Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa BT7

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài " " nhằm tạo dòng lúa BT7 mang đột biến chính xác trên SW14-BT bằng hệ thống CRISPR/Cas9; Sàng lọc dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT tăng cường tính kháng với vi khuẩn Xoo Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa BT7

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------------------- Vũ Hoài Sâm NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/Cas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 94.20.201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội - 2023
Công trình được hoàn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS) Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Phạm Xuân Hội 2. TS. Nguyễn Duy Phương Phản biện 1: Phản biện 2: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS) ...... ngày .. tháng... năm... Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư Viện Quốc gia 2. Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Công nghệ chỉnh sửa gen cho phép cải biến DNA hệ gen một cách chính xác và hiệu quả, bằng cách sử dụng các nuclease để tạo ra các đột biến đứt gãy sợi đôi tại vị trí xác định. CRISPR-Cas9 là công cụ chỉnh sửa gen tiên tiến, được ứng dựng phổ biến hiện nay, với cấu trúc đơn giản mà hiệu quả cao. Việc ứng dụng công nghệ này đã tạo ra một cuộc cách mạng trong khoa học sự sống nói chung và khoa học nông nghiệp nói riêng, mang lại cơ hội mới trong chọn giống cây trồng. Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (gọi tắt là Xoo) gây ra những thiệt hại nặng nề cho sản xuất lúa gạo ở Việt Nam. Sử dụng giống lúa kháng là cách tốt nhất để đối phó với bệnh bạc lá. Giống lúa Bắc thơm 7 (BT7) là một giống chủ lực ở miền Bắc với ưu điểm như chất lượng gạo thơm, ngon, năng suất cao. Tuy nhiên, giống này rất mẫn cảm với bệnh bạc lá (vụ Mùa). Vì vậy, nghiên cứu tạo giống lúa BT7 kháng bạc lá là yêu cầu tất yếu, giúp đảm bảo tính bền vững và hiệu quả trong sản xuất lúa gạo ở khu vực phía Bắc. Xoo xâm nhiễm vào tế bào lúa và gây bệnh thông qua hệ thống tiết loại III (T3SS). Các protein TAL thuộc T3SS liên kết với vùng promoter và hoạt hóa sự biểu hiện của gen “nhiễm” (S gene) gây bệnh bạc lá ở lúa. OsSWEET14 là gen “nhiễm” quan trọng, khi được hoạt hóa bởi các protein TAL, tế bào sẽ tăng cường vận chuyển đường đến gian bào, cung cấp dinh dưỡng cho Xoo sinh trưởng và phát triển. Các đột biến trên vùng promoter của gen “nhiễm” tại vị trí liên kết (Effector binding element – EBE) với protein TAL có thể phá vỡ mối liên kết giữa protein TAL của Xoo và gen “nhiễm”. Ý tưởng gây đột biến chính xác các gen “nhiễm” bằng công nghệ CRSIPR/Cas9 để cải tiến tính kháng bạc lá cho giống lúa BT7 là chiến lược chọn giống hoàn toàn mới ở Việt Nam, đáp ứng được đồng thời nhu cầu cấp thiết của sản xuất cũng như nền khoa học nông nghiệp Việt Nam.
2 Vì vậy, luận án “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa BT7” đã được thực hiện. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để tăng cường tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa BT7 thông qua chỉnh sửa promoter OsSWEET14. Mục tiêu cụ thể: - Tối ưu quy trình chuyển gen vào phôi non (immature embryo – IE) giống lúa BT7 thông qua Agrobacterium tumefaciens. - Thiết kế T-DNA biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 của giống lúa BT7 (gọi tắt là SW14-BT) - Tạo dòng lúa BT7 mang đột biến trên SW14-BT bằng CRISPR/Cas9. - Sàng lọc dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT tăng cường tính kháng với vi khuẩn Xoo Việt Nam. 3. Những đóng góp mới của luận án - Luận án đã tối ưu được quy trình chuyển gen IE lúa BT7 thông qua A. tumefaciens, đạt hiệu suất chuyển gen 20,68%. - Đã xác định được OsSWEET14 là một gen “nhiễm” quan trọng đối với bệnh bạc lá lúa ở giống BT7 và thiết kế thành công hệ thống vector chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện CRISPR/Cas9 chỉnh sửa SW14- BT. - Đã ứng dụng thành công hệ thống CRISPR/Cas9 để tạo được tám dòng lúa BT7 mang đột biến SW14-BT ở dạng đồng hợp, không chứa T-DNA và có đặc điểm nông sinh học tương tự giống đối chứng. - Đã sàng lọc được hai dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT thể hiện tính kháng hoàn toàn chủng VXO_11.
