa ̣n ra hoa hình thành củ không có tưới có tỷ lê ̣ nhiễm A. flavus từ 10,0- 20,0% cao hơn so với các mẫu đấ t thu ở Nam Đàn, Diễn Châu vào giai đoa ̣n đẻ nhánh trên vùng đấ t cát pha có tưới nước (3,3-5,0%). 3.1.6. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ các chợ của huyện Nghi Lộc và thành phố Vinh Với 107 mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ các chợ, trong đó 51 mẫu của các chợ ở Nghi Lộc và 56 mẫu của các chợ thành phố Vinh cho thấy: Tỷ lệ các mẫu nấm A. flavus được phân lập từ hạt lạc thu từ các chợ sinh độc tố aflatoxin từ 71,43-83,33%. Các chợ của Nghi Lộc trung bình có 80,39% số mẫu A. flavus sinh độc tố aflatoxin. Các chợ của thành phố Vinh trung bình có 76,79% mẫu A. flavus sinh aflatoxin. Trên tổng số 107 mẫu A. flavus thu từ các chợ có 84 mẫu sinh độc tố aflatoxin chiếm 78,50% (bảng 3.1).
6 Bảng 3.1. Số lượng các mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ các chợ của huyện Nghi Lộc và thành phố Vinh sinh độc tố aflatoxin Màu sắc trên Màu sắc dưới Tỷ lệ Tổng số Tổng môi trường CAM đèn UV mẫu mẫu sinh mẫu Vàng Vàng sinh Trắng Tím Xanh aflatoxin nhạt sẫm aflatoxin Nghi Lộc 51 5 15 31 10 41 41 80,39 Chợ Nghi Ân 18 1 5 12 3 15 15 83,33 Chợ Sơn 17 3 5 9 4 13 13 76,47 Chợ Mới 16 1 5 10 3 13 13 81,25 ThànhphốVinh 56 5 16 35 13 43 43 76,79 Chợ Ga 16 1 6 9 3 13 13 81,25 Chợ Vinh 16 1 4 11 4 12 12 75,00 Chợ Quán Lau 10 2 2 6 2 8 8 80,00 Chợ Quang Trung 14 1 4 9 4 10 10 71,43 Tổng 107 10 31 66 23 84 84 78,50 3.1.7. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ nông hộ Nghệ An Khả năng sinh độc tố aflatoxin của 191 mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ các nông hộ Nghệ An được trình bày trong bảng 3.2. Tỷ lệ mẫu nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin cao ở hầu hết các nông hộ từ 73,91-100%, trung bình chiếm 81,68% (bảng 3.2). Bảng 3.2. Số lượng các mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ nông hộ Nghệ An sinh độc tố aflatoxin Màu sắc trên Màu sắc dưới Tỷ lệ Tổng số Tổng môi trường CAM đèn UV mẫu Địa điểm mẫu sinh mẫu Vàng Vàng sinh Trắng Tím Xanh aflatoxin nhạt sẫm aflatoxin Nghi Lộc 105 16 33 56 18 87 87 82,86 Hưng Nguyên 20 3 2 15 3 17 17 85,00 Nam Đàn 23 5 7 11 6 17 17 73,91 Diễn Châu 20 3 7 10 4 16 16 80,00 Yên Thành 16 4 4 8 4 12 12 75,00 Anh Sơn 7 0 4 3 0 7 7 100,00 Tổng 191 31 57 103 35 156 156 81,68 3.1.8. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A.flavus phân lập được từ đất trồng lạc ở Nghệ An Bảng 3.3 cho thấy nuôi cấy trên môi trường CAM 49 mẫu nấm A. flavus phân lập được từ đất trồng lạc của Nghệ An: có 28 mẫu A. flavus có màu vàng sẫm, 12 mẫu có màu vàng nhạt và 9 mẫu có màu trắng; dưới đèn UV có 38 mẫu A. flavus quan sát thấy huỳnh quang màu xanh, 11 mẫu có huỳnh quang màu tím. Như vậy, với 49 mẫu isolate A. flavus phân lập được từ đất trồng lạc Nghệ An có 38 mẫu sinh độc tố aflatoxin chiếm 77,55%.
