Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

46
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm xác định được virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh tại Việt Nam. Xác định được di truyền tính kháng bệnh khảm vàng ở cây đậu xanh. Xác định được các QTL kháng bệnh khảm vàng. Giới thiệu được một số nguồn gen đậu xanh triển vọng làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng và năng suất cao tại Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---------------------------------------- BÙI THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG ĐẬU XANH KHÁNG BỆNH KHẢM VÀNG Chuyênngành : Di truyền và chọn giống cây trồ ng Mãsố : 62.62.01.11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2016
Công trình được hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Hà Viết Cường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2. TS. Trần Danh Sửu, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 1: ……………………………………………… Phản biện 2 ……………………………………………… Phản biện 3: ……………………………………………… Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ ngày tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư Viện Quốc gia 2. Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Đậu xanh là một trong những cây thực phẩm họ đậu quan trọng trên thế giới và Việt Nam. Bệnh khảm vàng là bệnh phổ biến trên cây đậu xanh ở một số nước và có phổ ký chủ rộng. Nguyên nhân gây bệnh là do một hoặc nhiều virus thuộc chi Begomovirus gây ra và được lan truyền bởi bọ phấn theo cơ chế không bền vững. Chỉ thị phân tử liên kế t với tính kháng bê ̣nh đã đươ ̣c báo cáo đều liên kết xa với tính trạng. Tại Việt Nam, bệnh đã được quan sát từ những năm 1980 nhưng chưa có nghiên cứu nào xác định virus gây bệnh cũng như xác định gen kháng. Vì thế, công tác đánh giá tập đoàn đậu xanh để tìm ra nguồn gen kháng bệnh, nghiên cứu xác định cơ sở di truyền tính kháng, lập bản đồ định vị gen kháng sẽ góp phần thúc đẩy công tác khai thác, sử dụng các nguồn gen kháng làm nguồn vật liệu cho chương trình chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh ở nước ta. Xuất phát từ yêu cầu thực tế sản xuất đậu xanh, nhằm cung cấp thêm cơ sở khoa học và vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh, đề tài: "Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng" đã được tiến hành.. 2. Mục tiêu của đề tài Tìm hiểu, xác định bản chất di truyền tính kháng bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh ở mức phân tử, giới thiệu nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh. Mục tiêu cụ thể của đề tài: - Xác định được virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh tại Việt Nam. - Xác định được di truyền tính kháng bệnh khảm vàng ở cây đậu xanh. - Xác định được các QTL kháng bệnh khảm vàng. - Giới thiệu được một số nguồn gen đậu xanh triển vọng làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng và năng suất cao tại Việt Nam. 3. Ý nghiã khoa ho ̣c và thư ̣c tiễn của đề tài Việc xác định được nguyên nhân gây bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh tại Việt Nam là MYMV, xác định nguồn gen kháng bệnh, đánh giá đa dạng di truyền, thiết
2 lập bản đồ gen kháng ở giống đậu xanh làm cơ sở khoa ho ̣c cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh. Xác định di truyền tính kháng bệnh và các chỉ thị SNP liên kết với gen kháng bệnh khảm vàng ở giống đậu xanh nhập nội NM94 không chỉ nhằm xác định nguồn gen kháng mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao trong việc khai thác hiệu quả các nguồ n gen kháng bênh ̣ phục vụ công tác cho ̣n ta ̣o giố ng đâ ̣u xanh kháng bênh. ̣ 4. Những đóng góp mới của luận án Đây là đề tài đầu tiên ở Việt Nam đã xác định được virus gây bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh là MYMV. Đã thiết lập được bản đồ di truyền gồm 11 liên kết tương ứng với 11 nhiễm sắc thể trên bộ gen của cây đậu xanh dựa trên chỉ thị SNP bằng phương pháp GBS. Đã xác định được vị trí các QTL kháng bệnh khảm vàng trên bản đồ di truyền và bản đồ vật lý ở nguồ n gen đâ ̣u xanh nhâ ̣p nô ̣i NM94. 5. Bố cục của luận án Luận án được trình bày trong 121 trang (không kể phần Tài liệu tham khảo và Phụ lục): Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan và cơ sở khoa học của Đề tài (39 trang), Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu (14 trang), Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận (62 trang), Kết luận và đề nghị (2 trang). Tài liệu tham khảo được sử dụng 158, trong đó có 20 tài liệu tiếng Việt và 138 tài liệu tiếng Anh. Luận án có 31 bảng, 40 hình, 13 phụ lục, 4 công trình đã công bố. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀ I LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI Luận án đã tham khảo và tổng quan 20 tài liệu tiếng Việt và 138 tài liệu tiếng Anh, với các nội dung liên quan bao gồm: 1. Giới thiệu chung về cây đậu xanh; 2. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đậu xanh; 3. Những nghiên cứu về bệnh khảm vàng đậu xanh; 4. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền và tiềm năng ứng dụng trong cải tiến giống ở cây đậu xanh; 5. Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử và lập bản đồ phân tử ở Việt Nam. Với các tài liệu thu thập được đã khẳng định cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek.) có nguồn gốc Ấn Độ và được thuần hóa từ 1500 năm trước công nguyên
3 (Mogotsi, 2006). Đậu xanh rất giàu và cân đối protein, thời gian sinh trưởng ngắn, có khả năng chịu hạn, thích ứng rộng với môi trường (Phạm Văn Thiều, 2009). Diện tích trồng đậu xanh trên toàn thế giới đạt trên 6 triệu ha nhưng năng suất đậu xanh hiện nay còn thấp (Nair et al., 2012). Đậu xanh là cây trồng tự thụ, bộ nhiễm sắc thể 2n=2x=22, kích thước bộ gen khoảng 579 Mbp (Somta và Srinives, 2007) và có nền di truyền rất hẹp (Nair et al., 2012). Bệnh khảm vàng (Mungbean yellow mosaic virus – MYMV) là bệnh hại nghiêm trọng đến canh tác đậu xanh. Bệnh được quan sát thấy lần đầu tiên vào năm 1955 tại Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ (IARI) (Nariani, 1960), sau đó được phát hiện tại một số quốc gia khác thuộc khu vực Nam Á và Đông Nam Á như Philippines (Benigno và Favali-Hedayat, 1977), Thái Lan (Thongmeearkom et al., 1981), Papua New Guinea (Pearson, 1981), SriLanka (Shivanathan, 1983), Bangladesh (Akanda et al., 1992), Pakistan (Saleem et al., 1998), Myammar (Han et al., 2001) cho thấy đây là bệnh quan trọng gây hại trên đậu xanh. Bệnh có phổ ký chủ rộng, không chỉ gây hại trên đậu xanh mà còn gây hại trên một số loài cây họ đậu khác như đậu xanh đen, đậu tương, đậu cowpea … (Varma, 1992). Nguyên nhân gây bệnh là do một hoặc nhiều virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus) gây ra và được lan truyền bởi vectơ truyền bệnh là bọ phấn (Bemisia tabaci Genn.) theo cơ chế không bền vững (Nariani, 1960). Bệnh đã từng gây hại rất nghiêm trọng, làm mất 100% năng suất tại Thái Lan và Ấn Độ (Thogmeearkhom et al., 1981; Manjunath et al., 2013), gây thiệt hại kinh tế trên 300 triệu USD (Varma, 1992). Tại Việt Nam, đậu xanh là cây đậu đỗ đứng thứ ba sau lạc và đậu tương. Đậu xanh được trồng từ Bắc vào Nam. Diện tích trồng đậu xanh của Việt Nam năm 2015 là 90.950 ha trong đó các tỉnh Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên là vùng trồng chính với 67,8% diện tích trồng cả nước (2015). Bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh đã được quan sát ở Việt Nam với các triệu chứng điển hình từ những năm 1980 (Phan Hữu Trinh và cs., 1986) và mặc dù chưa có một nghiên cứu chính thức nào về thiệt hại do MYMV gây ra đối với đậu xanh nhưng đã có những ước đoán về thiệt hại của bệnh gây mất năng suất từ 20-70% (Phạm Văn Thiều, 2009). Sử dụng các giống kháng bệnh được đánh giá là mang lại hiệu quả tối ưu, là
4 cách ổn định và an toàn để quản lý dịch bệnh. Nghiên cứu xác định nguồn gen kháng đã và đang được tiến hành tại nhiều quốc gia khác thế giới và Việt Nam. Một số nguồn gen kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh đã được phát hiê ̣n (Shad et al., 2006; Habib et al., 2007). Một số công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng di truyền tính kháng của MYMV được kiểm soát bằng đa gen. Tính kháng được quy định bằng đơn gen lặn (Singh và Patel, 1977; Reddy, 2009; Sudha et al., 2013a), một gen trội (Gupta et al., 2005), hai gen lặn (Ammavasai et al., 2004; Singh et al., 2013) và các gen lặn bổ sung (Dhole và Reddy, 2012). Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ chỉ thị phân tử, nhiều locut gen kháng sâu bệnh chính đã được định vị trên bản đồ bộ gen của cây đậu xanh (Chen et al., 2007; Zang et al., 2008). Chỉ thị phân tử liên kế t với gen kháng bênh ̣ khảm vàng trên đâ ̣u xanh cũng đã đươ ̣c báo cáo nhưng các chỉ thị này đều liên kết xa với tính trạng (Somta và Srinives, 2007; Dhole và Reddy, 2013). Trong số các chỉ thị phân tử, SNP là chỉ thị thế hệ mới, có số lượng cao trong bộ gen do vậy được ứng dụng tốt cho tăng mật độ chỉ thị, lập bản đồ QTL và chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử với nhiều thông tin (Choudhary et al., 2012). Sự phát triển nhanh chóng của các công nghệ giải trình tự thế hệ mới đã giúp dễ dàng phát hiện các SNP trên toàn bộ hệ gen. Công tác đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của tập đoàn đậu xanh để tìm ra nguồn gen kháng bệnh, lập bản đồ định vị gen kháng sẽ góp phần thúc đẩy công tác khai thác, sử dụng các nguồn gen kháng làm nguồn vật liệu cho chương trình chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh ở Việt Nam. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1. Vật liệu nghiên cứu - Giống đậu xanh: + Thí nghiệm sàng lọc nguồn gen đậu xanh kháng bệnh khảm vàng: gồm 96 nguồn gen đậu xanh địa phương và nhập nội đang được lưu giữ tại ngân hàng gen cây trồng Quốc bao gồm giống đối chứng nhiễm bệnh chuẩn là KPS2 (Akatar et al., 2011) có nguồn gốc từ AVRDC (Bảng 2.1 và Phụ lục 1) + Thí nghiệm đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh: gồm 94 nguồn gen trong đó có nguồn gốc từ Việt Nam (50 nguồn gen), AVRDC (13 nguồn gen) và Úc (31 nguồn
5 gen) (chi tiết ở Phụ lục 2) + Quần thể lập bản đồ: 200 dòng quần thể đậu xanh F3 do AVRDC khu vực Nam Á đóng tại ICRISAT, Hyderabad, Ấn Độ tạo ra từ tổ hợp lai NM94 (kháng MYMV) và KPS2 (nhiễm MYMV). - Nguồn bệnh: là những cây đậu xanh bị bệnh khảm vàng thu thập tại Phú Yên với triệu chứng điển hình. - Các vật liệu hóa chất dùng trong sinh học phân tử 2.2. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập và xác định virus gây bệnh khảm vàng ở Việt Nam Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng kháng bệnh khảm vàng và đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống trong tập đoàn đậu xanh Nội dung 3: Nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đậu xanh Nội dung 4: Nghiên cứu lập bản đồ gen của cây đậu xanh 2.3.1. Thời gian nghiên cứu: từ năm 2011 đến năm 2015. 2.3.2. Địa điểm nghiên cứu - Các nghiên cứu đánh giá tính kháng bệnh trên đồng ruộng được thực hiện tại Nam An Nghiệp, Tuy An, Phú Yên - Các thí nghiệm đánh giá bệnh trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo được thực hiện tại hệ thống nhà lưới chống côn trùng của Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Tài nguyên Thực vật. - Các thí nghiệm nghiên cứu về sinh học phân tử được thực hiện tại Bộ môn Đa dạng Sinh học Nông nghiệp - Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Phòng virus học và Phòng chỉ thị phân tử - Trung tâm Rau thế giới (AVRDC, Đài Loan). 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Phương pháp xác định virus gây bệnh khảm vàng đậu xanh Phương pháp thu mẫu bệnh: Thu thập và bảo quản mẫu bệnh được tiến hành theo AVRDC như sau: Thu mẫu bệnh là lá và quả non ngẫu nhiên trên đồng ruộng và ghi chép các thông tin liên quan tại các vùng trồng đậu xanh chính và các cây họ đậu khác theo biểu mẫu của DSMZ. Mẫu được làm khô bằng silicagen tự chỉ thị và được bảo quản
6 trong lọ hoặc ống falcon kín chứa silicagen và bảo quản ở điề u kiêṇ thường. Tách chiết ADN tổng số Tách chiết ADN tổng số bằng dung dịch đệm CTAB (Doyle và Doyle, 1987). Kiểm tra chất lượng ADN trên gel agarose 0,8%. Tinh sạch ADN bằng Kit ZR-96 DNA clean and concentratorTM-5 (Zymo Research). Nồng độ chính xác được đo trên máy quang phổ nanodrop. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2 % trong TBE 0,5X. Phương pháp tách dòng và giải trình tự ADN của begomovirus Dựa vào việc căn trình tự của các sản phẩm PCR 1,5kb và trình tự nucleotide thu được trên GenBank, thiết kế mồi khuếch đại các đoạn ADN-A và ADN-B hoàn chỉnh của các chủng MYMV từ Việt Nam. Các đoạn ADN-A và ADN-B hoàn chỉnh này sau đó được tách dòng và giải trình tự. Nhân dòng bằng vectơ pGEM-T Easy theo chỉ dẫn của nhà sản xuất (Promega, WI, USA). Sản phẩm nhân dòng được nhuộm bằng BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit và giải trình tự bằng thiết bị ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, San Francisco, CA, USA) tại công ty Yourgene (Đài Loan). Phân tích trình tự của các ADN begomovirus Sử dụng BLASTn trên NCBI để tìm kiếm các trình tự của geminivirus trên cơ sở dữ liệu của GenBank tương đồng nhất với trình tự ADN hoàn chỉnh thu được (Altschul et al., 1990). Phần mềm ClustalX2 2.0 (Larkin et al., 2007) được sử dụng để căn trình tự và so sánh trình tự. Cây đa dạng di truyền (Phylogenetic tree) của các ADN-A và ADN-B của virus được tạo ra bằng phần mềm MEGA6 (Tamura et al., 2013). Kỹ thuật ELISA Kỹ thuật ELISA là TAS-ELISA (Triple antibody sandwich –ELISA) được sử dụng để chẩn đoán một virus rất phổ biến trên cây đậu đỗ tại Việt Nam là Bean common mosaic virus. Kit ELISA do Viện DSMZ (Đức) cung cấp và qui trình được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