3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 4.1. Ý nghĩa khoa học Việc xác định được các yếu tố môi trường và yếu tố vật lý tác động đến chuyển gen IE vào giống lúa BT7 thông qua A. tumefaciens đã bổ sung các dẫn liệu khoa học cho nghiên cứu chuyển gen ở lúa indica. Cơ chế gây bệnh bạc lá ở mức độ phân tử của một số chủng VXO trên giống lúa BT7 cho thấy quần thể Xoo ở Việt Nam có sự đa dạng về hệ protein TAL liên quan tới độc tính của vi khuẩn trên cây lúa. Chủng VXO_11 gây bệnh trên giống BT7 thông qua protein TAL độc duy nhất liên kết với EBE AvrXa7/PthXo3/TalF, trong khi độc tính của VXO_60 và VXO_96 phụ thuộc vào ít nhất 2 protein TAL khác nhau. Thành công trong việc ứng dung CRISPR/Cas9 để tạo đột biến chính xác trên giống lúa chủ lực trong sản xuất (BT7) ở miền Bắc Việt Nam là nguồn dẫn liệu cho các nghiên cứu cải tiến giống sau này. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Luận án đã tạo được dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen có khả năng kháng chủng vi khuẩn VXO_11, có đặc tính nông sinh học chính không khác biệt giống ban đầu. Đây là nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu chọn tạo và phát triển dòng/giống BT7 kháng bạc lá sau này. Cấu trúc vector chỉnh sửa promoter OsSWEET14 có thể được sử dụng cho các nghiên cứu tương tự trên lúa ở Việt Nam. Thành công của luận án đã mở ra triển vọng về chỉnh sửa gen nâng cao năng suất, tính chống chịu và chất lượng các giống cây trồng khác ở Việt Nam. 5. Bố cục của luận án: Luận án gồm (1) Mở đầu 4 trang, (2) Tổng quan 37 trang, (3) Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 23 trang, (4) Kết quả nghiên cứu 61 trang, (5) Kết luận và đề nghị 2 trang, 162 TLTK, 23 bảng, 41 hình.
4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 là một công nghệ chỉnh sửa gen tiên tiến, cho phép cải biến DNA hệ gen trong tế bào một cách chính xác và hiệu quả. Hệ thống này tạo đứt gãy DNA sợi đôi tại vị trí xác định trong hệ gen và thông qua cơ chế tự sửa chữa DNA của tế bào để tạo ra những đột biến có chủ đích. Công nghệ này được xem là một bước phát triển đột phá trong việc cải tiến các tính trạng nông sinh học quý trên các giống cây trồng, bao gồm cả lúa gạo. Phức hợp CRISPR/Cas9 có cấu trúc đơn giản, dễ tùy biến để chỉnh sửa đặc hiệu DNA và đặc biệt là có thể thiết kế và thao tác không cần sử dụng DNA hay plasmid. Điều đó giúp giảm thiểu lo ngại tương tự trong trường hợp của sinh vật biến đổi gen. Quá trình thực hiện chỉnh sửa gen trên thực vật gồm 5 bước chính: sàng lọc vị trí gen đích và thiết kế sgRNA; tổng hợp sgRNA và thiết kế cấu trúc vector biểu hiện sgRNA-Cas9; biến nạp cấu trúc vector vào tế bào vật chủ; xác định đột biến; đánh giá kiểu hình và chọn dòng chỉnh sửa gen mục tiêu. Giới thiệu về bệnh bạc lá và vi khuẩn gây bệnh Bệnh bạc lá (bacterial leaf blight disease) lúa còn gọi là bệnh cháy bìa lá cây lúa, do vi khuẩn Xoo gây ra, là một trong những bệnh nhiệt đới điển hình gây hại đối và thành đại dịch với nhiều vùng trồng lúa ở Việt Nam và nhiều nơi trên thế giới. Khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ, Xoo tiết ra protein TAL tương thích (nhận biết EBE phù hợp) với các gen nhiễm, tăng cường sự biểu hiện của các gen này nhằm ức chế hệ thống phòng vệ của tế bào chủ và giúp vi khuẩn sinh trưởng và lan truyền trong cây chủ. Họ gen SWEET (OsSWEET11(Os8N3/Xa13), OsSWEET12, OsSWEET13 (Xa25), OsSWEET14 và OsSWEET) là đích tấn công của Xoo; sự biểu hiện của các gen này tăng cường quá
