Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và xác định đặc tính của omega-conotoxin

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

62
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu luận án: Tạo ra omega conotoxin tái tổ hợp (ω-CTX, viết tắt là CTX) có khả năng ứng dụng trong y dược học dưới dạng hoạt chất giảm đau. Sau đây là bản tóm tắt luận án.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và xác định đặc tính của omega-conotoxin

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÙI THỊ HUYỀNPHƯƠNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA OMEGA-CONOTOXIN Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015
Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS Phan Văn Chi Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS Nguyễn Bích Nhi Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1:……………………... Phản biện 2: …………………….. Phản biện 3: ……………………… Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ cấp nhà nước tại: Viện Công nghệ sinh học Vào hồi …… ngày …….. tháng ……năm 2015 Có thể tìm hiểu luận án tại: § Thư viện Quốc gia Việt Nam § Viện Công nghệ sinh học § Trang web của Bộ GDĐT
1 MỞ ĐẦU Đau do thần kinh là một rối loạn đặc trưng bởi những tổn thương hệ thần kinh từ các bệnh mạn tính như ung thư, đái tháo đường, HIV... hoặc do phẫu thuật, chấn thương.... Theo thống kê mới nhất của Viện Hàn lâm Y học về Đau của Mỹ (AAPM -American Academy of Pain Medicine), năm 2015 trên thế giới có khoảng 1,5 tỷ người bị đau mạn tính, trong đó 4,5% là bệnh nhân đau thần kinh và tỷ lệ mắc bệnh tăng theo tuổi, tính riêng ở Châu Âu số người phải chịu đựng các cơn đau do thần kinh chiếm khoảng 5% dân số. Trên thực tế, bệnh đau thần kinh không thể trị dứt điểm mà chỉ có thể cải thiện chất lượng sống cho bệnh nhân bằng cách sử dụng các loại thuốc giảm đau. Cho đến nay, việc điều trị giảm đau truyền thống với các thuốc chống viêm không steroid hoặc sử dụng nhóm opioid có tác dụng mạnh như Morphine vẫn chưa thực sự hiệu quả. Việc tìm kiếm các phân tử đích mới trong phát triển thuốc giảm đau vẫn đang là nỗ lực của các nhà khoa học trong nhiều năm qua. Một thế hệ chất giảm đau mới có nguồn gốc từ nọc các loài ốc cối biển (Conus) đã và đang được đầu tư nghiên cứu và phát triển mạnh trong thời gian gần đây. Đó là các conotoxin (có bản chất là peptide) được tách chiết từ bầu độc của ốc cối, có tác động khóa chọn lọc lên các kênh ion hay các thụ thể trên tế bào thần kinh nên được ứng dụng trong việc tạo thuốc giảm đau, bảo vệ tế bào thần kinh... Trong đó, omega conotoxin MVIIA là độc tố tách chiết từ loài ốc cối Conus magus, có tác dụng khóa chọn lọc kênh Ca2+ type N trên tế bào thần kinh, gây ức chế quá trình truyền tín hiệu thần kinh qua các khe synapse, có hiệu lực giảm đau tốt hơn Morphine nhưng không gây nghiện. Đặc biệt omega conotoxin MVIIA với tên thương mại là Prialt hay Ziconotide đã được Cơ quan Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (United States Food and Drug Administration - FDA) cấp phép sử dụng từ tháng 4 năm 2004 và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (Europe Medicines Agency - EMA) cấp phép sử dụng từ tháng 2 năm 2005 như một loại thuốc giảm đau mới. Bên cạnh đó, nhiều đặc tính khác của MVIIA cũng đang được nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng trong các pha khác nhau như tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vùng đồi thị trong các mô hình gây đột quị não... Việc tách chiết trực tiếp các conotoxin có hoạt tính dược lý từ bầu độc của ốc cối thường có hiệu suất thấp, độ tinh sạch không cao do sự đa dạng về thành phần protein trong nọc (khoảng 1000 loại) và hàm lượng của mỗi loại lại rất
2 thấp. Cho đến nay, conotoxin thường được tổng hợp bằng con đường hoá. Tuy nhiên, phương pháp tổng hợp hóa học bị hạn chế bởi cách thức tổng hợp thường qua nhiều khâu, giá thành sản xuất cao đồng thời việc tạo thành các cầu nối disulfide gặp khó khăn. Vì vậy conotoxin đang được chú trọng nghiên cứu, tạo ra bằng công nghệ ADN tái tổ hợp. Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu về conotoxin tự nhiên và tái tổ hợp vẫn còn hạn chế và mới bắt đầu được triển khai tại Phòng Hóa sinh Protein, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu biểu hiện và xác định đặc tính của omega conotoxin” với mục tiêu và nội dung như sau: Mục tiêu Tạo ra omega conotoxin tái tổ hợp (ω-CTX, viết tắt là CTX) có khả năng ứng dụng trong y dược học dưới dạng hoạt chất giảm đau. Nội dung nghiên cứu 1. Tạo phân tử CTX tái tổ hợp gồm: (i) Thiết kế và tạo dòng gen mã hóa cho CTX; (ii) Nghiên cứu biểu hiện CTX dạng dung hợp với thioredoxin (Trx- CTX) ở E. coli; (iii) Tinh sạch Trx-CTX và CTX tái tổ hợp; (iv) Xác định CTX tái tổ hợp đã được tạo ra bằng phương pháp khối phổ; (v) Xây dựng quy trình lên men 4 lít/mẻ thu nhận, tinh sạch và bảo quản CTX tái tổ hợp. 2. Thử nghiệm hoạt tính giảm đau của CTX trên chuột nhắt trắng bằng mô hình hóa chất sử dụng Formalin. Những đóng góp mới của luận án 1. Đã tạo được dòng và xác định được trình tự gen mã hoá cho CTX với kích thước 75 bp tương đồng 100% với trình tự nucleotide vùng peptide trưởng thành của conotoxin từ ốc cối biển Conus magus (ConcoSever, N01765). 