7 2.4.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền sử dụng DArT Tách chiết ADN Các nguồn gen nghiên cứu được gieo trồng, thu lá non từ 5 cây/nguồn gen để tách chiết ADN tại Phòng chỉ thị phân tử, AVRDC - Đài Loan. Tách chiết ADN theo phương pháp chiết ADN tổng số bằng dung dịch đệm CTAB (Doyle và Doyle, 1987). Sau khi tách chiết ADN của đậu xanh, các mẫu ADN này được gửi đến công ty Diversity Arrays Technology, Bldg 3, Lv D, University of Canberra, Kirinari st., Bruce, ACT 2617, Australia để thực hiện các bước tiếp theo của quy trình DArT và nhận lại số liệu thô cho phân tích đa dạng di truyền. Phân tích số liệu DarT Các dòng DArT đa hình với P lớn hơn hoặc bằng 80 được lựa chọn để phân tích đa dạng di truyền của đậu xanh sử dụng phần mềm DARwin 6. Sơ đồ hình cây được xây dựng dựa trên khoảng cách di truyền của Nei (1978) theo phương pháp UPGMA bằng phần mềm DARwin 6. 2.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của đậu xanh 2.4.3.1. Đánh giá trong điều kiện áp lực bệnh tự nhiên Địa điểm thí nghiệm: Nam An Nghiệp, Tuy An, Phú Yên ở vụ Hè (là vùng xuất hiện bệnh trong nhiều năm liên tục). Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm sàng lọc nguồn gen kháng bệnh của tập đoàn đậu xanh: được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) với 3 lần lặp, khoảng cách hàng x hàng: 40cm, cây x cây: 10cm, 15 cây/hàng/lần lặp. Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của các dòng trong quần thể F2:3: được bố trí tuần tự không nhắc lại, khoảng cách hàng x hàng: 40 cm, cây x cây: 10 cm, 30 cây/dòng. Các cây này được đeo thẻ từ 35 ngày sau trồng để phục vụ cho quá trình đánh giá. Quy trình kỹ thuật chăm sóc chung đối với cây đậu xanh được áp dụng cho thí nghiệm, nhưng không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để không ảnh hưởng đến quần thể bọ phấn - vector truyền bệnh. Cấp bệnh được đánh giá trên từng cây theo thang điểm 6 cấp (được cung cấp bởi AVRDC) tại thời điểm cây được 35 và 55 ngày trồng.
8 2.4.3.2. Đánh giá trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo nhờ bọ phấn Chuẩn bị cây nguồn nhiễm bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo nhờ vi khuẩn (Agroinoculation). Lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp ủ hạt qua đêm (Mandal et al., 1997). Lây nhiễm nhân tạo sử dụng bọ phấn Các dòng đánh giá được gieo trong khay xốp, mỗi dòng trồng 30 cây, gieo 1 hạt/hốc, đặt trong nhà lưới. Khi cây mọc và được 10 ngày sau gieo tiến hành cho lây nhiễm nhờ bọ phấn. Chuyển cây bị bệnh (cây nguồn) vào lồng kín, thả bọ phấn khỏe với mật độ 4-6 con/cây. Sau thời gian 2 ngày, tiếp tục chuyển cây không bị bệnh vào lồng chứa bọ phấn đã mang bệnh ngay sau khi mang cây bị bệnh ra ngoài. Chăm sóc hàng ngày và theo dõi kết quả sau 2 tuần lây nhiễm khi 100% cây của giống mẫn cảm KPS2 đã biểu hiện triệu chứng điển hình của bệnh và có kết quả dương tính với MYMV (PRC test). Mỗi cây được đeo thẻ đánh số để đánh giá bệnh theo thang điểm của AVRDC ở giai đoạn 35 ngày và 55 ngày sau trồng. 2.4.3.3. Phân tích thống kê: Tính tỷ lệ bệnh (TLB) theo phương pháp của Vũ Đình Ninh (1972) và chỉ số cấp bệnh trung bình (CBTB) tính theo Fang (2010) 2.4.4. Phương pháp đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự (GBS) 2.4.4.1. Thiết lập thư viện cho GBS theo mô tả chi tiết trong công bố của Elshire et al., 2011. 2.4.4.2. Xử lý số liệu bằng các phần mềm tin sinh học Sử dụng bộ công cụ STACKS 1.21 (Catchen et al., 2013) và Bộ công cụ GATK (https://www.broadinstitute.org/gatk/) chạy trên hệ điều hành Linux 32G-RAM để gọi ra các chỉ thị SNP 2.4.5. Phân tích QTLs (Quantitative Trait Loci) Sử dụng các phần mềm QTL Icimapping 4.0 (Li et al., 2007) và Qgene 4.3 (Li et al., 2007) để phân tích QTLs.
