Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn trên nền di truyền của giống lúa BC15

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được hoàn thành với mục tiêu nhằm xác định được các gen kháng hiệu quả với bệnh đạo ôn lúa và bộ chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn tại các tỉnh phía Bắc; Chọn tạo được dòng/giống lúa kháng bệnh đạo ôn mang nền di truyền của giống lúa BC15.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn trên nền di truyền của giống lúa BC15

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NHÀI NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN NỀN DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LÚA BC15 Chuyên ngành: Di truyền và Chọn giống cây trồng MÃ SỐ: 9620111 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI, NĂM 2023
Công trình được hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy 2. PGS.TS. Lê Hùng Lĩnh Phản biện 1: ................................................................................ Phản biện 2:................................................................................. Phản biện 3:................................................................................. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Viện họp tại ..................................... Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, vào hồi .... giờ ..... ngày ..... tháng ... năm 2023. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae Cavara gây ra là loại bệnh hại nghiêm trọng nhất ở hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới, dẫn đến mất mùa lên tới 70 - 80% và đe dọa an ninh lương thực toàn cầu. Hiện nay, hầu hết các giống lúa trồng chủ lực ở các tỉnh phía Bắc nước ta đều bị nhiễm đạo ôn với mức độ khác nhau. Để có cơ sở cải tiến hiệu quả tính kháng bệnh đạo ôn cho cây lúa, việc nghiên cứu đánh giá độc tính của quần thể nấm gây bệnh đạo ôn, chọn lọc nguồn gen kháng bệnh còn hiệu lực và định hướng ứng dụng chỉ thị phân tử để tích hợp nhiều gen kháng vào nền giống lúa trồng phổ biến chính là cách tiếp cận tối ưu nhất. Giống lúa BC15 là giống lúa cho năng suất cao, thích ứng rộng, chất lượng cơm tốt, được gieo trồng phổ biến ở các tỉnh phía Bắc. Mặc dù là giống lúa chủ lực, năng suất cao, chất lượng tốt, song giống lúa BC15 thường bị nhiễm đạo ôn, nhất là sản xuất ở vụ xuân, khi gặp thời tiết không thuận lợi thì năng suất và sản lượng bị ảnh hưởng rất nhiều. Chính vì vậy, luận án “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn trên nền di truyền của giống lúa BC15” được thực hiện. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Thu thập, phân lập, đánh giá độc tính các nòi nấm bệnh đạo ôn lúa ở các tỉnh phía Bắc từ đó xác định được bộ nòi nấm đại diện sử dụng cho việc đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh cho các dòng/giống lúa. - Xác định được các gen kháng hiệu quả với bệnh đạo ôn lúa và bộ chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn tại các tỉnh phía Bắc. - Chọn tạo được dòng/giống lúa kháng bệnh đạo ôn mang nền di truyền của giống lúa BC15. 3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu Giống lúa BC15, các dòng lúa mang đơn gen kháng đạo ôn nhập nội từ IRRI, các mẫu bệnh đạo ôn cổ bông thu thập trên đồng ruộng, các gen kháng bệnh đạo ôn và các chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng. 3.2. Phạm vi nghiên cứu - Thu thập, phân lập và định danh các mẫu nấm bệnh đạo ôn cổ bông thu thập trên đồng ruộng từ các tỉnh phía Bắc.
2 - Xác định các gen kháng bệnh đạo ôn còn hiệu lực tại miền Bắc và các chỉ thị phân tử liên kết gen kháng. - Tích hợp các gen kháng bệnh đạo ôn hữu hiệu vào giống lúa BC15. - Đánh giá dòng/giống lúa BC15 mang đa gen kháng đạo ôn trong điều kiện nhân tạo và ngoài đồng ruộng. - Các thí nghiệm được tiến hành từ năm 2012, thời gian thực hiện chính từ năm 2016 đến năm 2020. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu đã cung cấp các thông tin về các nòi nấm bệnh đạo ôn gây độc tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam, các gen kháng bệnh đạo ôn còn hiệu lực và chọn tạo được các dòng lúa tích hợp hai gen kháng bệnh đạo ôn hữu hiệu Pik-h và Pi9(t). - Ý nghĩa thực tiễn Chọn tạo được dòng BC15 tích hợp 2 gen kháng hữu hiệu Pik-h và Pi9(t), mang các đặc điểm nông học tốt của giống BC15. Các dòng lúa tích hợp hai gen kháng bệnh đạo ôn Pik-h và Pi9(t) có thể sử dụng làm nguồn vật liệu cho các chương trình chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn trong nước. 5. New contributions of the thesis - Đã xác định được bộ nòi nấm đạo ôn lúa đại diện cho các tỉnh phía Bắc phục vụ cho các thí nghiệm đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh đạo ôn cho cây lúa. - Công trình đã bổ sung các kết quả nghiên cứu mới nhất về các gen kháng bệnh đạo ôn còn hiệu lực tại các tỉnh phía Bắc, xác định được bộ chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng phục vụ trực tiếp cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn bền vững tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam. - Đã chọn tạo thành công dòng lúa BC15 tích hợp hai gen kháng bệnh đạo ôn hữu hiệu Pik-h và Pi9(t), đồng thời vẫn giữ được các đặc điểm nông sinh học tốt của giống gốc BC15. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm 120 trang: Mở đầu 4 trang, (2) Tổng quan 36 trang, (3) Nội dung và phương pháp nghiên cứu 16 trang, (4) Kết quả nghiên cứu và thảo luận 62 trang, (5) Kết luận và đề nghị 2 trang, 125 TLTK, 33 bảng, 39 hình CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3 1.1. Tình hình sản xuất lúa gạo và ảnh hưởng của bệnh đạo ôn đến sản xuất lúa của Việt Nam 1.1.1. Tình hình sản xuất lúa gạo của Việt Nam Từ năm 2018 đến năm 2021 sản lượng lúa tăng mặc dù diện tích trồng lúa giảm. Tổng diện tích gieo trồng lúa cả năm 2021 đạt 7,24 triệu ha, tuy giảm khoảng 40 nghìn ha so với năm trước nhưng sản lượng lúa đạt 43,8 triệu tấn, tăng 1,1 triệu tấn. Sản xuất thâm canh cao giúp năng suất và sản lượng tăng tuy nhiên vẫn còn rất nhiều khó khăn để tạo được sản xuất lúa gạo bền vững trước những thách thức biến đổi khí hậu và sâu bệnh hại, đặc biệt là bệnh đạo ôn lúa thường xảy ra vào vụ đông xuân. 1.1.2. Ảnh hưởng của bệnh đạo ôn đến sản xuất lúa của Việt Nam Hàng năm, diện tích lúa bị nhiễm bệnh đạo ôn lá và đạo ôn cổ bông tăng lên nhanh chóng và mức độ tăng dần. Giống lúa BC15 bị nhiễm nhiều ở vụ Đông Xuân. Nhiều giải pháp đã được áp dụng có hiệu quả trong hạn chế sự gây hại của bệnh đạo ôn tuy nhiên việc sử dụng giống kháng bệnh đạo ôn bền vững vẫn là giải pháp hiệu quả nhất. Do vậy việc nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn trên nền giống lúa BC15 là rất cần thiết 1.2. Chỉ thị di truyền và ứng dụng chỉ thị di truyền trong chọn tạo giống cây trồng Việc ứng dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại (MABC) trong nghiên cứu và chọn tạo giống rất hiệu quả và ngày càng được ứng dụng rộng rãi với những ưu điểm sau: Tăng hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống (sàng lọc ngay từ giai đoạn nẩy mầm, giai đoạn cây con; có khả năng sàng lọc những tính trạng khó đánh giá bằng kiểu hình); phân biệt được trạng thái đồng hợp tử/ dị hợp tử của nhiều locut trong cùng một thế hệ; chọn lọc được đồng thời nhiều tính trạng trong cùng một thời gian; có thể chọn lọc ngay ở thời kỳ cây non, chọn ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3 do đó tiết kiệm thời gian và nguồn lực. Phương pháp MABC được ứng dụng để tích hợp gen quý từ loài hoang dại sang các giống gieo trồng phổ biến, hiệu quả trong việc chuyển locut gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay nhiều gen vào giống mới và rút ngắn quá trình chọn lọc. Chính vì vậy, MABC là phương pháp hỗ trợ hiệu quả cho chọn giống truyền thống và quyết định sự thành công trong quá trình chọn tạo giống. 1.3. Bệnh đạo ôn và nghiên cứu quản lý bệnh đạo ôn hại lúa
4 1.3.1. Nấm đạo ôn 1.3.2. Bệnh đạo ôn hại lúa 1.3.3. Phân loại nấm bệnh đạo ôn hại lúa Năm 1986, Leung và cs. đã sử dụng phương pháp isozyme để phân tích quần thể nấm gây bệnh đạo ôn. Tuy nhiên phương pháp này thiếu sự đa hình ở hầu hết các dòng phân lập bệnh do vậy không thích hợp để phân tích đa dạng di truyền quần thể bệnh đạo ôn [68]. Phân loại nấm bệnh đạo ôn dựa trên chỉ thị phân tử đã được ứng dụng trong các nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể nấm đạo ôn ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2005, Dư và Loan, 2009, Hà Viết Cường và cs., 2015, Đoàn Thị Hòa và cs., 2016) [12], [7], [6], [8]. Phân loại nấm gây bệnh đạo ôn dựa vào bộ dòng lúa chỉ thị đã được ứng dụng trong các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam (Fukuta và cs., 2014, Tanaka và cs., 2016; Khan và cs, 2016; Lã Tuấn Nghĩa và cs., 1999, Võ Thị Thu Ngân và cs., 2018) [42], [99], [60], [11], [10]. Dựa vào bộ giống chỉ thị này có thể xác định được các nòi nấm gây bệnh đạo ôn cũng như dự đoán được sự xuất hiện của các nòi nấm đạo ôn mới. 1.3.4. Các biện pháp quản lý bệnh đạo ôn Trong công tác phòng chống bệnh đạo ôn, việc sử dụng các giống lúa kháng đang rất được quan tâm nhờ hiệu quả kinh tế của chúng và điều này cũng giúp giảm bớt được việc sử dụng thuốc hóa học tràn lan trong nông nghiệp. Chiến lược chọn giống nên chú trọng đến việc tận dụng những gen kháng phổ rộng và quy tụ nhiều gen kháng và cả các QTL vào cùng một giống (Tian và cs., 2022) [101]. Thông qua phương pháp chọn giống truyền thống và chọn giống phân tử, nhiều giống lúa kháng bệnh đạo ôn đã được phát triển trong thời gian ngắn, dễ dàng, hiệu quả cao và chính xác. 1.4. Nghiên cứu gen kháng bệnh đạo ôn và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn 1.4.1. Các gen kháng bệnh đạo ôn trên lúa và các chỉ thị liên kết với gen kháng Đến nay có khoảng hơn 100 gen/QTLs quy định tính kháng bệnh đạo ôn đã được phát hiện trên hệ gen lúa (Jiang và cs., 2020, Younas và cs, 2023, Zampieri và cs., 2023) [58], [121], [122]. Các gen kháng nằm rải rác trên 11 nhiễm sắc thể, trừ nhiễm sắc thể số 3 (Singh và cs., 2015, Ashkani và cs., 2016 [98], [23]) có khoảng 64% các gen kháng được định vị trên nhiễm sắc thể số 6, 11, 12 và trên nhiễm sắc thể số 7 có ít gen kháng được định vị nhất (1%). Trên