2. Đã thiết kế và biểu hiện được CTX dưới dạng dung hợp với Trx ở E. coli; đã tinh sạch được CTX tái tổ hợp dạng Trx-CTX với hiệu suất 60 mg/L, hiệu suất thu hồi từ dịch chiết tế bào đạt 12% và độ sạch là 96,6%; đã tinh sạch được peptide CTX từ Trx-CTX với hiệu suất thu hồi đạt 9% và độ sạch là 97,5%; đã xác định được peptide CTX có khối lượng phân tử là 2,769 kDa bằng phương pháp khối phổ.
3 3. Trên mô hình gây đau thực nghiệm bằng Formalin ở chuột nhắt trắng, CTX tái tổ hợp được khẳng định có hoạt tính giảm đau tương đương với Lidocain nhưng với liều lượng nhỏ hơn 142 lần. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 102 trang được chia thành các phần: Mở đầu 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 22 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp 18 trang; Chương 3: Kết quả 30 trang; Chương 4: Thảo luận 9 trang; Kết luận và kiến nghị: 1 trang; Các công trình công bố của tác giả 2 trang; Tài liệu tham khảo 17 trang; Tóm tắt luận án bằng tiếng anh 6 trang; Phụ lục 5 trang. Luận án có 20 bảng số liệu, 35 hình và 150 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh. NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Độc tố thần kinh (neurotoxin) Độc tố thần kinh (hay còn gọi là neurotoxin) là các chất độc có khả năng làm tổn thương và phá huỷ các mô cũng như tế bào thần kinh. Độc tố thần kinh ức chế sự kiểm soát nồng độ ion của tế bào thần kinh qua màng tế bào hoặc ức chế sự trao đổi thông tin giữa các tế bào thần kinh qua synapse. 1.2. Conotoxin 1.2.1. Cấu trúc và phân loại Conotoxin là độc tố thần kinh nằm ở phần bầu độc của các loài ốc cối biển (Conus), có bản chất là các peptide/protein gồm 8-35 amino acid và giàu các cầu nối disulfide để cố định hình dạng phân tử làm tăng khả năng bám của conotoxin với đích đặc hiệu. Conotoxin được chia thành 5 loại gồm α-, δ-, κ-, µ- và ω- conotoxin dựa vào sự sắp xếp của các gốc cysteine trong phân tử với đích tác dụng chủ yếu là các kênh ion như Ca2+, Na+, K+ hay các thụ thể như acetylcholine, NMDA… 1.2.2. Tác dụng dược lý của conotoxin Conotoxin đang được coi như các thuốc dẫn đầu trong điều trị giảm đau thần kinh và các bệnh lý thần kinh, có tác dụng đặc hiệu trên các tổn thương thần kinh như bệnh Alzheimer, Parkinson và chứng đa xơ cứng (multiple sclerosis). Bên
4 cạnh đó các conotoxin còn có triển vọng trong các nghiên cứu về các hội chứng rối loạn co giật, đột quị, nhồi máu cơ tim, bảo vệ hệ tim mạch... Trong phần tổng quan tài liệu chúng tôi chủ yếu đề cập đến tác dụng giảm đau và bảo vệ thần kinh của conotoxin liên quan đến nội dung nghiên cứu. 1.3. Omega conotoxin MVIIA (CTX) 1.3.1. Cấu trúc của CTX CTX được tách chiết từ bầu độc của ốc cối biển Conus magus, phân tử gồm 25 amino acid, trong đó có 6 gốc cysteine tạo thành ba cầu nối disulfide giữa các vị trí 1-16, 8-20 và 15-25. 1.3.2. Tác dụng dược lý của CTX CTX khóa chọn lọc các kênh Ca2+ type N, phân bố chủ yếu ở trong các tế bào thần kinh tiền synapse. Khi CTX được truyền trực tiếp vào tuỷ sống, nó sẽ liên kết với quai P trong tiểu phần đơn vị α1 ức chế mở kênh Ca2+, ngăn cản dòng Ca2+ nhập bào đi vào trong tế bào thần kinh tiền synapse kéo theo ức chế sự giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmitters) trong cúc synape. Từ đó tín hiệu thần kinh không được truyền qua khe synape, các dẫn truyền thần kinh liên tục giữa các neuron thần kinh kế cận bị gián đoạn. Dựa trên cơ sở này mà CTX có ứng dụng làm chất giảm đau và bảo vệ tế bào thần kinh trong mô hình gây đột quị. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và hóa chất Các chủng vi sinh: Chủng E. coli DH5α (Invitrogen, Mỹ), chủng E. coli BL21 (DE3) (Novagen, Mỹ). Plasmid: Vector tác dòng pBT được cải biến từ vector pUC18 (do phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp) và vector biểu hiện pET32c(+) (Novagen, Mỹ). Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng dòng Swiss do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Học viện Quân Y, Bộ Quốc phòng cung cấp. Các hóa chất và thiết bị máy móc: Invitrogen, Novagen, Merck, New England Biolab. Qiagen, Sigma….