7 Bảng 3.3. Số lượng các mẫu nấm A. flavus phân lập được từ đất trồng lạc ở Nghệ An sinh độc tố aflatoxin Màu sắc trên Màu sắc dưới Tỷ lệ Tổng số Tổng môi trường CAM đèn UV mẫu Địa điểm mẫu sinh mẫu Vàng Vàng sinh Trắng Tím Xanh aflatoxin nhạt sẫm aflatoxin Nghi Lộc 23 3 7 13 4 19 19 82,61 HưngNguyên 9 2 2 5 2 7 7 77,78 Nam Đàn 2 1 0 1 1 1 1 50,00 Diễn Châu 3 2 0 1 2 1 1 33,33 QuỳnhLưu 12 1 3 8 2 10 10 83,33 Tổng 49 9 12 28 11 38 38 77,55 3.2. Thu thập, phân lập và tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus hại lạc tại Nghệ An 3.2.1. Thu thập và phân lập nấm đối kháng Trichoderma trên đất trồng lạc Tần suất xuất hiện của nấm Trichoderma trên 1000 mẫu đất trồng lạc thu tại Nghệ An, Thanh Hóa và Hà Tĩnh. Số mẫu đất trồng lạc có nấm Trichoderma của Nghệ An chiếm 44,30%, Thanh Hoá 52,00% và Hà Tĩnh 39,50%. Trong tỉnh Nghệ An, tần suất xuất hiện Trichoderma của huyện Diễn Châu cao nhất 55,00%, huyện Quỳnh Lưu trung bình 49,50% và thấp nhất huyện Nghi Lộc 28,50% (bảng 3.4). Bảng 3.4. Tần suất xuất hiện nấm Trichoderma trên đất trồng lạc tại các điểm thu mẫu từ 2011-2013 Số mẫu có Tần suất STT Điạ điể m thu mẫu Số mẫu Trichoderma xuất hiện (%) 1 Nghê ̣ An 600 266 44,30 Quỳnh Lưu 200 99 49,50 Diễn Châu 200 110 55,00 Nghi Lô ̣c 200 57 28,50 2 Hà Tinh ̃ 200 79 39,50 3 Thanh Hoá 200 104 52,00 Tổ ng số 1000 449 44,9 3.2.2. Nghiên cứu tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma đối kháng cao với nấm mốc A. flavus hại lạc Khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) hại lạc của 99 nguồn nấm Trichoderma phân lập tại các vùng đất trồng lạc tại Nghệ An, Thanh Hóa và Hà Tĩnh đã được đánh giá bằng phương pháp nuôi kép trên đĩa petri. Trong số 37 nguồn nấm Trichoderma phân lập tại vùng đất trồng lạc của tỉnh Nghệ An, có 7 nguồn (chiếm 18,92%) đối kháng rất cao (PIRG>75%) với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) bao gồ m: Tri.011(1).NL; Tri.007(1).NĐ; Tri.014(1).NL; Tri.020(2).NC; Tri.005(2).NĐ; Tri.041(1).NĐ; Tri.027(2).NĐ (bảng 3.5).
8 Bảng 3.5. Khả năng đối kháng của các nguồn nấm Trichoderma phân lập được từ đất trồng lạc Nghệ An đối với nấm A. flavus (Asp1.011NA) sau 7 ngày nuôi cấ y Cấp độ đối kháng Nguồn nấm Đối kháng rất cao Tri.011(1).NL; Tri.007(1).NĐ; Tri.014(1).NL; Tri.020(2).NC; PIRG >75% Tri.005(2).NĐ; Tri.041(1).NĐ; Tri.027(2).NĐ Đối kháng cao Tri.038(1).NL; Tri .022(1).NL; Tri.025(1).NĐ; Tri.011(1).NĐ; 60% < PIRG ≤ 75% Tri.016(2).NĐ; Tri .042(1).NĐ; Tri.016(1).NĐ; Tri.063(2).NĐ; Tri.062(1).QL; Tri.020(2).NĐ; Tri .046(2).NĐ; Tri.039(2).DC Đối kháng trung bình Tri.023(1).QL; Tri.022(1).NL; Tri .035(1).NL; Tri.059(1).NL 50% < PIRG ≤ 60% Đối kháng thấp Tri.046(1).NL; Tri.062(2).NĐ; Tri.008(1).NĐ; Tri.006(1).NĐ; PIRG ≤ 50% Tri.040(2).NL; Tri.127(2).NC;Tri.008(2).NĐ; Tri.010(1).NĐ; Tri.030(1).NĐ; Tri.032(1).NL; Tri.013(2).NĐ; Tri.022(2).NP; Tri.009(1).NĐ; Tri.023(3).NP Ghi chú: PIRG: chỉ số đối kháng Khả năng đối kháng của 32 nguồn nấm