5 nhiễm sắc thể 11, với tỷ lệ phần trăm gen kháng lớn nhất (25%), có ít nhất 27 gen kháng và các alen (Pik-h, Pi-hk1, Pi54, Pi-1(t), Pb1, Pise1, Pikur2, Pi38, Pik, Pif, Pi34, Pia, PiCO39 (t), Pilm2, Pi30(t), Pi7(t), Pi44(t), Pi49, Pik-m, Pi18(t), Pik-p, Pik-s, Pi47, Pikg, Pi60(t), Pi-1 (t) và Pi1. Trên nhiễm sắc thể 6 (18%) có ít nhất 19 gen kháng và các alen (Pigm (t), Pi22 (t), Pi26 (t), Pi27(t), Piz-5, Pi8, Pi13(t), Pi40 (t), Pi59 (t), Pi9, Pi2-1, Pi-tq1, Piz-t, Pid2, Pi25(t), Piz,Pi13, Pi2-2 và Pi50 (t) [23].Các kết quả nghiên cứu về gen kháng và chỉ thị liên kết với gen kháng bệnh đạo ôn sẽ là nguồn dữ liệu quý cho các nhà chọn giống có thể khai thác và ứng dụng vào chương trình chọn tạo giống. 1.4.2. Những nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn trên thế giới Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn mang lại hiệu quả cao trong chọn lọc và đánh giá nền di truyền. Các dòng mang hai hoặc ba gen kháng được đánh giá khả năng kháng bệnh đạo ôn tốt hơn hơn so với các dòng đơn gen (Xiao và cs. 2019, Thulasinathan và cs., 2023 [116], [103]…). 1.4.3. Những nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn tại Việt Nam Các tác giả đã nghiên cứu chọn tạo ra một số dòng lúa mang một hoặc hai gen kháng bệnh đạo ôn bằng phương pháp chọn giống nhờ chị thị phân tử và lai trở lại (Phạm Thiên Thành và cs năm 2020, 2021, Nguyễn Thị Minh Nguyệt và cs. 2021 [16], [17], [14]…). Những công trình công bố tại Việt Nam về nghiên cứu tính kháng và ứng dụng chỉ thị phân tử để cải tiến tính kháng bệnh đạo ôn trên cây lúa đã gặt hái được những kết quả đáng ghi nhận. Tuy nhiên, đa số các giống lúa mới chỉ được tích hợp một gen kháng đạo ôn. Do vậy, việc tiếp cận với những thành quả nghiên cứu trước đây để định hướng nghiên cứu, tích hợp đa gen kháng bệnh đạo ôn vào các giống lúa phổ biến sẽ góp phần chọn tạo và phát triển các giống lúa chất lượng, kháng bệnh đạo ôn bền vững, đáp ứng với yêu cầu sản xuất trong nước. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu thực vật - Các mẫu bệnh đạo ôn cổ bông lúa thu thập từ 28 tỉnh phía Bắc. - Bộ 25 dòng lúa chỉ thị bao gồm 23 dòng đơn gen mang 21 gen kháng đạo ôn: Pish, Pib, Pit, Pia, Pii, Pi3, Pi5(t), Pik-s, Pik-m, Pi1, Pik-p, Pi7(t), Pi9, Piz, Piz-5, Piz-t, Pita-2, Pita, Pi12(t), Pi19(t) và
6 Pi20(t) (Tsunematsu và cs., 2000) [105], 2 dòng NILs mang đơn gen Pik-h và Pik trên nền di truyền của giống LTH (Yanoria và cs., 2010) [119] và giống lúa chuẩn nhiễm LTH do JIRCAS cung cấp; - 7 dòng NILs mang đơn gen kháng bệnh đạo ôn trên nền giống lúa chuẩn nhiễm CO39 và dòng đơn gen IRBL9-W do IRRI cung cấp; dòng lúa AH3 mang gen kháng đạo ôn Pi9(t) do INTA cung cấp; - Giống lúa BC15 được lưu giữ tại Bộ môn Sinh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp; Các chỉ thị phân tử và hóa chất: + 14 chỉ thị liên kết với các gen kháng đạo ôn để phục vụ cho việc sàng lọc các cá thể mang gen kháng. + 758 chỉ thị phân tử nằm rải rác trên toàn bộ 12 NST của hệ gen lúa để phục vụ cho việc chọn lọc nền di truyền. - Hóa chất phục vụ thí nghiệm sinh học phân tử, phân lập, nuôi cấy nấm đạo ôn. 2.2. Research contents - Thu thập, đánh giá và định danh các nòi nấm gây bệnh đạo ôn gây hại ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam. - Xác định các gen kháng bệnh đạo ôn còn hiệu lực tại các tỉnh phía Bắc và chọn lọc bộ chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh đạo ôn. - Xây dựng và chọn tạo nguồn vật liệu chọn giống - Tích hợp hai gen kháng bệnh đạo ôn hữu hiệu vào giống lúa BC15 - Phát triển, chọn lọc dòng thuần BC15 mang hai gen kháng bệnh đạo ôn Pik-h, Pi9(t) 2.3. Địa điểm nghiên cứu - Địa điểm thu thập mẫu bệnh đạo ôn tại 28 tỉnh phía Bắc Việt Nam. - Các thí nghiệm đánh giá, định danh các nòi nấm gây bệnh đạo ôn gây hại, xác định các gen kháng bệnh đạo ôn, đánh giá tính kháng bệnh đạo ôn của các dòng/giống lúa trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo và chất lượng cơm gạo của các dòng/giống lúa được thực hiện tại phòng thí nghiệm, hệ thống nhà lưới của Viện Di truyền Nông nghiệp, - Các thí nghiệm đánh giá đặc điểm nông học, mức độ nhiễm sâu bệnh hại của các dòng/giống lúa được tiến hành tại ruộng thí nghiệm tại xã Lại Yên, huyện Hoài Đức, Hà Nội, Hà Nội
7 2.4. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thu thập, đánh giá và định danh nấm đạo ôn lúa theo Hayashi và cs., 2009 [47] - Phương pháp xác định các gen kháng bệnh đạo ôn còn hiệu lực dựa trên kết quả đánh giá độc tính của các nòi nấm đạo ôn thu thập. - Phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) + Phương pháp lai tạo, chọn lọc cá thể, phát triển quần thể tích hợp đa gen kháng bệnh đạo ôn + Phương pháp sinh học phân tử: tách chiết ADN theo Wang và cs. (1993) [109]. Kỹ thuật PCR được tiến hành trên máy Mastercycler® pro- Eppendorf: tổng thể tích 15 µl, gồm: 5µl ADN, 0,15µM mồi, 0,2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR, 2,5mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq TaKaRa. Điều kiện phản ứng: 940C - 5'; 35 chu kỳ (940C - 30", 550C - 30", 720C - 1'30"; 720C - 7'); lưu giữ 40C. Sản phẩm PCR được điện di gel agarose 2,5%, thu nhận và phân tích kết quả. + Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng và theo dõi, đánh giá các chỉ tiêu thí nghiệm: được áp dụng theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về khảo nghiệm giá trị canh tác và giá trị sữ dụng (Quy chuẩn khảo nghiệm VCU) của giống lúa, QCVN 01- 55:2011/BNNPTNT [2]. + Thí nghiệm đánh giá các dòng lúa triển vọng được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ, 3 lần lặp lại và diện tích ô thí nghiệm 10m2 (2m x 5 m). + Phương pháp đánh giá chất lượng cơm theo: TCVN 8373:2010. + Phương pháp đánh giá khả năng kháng/ nhiễm với bệnh đạo ôn của các dòng/ giống lúa theo IRRI, 2013 - Phương pháp tính toán, xử lý số liệụ: + Số liệu thí nghiệm đồng ruộng được xử lý theo chương trình IRRISTAT 5.0. + Phân tích nền di truyền được xử lý bằng phần mềm Graphical Genotypes 2 (GGT2.0). + Bản đồ chỉ thị phân tử được vẽ tự động bằng phần mềm MapChart version 2.2 (Voorrips và cs., 2006). Các bước thực hiện đề tài luận án được sơ đồ hóa tại Hình 2.2.