5 2.2. Phương pháp nghiên cứu Luận án sử dụng ba nhóm phương pháp nghiên cứu chính 2.2.1. Nhóm phương pháp tạo dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định CTX tái tổ hợp • Nhân gen mã hoá cho CTX bằng kỹ thuật PCR • Tách dòng gen mã hoá cho CTX vào vector tách dòng và vector biểu hiện • Xác định trình tự gen mã hoá cho CTX • Biểu hiện và tối ưu hoá các điều kiện biểu hiện CTX ở E. coli • Tinh sạch Trx-CTX tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực Ni-NTA và sắc ký lọc gel Sephacryl S100 • Tinh sạch peptide CTX bằng enterokinase và cột siêu lọc VIVASPIN 500 • Xác định khối lượng phân tử CTX bằng khối phổ 2.2.2. Nhóm phương pháp xác định đặc tính của CTX tái tổ hợp • Thử nghiệm hoạt tính giảm đau của peptide CTX trên mô hình chuột thực nghiệm bằng phương pháp Formalin 2.2.3. Nhóm phương pháp xử lý số liệu bằng tin sinh học • Blast, DNAclub, BioEdit, ConcoSever, ImageJ, Alalyst QS, thống kê sinh học… CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. THIẾT KẾ TẠO GEN MÃ HOÁ CHO CTX Từ kết quả khảo sát hệ protein nọc của các loài ốc cối thu thập được ở vùng biển Nha Trang, Việt Nam, hơn 40 loại conotoxin đã nhận dạng được bằng hệ thống khối phổ LC-MS/MS. Một số conotoxin có tiềm năng ứng dụng trong y dược như omega conotoxin MVIIA cũng được tìm thấy từ nguồn ốc cối của Việt Nam (Lê Thị Bích Thảo et al., 2011). Kết hợp với các thông tin về trình tự peptide và nucleotide của omega conotoxin MVIIA được tìm kiếm trên ConoServer (Hình 3.2). Chúng tôi tiến hành nghiên cứu thiết kế, biểu hiện và thử nghiệm hoạt tính giảm đau của omega conotoxin MVIIA tái tổ hợp (CTX tái tổ
6 hợp). Sơ đồ nghiên cứu trên Hình 3.1. Do kích thước gen mã hóa cho CTX khá nhỏ, gồm 75 nucleotide mã hóa cho 25 amino acid nên gen ctx được tổng hợp trực tiếp bằng 2 mồi bổ sung với nhau ctx1 với ctx 2 và ctx3 với ctx4 theo nguyên tắc bổ sung A-T, G-C. Trong đó mỗi mồi dài khoảng từ 45 - 55 bp, ctx1 chứa điểm cắt của enzyme giới hạn NcoI và ctx4 chứa điểm cắt của EcoRI để thuận lợi cho mục đích biểu hiện trong hệ vector pET32c+. Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu Hình 3.2. Kết quả tìm kiếm trình tự gen mã hoá cho CTX trên ConoServer (Nguồn: www.conoserver.org)
7 Quá trình tạo dòng gen mã hóa peptide CTX được thực hiện như sau: Trước khi thực hiện phản ứng PCR, các đoạn mồi được phosphoryl hóa bởi T4 PNK. Hỗn hợp 1 (ctx1, ctx2) và hỗn hợp 2 (ctx3, ctx4) được trộn đều với nhau, sau đó được biến tính ở 95oC trong 3 phút trước khi giảm dần xuống 45oC ở nhiệt độ phòng, tạo điều kiện thuận lợi cho các đoạn mồi bắt cặp bổ sung với nhau. Phản ứng nối hai đoạn DNA sợi đôi mới được hình thành được thực hiện bởi enzyme T4 ligase ở 14oC để tạo phân tử ctx (Hình 3.3). Hình 3.3. Sơ đồ mô tả chuỗi phản ứng tạo gen mã hóa cho peptide CTX và trình tự các cặp mồi đã thiết kế 3.2. TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA CHO CTX 3.2.1. Kết quả nhân gen mã hóa cho CTX bằng kỹ thuật PCR Sản phẩm của phản ứng nối ghép được pha loãng 200 lần và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi ctx1 và ctx4. Gen mã hóa cho protein CTX được nhân lên bằng kỹ thuật PCR có kích thước 75 bp. Cặp mồi để nhân đoạn gen này được thiết kế và tổng hợp gồm: Mồi xuôi với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn NcoI mang mã khởi đầu dịch mã ở E. coli nối với đoạn trình tự nucleotide của một nửa gen ctx. Mồi ngược là trình tự nucleotide nửa gen ctx còn lại nối tiếp với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn EcoRI mang mã kết thúc.