Trichoderma được phân lập từ đất trồng lạc Thanh Hóa với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) thể hiện trên bảng 3.6: có 11 nguồn (chiếm 34,38%) đối kháng rất cao, bao gồm (Tri.019(4).NC; Tri.053(1).TG; Tri.011(1).NC; Tri.039(1).TG; Tri. 014(4).NC; Tri.013(1).NC; Tri.002(2).NC; Tri.149(1).TG; Tri.009(1).NC; Tri.069(2).QX; Tri.008(1).NC). Bảng 3.6. Khả năng đối kháng của các nguồn nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng lạc Thanh Hóa đối với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) sau 7 ngày nuôi cấ y Cấp độ đối kháng Nguồn nấm Đối kháng rất cao Tri.019(4).NC; Tri.053(1).TG; Tri.011(1).NC; Tri.039(1).TG; Tri. PIRG >75% 014(4).NC; Tri.013(1).NC; Tri.002(2).NC; Tri.149(1).TG; Tri.009(1).NC; Tri.069(2).QX; Tri.008(1).NC Đối kháng cao Tri.016(1).NC; Tri. 100(2).NC; Tri.012(2).NC; Tri.077(1).QX; Tri. 60% < PIRG ≤ 75% 062(2).QX; Tri.034(1).TG; Tri. 142(1).TG; Tri.013(4).NC; Tri.014(1).NC; Tri.065(1).QX; Tri.004(1).NC; Tri.012(1).NC Đối kháng trung bình Tri.049(2).TG; Tri.104(1).TH; Tri.081(1).QX; Tri.003(2).NC 50% < PIRG ≤ 60% Đối kháng thấp Tri.062(1).QX; Tri.127(1).NC; Tri.123(2).TH; Tri.033(1).TG; Tri. PIRG ≤ 50% 156(2).TG Ghi chú: PIRG: chỉ số đối kháng Khả năng đối kháng của 30 nguồn nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng lạc của Hà Tĩnh đối với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA): có 10 nguồn nấm Trichoderma đối kháng rất cao với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) (chiếm 33,33%) gồ m: Tri.002(2).NX; Tri.006(2).NX; Tri.004(2).NX; Tri.057(1).NX; Tri.005(1)NX; Tri.095(1).TH; Tri.008(1).NT; Tri.092(1).TH; Tri.038(2).NX; Tri.014(2).NX (bảng 3.7). Như vậy, qua thí nghiệm nuôi kép trên đĩa petri đánh giá khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) hại lạc của 99 nguồn nấm Trichoderma phân lập tại các vùng đất trồng lạc tại Nghệ An, Thanh Hóa và Hà Tĩnh đã xác định được 28 nguồn nấm Trichoderma (chiếm 28,3%) có khả năng đối kháng rất cao đối với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) với chỉ số đối kháng PIRG > 75%.
9 Bảng 3.7.Khả năng đối kháng của các nguồn nấm Trichoderma phân lập được từ đất trồng lạc Hà Tĩnh đối với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) sau 7 ngày nuôi cấ y Cấp độ đối kháng Nguồn nấm Đối kháng rất cao Tri.002(2).NX; Tri.006(2).NX; Tri.004(2).NX; Tri.057(1).NX; PIRG >75% Tri.005(1)NX; Tri.095(1).TH; Tri.008(1).NT; Tri.092(1).TH; Tri.038(2).NX; Tri.014(2).NX Đối kháng cao Tri.016(1).NX; Tri.007(2).NA; Tri.123(2).TH 60% < PIRG ≤ 75% Đối kháng trung bình Tri.164(1).CL 50% < PIRG ≤ 60% Đối kháng thấp Tri.032(1).NX; Tri.118(1).TH; Tri.010(1).NX; Tri.028(2).NL; PIRG ≤ 50% Tri.123(1).TH; Tri.135(1).CL; Tri.127(2).CL; Tri.128(1).CL; Tri.020(1).NX; Tri.126(1).CL; Tri.114(1).TH; Tri.092(2).TH; Tri.059(1).NX; Tri.100(1).TH; Tri.101(2).TH; Tri.023(3).NP Ghi chú: PIRG: chỉ số đối kháng Hình 3.1. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm A. flavus (Asp1.011NA); a. Bán kính của nấm A. flavus sau 7 ngày nuôi cấy trên đĩa đối chứng; b-i: Bán kính của nấm A. flavus trên đĩa nuôi kép, tản nấm Trichoderma bao phủ lên nấm A. flavus sau 7 ngày nuôi cấy: Tri .011(1).NL; Tri. 002(2).NC; Tri. 053(1).TG); Tri.005(1)NX; Tri.011(1).NC; Tri.020(2).NC; Tri.092(1).TH); Tri .046(2).NĐ theo thứ tự