5 trình vận chuyển đường tích lũy ở ngoài màng sinh chất, cung cấp dinh dưỡng cho Xoo sinh trưởng và phát triển. OsSWEET14 được xác định là đích tác động của protein TAL TalC, PthXo3, AvrXa7, TalF/Tal5 và hoạt động như một gen “nhiễm” đóng vai trò quan trọng đối với độc tính của Xoo. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá Việc phát triển các giống lúa kháng bệnh bạc lá trong sản xuất các giống lúa chủ lực có ý nghĩa vô cùng to lớn để tăng sản lượng, góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản xuất. Tính biến động của quần thể bạc lá trong nước có thể là một thách thức lớn cho công tác chọn tạo giống lúa kháng. Gần đây, với sự ra đời và phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉnh sửa hệ gen, các nhà khoa học đã có thể can thiệp và biến đổi trình tự bám của các protein TAL trên vùng promoter của các gen “nhiễm” ở lúa. Một số giống lúa mẫn cảm với chủng vi khuẩn Xoo ở châu Á và châu Phi đã được nghiên cứu chỉnh sửa gen bằng hệ thống TALEN và CRISPR/Cas9 nhằm tạo giống lúa kháng bạc lá cũng đã được công bố. Ở Việt Nam, nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên về chọn tạo giống lúa kháng bạc lá dựa trên tương tác protein TAL-gen “nhiễm”. Giống lúa BT7 và các nghiên cứu cải tiến giống lúa BT7 Giống lúa BT7 là giống lúa nhập nội từ Trung Quốc, được chọn lọc và làm thuần bởi Công ty cổ phần Tập đoàn ThaiBinh Seed. Đây là giống lúa thuộc nhóm giống ngắn ngày loài phụ indica, là một trong các giống lúa chủ lực trong sản xuất ở miền Bắc Việt Nam. Tuy nhiên, giống lúa BT7 cũng rất mẫn cảm với các chủng vi khuẩn Xoo. Với những ưu điểm về mặt năng suất và chất lượng, giống lúa BT7 là đối tượng được đặc biệt quan tâm trong các chương trình nghiên cứu chọn tạo giống. Bằng chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại (MABC),
6 hướng nghiên cứu chọn giống có khả năng chịu ngập và chịu mặn trên nền di truyền của giống BT7 cũng đã được thực hiện. Một vài nghiên cứu gần đây đã cố gắng tích hợp các gen kháng bệnh bạc lá vào BT7 (bằng phương pháp lai) nhằm nâng cao giá trị thương mại cho giống lúa này. Vì vậy, ứng dụng công nghệ tiên tiến CRISPR/Cas9 vào chỉnh sửa gen “nhiễm” (OsSWEET14) của giống lúa BT7 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá là hướng nghiên cứu có tính thực tiễn cao, bắt kịp xu hướng chọn giống chính xác với thế giới. Chuyển gen lúa thông qua vi khuẩn A. tumefaciens Trong các nghiên cứu về chỉnh sửa hệ gen ở thực vật bằng CRISPR/Cas9, các cấu trúc chỉnh sửa được chuyển đến vị trí mục tiêu chủ yếu thông qua tích hợp ổn định T-DNA vào hệ gen cây chủ thông qua A. tumefaciens là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác và ổn định. Vật liệu khác nhau hay gen đích khác nhau cho hiệu quả chỉnh sửa gen khác nhau ở cùng loài. Đặc biệt ở lúa, khi chuyển hệ thống CRISPR-Cas qua A. tumefaciens, cây con thu được phần lớn chỉ mang một bản sao, sẽ thuận lợi cho việc xác định đột biến trong hệ gen và phân tích di truyền ở thế hệ con cháu cũng trở nên dễ dàng hơn. Sử dụng IE (phôi hạt non) làm vật liệu khởi đầu cho quá trình chuyển gen đã được chứng minh là hiệu quả hơn nhiều so với các loại vật liệu khác (phôi hạt già), do khả năng tạo mô sẹo và khả năng tái sinh cây từ vật liệu IE tốt hơn. Ở Việt Nam, chưa có nhiều các nghiên cứu chuyển gen lúa sử dụng IE được công bố, đặc biệt đối với giống lúa chủ lực phía Bắc như Bắc thơm 7.