8 Hình 3.4. Kết quả nhân gen mã hóa cho CTX M: Thang DNA chuẩn 100 bp Đường chạy (ĐC) số 1: Sản phẩm gen mã hóa cho CTX Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,7% được thể hiện trên Hình 3.4 cho thấy, đường chạy số 1 cho một băng DNA duy nhất có kích thước khoảng 100 bp phù hợp với tính toán lý thuyết (gồm đoạn gen và mồi). Sản phẩm PCR sau đó được sử dụng trực tiếp để đưa vào vector tách dòng pBT đã mở vòng. Tổ hợp gen mới (plasmid tái tổ hợp) được tạo thành được biến nạp vào tế bào tách dòng DH5α để chọn ra dòng plasmid có khả năng mang gen mã hoá cho CTX (CTXpBT). 3.2.2. Tách dòng gen mã hóa cho CTX DNA plamid được tách chiết từ các khuẩn lạc đã chọn tiếp tục được kiểm tra song song bằng hai phương pháp gồm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn BamHI và PCR trực tiếp từ khuẩn lạc bằng cặp mồi ctx1 và ctx4 để chọn ra dòng mang gen ctx. Sản phẩm thu được từ 2 phương pháp này được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,7% (Hình 3.5 và 3.6). Kết quả trên Hình 3.5 cho thấy tại các đường chạy 4, 5, 6 và 8, mẫu DNA plasmid sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn BamHI đã xuất hiện 2 băng: băng thứ nhất có kích thước khoảng 2700 bp chính là vector pBT nguyên gốc đã được mở vòng thành dạng mạch thẳng; băng thứ hai có kích thước tương đương với kích thước của sản phẩm PCR so với thang DNA chuẩn, khoảng 100 bp. Trong khi đó tại đường chạy số 2, 3 và 7 chỉ có một băng duy nhất tương ứng với vector pBT ở đường chạy số 1. Như vậy các dòng 4, 5, 6 và 8 là các plasmid tái tổ hợp có khả năng mang gen mã hóa cho CTX
9 Hình 3.5. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt plasmid Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR tái tổ hợp bởi BamHI chọn lọc khuẩn lạc trên gel agarose 1,7% M: thang DNA chuẩn 100 bp; ĐC 1: vector pBT M: thang DNA chuẩn; ĐC 1 - 4: sản phẩm PCR nguyên thể; ĐC 2, 3 và 7: các plasmid không có tổ từ các dòng tế bào chọn kiểm tra; ĐC 5: Sản hợp gen mới chèn vào; ĐC 4, 5, 6 và 8: các phẩm PCR mục 3.1.1 plasmid có khả năng mang gen mới chèn vào Kết quả kiểm tra song song bốn dòng plasmid này bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc sử dụng cặp mồi đặc hiệu (ctx1 và ctx4) với đối chứng dương là sản phẩm PCR trong Hình 3.4 được thể hiện trên Hình 3.6 cũng cho kết quả tương tự, thu được một băng DNA duy nhất có kích thước khoảng 100 bp so với thang DNA chuẩn. Như vậy 4 dòng tế bào 4, 5, 6 và 8 trong Hình 3.5 có khả năng chứa gen mã hóa cho CTX. 3.2.3. Kết quả xác định trình tự gen mã hóa cho CTX Hai trong bốn dòng tế bào có khả năng mang gen mã hóa cho CTX được tiến hành kiểm tra xác định trình tự gen trên Hệ thống ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Mồi M13F và M13R được sử dụng để đọc kiểm tra từ 2 đầu của đoạn gen. Mỗi dòng plasmid được tiến hành đọc 3 lần để đảm bảo độ chính xác theo nguyên tắc thống kê. Kết quả xác định trình tự của cả 2 dòng plasmid là giống hệt nhau sau khi xử lý bằng các phần mềm tin sinh Clutal X và BioEdit (Hình 3.8). Kết quả trên Hình 3.8 đã cho thấy gen được tạo dòng có kích thước 75 bp, có độ tương đồng 100% so với trình tự nucleotide vùng peptide trưởng thành của ctx được tìm thấy trên ConoServer với số đăng ký N01765. Đồng thời đoạn nucleotide này mã hóa cho 25 amino acid cũng có độ tương đồng 100% với trình tự của peptide CTX với số đăng ký trên. Các kết quả trên khẳng định gen mã hóa cho CTX đã được dòng hóa vào vector pBT.