9 CHƯƠNG 3 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và xác định virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh 3.1.1. Kết quả thu mẫu bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh, các cây họ đậu khác tại Việt Nam Mẫu bệnh khảm vàng đã được thu thập tại 17 tỉnh, thành trong cả nước. Tổng cộng đã thu được 68 mẫu bệnh, 57 mẫu bệnh trên đậu xanh, 11 mẫu bệnh trên các cây họ đậu khác. Trong đó 16 mẫu bệnh thu tại Phú Yên trên cây đậu xanh, 10 mẫu bệnh thu tại Hà Nội (9 mẫu bệnh trên đậu xanh, 1 mẫu bệnh trên đậu đen), 7 mẫu bệnh thu tại Thái Bình trên đậu xanh, còn lại các mẫu bệnh khác được thu rải rác trên các tỉnh thành khác (Bảng 3.1, Hình 3.2). Triệu chứng của cây bị bệnh khảm vàng thu mẫu bệnh được thể hiện trong Hình 3.1. Bảng 3.1: Tổng hợp kết quả điều tra, thu thập mẫu bệnh Begomovirus theo vùng địa lý Tính đến ngày 15 tháng 12 năm 2013 Vùng, địa Đậu Cây Vùng, địa Đậu Cây TT phương xanh khác TT phương xanh khác 1 Bắc Giang 1 - 10 Thái Bình 7 - 2 Bắc Ninh 1 - 11 Thanh Hóa 2 - 3 Yên Bái 2 2 12 Nghệ An 2 - 4 Bắc Cạn 1 13 Quảng Trị 1 - 5 Sơn La 4 3 14 Đà Nẵng 4 - 6 Lào Cai 1 - 15 Bình Định 3 - 7 Q.Ninh 4 16 Phú Yên 16 - 8 Hà Nội 9 1 17 Cần Thơ 2 - 9 Hưng Yên 2 - Tổng số 57 11 Hình 3.1: Các triệu chứng Hình 3.2: Định vị các khảm vàng ở đậu xanh tại vùng thu thập mẫu Phú Yên bệnh khảm vàng chính tại Việt Nam, năm 2011-2013
10 3.1.2. Thiết kế mồi phát hiện các virus gây hại trên cây đậu xanh và các cây họ đậu khác bằng kỹ thuật PCR Vì các begomovirus trên cây họ đậu chủ yếu là các begomovirus có bộ gen kép nên 2 loại mồi sẽ được thiết kế là các mồi đặc hiệu MYMV và các mồi chung đặc hiệu cho tất cả các begomovirrus gây hại trên cây họ đậu (còn được gọi là các legumovirus) từ cựu thế giới. Kết quả đã thiết kế được 7 mồi có thể phát hiện các begomovirus có bộ gen kép gây hại trên cây họ đậu và mồi đặc hiệu phát hiện MYNV (Bảng 3.2). Bảng 3.2: Kết quả thiết kế mồi cho ADN-A của begomovirus Trình tự mồi Số Nu Kích thước TT Tên mồi Tm Vị trí (5’-3’) (*) (bp) ATAATGBGGATC 1 LegA-repF1 21 49-53 1846-1866 RACGTCATC TCAYCTVCATGT F1/R1 = 634 2 LegA-repR1 20 43-48 2461-2480 TCTGCTTC F1/R2 = 548 CAYATTWCCAT 3 LegA-repR2 23 51 2372-2394 CCGAACATTCAG GGTCAAGTKTTY 4 LegA-cpF1 23 46-48 770-820 AACATGTATGA 280 GCATGAGTACAT 5 LegA-cpR1 21 49 1000-1050 GCCATATAC CAATTTGAGTGC 6 MYA-For1 23 52 1773 – 1795 TGTGTTATCAG 566 CTCAATAGTGGA 7 MYA-Rev1 22 49 2316-2339 TCCAAGTTAC *: Y: C/T, R: G/A, H: A/C/T, M: A/C, B: C/G/T, D: A/G/T, K: G/T; i=inosine. 3.1.3. Kết quả chuẩn đoán bệnh virus trên đậu xanh và các cây họ đậu khác bằng kỹ thuật PCR Kết quả chuẩn đoán bằng PCR 68 mẫu bệnh thu được (Bảng 3.3), tất cả 11 mẫu bệnh của cây họ đậu khác đều biểu hiện dương tính với begomovirus, legumovirus, MYMV. 25 trên tổng số 57 mẫu bệnh đậu xanh dương tính với begomovirus,
11 legumovirus, MYMV. Có 4 địa phương phát hiện mẫu đậu xanh nhiễm MYMV, 5 địa phương phát hiện MYMV trên các cây họ đậu khác (Bảng 3.3). Trong đó 100% mẫu bệnh thu được trên đậu xanh tại Bình Định và Phú Yên dương tính với MYMV. Kết quả chuẩn đoán bằng ELISA để phát hiện BCMV với 68 mẫu bệnh thu được cho thấy: cả 11 mẫu bệnh của cây họ đậu khác đều không nhiễm BCMV, 14 trên 57 mẫu bệnh đậu xanh thu được dương tính với BCMV, các mẫu này đều âm tính với begomovirus. Bảng 3.3: Tổng hợp kết quả thu