7 Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Promoter OsSWEET14 của giống lúa BT7. 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu Hạt giống lúa BT7 và IR24 được cung cấp bởi Công ty cổ phần Tập đoàn ThaiBinh Seed. Vi khuẩn E. coli chủng DH5α do công ty Thermo Fisher Scientific; A. tumefaciens chủng EHA105 khả biến do Công ty Clontech Laboratories cung cấp; chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang vector pCAMBIA1301 và 20 chủng Xoo được cung cấp bởi Bộ môn Bệnh học phân tử, Viện Di truyền nông nghiệp. Vector pCas9 và pENTR4-gRNA do nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Sebastien Cunnac (Viện Nghiên cứu vì sự phát triển, Montpellier, Pháp) cung cấp. Vector pGEM-T đóng gói trong bộ kit pGEM®-T Easy Vector Systems do hãng Promega cung cấp. Các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi công ty Invitrogen (Hoa Kỳ) và Sigma (Hoa Kỳ). Nội dung và phương pháp nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa BT7 sử dụng phôi non (IE). - Tối ưu hệ thống tái sinh in vitro lúa BT7 từ IE. - Tối ưu điều kiện chuyển gen IE giống lúa BT7 nhờ A. tumefaciens. - Quy trình chuyển gen IE giống lúa BT7 nhờ A. tumefaciens. Nội dung 2 – Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa promoter OsSWEET14 ở giống lúa BT7 (SW14-BT). - Nghiên cứu cơ chế phân tử lây nhiễm của Xoo ở giống lúa BT7.
8 - Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT. Hình 2.4&5. Sơ đồ thiết kế vector pCas9/gRNA-SW14 Ghi chú: Trình tự DNA nhận biết SW14-BT (gRNA-SW14) được chèn vào vị trí BsaI trên vector pENTR4-gRNA. Cấu trúc biểu hiện sgRNA được chèn vào khung vector pCas9 bằng LR clonase. Nội dung 3 - Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa promoter SW14-BT. - Tạo chủng A. tumefaciens mang cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT - Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT vào giống lúa BT7 - Sàng lọc kiểu gen và kiểu hình các dòng lúa BT7 tái sinh - Sàng lọc kiểu gen và kiểu hình các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen T1 Nội dung 4 - Đánh giá tính kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa BT7 chỉnh sửa promoter SW14-BT - Đánh giá đặc điểm nông sinh học dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT - Nghiên cứu biểu hiện của OsSWEET14 trong các dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT - Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng BT7 đột biến SW14 thế hệ T2
9 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào lúa BT7 sử dụng phôi non Trong nghiên cứu này, trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu trước đây của Hiei (2008) và Slamet (2014), các yếu tố về thời gian xử lý khử trùng hạt non (NaOCl 1,0% trong 5 phút), điều kiện ánh sáng (nuôi hoàn toàn trong tối từ đồng nuôi cấy đến hết giai đoạn chọn lọc); chất ĐHST (BAP 2 mg/L + NAA 0,2 mg/L và 20% nước dừa) đã được tối ưu cho quy trình tái sinh từ vật liệu IE phục vụ bước chuyển gen vào giống lúa BT7 (thuộc loài phụ indica). Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian xử lý NaOCl 1,0% Thời gian xử Tỉ lệ IE sống sót Tỉ lệ IE nhiễm vi Tỉ lệ IE chết (%) lý (phút) (%) khuẩn/nấm (%) 3 70,00ab 3,33c 26,67a 5 85,00a 3,33c 11,67b 8 63,33 28,33b 8,33b 10 40,00d 55,00a 5,00b Số liệu trình bày trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại của một công thức. Các chữ cái khác nhau trong cùng 1 cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (α=0,05). Bảng 3.2&3.3 Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng phát sinh mô sẹo và tái sinh chồi từ IE giống lúa BT7 Tỷ lệ mô sẹo Tỷ lệ mô sẹo Công thức Số chồi/mô sẹo tăng sinh1 (%) tạo chồi2 (%) Mô sẹo nuôi 65,00a 61,67a 3,57b cấy ngoài sáng Mô sẹo nuôi 86,67b 75,00b 2,87a cấy trong tối Số liệu trình bày trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại của một công thức. Các chữ cái khác nhau trong cùng 1 cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (α=0,05).