10 3.2.2.4. Khả năng đối kháng của các nguồn nấm Trichoderma đối với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) bằng chất kháng sinh bay hơi Hai mươi tám nguồn nấm Trichoderma được tuyển chọn từ thí nghiệm nuôi kép trên đĩa petri tiếp tục được đánh giá hiệu lực phòng trừ đối với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) bằng chất kháng sinh bay hơi theo phương pháp của Dennis et al. (1971). Kết quả thu được như bảng 3.8. Bảng 3.8. Hiệu lực phòng trừ của các nguồn nấm Trichoderma đối với nấm mốc A. flavus bằng chất kháng sinh bay hơi sau 5 ngày nuôi cấy Đường kính Hiệu lực Nguồn nấm tản nấm A. flavus (mm) phòng trừ (%) Tri.011(1).NL 14,10 80,69 Tri.007(1).NĐ 13,13 82,02 Tri.014(1).NL 17,80 75,63 Tri.020(2).NC 9,07 87,59 Tri.005(2).NĐ 21,83 70,11 Tri.041(1).NĐ 32,63 55,32 Tri.006(2).NX 27,63 62,16 Tri.019(4).NC 10,83 85,17 Tri.053(1).TG 12,07 83,48 Tri.011(1).NC 9,93 86,40 Tri.013(1).NC 16,93 76,81 Tri.002(2).NC 19,83 72,84 Tri.039(1).TG 29,17 60,06 Tri.014(4).NC 37,50 48,65 Tri.149(1).TG 32,40 55,64 Tri.009(1).NC 41,67 42,95 Tri.005(1)NX 53,40 26,88 Tri.008(1).NC 47,23 35,33 Tri.002(2).NX 14,53 80,10 Tri.027(2).NĐ 13,70 81,24 Tri.004(2).NX 17,77 75,67 Tri.095(1).TH 19,33 73,53 Tri.069(2).QX 24,53 66,41 Tri.057(1).NX 32,70 55,23 Tri.008(1).NT 27,47 62,39 Tri.092(1).TH 44,50 39,07 Tri.038(2).NX 50,27 31,17 Tri.014(2).NX 57,07 21,86 Đối chứng 73,03 - Tất cả 28 nguồn nấm Trichoderma thí nghiệm đều có khả năng tiết ra các hợp chất kháng sinh dễ bay hơi để ức chế sự phát triển của nấm A. flavus (Asp1.011NA). Trong đó nguồn nấm Trichoderma (Tri.020(2).NC) có hiệu lực phòng trừ nấm A. flavus (Asp1.011NA) bằng kháng sinh bay hơi đạt lớn nhất 87,59%.
11 3.2.3. Định danh 15 nguồn nấm Trichoderma có khả năng đố i kháng rất cao với nấm mốc A. flavus hại lạc dựa trên vùng gen ITS-rDNA 3.2.3.1. Định danh bằng phần mềm tìm kiếm trực tuyến TrichOKEY Nhóm 15 nguồn nấm Trichoderma có chỉ số đối kháng cao với nấm mốc A. flavus đã được đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase, tiếp tục được định danh đến loài dựa vào trình tự vùng gen ITS. 15 nguồn nấm Trichoderma được định danh dùng phần mềm trực tuyến chuyên cho nấm Trichoderma là TrichOKEY v. 2.0. Phần mềm TrichOKEY 2 cho phép định danh nấm dựa trên tổ hợp các trình tự nucleotide nhận dạng (hallmarks) nằm trên vùng ITS (Druzhinina et al., 2005). Bảng 3.9. Kết quả định danh của các nguồn nấm Trichoderma dùng phần mềm TrichOKEY v. 2.0 STT Nguồn nấm Loài xác định với mức tin cậy cao 1 VN013NC T. asperellum, T. koningiopsis 2 VN053TG T. asperellum, T. koningiopsis 3 VN095TH