thập theo nhóm cây trồng Loại Số Số mẫu dương tính với Địa phương phát STT cây lượng Begomo Legumo MYMV BCMV hiện mẫu bệnh trồng mẫu virus virus Bình Định (3), Phú Đậu 1 57 25 25 25 14 Yên (16), Sơn La (3), xanh Thái Bình (3), Yên Bái (2), Quảng Đậu Ninh (4), Sơn La 2 11 11 11 11 0 khác (3), Bắc Cạn (1), Hà Nội (1) Tổng 68 36 36 36 14 3.1.4. Kết quả giải và phân tích trình tự ADN-A của begomovirus Kết quả đã xác định được chủng begomovirus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh từ Nam Trung Bộ đều là MYMV và có tương đồng cao nhất về trình tự ADN-A với isolate phân lập tại Campuchia (SĐK GenBank: AY271892) và 2 isolate phân lập tại Thái Lan (SĐK GenBank: AB017341 và D14703), có độ tương đồng cao nhất về trình tự ADN-B với isolate phân lập được ở Thái Lan (SĐK GenBank: D14704) 3.1.5. Kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài của MYMV từ các trình tự ADN-A và ADN-B hoàn chỉnh của Việt Nam Từ kết quả phân tích cây phát sinh loài và so sánh tương đồng trình tự với nhóm
12 ADN-A và ADN-B đã xác định được MYMV trên thế giới chia làm 3 nhóm, trong đó nhóm I từ Việt Nam, Thái Lan, Campuchia, nhóm II từ Ấn Độ, nhóm III từ Ấn Độ và Pakistan. Ba nhóm này thuộc 2 chủng virus MYMV khác nhau dựa vào sự tương đồng trình tự ADN-A nucleotide, chủng A là các isolate thuộc nhóm I và II, chủng B là các isolate thuộc nhóm III. 3.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đồng ruộng và đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống đậu xanh 3.2.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của các nguồn gen đậu xanh Đánh giá 96 nguồn gen đậu xanh qua 2 năm có 65 nguồn gen (chiếm 67,7%) biểu hiện nhiễm đến nhiễm nặng bệnh khảm vàng, 24 nguồn gen (chiếm 25%) nhiễm bệnh ở mức trung bình. Bảng 3.6: Thống kê mức độ nhiễm bệnh khảm vàng của tập đoàn đậu xanh tại Phú Yên vụ Hè 2012 và 2013 Chỉ số bệnh trung bình Mức độ nhiễm bệnh Số nguồn gen Tỉ lệ % 2,0 -
13 Bảng 3.7: Danh sách các nguồn gen đậu xanh kháng bệnh khảm vàng được đánh giá tại Phú Yên qua 2 năm 2012 và 2013 Chỉ số bệnh TB Khả STT SĐK Tên giống Tỷ lệ bệnh (55 ngày) năng kháng 1 3227 Xanh Đắc Lắc 93 3,78 MR 2 4292 VC 6372 (45-8) 100 3,93 MR 3 4329 Đậu xanh mỡ 82 3,72 MR 4 4332 Đậu xanh mỡ 100 3,83 MR 5 8493 VC 3960-88 53 1,13 - 1,64 HR 6 8923 NM 92 38 1,22 - 1,89 HR 7 12195 NM 94 56 1,53 - 1,73 HR KPS2 (Đ/c nhiễm 12200 100 5,58 - 5,93 S 8 chuẩn) 3.2.2. Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống đậu xanh Các đặc điểm nông sinh học chính và các yếu tố cấu thành năng suất là những tính trạng cần thiết được đánh giá để từ đó chọn ra các nguồn gen triển vọng có thể trực tiếp giới thiệu ra sản xuất hoặc sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chọn tạo giống năng suất, chất lượng. Đồng thời, trong công tác chọn tạo giống kháng bệnh, các nhà chọn tạo giống phải kết hợp chọn tổ hợp lai có sự đối lập nhau về khả năng kháng/nhiễm bệnh đồng thời một trong hai bố mẹ phải có đặc điểm nông sinh học tốt và cho năng suất khá để có thể tạo ra các dòng vừa kháng bệnh vừa có các đặc điểm nông sinh học tốt, cho nang suất cao. Chính vì vậy, nội dung đánh giá đặc điểm nông sinh học và các yếu tố cấu thành năng suất của tập đoàn đậu xanh nghiên cứu được tiến hành. Từ kết quả sàng lọc khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đồng ruộng tại Phú Yên và kết quả đánh giá các đặc điểm nông sinh học của 98 nguồn gen đậu xanh nghiên cứu, chúng tôi đã chọn lọc 17 nguồn gen đậu xanh triển vọng dựa trên tiêu chí năng suất cao hoặc có khả năng kháng bệnh khảm vàng từ mức trung bình đến kháng cao giới thiệu cho sản xuất góp phần là làm phong phú bộ giống đậu xanh trong sản