10 Bảng 3.4 Ảnh hưởng chất ĐHST, nước dừa đến tái sinh chồi BAP NAA CW Tỉ lệ mô sẹo tái Công thức Số chồi/mô sẹo (mg/L) (mg/L) (%) sinh chồi (%) RW1 2,0 0,2 10 73,33b 1,95d bc RW2 2,0 0,4 10 70,00 2,26c RW3 2,0 0,2 20 85,00a 3,20a c RW4 2,0 0,4 20 63,33 2,96b Các chữ cái khác nhau trong cùng 1 cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (α=0,05). (CW) nước dừa. Hiệu quả của quy trình chuyển T-DNA vi khuẩn A. tumefaciens vào tế bào thực vật thường bị tác động bởi nhiều yếu tố, bao gồm cả mật độ vi khuẩn dùng để lây nhiễm và thời gian đồng nuôi cấy. Lây nhiễm IE lúa BT7 với dung dịch vi khuẩn A. tumerfaciens có giá trị OD600nm là 0,3 và đồng nuôi cấy trong thời gian 5 ngày là phù hợp nhất với IE của giống lúa BT7, cho hiệu quả chuyển gen đạt 5,55%. Bảng 3.3 Ảnh hưởng của mật độ, thời gian đồng nuôi cấy vi khuẩn Số mô sẹo/cây sống sót Số cây Công Số IE tạo OD1 ND2 Chọn Chọn Chọn chuyển thức mô sẹo Tái sinh gen3 lọc 1 lọc 2 lọc 3 AD1 0,1 5 47,7a 22,0a 7,3b 0 - - AD2 0,1 7 43,0b 17,0b 6,3bc 0,3b 0 - c b a a AD3 0,3 5 39,3 15,0 11,3 8,3 8,3 3,3 d c cd AD4 0,3 7 34,3 9,3 3,0 0 - - AD5 0,5 5 24,7e 2,0d 0 - - - f AD6 0,5 7 17,7 0 - - - - 1 2 3 Giá trị OD600 của dung dịch vi khuẩn; Số ngày đồng nuôi cấy; Số cây tái sinh có kết quả PCR dương tính với cặp mồi HPT-Fw/HPT/Rv (đặc hiệu cho gen chọn lọc HPT). (-) Không đánh giá. Số liệu trình bày trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại của một công thức. Các chữ cái khác nhau trong cùng 1 cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (α=0,05).
11 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tuổi IE đến hiệu quả chuyển gen BT7 Công DAP1 Tỉ lệ IE tạo TL mô sẹo sau Tỉ lệ mô sẹo Số cây tái Tỉ lệ cây mang thức mô sẹo (%) chọn lọc (%) tái sinh (%) sinh gen chuyển2 (%) IE1 8 -10 70,1b 16,3b 64,2a 6,7b 45,8b IE2 11 - 13 80,8a 24,6ab 56,8a 14,0a 59,0a IE3 14 - 16 85,0a 26,4a 22,6b 3,7b 24,4b 1 2 Tuổi phôi (số ngày sau thụ phấn); Tỉ lệ cây tái sinh có kết quả PCR dương tính với cặp mồi HPT-Fw/HPT/Rv (đặc hiệu cho gen chọn lọc HPT). Số liệu trình bày trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại của một công thức. Các chữ cái khác nhau trong cùng 1 cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (α=0,05). Tuổi phôi non có tác động rõ rệt đến sự tạo thành mô sẹo sau giai đoạn đồng nuôi cấy và số mô sẹo thu được sau quá trình chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh. Tuổi phôi thích hợp nhất để chuyển gen vào IE giống lúa BT7 là 11-13 DAP, đây là giai đoạn đầu của quá trình phôi trưởng thành, hiệu suất chuyển gen đạt 13,9%. Bảng 3.5 Ảnh hưởng của AS đến quá trình chuyển gen BT7 Nồng độ Tổng IE tạo mô Mô sẹo sống Số mô sẹo tái Số cây tái sinh AS (μM) số IE sẹo sau chọn lọc sinh mang gen chuyển1 0 60 46,3a 15,7a 9,7a 0 b b b 100 60 41,7 11,0 6,3 8,3b 150 60 38,0b 10,0b 6,0b 12,3a 200 60 26,7c 2,7c 0 - 1 Số cây tái sinh có kết quả PCR dương tính với cặp mồi HPT-Fw/HPT/Rv (đặc hiệu cho gen chọn lọc HPT). (-) Không đánh giá. Số liệu trình bày trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại của một công thức. Các chữ cái khác nhau trong cùng 1 cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (α=0,05). Ngoài ra, nồng độ Acetosyringone (AS) bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy nếu quá thấp gây hiệu quả chuyển gen kém, nếu quá cao gây độc và làm mất khả năng tái sinh của mô sẹo. Trong nghiên cứu này, với mật độ vi khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy và tuổi phôi non đã tối ưu, nồng độ AS 150 μM đã cho hiệu suất chuyển gen cao nhất, đạt 20,6%.