10 CTX1 CTX3 N01756 CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC CTX CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Hình 3.8. Phổ trình tự nucleotide đoạn gen ctx mã hóa cho ω-conotoxin MVIIA và so sánh trình tự amino acid của CTX với trình N01765 trên ConoSever 3.3. BIỂU HIỆN CTX TÁI TỔ HỢP 3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện CTXpET32c Gen mã hóa cho CTX sau khi đã được tách dòng vào vector pBT và xác định đúng trình tự thiết kế được chuyển vào vector pET32c (+) để biểu hiện. Vector tách dòng CTXpBT và vector pET32c cùng đồng thời được xử lý với hai enzyme giới hạn là NcoI và EcoRI để tạo đầu dính tương hợp giữa đoạn gen cần chèn và vector (Hình 3.9). Hình 3.9. (A) Điện di sản phẩm cắt bởi NcoI và EcoRI. (B) Điện di sản phẩm sau khi thôi gel M: thang DNA chuẩn; ĐC 1: pET32c+ đã mở vòng; ĐC 2: Sản phẩm PCR; ĐC 3: CTXpBT sau khi xử lý bởi NcoI và EcoRI; ĐC 4: ctx sau khi thôi gel; ĐC 5: pET32c+ mở vòng sau khi thôi gel.
11 Kết quả trên Hình 3.9 A là sản phẩm sau khi xử lý bằng 2 enzyme giới hạn NcoI và EcoRI cho thấy, đường chạy (ĐC) số 1 có một băng DNA duy nhất có kích thước 5,9 Kb, đây là vector pET32c+ đã mở vòng. ĐC số 3 xuất hiện 2 băng: băng trên có kích thước 2,7 Kb là vector pBT bị cắt văng ra và băng thấp hơn có kích thước khoảng 100 bp tương đương với sản phẩm PCR ở đường chạy số 2 là gen mã hóa cho CTX. Sử dụng kít QIAGEN để tách vector pET32c+ và gen đích như đã mô tả ở phần phương pháp. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel (Hình 3.9 B) cho thấy, các băng DNA thôi ra đạt độ tinh sạch cần thiết để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Gen mã hóa cho CTX và vector pET32c+ được nối ghép với nhau nhờ enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm gắn kết được biến nạp vào chủng E. coli DH5α để chọn dòng những vector pET32c (+) có chứa gen ctx. Vector tái tổ hợp này được ký hiệu là CTXpET32c và sau đó được biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3) để biểu hiện. 3.3.2. Biểu hiện CTX tái tổ hợp Tế bào E. coli BL21(DE3) chứa tổ hợp gen mới CTXpET32c được nuôi cấy trên môi trường LB đặc sau đó được chuyển sang môi trường LB lỏng đều được bổ sung kháng sinh ampicillin đến nồng độ cuối cùng 100 µg/ml. Dịch tế bào sau khi cấy chuyển với tỷ lệ 1%, nuôi lắc ở 37oC đến khi OD600 đạt từ 0,6 - 0,8 thì được cảm ứng bởi IPTG đến nồng độ cuối cùng 0,5 mM. Sinh khối tế bào được thu ở các thời điểm 0h (trước khi cảm ứng) và 3h (sau khi cảm ứng) để tiến hành điện di kiểm tra sự biểu hiện của protein dung hợp mới. Hình 3.10. Biểu hiện protein dung hợp Trx-CTX trên gel polyacrylamide 12,6% M: thang protein chuẩn SM0431; ĐC 0h: protein tổng số tại thời điểm 0 giờ (trước khi cảm ứng); ĐC 3h: protein tổng số tại thời điểm 3 giờ (sau cảm ứng).