8 Hình 2.2. Sơ đồ các bước triển khai thực hiện luận án CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập, đánh giá và định danh các nòi nấm bệnh đạo ôn gây hại ở các tỉnh phía bắc 3.1.1. Thu thập, phân lập và lưu giữ mẫu nấm bệnh đạo ôn ở các tỉnh phía Bắc 277 mẫu bệnh đạo ôn cổ bông đã được thu thập ở 28 tỉnh thành phía Bắc Việt Nam. Trong đó số mẫu nấm bệnh đạo ôn cổ bông thu được nhiều nhất tại đồng bằng sông Hồng (104 mẫu), Trung du miền
9 núi phía Bắc (89 mẫu) và Bắc Trung Bộ (84 mẫu). Từ 277 mẫu cổ bông lúa nhiễm đạo ôn thu thập đã phân lập, lưu giữ và bảo quản được 206 mẫu bào tử đơn nấm bệnh. 3.1.2. Đánh giá độc tính và định danh các nòi nấm đạo ôn phổ biến tại các tỉnh phía Bắc Kết quả đánh giá độc tính của 206 mẫu nấm bệnh đạo ôn cho thấy, các mẫu nấm có biểu hiện độc tính khác nhau đối với 25 dòng lúa chỉ thị và giống LTH, tỷ lệ số mẫu gây độc trên các dòng lúa dao động mang đơn gen kháng và giống LTH từ 3,4 đến 100%. Tất cả các mẫu nấm đều có độc tính cao với giống LTH. Tỷ lệ cao số mẫu gây độc trên 11 dòng lúa chỉ thị mang đơn gen kháng tương ứng Pib, Pit, Pia, Pii, Pi3, Pi5(t), Pi12(t), Pi19(t), Pi20(t), Piz, Piz(t) và Pik-s cao dao động từ 49,03 đến 93,69%. Tỷ lệ số mẫu gây độc trên 6 dòng lúa mang đơn gen kháng Pish, Pik-m, Pi1, Pik-h, Pi9(t) và Pita2 (Pi) khá thấp, chưa đến 6%, cụ thể IRBLsh-B (4,4%), IRBLkm-Ts (4,9%), IRBL1-CL (5,3%), IRBLkh-K3[LT] (3,4%), IRBL9-W (5,3%) và IRBLta2-Pi (4,4%). Trong khi tỷ lệ số mẫu gây độc trên 7 dòng chỉ thị mang đơn gen kháng tương ứng Pik, Pik-p, Pi7(t), Piz-5, Pita-2(Re), Pita (K1) và Pita (CP1) dao động từ 6,31 đến 24,76%. Thông qua kiểu phản ứng bệnh của 5 nhóm dòng đơn gen, 206 mẫu nấm được định danh thành 135 nòi, trong đó nòi phổ biến nhất là U63-i7-k100-z04-ta403 gồm 36 mẫu nấm, nòi U63-i7-k100-z05- ta403 gồm 14 mẫu nấm, nòi U63-i7-k100-z01-ta403 gồm 7 mẫu, nòi U63-i7-k100-z00-ta403 gồm 5 mẫu, các nòi còn lại chỉ có 1 - 3 mẫu nấm. Đây là dữ liệu quan trọng để nghiên cứu sự phân bố quần thể nấm bệnh đạo ôn tại các tỉnh phía Bắc, theo dõi sự biến đổi về thành phần nòi và định hướng được cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bền vững cho các vùng trồng lúa tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam. Kết quả định danh 206 mẫu nấm bệnh đã cho thấy sự đa dạng của các nòi nấm gây bệnh đạo ôn tại các tỉnh phía Bắc. Từ tên định danh của các nòi nấm, có thể nhận diện chính xác kiểu phản ứng bệnh của các đơn gen kháng bệnh đạo ôn. Kết quả phân tích cho thấy nòi phổ biến nhất là U63-i7-k100-z04-ta403 có thể gây độc trên 11 dòng mang đơn gen kháng Pib, Pit, Pia, Pii, Pi3, Pi5(t), Pik-s, Piz-t, Pi12(t), Pi19(t) và Pi20(t). Đây chính là các gen kháng đã bị mất hiệu lực tại các tỉnh phía Bắc. Nòi phổ biến thứ 2 là U63-i7-k100- z05-ta403 có thể gây độc trên 11 dòng mang các gen kháng bệnh đạo ôn nói trên, đồng thời cũng gây độc cho dòng mang gen Piz. Đây là
10 dữ liệu quan trọng để nghiên cứu sự phân bố quần thể nấm bệnh đạo ôn tại các tỉnh phía Bắc, theo dõi sự biến đổi về thành phần nòi và định hướng được cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bền vững cho các vùng trồng lúa tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam. Từ kết quả đánh giá độc tính của 206 mẫu nấm đạo ôn thu thập từ 28 tỉnh phía Bắc Việt Nam, 24 nòi nấm: I19 (Hà Nội), I95 (Sơn La), I165 (Cao Bằng), I185 (Quảng Bình), I106 (Phú Thọ), I118 (Thái Nguyên), I143 (Điện Biên), I221 (Bắc Cạn), I126 (Điện Biên), I128 (Điện Biên), I127 (Điện Biên), I186 (Quảng Trị), I201 (Quảng Bình), I45 (Ninh Bình), I175 (Hà Tĩnh), I113 (Vĩnh Phúc), I147 (Hòa Bình), I2a (Hà Nội), I148 (Hòa Bình), I194 (Quảng Trị), I140 (Lai Châu), I75 (Thái Bình), I219 (Bắc Cạn) và I123 (Điện Biên) đã được chọn lọc, theo tiêu chí mang tính đại diện, giúp cho việc dễ dàng phân loại, dự đoán sự có mặt của các gen kháng đã biết và các gen kháng mới có thể có mặt trong nền di truyền của các giống lúa nghiên cứu, qua đó phục vụ hiệu quả cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn cũng như phân tích đa dạng và phát hiện nguồn gen lúa kháng bệnh đạo ôn. Bộ 24 nòi nấm đại diện được sử dụng trong các thí nghiệm đánh giá tính kháng của các dòng lúa vật liệu chọn giống trong các nội dung sau. 3.2. Xác định các gen kháng bệnh đạo ôn hiệu quả tại các tỉnh phía bắc và chọn lọc các chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng bệnh đạo ôn 3.2.1. Xác định các gen kháng bệnh đạo ôn hiệu quả tại các tỉnh phía Bắc thông qua đánh giá kiểu hình tính kháng với các nòi nấm đạo ôn Kết quả phân tích độc tính của 206 mẫu nấm đạo ôn tại các tỉnh phía Bắc của Việt Nam đã xác định được các dòng lúa chỉ thị mang đơn gen kháng IRBLkh-K3, IRBLsh-S, IRBLta2-Pi, IRBLkm-Ts, IRBL1-CL và IRBL9-W có khả năng kháng tốt với đa số các nòi nấm đưa vào đánh giá: Dòng lúa IRBLkh-K3[LT] (mang gen Pik-h) kháng 199/206 nòi (96,6%); hai dòng lúa IRBLsh-S (mang gen Pish, IRBLta2-Pi (mang gen Pita) đều kháng được 197/206 nòi (95,6%); dòng lúa IRBLkm-Ts (mang gen Pik-m) kháng được 196/206 nòi (95,1%); dòng IRBL1-CL (mang gen Pi1) và IRBL9-W (mang gen Pi9(t)) đều kháng được 195/206 nòi (94,7%). Kết quả này cho thấy 6 gen kháng Pik-h, Pish, Pita2, Pik-m, Pi1 và Pi9(t) có khả năng kháng hiệu quả với bệnh đạo ôn tại các vùng sinh thái phía Bắc của Việt Nam. Ngoài ra 5 gen kháng Pik, Pik-p, Pi7, Piz-5, Pita cũng biểu
11 hiện tính kháng với phần lớn các nòi nấm đạo ôn (Hình 3.4). Kết quả phân tích cũng cho thấy các gen kháng còn hiệu lực ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam thuộc locut Piz trên NST số 6, locut Pik trên NST số 11 và locut Pita trên NST số 12. Do vậy, việc tìm kiếm các chỉ thị phân tử liên kết gen kháng, cho đa hình giữa các giống mang gen và giống nhận gen là rất cần thiết cho công tác chọn tạo giống dựa vào chỉ thị phân tử. 3.2.2. Chọn lọc bộ chỉ thị phân tử liên kết phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn 14 chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng bệnh đạo ôn nằm trên 2 locut Piz mang gen Pi9(t) và locut Pik mang gen Pik-h sẽ được sử dụng trong thí nghiệm đánh giá đa hình ADN giữa các dòng/giống lúa mang đơn gen kháng và giống lúa BC15 phục vụ mục đích nghiên cứu cải tiến tính kháng bệnh đạo ôn cho giống lúa BC15 (Hình 3.5, Hình 3.6, Hình 3.7). Hình 3.5. Kết quả khảo sát đa hình của các dòng/ giống lúa vật liệu với các chỉ thị liên kết với gen kháng Piz-5 và Pi9(t) Từ trái qua phải: Thang ADN chuẩn 50bp, BC15, S5: IRBLz5- CA[CO], R20: IRBL9-W Hình 3.6. Kết quả khảo sát đa hình Hình 3.7. Kết quả khảo sát đa hình của của các dòng/giống lúa với các chỉ các dòng/ giống lúa vật liệu với các chỉ thị RM1233, RM206, RM224, thị liên kết k4761F2/R, k6816, RM2136 RM144, RM4112 và RM7654B Từ trái qua phải: Thang ADN chuẩn 50bp, BC15, S8: IRBL1-CL[CO], S9: IRBL7-M[CO], S10:IRBLk-Ku[CO], S12: IRBLkh-K3[CO], S13: IRBLkm-Ts[CO], S14: IRBLkp-K60[CO] Kết quả phân tích đa hình ADN giữa các dòng lúa mang đơn gen kháng và giống lúa BC15 đã xác định được bộ chỉ thị phân tử liên kết gen kháng phục vụ nghiên cứu cải tiến tính kháng bệnh đạo ôn: chỉ thị RM244 (Pik-h). Chỉ thị pB8 (Pi9(t)) (Chỉ thị pB8 liên kết đặc hiệu với gen kháng Pi9(t), băng sản phẩm PCR kích thước ~500 bp chỉ xuất hiện ở giống IRBL9-W mang gen kháng và không xuất hiện băng sản phẩm PCR ở giống BC15 (Wen và cs., 2011)).