12 Quy trình chuyển gen IE giống lúa BT7 nhờ A. tumefaciens đã được thiết lập. So với quy trình chuyển gen sử dụng phôi trưởng thành của Cao Lệ Quyên et al. (2019), hiệu suất chuyển gen của quy trình này sai khác không có ý nghĩa, lần lượt là 22,53% và 20,68%. Hình 3.7 Quy trình chuyển gen IE lúa BT7 nhờ A. tumefaciens Thiết kế cấu trúc T- DNA chỉnh sửa SW14-BT 3.2.1. Nghiên cứu cơ chế phân tử quá trình lây nhiễm Xoo trên BT7 Độc tính của 20 chủng Xoo phân lập được tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam (gọi tắt là VXO) giai đoạn từ 2013 – 2017 được đánh giá trên lúa BT7 bằng phương pháp cắt lá lây nhiễm nhân tạo. Chiều dài vết bệnh cho thấy giống lúa BT7 rất mẫn cảm với 19/20 vi khuẩn Xoo thu thập tại miền Bắc. Bảy chủng Xoo (VXO_11, VXO_15, VXO_59, VXO_60, VXO_62, VXO_69 và VXO_96) có độc tính cao đối với BT7, đại diện cho 6 vùng trồng lúa đều hoạt hóa OsSWEET14 trong quá trình xâm nhiễm vào cây lúa BT7. Kết quả này cho phép dự đoán
13 OsSWEET14 có thể là một (trong những) gen “nhiễm” chính, có vai trò quan trọng đối với độc tính của các chủng VXO (Hình 3.11). Hình 3.11 Biểu hiện OsSWEET14 trong cây lúa BT7 nhiễm Xoo Ghi chú: RT-PCR nhân bản đoạn gen đích OsSWEET14 và gen nội chuẩn (OsEF1α); (VXO_11, 15, 59, 60, 62, 69, 96): khuôn là mẫu RNA tách chiết từ mẫu lúa nhiễm vi khuẩn Xoo; (ĐC): khuôn là mẫu RNA: tách chiết từ mẫu lúa không lây nhiễm Xoo; Hình 3.15 Phân tích trình tự SW14-BT Ghi chú: Hộp TATA (TATA box) được đóng khung. Vị trí các EBE (AvrXa7, Tal5, PthXo3 và TalC) và Exon I được đánh dấu bằng mũi tên. Đoạn DNA dự đoán từ vị trí [-1343] đến [+52] so với bộ ba mã mở đầu (ATG) của OsSWEET14 đã được nhân bản với cặp mồi cặp mồi SW14-F/SW14-R từ DNA tổng số của giống lúa BT7 và dòng hóa vào vector pGEM-T. Đoạn DNA đích phân lập có chiều dài 1395 bp, bao gồm đoạn exon I của OsSWEET14 dài 52 bp, và vùng promoter của OsSWEET14 (1343 bp) có chứa 4 EBE TalC, Tal5, PthXo3 và AvrXa7 (Hình 3.15). Vị trí của hai EBE AvrXa7 và PthXo3 được xác
14 định là mục tiêu chính cần chỉnh sửa trên SW14-BT để cải tiến khả năng kháng bệnh bạc lá cho giống lúa chủ lực BT7 bằng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9. 3.2.2. Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT Bằng công cụ CRISPR-P 2.0, Mfold 2.3, CCTop và Benchling, trình tự crRNA-8 đã được chọn lọc từ 9 trình tự crRNA ứng viên. crRNA-8 nhận biết đồng thời 3 EBE AvrXa7, PthXo3 và Tal5 (Hình 3.17), có khả năng duy trì hoạt tính và tính đặc hiệu của phức hệ CRISPR/Cas9 trong nhân tế bào được sử dụng cho thí nghiệm thiết kế cấu trúc vector CRISPR/Cas9 gây đột biến SW14-BT. Hình 3.17 Vị trí nhận biết của sgRNA trên SW14-BT Ghi chú: Vị trí các EBE Tal5, PthXo3, AvrXa7, hộp TA và trình tự crRNA (gRNA-SW14) theo chiều 5’-3’ được thể hiện bằng mũi tên Để thiết kế cấu trúc biểu hiện sgRNA nhận biết SW14-BT, đoạn DNA gRNA-SW14 có mang trình tự crRNA-8 đã được ghép nối vào vector pENTR4-gRNA tại vị trí BsaI nằm giữa trình tự promoter OsU6 và tracrRNA. Sản phẩm ghép nối đã được kiểm tra bằng PCR với hai cặp mồi pEN-F/pEN-R và U6-F/gRNA-SW14-R và giải trình tự (Hình 3.20). Sau đó, cấu trúc biểu hiện sgRNA mang gRNA-SW14 (đặt tên là U6::gRNA-SW14) đã được ghép nối vào vector nhị phân pCas9 có cấu trúc biểu hiện protein Cas9 ([Ubiquitin:Cas9:Nos]) bằng hệ thống Gateway. Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy tất cả sản phẩm PCR đều cho băng DNA đúng tính toán lý thuyết (Hình 3.21, giếng 1,