12 Protein tổng số được biểu hiện từ các dòng tế bào cảm ứng và đối chứng không cảm ứng của cùng một dòng tế bào được kiểm tra điện di bằng SDS- PAGE 12,6% (Hình 3.10). Kết quả trên Hình 3.10 cho thấy, ở đường chạy 3h là protein tổng số tại thời điểm 3 giờ sau khi cảm ứng bởi IPTG, xuất hiện một băng protein mới so với đường chạy 0h là protein tổng số tại thời điểm 0 giờ (trước khi cảm ứng), có kích thước khoảng 20,5 kDa so với thang protein chuẩn. Thực chất CTX chỉ có kích thước khoảng 3 kDa, nhưng khi được biểu hiện trong vector pET32c+ sẽ tạo ra protein dung hợp với thioredoxin (Trx) và một nhóm 6 gốc Histidine trong vector pET32c+, do vậy băng protein mới xuất hiện có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết (bao gồm 109 amino acid của Trx và đuôi His.Tag). 3.3.3. Khảo sát các điều kiện biểu hiện CTX tái tổ hợp ở E. coli Sau khi protein tái tổ hợp được biểu hiện, việc tối ưu hoá điều kiện biểu hiện và khả năng tan của protein tái tổ hợp đóng vai trò then chốt và quyết định cho quá trình tinh sạch cũng như kiểm tra hoạt tính của protein này. Các điều kiện biểu hiện được thiết lập theo thời gian, nồng độ IPTG, độ pH của môi trường và thời gian thu mẫu là các thông số quan trọng phục vụ quá trình lên men. 3.3.3.1. Khảo sát mức độ biểu hiện và độ tan của CTX tái tổ hợp theo nhiệt độ Dòng thế bào E. coli BL31(DE3) chứa plasmid CTXpET32c đã được nghiên cứu biểu hiện ở 4 nhiệt độ khác nhau là 22, 28, 30 và 37oC để so sánh độ tan cũng như mức độ biểu hiện của CTX tái tổ hợp. Sau 1 giờ cảm ứng bởi IPTG, sinh khối tế bào được thu lại. Siêu âm phá màng tế bào trong đệm thích hợp (50 mM Tris HCl pH 7; 0,01% Triton X100 và 0,0001% Lysozyme) rồi sau đó ly tâm chia thành 2 pha: pha cặn và pha tan. Các mẫu của 2 pha được điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE 12,6% (Hình 3.11). Kết quả nhận được cho thấy, ở cả 4 điều kiện nhiệt độ đã khảo sát, protein tái tổ hợp hầu hết xuất hiện ở pha tan (đường chạy T) với 1 băng đậm, rõ nét có kích thước khoảng 20,5 kDa so với thang protein chuẩn mà không thấy hoặc xuất hiện với hàm lượng nhỏ so với pha cặn (Đường chạy C) và dòng tế bào không được cảm ứng bởi IPTG (ĐC 1).Kết quả định lượng sự biểu hiện của protein dung hợp ở 4 nhiệt độ đã khảo sát bằng phần mềm ImageJ cho thấy mức độ biểu hiện của
13 protein dung hợp ở 22oC là thấp nhất, ở 28oC tăng 1,8 lần, ở 30oC tăng 2,3 lần và ở 37oC tăng 4,5 lần so với mức độ biểu hiện của protein này ở 22oC (Bảng 1, phụ lục). Tại 37oC, protein dung hợp Trx-CTX được biểu hiện nhiều nhất vì đây là nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn hoạt động. Do đó khi lên men sản xuất lượng lớn có thể tạo ra hiệu suất biểu hiện cao hơn nhờ điều kiện sinh trưởng tối ưu của chủng tái tổ hợp này là 370C. Hình 3.11. Mức độ biểu hiện và độ tan của protein dung hợp Trx-CTX ở nhiệt độ khác nhau M: Thang protein chuẩn SM0431 (Fermentas); ĐC 1: Protein tổng số biểu hiện không được cảm ứng bởi IPTG; ĐC C: Protein pha; ĐC T: Protein pha tan. Như vậy có thể nhận thấy phần lớn protein tái tổ hợp (Trx-CTX) được biểu hiện ở pha tan và không phụ thuộc vào các nhiệt độ đã nghiên cứu. 3.3.3.2. Khảo sát mức độ biểu hiện của CTX tái tổ hợp theo nồng độ chất cảm ứng IPTG Kết quả khảo sát (Hình 3.12) cho thấy, mức độ biểu hiện của Trx-CTX thay đổi theo các nồng độ chất cảm ứng IPTG. Bắt đầu cảm ứng với nồng độ 0,2 mM IPTG thì xuất hiện băng protein mới so với chế độ nuôi không cảm ứng (ĐC số 9). Kết quả định lượng sự biểu hiện của protein dung hợp cho thấy tại nồng độ 0,5mM IPTG, Trx-CTX được biểu hiện nhiều nhất và gấp khoảng 4 lần so với mức độ biểu hiện của protein này khi cảm ứng bởi 0,2 mM IPTG. Mức độ biểu hiện của Trx-CTX ở nồng độ IPTG là 0,7 mM gấp 3 lần so với mức độ biểu hiện của protein này ở 0,2mM. Mức độ biểu hiện của Trx-CTX thay đổi không đáng kể ở nồng độ cảm ứng 0,9 mM IPTG và 1,2 mM IPTG sau đó giảm dần theo nồng độ chất cảm ứng (Bảng 2, Phụ lục). Điều này có thể giải thích do IPTG dư thừa đã ức chế sự sinh tổng hợp protein dung hợp. Như vậy chủng E. coli BL21(DE3) mang plasmid CTXpET32c biểu hiện tối ưu tại 0,5 mM IPTG.