12 3.3. Xây dựng và chọn tạo nguồn vật liệu chọn giống 3.3.1. Lựa chọn bố mẹ, chọn lọc bộ chỉ thị phân tử cho đa hình và lai tạo quần thể F1 3.3.1.1. Chọn lọc nguồn vật liệu bố mẹ cho lai tạo Kết quả nghiên cứu ở nội dung trên đã xác định được 2 gen Pi9(t) và Pik-h có khả năng kháng với lần lượt là 94,7% và 96,6% số nòi nấm bệnh đạo ôn gây hại ở các tỉnh phía Bắc, do vậy nguồn vật liệu chọn tạo giống được lựa chọn cho nghiên cứu này là dòng IRBLkh-K3[CO] mang gen Pik-h và dòng AH3 mang gen Pi9(t). Dòng IRBLkh-K3[CO] được nhập nội từ IRRI, kết quả đánh giá trong vụ xuân 2014 cho thấy: Dòng có số bông/khóm cao đạt 10,2 bông, số hạt/bông đạt 122 hạt, tỷ lệ lép cao 16,2%, năng suất thực thu của dòng đạt 5,5 tấn/ha. Dòng AH3 được nhập nội từ INTA, kết quả đánh giá trong vụ xuân 2014 cho thấy: Dòng có thời gian sinh trưởng 128 ngày, tương đương với giống BC15 (130 ngày), có số bông/khóm đạt 6,8 bông cao hơn giống BC15 (5,6 bông/khóm), số hạt/bông đạt 180 hạt và năng suất thực thu của dòng đạt 7,9 tấn/ha cao hơn năng suất thực thu của giống BC15 (5,7 tấn/ha). Trong điều kiện đồng ruộng, thí nghiệm có sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nhưng không phun thuốc phòng trừ đạo ôn. Kết quả theo dõi mức độ nhiễm sâu bệnh cho thấy hai dòng lúa IRBLkh-K3[CO] và AH3, chọn làm vật liệu lai tạo có khả năng kháng tốt với bệnh đạo ôn cổ bông (điểm 1), trong khi giống lúa BC15 nhiễm điểm 7. 3.3.1.2. Chọn lọc bộ chỉ thị phân tử đa hình giữa giống gốc BC15 và các dòng vật liệu chọn giống Tổng số 758 chỉ thị khảo sát đã xác định được 81 chỉ thị, tương ứng 10,7 % cho kết quả đa hình giữa BC15 và và AH3, 86 chỉ thị, tương ứng 11,3% cho kết quả đa hình giữa BC15 và IRBLkh- K3[CO]. Bộ chỉ thị phân tử này sẽ được sử dụng để phân tích nền di truyền sẽ được sử dụng để phân tích nền di truyền của các cá thể con lai trong các quần thể lai trở lại. Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các giống lúa với chỉ thị phân tử SSR trên gel agarose 2,5% Ghi chú: P1: BC15, P2: IRBLkh-K3[CO], P3: AH3
13 3.3.1.3. Lai tạo quần thể F1 Trong vụ Xuân 2014, 2 tổ hợp lai giữa BC15 x AH3 và BC15 x IRBLkh-K3[CO] đã được thực hiện, tạo ra 2 quần thể F1 với số lượng hạt lai lần lượt là 50 và 70 hạt lai. Kết quả đã chọn được 15 cây lai F1 của mỗi tổ hợp để tiếp tục lai tạo các thế hệ tiếp theo. 3.3.2. Lai tạo, đánh giá, chọn lọc cá thể con lai mang gen kháng trong các quần thể lai trở lại 3.3.2.1. Lai tạo, đánh giá, chọn lọc cá thể trong các quần thể lai trở lại Từ vụ Mùa 2014 đến vụ Mùa Xuân 2016, các phép lai trở lại giữa các cá thể mang gen kháng với giống lúa BC15 được thực hiện để tạo ra các quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1, BC4F1. Qua mỗi thế hệ, thí nghiệm đánh giá sàng lọc cá thể mang gen kháng mục tiêu và sàng lọc nền di truyền được thực hiện để chọn lọc được những cá thể mang gen kháng đạo ôn mục tiêu, đồng thời mang nền di truyền giống với giống gốc BC15 (Bảng 3.11, Bảng 3.12). Bảng 3.11. Kết quả chọn lọc các cá thể trong các quần thể lai trở lại [(BC15 x AH3) x BC15] Vụ Quần thể Số lượng Số lượng cá Số cá thể mang lai trở lại cá thể thể mang gen nền di truyền (BC4F1) kháng Pi9(t) giống với BC15 Mùa 2014 BC1F1 150 70 5 Xuân 2015 BC2F1 100 45 5 Mùa 2015 BC3F1 120 56 3 Xuân 2016 BC4F1 80 38 5 Bảng 3.12. Kết quả chọn lọc các cá thể trong các quần thể lai trở lại [(BC15 x IRBLkh-K3[CO]) x BC15] Vụ Quần thể Số lượng Số lượng cá thể Số cá thể mang lai trở lại cá thể mang gen kháng nền di truyền (BC4F1) Pi9(t) giống với BC15 Mùa 2014 BC1F1 160 75 4 Xuân 2015 BC2F1 130 61 5 Mùa 2015 BC3F1 100 47 4 Xuân 2016 BC4F1 90 40 5
14 Qua 4 vụ lai tạo, chọn lọc, sàng lọc nền di truyền của các quần thể lai trở lại đã thu được 5 cá thể BC4F1 mang gen kháng Pi9(t), mang nền di truyền giống với BC15 (98,2% trên tổng số 81 chỉ thị phân tích) và 5 cá thể BC4F1 mang gen kháng Pik-h, mang nền di truyền giống với BC15 (98,1% trên tổng số 86 chỉ thị phân tích). Các cá thể này được tự thụ và phát triển thành thế hệ BC4F2 trong vụ tiếp theo. 3.3.2.2. Tự thụ, chọn tạo dòng lúa mang đơn gen kháng đạo ôn hữu hiệu và mang nền di truyền của giống lúa BC15 Thí nghiệm gieo trồng, tự thụ, chọn tạo dòng lúa mang đơn gen kháng được thực hiện trong vụ Mùa 2016, kết quả đã tạo ra được 2 quần thể BC4F2 (BC15/AH3) và BC4F2 (BC15/ IRBLkh-K3[CO]) với số lượng cá thể lần lượt là 200 và 210 cá thể. Những quần thể này tiếp tục được sàng lọc bằng chỉ thị phân tử và đánh giá kiểu hình tính kháng để chọn lọc ra những cá thể mang đơn gen kháng trong các nội dung tiếp theo. Như vậy, kết quả sàng lọc 2 quần thể BC4F2 tích hợp đơn gen kháng đạo ôn đã chọn lọc được 3 cá thể mang gen Pi9(t) và 4 cá thể mang gen Pik-h ở trạng thái đồng hợp tử. Các cá thể này đều mang nền di truyền giống gốc BC15, có điểm kháng ≤ 3 trong lây nhiễm nhân tạo. Các cá thể này được tiếp tục tự thụ tạo quần thể BC4F3 và đánh giá trong vụ Xuân 2017 để chọn lọc vật liệu cho phép lai tích hợp hai gen kháng. 