15 3, 5 và 7), chứng tỏ plasmid tái tổ hợp pCas9/gRNA-SW14 thu được có mang đồng thời cấu trúc biểu hiện gen Cas9 (điều khiển bởi promoter Ubiquitin) và cấu trúc biểu hiện gRNA-SW14 (được điều khiển bởi promoter U6) (Hình 3.21). Hình 3.20 Giải trình trình tự pENTR4/gRNA-SW14 Ghi chú: Một phần vector pENTR4/gRNA-SW14 được giải trình tự nucleotide bằng mồi Ter-R. Hình 3.21 Kiểm tra vector pCas9/gRNA-SW14 Ghi chú: Giếng 1, 3, 5, 5 và 7: khuôn là pCas9/gRNA-SW14; giếng 2, 4, 6 và 8: đối chứng âm (không có DNA khuôn); giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi Ubi-F/NOS-R; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi Cas9-F/Cas9-R; giếng 5 và 6: PCR với cặp mồi U6-F/Ter-R; giếng 7 và 8: PCR với cặp mồi U6-F/gRNA-SW14-R. Giếng M: thang chuẩn DNA 1,0 kb (iNtRoN). Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT 3.3.1. Tạo chủng A. tumefaciens mang cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT Cấu trúc T-DNA pCas9/gRNA-SW14 được biến nạp vào A. tumefaciens EHA105. Thể biến nạp được sàng lọc bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi U6-F/Ter-R.
16 3.3.2. Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT vào lúa BT7 Cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT được chuyển vào IE lúa BT7 theo quy trình đã tối ưu. Kết quả thu được cho thấy số mẫu tái sinh chồi sau 3 lần chọn lọc đạt 51,11% (115 cây tái sinh/225 mô sẹo sống sót sau chọn lọc). Tổng số cây sống sót ở điều kiện nhà lưới thu được là 88 cây, tỉ lệ sống đạt 76,52%. Bảng 3.6 Kết quả biến nạp cấu trúc pCas9/gRNA-SW14 vào BT7 Giai đoạn Số mẫu sống sót1 Tổng số Tỉ lệ mẫu (Đơn vị tính) Lô I Lô II Lô III mẫu sống2 (%) Số IE (phôi) 300 300 300 900 - Đồng nuôi cấy (phôi) 269 230 275 774 86,00 Phục hồi (phôi) 250 220 246 716 92,51 Chọn lọc I (mô sẹo) 200 150 190 540 75,42 Chọn lọc II (mô sẹo) 150 120 150 420 77,78 Chọn lọc III (mô sẹo) 80 78 110 268 63,81 Tiền tái sinh (mô sẹo) 70 70 85 225 83,96 Tái sinh (cây) 38 30 47 115 51,11 Nhà lưới (cây) 30 23 35 88 76,52 Ghi chú: 1Thí nghiệm chuyển gen đươc thực hiện 3 lô (I, II và III); 2Tỉ lệ mẫu sống (%) = Số mẫu sống sót ở giai đoạn quan sát/số mẫu sống sót ở giai đoạn trước liền kề) x 100%. 3.3.3. Sàng lọc kiểu gen và kiểu hình của dòng lúa BT7 tái sinh Để xác định sự có mặt của cấu trúc pCas9/gRNA-SW14 trong hệ gen, 88 dòng lúa BT7 sống sót trong điều kiện nhà lưới đã được kiểm tra bằng PCR (Bảng 3.12). Hiệu suất chuyển gen trung bình của toàn bộ quy trình đạt 8,67%. Các dòng lúa có mang một bản sao của cấu trúc T-DNA chứa đầy đủ gen HPT, Cas9 và cấu trúc [U6:gRNA- SW14] (37 cây) được chọn cho phân tích sàng lọc đột biến tiếp theo. Kết quả phân tích trình tự Nu của các dòng lúa chuyển gen bằng phần mềm BioEdit và CRISPR ID đã xác định được 30/37 dòng lúa chuyển gen có mang đột biến trên vùng trình tự đích SW14-BT (Bảng 3.13, Hình 3.27). Các đột biến được phát hiện đều là các đột biến nhỏ thêm hoặc