14 xuất (Bảng 3.11). Bảng 3.11: Danh sách các giống đậu xanh triển vọng trong tập đoàn đậu xanh vụ Hè 2013 Cao Ngày Ngày Số P100 NS Nhiễm STT SĐK Tên giống cây ra thu quả/ (g) (kg/ha) MYMV (cm) hoa hoạch cây 1 3210 Mốc Quảng Ngãi 51,40 39 56 4,8 1.255 9,9 MS 2 3211 Sẻ sơn T.Quảng Ngãi 72,20 42 65 5,5 1.349 9,4 S 3 3217 Xanh Bình Định 56,60 45 63 5,0 1.225 9,5 S 4 3222 Xanh Buôn Mê Thuật 41,40 44 59 6,9 1.755 10,0 MS 5 3225 Sẻ Kon Tum 51,80 45 59 6,2 1.258 8,5 HS 6 3226 Xanh Lâm Đồng 68,00 42 65 4,5 1.219 10,7 MS 7 3227 Xanh Đắc Lắc 69,60 49 65 5,1 1.372 10,3 MR 8 3232 Mỡ Tân Ba Sông Bé 47,00 46 63 5,7 1.310 8,2 MS 9 3233 Mỡ Biên Hòa 36,40 45 59 6,2 1.316 8,2 HS 10 3234 Mỡ Đồng Nai 50,80 44 59 6,3 1.359 7,9 HS 11 4347 Đậu xanh 71,20 42 63 6,1 1.341 7,9 MS 12 6497 Đậu xanh 67,40 49 62 5,4 1.290 8,3 HS 13 8493 VC 3960-88 46,40 48 70 5,3 975 7,4 HR 14 8923 NM 92 57,60 42 64 4,6 1.105 9,5 HR 15 12195 NM 94 56,80 41 65 4,6 1.151 9,8 HR 16 12199 KPS1 70,50 39 60 5,0 1.274 9,1 HS 17 12200 KPS2 70,50 39 60 5,3 1.381 9,4 HS 3.3. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen đậu xanh 3.3.1. Thống kê các chỉ tiêu đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị DArT Kết quả đánh giá được thể hiện ở Bảng 3.12. Ở nghiên cứu này giá trị PIC trung bình rất thấp chỉ đạt 0,157, thấp hơn rất nhiều so với các nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng DArT trước đó trên các đối tượng cây trồng như lúa mạch (0,38) (Castillo et al., 2013), sắn (0,42) (Xia et al., 2005), cao lương (0,41) (Mace et al., 2008), đậu triều (0,42) (Yang et al., 2011). Điều này chứng tỏ đậu xanh có nền di truyền hẹp.
15 Bảng 3.12: Các giá trị nội dung thông tin đa hình (PIC) cho 560 chỉ thị DArT Giá trị PIC Số lượng chỉ thị DArT Tỉ lệ phần tram 0-0,1 340 60,71 0,1-0,2 61 10,89 0,2-0,3 31 5,54 0,3-0,4 25 4,46 0,4-0,5 103 18,39 Tổng 560 100 Giá trị PIC trung bình 0,157 Khi phân tích riêng đa dạng di truyền 50 nguồn gen đậu xanh đóng góp từ Việt Nam và 4 nguồn gen có nguồn gốc từ AVRDC (NM92, NM94, KPS1, KPS2) trong nghiên cứu, kết quả cho thấy giá trị PIC trung bình đạt 0,248. Đây cũng là giá trị PIC thấp so với giá trị PIC lý tưởng, cũng chứng tỏ các nguồn gen đậu xanh từ Việt Nam này cũng có nền di truyền hẹp. 3.3.2. Phân tích khoảng cách di truyền của các giống đậu xanh nghiên cứu Kết quả phân tích đa dạng di truyền 94 nguồn gen đậu xanh cho thấy hầu hết các nguồn gen có cùng nguồn gốc thu thập được phân nhóm cùng nhau trong các nhóm phụ, tuy nhiên sự phân nhóm này chưa phản ánh rõ ràng nguồn gốc địa lý của các nguồn gen đậu xanh nghiên cứu. Đối với 54 nguồn gen đậu xanh gồm 50 nguồn gen từ Việt Nam đóng góp và 4 nguồn gen đậu xanh từ AVRDC (NM92, NM94, KPS1 và KPS2) cho thấy sự phân nhóm theo vùng địa lý thu thập của các nguồn gen đậu xanh Việt Nam cũng không rõ ràng thể hiện ở sự xen kẽ các nguồn gen có nguồn gốc thu thập khác nhau trong cả nước vào cùng nhóm chứng tỏ nguồn vật liệu nghiên cứu có nền di truyền hẹp và phân nhóm theo vùng địa lý không rõ ràng (Hình 3.13).