3.4. Tích hợp hai gen kháng bệnh đạo ôn hữu hiệu vào giống lúa BC15 3.4.1. Đánh giá, chọn lọc nguồn vật liệu cho phép lai tích hợp hai gen kháng, chọn lọc bộ chị thị phân tử cho phân tích nền di truyền 3.4.1.1. Xác nhận sự có mặt của gen kháng và đánh giá đặc điểm nông học, tiềm năng năng suất của vật liệu chọn giống Trong vụ xuân 2017, hai dòng lúa thế hệ BC4F3 BC15-Pi9(t) và BC15-Pik-h và giống lúa BC15 đã được gieo trồng để theo dõi, đánh giá các đặc điểm nông học, năng suất, mức độ nhiễm sâu bệnh trên đồng ruộng tại xã Lại Yên, Hoài Đức, Hà Nội đồng thời xác nhận sự có mặt của gen kháng mục tiêu trong các dòng lúa vật liệu. (Hình 3.10, Hình 3.11, Bảng 3.14). Kết quả phân tích kiểu gen và đánh giá các đặc điểm nông học, năng suất của các dòng/giống lúa được tổng hợp tại Bảng 3.14 cho
15 thấy: dòng lúa BC15-Pik-h mang gen Pik-h ở trạng thái đồng hợp tử, dòng lúa BC15-Pi9(t) mang gen Pi9(t) và cả hai dòng lúa đều mang một số đặc điểm nông học, các chỉ tiêu cấu thành năng suất tương tự giống BC15. Do mang các gen kháng bệnh đạo ôn hiệu quả nên 2 dòng lúa BC15-Pik-h và BC15-Pi9(t) không bị nhiễm bệnh đạo ôn trong vụ Xuân 2017 (điểm 1). Bảng 3.14. Các đặc điểm nông học, các yếu tố cấu thành năng suất và mức độ nhiễm sâu bệnh của các dòng/giống vật liệu trong vụ Xuân 2017 (Hoài Đức, Hà Nội) TT Tên dòng/giống BC15 BC15-Pi9(t) BC15-Pik-h Chỉ tiêu 1 Sức sống mạ (điểm) 5 5 5 2 Độ dài giai đoạn trỗ (điểm) 5 5 5 3 Độ thuần đồng ruộng (điểm) 1 3 3 4 Độ thoát cổ bông (điểm) 1 1 1 5 Độ cứng cây 1 1 1 6 Độ tàn lá 5 5 5 7 Độ rụng hạt 1 1 1 8 TGST (ngày) 134 135 137 9 Chiều cao cây (cm) 115 117 118 10 Số bông/ khóm 5,8 6,2 6,0 11 Số hạt/ bông 201 170 175 12 Tỷ lệ hạt lép (%) 27,5 10,8 11,2 13 Khối lượng 1000 hạt (g) 23,8 24,5 24,2 14 Năng suất thực thu (tạ/ha) 58,2 68,0 69,3 15 Bệnh đạo ôn cổ bông (điểm) 7 1 1 16 Bệnh bạc lá (điểm) 0-3 0-3 0-3 17 Rầy nâu (điểm) 0-1 0-1 0-1 18 Gen kháng đạo ôn - Pi9(t) Pik-h 3.4.1.2. Chọn lọc bộ chỉ thị phân tử đa hình giữa giống gốc BC15 và các dòng vật liệu chọn giống Thí nghiệm khảo sát chỉ thị đa hình giữa các giống lúa bố mẹ đã được trình bày trong mục 3.3.1.2. Trong tổng số 758 chỉ thị phân tử SSR phân bố trên 12 NST của hệ gen lúa đã được sử dụng để khảo
16 sát đa hình giữa ba giống lúa bố mẹ BC15, AH3 và IRBLkh-K3[CO] đã xác định được 61 chỉ thị, tương ứng 8,0%, cho kết quả đa hình giữa ba giống lúa BC15, IRBLkh-K3[CO] và AH3. Bộ chỉ thị phân tử này sẽ được sử dụng để phân tích nền di truyền của dòng lúa BC15-Pi9(t), BC15-Pik-h và chọn lọc các cá thể mang nền di truyền của giống BC15 làm vật liệu cho phép lai tích hợp hai gen kháng đạo ôn. 3.4.1.3. Phân tích nền di truyền các dòng vật liệu chọn giống bằng chỉ thị phân tử Để chọn lọc các cá thể ưu tú làm vật liệu lai tạo tích hợp hai gen kháng, 20 cá thể của dòng lúa BC15-Pik-h và 20 cá thể của dòng lúa BC15-Pi9(t) đã được phân tích nền di truyền với 61 chỉ thị phân tử cho đa hình trên 12 NST. Kết quả đã chọn được hai cá thể A1.9 mang gen Pik-h, mang nền di truyền giống với BC15 (99,6% với 61 chỉ thị khảo sát) và cá thể A2.1 mang gen Pi9(t), mang nền di truyền giống với BC15 (99,1% với 61 chỉ thị khảo sát) làm vật liệu lai tạo thế hệ F1 tích hợp hai gen kháng bệnh đạo ôn. 3.4.2. Kết quả tích hợp hai gen kháng bệnh đạo ôn Pik-h, Pi9(t) vào giống lúa BC15 3.4.2.1. Lai tạo quần thể, phân tích kiểu gen và chọn lọc cá thể mang hai gen kháng đạo ôn Pik-h, Pi9(t) Hai cá thể BC15-Pik-h A1.9 và BC15-Pi9(t) A2.1 được gieo trồng trong vụ Mùa năm 2017, lai tạo thế hệ F1, kết quả lai tạo được 20 cá thể F1. Với mục đích là nhận thêm nền di truyền từ giống BC15 cho nguồn vật liệu chọn tạo giống, 20 cá thể F1 tiếp tục được sử dụng làm vật liệu lai trở lại với giống BC15 để tạo quần thể tích hợp gen trong vụ Xuân 2018. Quần thể tích hợp hai gen kháng gồm 125 cá thể được gieo trồng trong nhà lưới Viện Di truyền Nông nghiệp. Để xác định sự có mặt của hai gen kháng bệnh đạo ôn Pik-h và Pi-9(t) trong quần thể, chỉ thị RM224 liên kết chặt với gen Pik-h và chỉ thị pB8 liên kết đặc hiệu gen Pi9(t) được sử dụng để phân tích kiểu gen. Kết quả phân tích 125 cá thể đã xác định được 30 cá thể mang cả hai gen Pik-h và Pi-9(t)(Hình 3.21, Hình 3.22).