17 bớt từ 1 – 6 Nu, không có đột biến thay thế Nu nào được xuất hiện trong các dòng lúa BT7 chuyển gen. Các đột biến này đều xuất hiện xung quanh vị trí DBS (theo tính toán lý thuyết) do phức hệ Cas9/gRNA tạo ra trên SW14-BT. Bảng 3.12 Kết quả sàng lọc kiểu gen các dòng lúa BT7 tái sinh Số mẫu dương tính* Tổng số Thí nghiệm I II III mẫu Trồng cây tái sinh trong nhà lưới 30 23 35 88 PCR với mồi đặc hiệu cho Actina 30 23 35 88 PCR với mồi đặc hiệu cho HPTa 28 20 30 78 PCR với mồi đặc hiệu cho Cas9a 28 20 28 76 PCR với mồi đặc hiệu cho sgRNAa 28 20 28 76 qPCR xác định cây có 1 bản sao T- 14 9 14 37 DNAb T7E1c 12 8 12 29 Ghi chú: aSố cây có kết quả PCR dương tính; bSố cây có 2ΔCt từ 0,4-0,57;*Thí nghiệm chuyển gen được thực hiện 3 lô (I, II, III) Bảng 3.13 Kiểu gen SW14-BT của các dòng lúa chuyển gen T0 Kiểu gen Tên dòng/Loại đột biến 1.01(-5), 1.03(-5), 1.09(+2), 1.10(-3), 1.12(+3), 1.18(-1), a 1.24(-2), 1.26(+1), 2.06(+1), 2.13(-2) 2.18(-2), 3.02(+3), Dị hợp 3.04(-3), 3.06(-2), 3.10(-4), 3.11(-6), 3.13(-1), 3.19(+3), 3.21(-1), 3.25(-1) Đồng hợpb 1.15(-6), 1.23(+1), 2.08(+3), 2.17(+1) 1.05(-3/-2), 1.07(-5/-1), 2.02(-3/-5), 2.04(-3/+1), 2.12(- Bi-alenc 1/-4), 3.14(-4/-5), 3.27(-1/-5), 3.45(+1/-3) Không đột biến 1.14, 1.20, 2.11, 3.07, 3.15 a Đột biến trên một alen; bđột biến giống nhau trên cả 2 alen; cđột biến khác nhau trên 2 alen. Kí tự trong ngoặc nằm sau tên dòng lúa thể hiện số Nu đột biến thêm (+)/mất (-).
18 Hình 3.27 Giải trình tự SW14-BT7 của các dòng lúa BT7 T0 Ghi chú: Cột kí tự bên trái thể hiện tên dòng lúa chuyển gen (1.03, 1.15, 2.06, 3.14) và không chuyển gen (WT). Cột kí tự bên phải thể hiện loại đột biến; kí tự số thể hiện số Nu đột biến thêm (+) hoặc mất (-) trên SW14-BT, (WT) không đột biến. Vị trí các EBE Tal5, PthXo3 và AvrXa7 được đánh dấu bằng mũi tên, đường nét đứt (---) thể hiện trình tự crRNA-8. Kết quả bước đầu đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của 30 dòng lúa chỉnh sửa gen OsSWEET14 khác biệt không đáng kể so với dòng lúa đối chứng tái sinh từ mô sẹo không chuyển gen, mặc dù sức sống có phần kém hơn, đã được hạt của các dòng chỉnh sửa gen BT7 thế hệ T0 để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo. 3.3.4. Sàng lọc kiểu gen, kiểu hình dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen T1 Kết quả giải trình tự SW14-BT của các cây lúa T1 (Bảng 3.17) cho thấy tất cả các đột biến ở thế hệ T0 đều được di truyền chính xác sang thế hệ T1; các cây lúa T1 thuộc cùng một dòng T0 đều mang các đột biến đã có ở thế hệ bố mẹ, không xuất hiện đột biến mới. Các quan sát bước đầu đã chỉ ra rằng các đột biến trên promoter OsSWEET14 tạo ra bởi phức hệ CRISPR/Cas9 có thể không gây ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất của lúa BT7. Các dòng lúa T1 chỉnh sửa SW14-BT này đã được gieo trồng trong điều kiện nhà lưới để thu số lượng hạt lớn nhằm phục vụ các thí nghiệm phân tích đánh giá tính kháng bạc lá.