16 Hình 3.13: Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ của 54 nguồn gen đậu xanh nghiên cứu (theo phương pháp neighbour-joining UPGMA dựa trên chỉ số khác biệt DICE sử dụng 119 chỉ thị có P>80) 3.3.3. Kết quả chọn tổ hợp lai để xây dựng quần thể lập bản đồ Dựa vào sự đối lập về tính kháng/nhiễm bê ̣nh, khoảng cách di truyền và các đặc điểm nông sinh học của các nguồn gen đậu xanh trong tập đoàn, chúng tôi đã chọn được 1 cặp lai: NM94 x KPS2 là cặp lai có sự khác biệt di truyền lớn nhất và có khoảng cách di truyền xa nhất tạo quần thể lập bản đồ di truyền, bản đồ liên kết gen dựa vào chỉ thị phân tử SNP bằng phương pháp GBS và xác định chỉ thị liên kết gen kháng bệnh khảm vàng (Bảng 3.16). Bảng 3.16: Bảng tổng hợp các chỉ tiêu chọn các cặp bố mẹ làm vật liệu lai tạo quần thể Đặc điểm KPS1 KPS2 NM92 NM94 Khả Tỷ lệ bệnh (%) 100 100 38 56 năng Chỉ số bệnh trung bình 5,93 5,98 1,22 1,53 kháng Ngày xuất hiện bệnh (ngày)
17 Khoảng cách di truyền với NM94 0,657 0,657 - - Thời gian từ gieo - ra hoa (ngày) 39 39 41 42 Thời gian gieo-thu hoạch (ngày) 60 60 64 65 Đặc Chiều cao cây (cm) 70,5 70,5 57,6 56,8 điểm Số quả/cây 9,1 9,4 9,5 9,8 nông Số hạt/quả 12,0 12,0 10,9 11,3 sinh Chiều dài quả (cm) 10,23 10,35 8,52 9,56 học P100 hạt (g) 5,30 5,00 4,62 4,60 Năng suất thực thu (kg/ha) 1.274 1.381 1.105 1.151 3.4. Nghiên cứu lập bản đồ gen ở cây đậu xanh. 3.4.1. Đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng Kết quả đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng của quần thể đậu xanh trong điều kiện áp lực bệnh tự nhiên trên đồng ruộng cho thấy phân bố kiểu hình kháng bệnh của quần thể F2:3 được chia thành 4 nhóm: kháng, kháng trung bình, nhiễm trung bình và nhiễm. Chỉ số bệnh trung bình của quần thể là 3,57, chỉ số bệnh cao nhất của quần thể là 4,78, chỉ số bệnh thấp nhất là 2,04 (Hình 3.14). Hình 3.14: Phân bố kiểu hình kháng bệnh khảm vàng của quần thể F2:3 đậu xanh Để đánh giá kiểu gen bằng phương pháp GBS quần thể đã được rút xuống 71 dòng (Phụ lục 8) và đánh giá kiểu hình bằng lây nhiễm nhân tạo trong nhà lưới sử dụng môi giới truyền bệnh là bọ phấn. Kết quả đánh giá phân ly kiểu hình của 71 dòng quần thể F2:3 bằng lây nhiễm nhân tạo cho thấy chỉ có 18 dòng biểu hiện kiểu hình kháng thực sự với MYMV (so với
18 kiểu hình kháng thu được ngoài đồng là 28 dòng), 12 dòng biểu hiện kiểu hình kháng vừa, 24 dòng biểu hiện kiểu hình nhiễm vừa và 17 dòng biểu hiện kiểu hình nhiễm. Dựa vào kiểu hình phân ly đối với 71 dòng này cũng cho thấy gen kháng của NM94 không phải là một gen đơn mà được quy định bởi nhiều gen (QTL). Số liệu kiểu hình chính xác thu được từ 71 dòng này hoàn toàn có thể sử dụng cho việc xây dựng bản đồ gen. Hình 3.16: Phân lớp kiểu hình kháng bệnh MYMV của 200 dòng và 71 dòng quần thể đậu xanh F2:3 Trong quá trình đánh giá kiểu hình đã chọn được một số dòng kháng bệnh và có những đặc điểm nông học tốt để tiếp tục đánh giá và giới thiệu ra sản xuất mà điển hình là dòng 148 (VR2011-2-189) và dòng 178 (VR2011-2-223) (Bảng 3.19). Bảng 3.19: Một số đặc điểm nông sinh học chính của hai dòng đậu xanh F5 triển vọng: dòng 148 và dòng 178 vụ Xuân 2015 tại Hà Nội Tính trạng NM94 KPS2 Dòng 148 Dòng 178 (VN2011-2-189) (VN2011-2-223) Chiều cao cây (cm) 62,8 70,5 67,2 70,3 Ngày ra hoa 43 39 42 40 Ngày thu đầu 65 60 62 63 Số hạt/quả 11,0 12,0 11,6 12,2 Số quả/cây 13,8 15,4 18,3 26,8 P100 hạt (g) 5,4 5,8 6,1 5,61 Năng suất thực thu 1.551 1.781 2.437 2.910 (kg/ha) Mức độ kháng 1,73 5,93 1,92 2,03 nhiễm MYMV (HR) (HS) (HR) (R)