14 Hình 3.12. Mức độ biểu hiện của Trx-CTX theo nồng độ chất cảm ứng IPTG M: Thang protein chuẩn SM0431 (Fermentas); ĐC 1- 8: Protein tổng số của vi khuẩn sau 2h cảm ứng biểu hiện bằng IPTG ở các nồng độ khác nhau; ĐC 9: Protein tổng số của vi khuẩn không được cảm ứng bởi IPTG. 3.3.3.3. Khảo sát mức độ biểu hiện của Trx-CTX theo pH môi trường nuôi cấy Mức độ biểu hiện của Trx-CTX khác nhau ở các điều kiện pH (từ 6 – 8) đã nghiên cứu (Hình 3.13). Tại pH bằng 7,0, mức độ biểu hiện của Trx-CTX là cao nhất so với các pH môi trường là 6; 6,5; 7,5 và 8. Nhìn chung, chủng E. coli tái tổ hợp sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp Trx-CTX tốt trong dải pH từ 6-8 song tốt nhất ở pH 7,0 (Bảng 3, phụ lục). Hình 3.13. Mức độ biểu hiện của Trx-CTX theo pH môi trường nuôi cấy M: Thang protein chuẩn SM0431 (Fermentas); ĐC 1: Protein tổng số của vi khuẩn không được cảm ứng bởi IPTG. ĐC 2-8: Protein tổng số của vi khuẩn sau 3h cảm ứng biểu hiện bằng 0,5 mM IPTG ở các môi trường pH khác nhau. 3.3.3.4. Khảo sát thời gian thu mẫu Tiến hành khảo sát thời gian thu mẫu của chủng E. coli mang plasmid CTXpET32c khi được biểu hiện ở 37oC ở quy mô nuôi trong bình tam giác 500 ml. Sau 3 giờ cấy chuyển mật độ tế bào OD600nm đạt 0,7 là thời điểm thích hợp
15 tiến hành cảm ứng với IPTG. Sau 11 giờ cảm ứng, mật độ tế bào cao nhất sau đó giảm dần (Hình 3.14). Hình 3.14. Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy và giá trị OD600nm dịch lên men chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) biểu hiện Trx-CTX trong bình tam giác 500 ml Mức độ biểu hiện của protein dung hợp tại các thời điểm thu mẫu được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE (Hình 3.15). Hình 3.15. Mức độ biểu hiện của Trx-CTX theo thời gian thu mẫu trên SDS- PAGE M: Thang protein chuẩn SM0431 (Fermentas); ĐC 1h-13h: Protein tổng số của vi khuẩn tại các thời điểm 1 giờ -13 giờ sau khi cảm ứng. Kết quả thể hiện trên Hình 3.15 cho thấy, mức độ biểu hiện của protein dung hợp Trx-CTX tăng dần theo thời gian thu mẫu đến từ 2 giờ đến 11giờ sau khi cảm ứng, đến thời điểm 13 giờ (hay 16 giờ tính từ khi nuôi cấy), mức độ biểu hiện prtoein tái tổ hợp giảm hẳn. Như vậy, thời điểm thu mẫu tốt nhất là sau 11 giờ cảm ứng hay sau 14 giờ nuôi cấy trong bình tam giác.
16 Từ các kết quả khảo sát cho thấy, CTX tái tổ hợp được biểu hiện tốt ở 37oC, pH 7,0, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM và sinh khối tế bào đạt giá trị cực đại sau 14 giờ khi nuôi cấy trong bình tam giác, đồng thời độ tan của protein tái tổ hợp không phụ thuộc vào các nhiệt độ đã khảo sát. 3.4. TINH SẠCH CTX TÁI TỔ HỢP 3.4.1. Tinh chế protein dung hợp Trx-CTX bằng sắc ký ái lực Ni-NTA và sắc ký lọc gel Sephacryl S100 Gen ctx được biểu hiện trong hệ vector pET32c sẽ dung hợp cùng đoạn DNA mã hóa cho 109 amino acid của Trx, tăng tính tan của protein được biểu hiện và trình tự mã hóa cho His.Tag tạo điều kiện thuận lợi cho bước tinh sạch tiếp theo. Hình 3.16. SDS-PAGE của các phân đoạn protein thu được sau sắc ký ái lực Ni-NTA M: Thang protein chuẩn (SM 0431- Fermentas); ĐC T: Pha tan đưa lên cột sắc ký ái lực; ĐC F1-F6: Các phân đoạn sắc ký ái lực thu được. Các phân đoạn thu được sau sắc ký ái lực được gom lại và thẩm tích loại muối sau đó cho qua cột sắc ký lọc gel Sephacryl S-100. Nồng độ protein của các phân đoạn này được định lượng bằng phương pháp Bradford (Bảng 10, Phụ lục). Phân đoạn protein tinh sạch từ sắc ký ái lực và sắc ký lọc gel được điện di trên gel SDS-PAGE 12,6 % để kiểm tra độ sạch của protein tái tổ hợp thu được bằng phần mềm định lượng ImageJ (Hình 3.17).