T. asperellum, T. koningiopsis 4 VN002NC T. asperellum, T. koningiopsis 5 VN002NX T. asperellum, T. koningiopsis 6 VN004NX T. asperellum 7 VN005ND T. harzianum 8 VN011NC T. asperellum, T. koningiopsis 9 VN014NL T. asperellum, T. koningiopsis 10 VN019NC T. asperellum, T. koningiopsis 11 VN027ND T. asperellum, T. koningiopsis 12 VN069QX T. asperellum, T. koningiopsis 13 VN011NL T. asperellum, T. koningiopsis 14 VN020NC T. asperellum, T. koningiopsis 15 VN007ND T. asperellum, T. koningiopsis Kết quả định danh bằng phần mềm TrichOKEY 2 (bảng 3.9) cho thấy trong 15 nguồn nấm Trichoderma kiểm tra có 13 nguồn: VN013NC, VN053TG, VN095TH, VN002NC, VN002NX, VN011NC, VN014NL, VN019NC, VN027ND, VN069QX, VN011NL,VN020NC và VN007ND, trùng với 2 loài T. asperellum và T. koningiopsis với mức độ tin cậy cao. Nguồn nấm VN004NX chỉ trùng với 1 loài T. asperellum. Đáng chú ý, chỉ duy nhất nguồn nấm VN005ND trùng với loài T. harzianum. 3.2.3.2. Phân tích phả hệ Dựa trên kết quả định danh dùng phần mềm TrichOKEY v. 2.0 ở trên, các nguồn nấm tiếp tục được phân tích phả hệ như hình 3.2. Các nguồn nấm Trichoderma điển hình cho loài được xác định (T. asperellum, T. koningiopsis và T. harzianum) cũng như một số loài Trichoderma tham khảo phổ biến khác (T. austrokoningii, T. ovalisporum, T. viride và T. atroviride) đã được sử dụng cho phân tích phả hệ. Mã Genbank của các mẫu phân tích được tham khảo từ các công bố của Bissett et al. (2015), Samuels (2006) và Samuels et al (2006). Kết quả phân tích trình tự gen đã cho phép kết luận nguồn VN005ND là loài T. harzianum, nguồn VN004NX có thể là một loài mới gần gũi với T. asperellum, 13 nguồn còn lại loài T. asperellum.
12 Hình 3.2. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của các nguồn nấm Trichoderma dùng phần mềm MEGA v.6. Cây được xây dựng dựa trên mô hình thay thế nucleotide Jukes-Cantor (JC) được lựa chọn từ phân tích xác định mô hình thay thế phù hợp nhất (lệnh models trong phầm mềm MEGA). Giá trị ở các nốt là giá trị thống kê boostrap dưới dạng % (1000 lần lặp) (Ngưỡng tin cậy nhìn chung là 75% có nghĩa trong 1000 lần lặp thì 750 lần các đơn vị phân loại phân nhóm với nhau). Ký tự T trong ngoặc đơn là nguồn nấm điển hình của loài (Type strain). Các nguồn nấm Trichoderma của Việt Nam được đánh dấu bằng hình tròn. Những kết quả về đánh giá khả năng phòng trừ của các nguồn nấm Trichoderma đối với nấm mốc A. flavus bằng phương pháp nuôi kép trên đĩa petri và bằng các hợp chất kháng sinh dễ bay hơi làm cơ sở tuyển chọn được 15 nguồn nấm Trichoderma có triển vọng cho phòng trừ nấm mốc A. flavus, bao gồm: Tri.013(1).NC; Tri.053(1).TG; Tri.095(1).TH; Tri.002(2).NC; Tri.002(2).NX; Tri.004(2).NX; Tri.005(2).NĐ; Tri.011(1).NC; Tri.014(1).NL; Tri.019(4).NC; Tri.027(2).NĐ; Tri.069(2).QX; Tri.011(1).NL; Tri.020(2).NC; Tri.007(1).NĐ. Theo kết quả định danh dựa vào trình tự vùng gen ITS-rDNA cho thấy nhóm 15 nguồn nấm này chủ yếu là loài T. asperellum (chiếm 86,67%).