17 Hình 3.21. Kết quả phân tích kiểu gen Hình 3.22. Kết quả phân tích kiểu gen kháng của quần thể tích hợp hai gen kháng của quần thể tích hợp hai gen kháng với chỉ thị RM224 liên kết gen Pik- kháng với chỉ thị pB8 liên kết đặc hiệu h. với gen Pi9(t) Ghi chú: thang ADN chuẩn Ghi chú: 1-20: các mẫu ADN của quần thể, 50bp, AH3, BC15, 1-20: các mẫu ADN của BC15, IRBLkh-K3[CO], thang ADN chuẩn quần thể 50bp 30 cá thể này tiếp tục được đánh giá nền di truyền với 61 chỉ thị phân tử đa hình trên 12 NST. Kết quả phân tích kiểu gen được xử lý bằng phần mềm GGT v. 2.0 đã xác định được 6 cá thể có nền di truyền giống với BC15 nhất (99,6 %) trên tổng số 61 chỉ thị được phân tích. Sáu cá thể này được đánh số B1.1 đến B1.6 sẽ tiếp tục được tự thụ thế hệ tiếp theo. 3.4.2.2. Phát triển quần thể tự thụ, phân tích kiểu gen quần thể và chọn lọc cá thể mang hai gen kháng đạo ôn Pik-h và Pi9(t) Sáu cá thể (B1.1, B1.2, B1.3, B1.4, B1.5 và B1.6) được xác định là mang hai gen kháng đạo ôn Pik-h và Pi-9(t) và mang nền di truyền giống với BC15 của thí nghiệm trên tiếp tục được gieo trồng và tự thụ phát triển thành quần thể tích hợp hai gen kháng (310 cá thể) trong vụ Mùa 2018. Kết quả phân tích kiểu gen của 310 cá thể đã xác định được 27 cá thể mang hai gen Pik-h và gen Pi-9(t) ở trạng thái đồng hợp tử (Hình 3.25, Hình 3.26). Hình 3.25. Kết quả phân tích kiểu gen kháng của các cá thể với chỉ thị Hình 3.26. Kết quả phân tích kiểu RM224 liên kết gen Pik-h gen kháng của các cá thể với chỉ thị Ghi chú: 1 Ghi chú: 1-20: các cá thể pB8 liên kết đặc hiệu với gen Pi9(t) của quần thể, BC15, IRBLkh-K3[CO], Ghi chú: Ghi chú: AH3, BC15, 1-20: các cá thang ADN chuẩn 50bp thể của quần thể, thang ADN chuẩn 50bp 27 cá thể tích hợp 2 gen kháng được được đánh số từ B2-1 đến B2-27 và tiếp tục theo dõi các đặc điểm nông học, các yếu tố cấu thành năng suất trong vụ Mùa 2018. Kết quả đã chọn được 10 cá thể
18 B2-6, B2-9, B2-10, B2-14, B2-17, B2-19, B2-20, B2-23, B2-25 và B2-27 được tích hợp hai gen Pik-h và Pi-9 (t), có đặc điểm nông học và năng suất cao tương đương với giống BC15 được tiếp tục gieo trồng và tự thụ phát triển thành 10 quần thể (ký hiệu B3.1 đến B3.10) trong vụ Xuân 2019. Trong vụ Xuân 2019, thí nghiệm đánh giá kiểu hình tính kháng bằng lây nhiễm nhân tạo, theo dõi đặc điểm nông học của các dòng lúa tích hợp hai gen kháng bệnh đạo ôn được tiến hành song song với thí nghiệm phân tích kiểu gen kháng Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên 10 dòng lúa tích hợp cả 2 gen kháng Pik-h+Pi9(t)) đã cho thấy các dòng lúa này biểu hiện khả năng kháng tốt hơn so với các dòng mang đơn gen kháng. Trong đó, có 3 dòng B3.2, B3.4 và B3.7 biểu hiện tính kháng điểm < 5 đối với toàn bộ 24 nòi nấm đại diện, 4 dòng B3.3, B3.5, B3.6 và B3.8 biểu hiện nhiễm trung bình điểm 5 với nòi I126 (Điện Biên) và kháng điểm ≤ 3 với 23 nòi nấm còn lại. Hai dòng B3.9 và B3.10 biểu hiện nhiễm trung bình điểm 5 với 2/24 nòi nấm đại diện, riêng dòng B3.1 biểu hiện nhiễm trung bình điểm 5,0 - 5,5 với 4/24 nòi. Kết quả này đã cho thấy việc tích hợp 2 gen kháng hữu hiệu vào cùng một nền di truyền đã cải thiện rõ rệt khả năng kháng bệnh đạo ôn cho giống lúa gốc ban đầu, đồng thời cũng thể hiện tính kháng tốt hơn so với các dòng mang đơn gen kháng. Hình 3.27. Kết quả thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo các dòng lúa tích hợp hai gen kháng đạo ôn với nòi nấm đạo ôn đại điện (vụ Xuân 2019) Song song với thí nghiệm đánh giá kiểu hình tính kháng, kiểu gen của 100 cá thể ngẫu nhiên đã được tách chiết ADN và phân tích PCR với các chỉ thị liên kết gen kháng mục tiêu. Kết quả phân tích cho