17 Hình 3.17. Điện di protein kiểm tra các phân đoạn tinh chế Trx- CTX bằng sắc ký ái lực Ni-NTA và sắc ký lọc gel S-100 trên gel polyacrylamide 12,6% M: thang protein chuẩn. Kết quả thể hiện trên Hình 3.17 cho thấy pha tan (ký hiệu là Tan) chứa phần lớn protein tái tổ hợp so vớ pha cặn (ký hiệu là Cặn) sau ly tâm. Kết quả này phù hợp với kết quả khảo sát mức độ tan của protein tái tổ hợp Trx-CTX ở Mục 3.3.3.1. Phân đoạn sau khi tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA vẫn còn 1 số băng phụ, trong khi đó phân đoạn protein sau khi đi qua cột Sephacryl S-100 chỉ có một băng protein duy nhất chứng tỏ qua 2 lần sắc ký protein tái tổ hợp đã đạt được độ tinh sạch cần thiết để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Nồng độ protein của phân đoạn thu được qua cột sắc ký lọc gel được xác định bằng phương pháp Bradford là 5 mg/ml (Bảng 10, Phụ lục). Kết hợp với kết quả định lượng bằng phần mềm ImageJ, chúng tôi xác định được độ sạch của Trx-CTX qua 2 lần sắc ký là 96,6 % (Bảng 3.3) Như vậy, hiệu suất của quá trình lên men biểu hiện và tinh sạch Trx-CTX trong bình tam giác đạt 9 mg/200 ml dịch tế bào nuôi cấy, tương đương với 45 mg/L dịch tế bào nuôi cấy. 3.4.2. Lên men thu sinh khối E. coli BL21 (DE3) mang plasmid CTXpET32c ở qui mô 4 lít/ mẻ Các thử nghiệm xác định đặc tính của Trx-CTX đòi hỏi một lượng protein tái tổ hợp lớn, do đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu lên men thu protein này ở quy mô 4lít/mẻ sử dụng hệ thống lên men BioFlo 110 Fermentor (Mỹ) (Hình 3.18).
18 Hình 3.18. Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy và giá trị OD600nm dịch lên men chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) biểu hiện Trx-CTX Đường màu xanh: Đường cong sinh trưởng của tế bào lên men ở bình tam giác 500 ml; Đường màu đỏ: Đường cong sinh trưởng của tế bào lên men ở qui mô 4 lít/mẻ. Kết quả trên Hình 3.18 cho thấy, đường màu đỏ là đường cong sinh trưởng của chủng tế bào E. coli BL21 (DE3) biểu hiện trong bình lên men 4 lít. Tại thời điểm 2,7 giờ sau khi cấy chuyển mật độ tế bào OD600nm đạt 0,795 thì tiến hành cảm ứng với IPTG đến nồng độ cuối cùng 0,5 mM. Sau 10 giờ nuôi cấy mật độ tế bào đạt lớn nhất là 5,0 sau đó giảm dần. Đây là thời gian thích hợp để dừng quá trình lên men. Trong khi đó mật độ tế bào nuôi trong bình tam giác đạt giá trị cực đại sau 14 giờ nuôi cấy là 4,7. Điều này có thể lý giải là do khi được nuôi cấy trong hệ thống lên men với các ưu việt như pH môi trường và nồng độ oxy hòa tan được điều chỉnh ổn định nên tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn trong bình lên men nhanh hơn ở bình tam giác. Sinh khối tế bào được thu lại theo đơn vị 200 ml dịch nuôi cấy và tiến hành siêu âm phá tế bào và tinh chế Trx-CTX bằng sắc ký ái lực và sắc ký lọc gel. Hiệu suất của quá trình lên men, biểu hiện và tinh sạch đạt 12 mg/200 ml dịch sinh khối tế bào lên men hay tương đương 60 mg/L dịch sinh khối tế bào. Như vậy khi lên men bằng hệ thống BioFlo, hiệu suất sinh tổng hợp Trx-CTX đã tăng lên 60 mg/L dịch sinh khối tế bào. 3.4.3. Tinh sạch peptide CTX Gen mã hóa cho CTX được thiết kế trong vector pET32c+ dưới dạng sơ đồ hóa trong Hình 3.19. Enterokinase cắt sau gốc Lys của trình tự 5 amino acid Asp