13 Trong nhóm 15 nguồn nấm Trichoderma triển vọng này nguồn nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) có chỉ số đối kháng với A. flavus trong thí nghiệm nuôi kép là PIRG > 75% và hiệu quả phòng trừ đạt cao nhất 87,59% bằng các chất kháng sinh dễ bay hơi. Do vậy, chọn nguồn nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) cho các thí nghiệm phòng trừ A. flavus trong điều kiện nhà lưới và đồng ruộng. 3.2.4. Mô tả đặc điểm hình thái của T. asperellum (Tri.020(2).NC) Đặc điểm hình thái của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) được mô tả theo như bảng 3.10 dưới đây: Bảng 3.10. Đặc điểm hình thái nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) Hình thái Đặc điểm Bào tử Hình gần cầu hoặc hình trứng. Màu xanh đậm. Kích thước 2,9- (Conidia) 3,8 x 3,2-4,5 µm, tỷ lệ dài/rộng 1,0-1,3. Cuống đính bào tử Cuống bào tử đính có các cành bên phân nhánh. (Conidiophores) Thể bình Dài 6,8-9,9 µm, điểm giữa của thể bình từ 2,1-3,3 µm, chiều (Phialides) rộng ở đáy là 1,1 – 1,8; tỷ lệ dài/rộng 1,5-1,9. Bào tử hậu Được hình thành nhiều sau 7 ngày nuôi cấy, hình gần cầu đến (Chlamydospores) cầu, đường kính 8,3 - 12,2 µm. Tản nấm trên PDA Sau 72 giờ ở 300C đường kính đạt 41,3 - 63,7 mm, bào tử màu (Colony) xanh hình thành tạo những vòng tròn đồng tâm. Không có mùi dừa. Đặc điểm hình thái của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trùng khớp hoặc gần giống với các mô tả về loài chuẩn T. asperellum trong nghiên cứu của Samuels (2004) và nghiên cứu gần đây của Sriam et al. (2013). 3.3. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm nấm T. asperellum phòng trừ A. flavus hại lạc tại Nghệ An Nguồn nấm Trichoderma asperellum (Tri.020(2).NC) đã được tuyển chọn dùng trong nghiên cứu các biện pháp sản xuất chế phẩm phòng trừ nấm mốc A. flavus hại lạc tại Nghệ An. 3.3.1. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy giống cấp 1 đến sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) Đường kính tản nấm và nồng độ bào tử T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên môi trường PDA sau 3 ngày nuôi cấy đạt kích thước và nồng độ cao hơn (8,68 cm và 51,4 x 108 bt/ml) so với trên môi trường Czapek và CMA. Như vậy, môi trường PDA là môi trường thích hợp cho việc nhân giống cấp 1 nguồn nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC). 3.3.2. Lựa chọn môi trường nhân giống cấp 2 thích hợp nhất cho nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) 3.3.2.1. Xác đinh ̣ khố i lượng đường glucose thích hợp nhất cho nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) Khối lượng đường glucose trong 1000 ml thành phần môi trường là 30 g (CT4_30) là thích hợp nhất cho sự sinh trưởng, phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC), tương ứng với khối lượng sinh khối nấm thu được lớn nhất là 2,47 g/100ml sau 72 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 300C.
14 3.3.2.2. Xác đinh ̣ khố i lượng giá đỗ thích hợp nhất cho nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) Lượng giá đỗ trong 1000 ml môi trường lỏng là 250 g (CT6_250) thì khối lượng nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) đạt lớn nhất là 1,97 g. Tuy nhiên, phân tích thống kê cho thấy, khối lượng nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) thu được ứng với lượng giá đỗ này không sai có ý nghĩa so với lượng giá đỗ là 200 g (CT5_200) và 150 g (CT4_150). Với lượng giá đỗ là 150 g trong môi trường lỏng thì khối lượng nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) thu được là 1,94 g. 3.3.2.3. Xác đinḥ thời gian thu hồi sinh khối nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) thích hợp nhất trên môi trường nhân giống cấp 2 Sinh khối của nấm T. asperellum trên môi trường lỏng tăng dần theo các ngày nuôi cấy. Đến ngày thứ 3, sinh khối nấm T. asperellum đạt lớn nhất là 2,51 g và không sai khác khi xử lý thống kê ở ngày thứ 4. Đến ngày thứ 5 và thứ 6, sinh khối sợi nấm T. asperellum giảm dần. Như vậy, thu hồi sinh khối nấm T. asperellum trên môi trường lỏng thích hợp nhất là từ sau 3-4 ngày nuôi cấy. 3.3.3. Lựa chọn môi trường rắn nuôi nhân sinh khối thích hợp nhất cho nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) 3.3.3.1. Nghiên cứu loại cơ chất rắn thích hợp Nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) phát triển nhanh nhất trên môi trường rắn là thóc nguyên hạt: lượng bào tử đạt cao nhất 5,36 × 109 bt/g và sau 2-3 ngày nuôi cấy đã xuất hiện bào tử trên thóc so với môi trường bột thóc và bột ngô (bảng 3.11). Bảng 3.11. Sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên các loại cơ chất rắn sau 10 ngày nuôi cấy Công thức Lượng bào tử × 109 (bt/g) Ngày xuất hiện bào tử (ngày) a CT1 5,36 2-3 b CT2 3,88 3-4 CT3 1,96c 3-4 CV (%) 6,7 LSD 0,05 0,36 3.3.3.2. Nghiên cứu tỷ lệ cơ chất rắn/lượng nước thích hợp Kết quả bảng 3.12 thấy rằng tỷ lệ thóc/nước: 1/1 là thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC), lượng bào tử sinh ra sẽ đạt cao nhất. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Trần Thị Thuần và cs. (1995), tỷ lệ nước là 1/1 trên môi trường thóc thì sẽ cho lượng bào tử nấm T. harzianum đạt cao nhất. Bảng 3.12. Sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên các tỷ lệ thóc/lượng nước sau 10 ngày nuôi cấy Công thức Lượng bào tử (bt/g) Ngày xuất hiện bào tử (ngày) 7 CT1_1/0,5 5,2 × 10 e 4-5 9 CT2_1/0,75 1,77 × 10 c 3-4 CT3_1/1 5,37 × 109 a 2-3 9 CT4_1/1,25 4,83 × 10 b 2-3 7 CT5_1/1,5 7,83 × 10 d 2-3 CV (%) 3,7 LSD 0,05 0,25
15 3.3.3.4. Nghiên cứu chế độ đảo trộn và cấp khí trong quá trình nuôi nhân sinh khối Chế độ buộc kín túi, không có sự trao đổi không khí và đảo trộn quá nhiều lần không phù hợp cho việc phát triển và sinh bào tử của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên môi trường thóc. Chế độ buộc túi hở và đảo trộn 2 lần sau cấy 3 ngày và 7 ngày trên môi trường thóc là điều kiện thuận lợi nhất cho nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) phát triển và đạt nồng độ bào tử cao nhất. 3.3.3.5. Nghiên cứu thời gian chiếu sáng thích hợp Chế độ chiếu sáng là 12 giờ sáng và 12 giờ tối là thích hợp nhất cho sự phát triển và phát sinh bào tử của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) lượng bào tử nấm T. asperellum đạt cao nhất 5,33 ×109 bt/g. Như vậy, các thí nghiệm từ phần 3.3.1 đến 3.3.3.5 đã xác định được các loại môi trường và các điều kiện nuôi cấy phù hợp nhất cho việc sản xuất chế phẩm nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC): Nguồn nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) được nhân giống trong những điều kiện thích hợp nhất đã được xác định ở trên. Cụ thể: Nhân giống cấp 1 nguồn nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên môi trường PDA trong 3 - 4 ngày ở nhiệt độ 300C. Sau đó, nguồn T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên môi trường PDA tiếp tục được nhân giống cấp 2 trên môi trường lỏng 150 (g) giá + 30 (g) đường + 1 (g) urê + 1 (g) KH2P04 + 0,5 MgS04 + 1000 (ml) H2O và nuôi lắc 150 vòng/phút từ 3-4 ngày ở nhiệt độ 300C. Thu dịch sinh khối nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên môi trường nhân giống cấp 2 để làm nguồn nhân lên trên môi trường rắn là thóc nguyên hạt với tỷ lệ thóc/nước là 1/1; túi môi trường buộc hở; 2 lần đảo trộn trong suốt thời kỳ nhân sinh khối sau 3 ngày và sau 7 ngày nuôi cấy. Nuôi nhân trên môi trường thóc sau 10 ngày ở điều kiện nhiệt độ 300C, sản phẩm nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) thu được đưa đi sấy khô ở 400C hoặc hong khô tự nhiên trên nia, lượng bào tử là 5,3 × 109 bt/g chế phẩm. Đây chính là cơ sở để xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) như dưới đây: 3.3.3.6. Quy trình sản xuất chế phẩm nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) phòng trừ nấm A. flavus hại lạc tại Nghệ An Nội dung quy trình (hình 3.3): Nguồn giống nấm T. asperellum: nguồn nấm T. asperellum được dùng làm chế phẩm là T. asperellum (Tri.020(2).NC) được phân lập từ đất trồng lạc ở tỉnh Nghệ An và có khả năng đối kháng rất cao với nấm mốc A. flavus hại lạc. Nhân giống cấp 1: Nấm đối kháng T. asperellum (Tri.020(2).NC) được nhân giống cấp 1 trên môi trường PDA (Potato Dextro Agar) trong 3 - 4 ngày ở nhiệt độ 300C. Nhân giống cấp 2: Nguồn giống T. asperellum (Tri.020(2).NC) cấp 1 được nhân giống cấp 2 trên môi trường lỏng và nuôi lắc 150 vòng/phút để tăng nhanh sinh khối. Thành phần môi trường lỏng bao gồm: 150 (g) giá + 30 (g) đường + 1 (g) urê + 1 (g) KH2P04 + 0,5 MgS04 + 1000 (ml) H2O. Thời gian nhân giống cấp 2 trong thời gian 3 ngày ở nhiệt độ 300C. Dùng dịch sinh khối nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên môi trường nhân giống cấp 2 để làm nguồn nhân lên trên môi trường thóc nguyên hạt. Nhân sinh khối trên môi trường thóc: Môi trường thóc được hấp khử trùng trong điều kiện 1210C trong 30 phút với tỷ lệ thóc/lượng nước là 1/1. Các túi nuôi cấy nấm được
16 đặt trong điều kiện 12h sáng : 12h tối, ở nhiệt độ 300C, túi đựng môi trường được buộc hở 2 lần đảo trộn: sau 3 ngày và 7 ngày nuôi cấy. Nuôi nhân 10 ngày ở điều kiện nhiệt độ 30 0C thì thu sinh khối nấm đưa đi làm khô . Thu sản phẩm nhân sinh khối, làm khô và đóng gói: làm khô nấm bằng hong khô tự nhiên trên nia hoặc bằng tủ sấy ở nhiệt độ 400C cho đến khi khô. Cho vào các túi và được hút chân không để đảm bảo lượng bào tử trong thời gian bảo quản. Nguồn giống nấm Trichoderma T. asperellum (Tri.020(2).NC) Nhân giống cấp 1 Môi trường PDA (3-4 ngày): 200 (g) khoai tây + 20 (g) dextro + 15 (g) agar Nhân giống cấp 2 Môi trường lỏng (nuôi lắc 3 ngày):150 (g) giá + 30 (g) đường glucose + 1 (g) urê + 1 (g) KH2P04 + 0,5 (g) MgS04 + 1000 (ml) H2O Nhân sinh khối trên môi trường rắn Môi trường rắn (10 ngày): Thóc Lượng nước: Tỉ lệ thóc/nước =1/1 Buộc hở túi môi trưởng và đảo trộn 2 lần: sau 3 và 7 ngày cấy o Ánh sáng: 12h sáng và 12h tối; Nhiệt độ: 30 C Thu sản phẩm nhân sinh khối, làm khô và đóng gói CHẾ PHẨM TRICHODERMA Hình 3.3. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) phòng trừ nấm mốc A. flavus hại lạc 3.3.3.7. Kết quả thử nghiệm tính an toàn sinh học của chế phẩm sinh học T. asperellum Tiến hành thí nghiệm kiểm tra tính an toàn sinh học của chế phẩm nấm T. asperellum tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương trên đối tượng động vật thí nghiệm là chuột Swiss. Chuột ở các nhóm 2 và 3 dùng chế phẩm nấm Trichodema (5g/kg và 10g/kg) đều tăng tốt tương đương nhóm chứng. Kết quả thực nghiệm cho thấy ở mức liều uống từ 10g/kg chuột trở xuống chế phẩm nấm T. asperellum là an toàn.
17 3.4. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm T. asperellum phòng trừ A. flavus hại lạc tại Nghệ An 3.4.1. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc trong điều kiện nhà lưới 3.4.1.1. Nghiên cứu khả năng ức chế của nấm T. asperellum với nấm A. flavus ở các mức mật độ khác nhau Bảng 3.13 cho thấy khả năng ức chế nấm A. flavus của nấm T. asperellum tỷ lệ thuận với mật độ của nấm có trong đất. Ở công thức mật độ bào từ nấm đối kháng T. asperellum cao gấp đôi mật độ bào tử nấm A. flavus, số lượng mầm bệnh nấm A. flavus trong đất giảm thấp nhất so với các công thức còn lại 3,11× 104 CFU/g tương ứng giảm 77,05% so với đối chứng. Bảng 3.13. Khả năng ức chế của nấm T. asperellum với nấm A. flavus ở các mức mật độ khác nhau trong điều kiện nhà lưới sau 4 tuần gieo hạt Công thức Số lượng mầm bệnh A. flavus (CFU/g) Giảm so với đối chứng (%) 4 CT1_0/1 13,56 × 10 - CT2_1/1 7,44× 104 45,08b CT3_2/1 3,11× 104 77,05a CT4_1/2 8,67× 104 36,07c CV (%) 1,8 LSD 0,05 1,42 Ghi chú: Các chữ cái là số mũ khác nhau trong cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P
18 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của các phương pháp sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum đến số lượng số lượng mầm bệnh nấm A. flavus trong điều kiện nhà lưới sau 4 tuần gieo hạt Công thức Số lượng mầm bệnh A. flavus (CFU/g) Giảm so với đối chứng (%) CT1_Đ/C 11,78 × 10 4 - 4 CT2_P 4,89× 10 58,49b CT3_G 3,56× 104 69,81a CT4_Đ 6,22× 104 47,17c CV (%) 3,7 LSD 0,05 3,25 Ghi chú: Các chữ cái là số mũ khác nhau trong cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P