Tóm tắt luận án Tiễn sĩ Sinh học: Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:25

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm khảo sát hoạt tính sinh học của các alkaloid phân lập từ rễ tơ cây Bá bệnh để tìm ra những hoạt tính mới; xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu để rễ tơ cây Bá bệnh sinh trưởng và phát triển... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiễn sĩ Sinh học: Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Trần Thu Trang NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ ALKALOID CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI RỄ TƠ CÂY BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR 20 LÍT Chuyên ngành: Hoá sinh học Mã số: 9 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội-2020 1
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Chu Nhật Huy Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. Phạm Bích Ngọc Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201…. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam 2
MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) là cây thuốc phổ biến ở nước ta, phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Trung, Kon tum, Đồng Nai, Phú Quốc và Vườn quốc gia Bái Tử Long. Cây Bá bệnh được dùng bồi bổ sức khoẻ, tăng lượng testosterone ở nam giới, có hoạt tính kháng viêm mạnh, chống ung thư tốt và một số tác dụng khác như chữa sốt rét, chống loãng xương, trị tiểu đường...Các công trình nghiên cứu về cây Bá bệnh cho thấy cây có chứa nhiều hoạt chất alkaloid có giá trị trong kháng sốt rét, chống viêm, gây độc tế bào ung thư và tăng cường sinh lực… Hiện nay, cây Bá bệnh đang bị khai thác quá mức ngoài tự nhiên do nhu cầu sử dụng thảo dược ngày càng tăng. Hơn nữa, Bá bệnh khó nuôi trồng và nhân rộng, với thời gian thu hoạch được rễ có chất lượng phải cần ít nhất 5-6 năm dẫn tới nguồn nguyên liệu cung cấp cho sản xuất dược phẩm còn gặp nhiều khó khăn. Đến nay, nuôi cấy rễ được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu nhận ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch trong thời gian ngắn từ 30- 40 ngày làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược liệu. Công nghệ nuôi cấy mô sẹo hay nuôi cấy huyền phù tế bào cần phải bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (CĐHST). Tuy nhiên, sự tồn dư CĐHST ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người sử dụng. Vấn đề này có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối rễ tơ do rễ tơ có thể sinh trưởng và phát triển liên tục không cần bổ sung CĐHST. Hơn thế, rễ tơ có nhiều ưu điểm khác như có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo. Trong nuôi cấy in vitro, việc gây kích kháng hay bổ sung các elicitor giúp tăng đáng kể khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong quá trình nhân nhanh sinh khối rễ. Nuôi cấy rễ tơ Bá bệnh in vitro, dù môi trường giàu dinh dưỡng giúp rễ phát triển nhanh, nhưng hàm lượng alkaloid phân tích được rất thấp. Hơn nữa, quá trình tích lũy một số chất không diễn ra do thiếu một số yếu tố kích kháng, dẫn đến hàm lượng alkaloid nội sinh thấp hơn so 3
với rễ thu ngoài tự nhiên. Kể từ khi các stress do sự thay đổi về ánh sáng, nhiệt độ hay tác động từ các tác nhân gây hại cây trồng được phát hiện làm kích thích tích lũy các hợp chất thứ cấp thông qua con đường truyền tín hiệu của các elicitor như jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), yeast extract (YE)… lần lượt kích hoạt biểu hiện các gen phòng vệ, đồng thời sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Các elicitor đã được ứng dụng rộng rãi vào nuôi cấy để gia tăng hoạt chất saponin trong nuôi cấy nhiều loài cây dược liệu quý. Việc nghiên cứu bổ sung các elicitor trong việc tăng cường khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro vẫn chưa có. Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao; do việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dể bị nhiễm. Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới làm sao có thể tự động hóa giúp giảm thiểu nhân công, thời gian và số lượng cây nhiều. Trong nuôi cấy lỏng người ta chia ra ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy bioreactor, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh cơ quan. Hiện nay đang có xu hướng dùng bioreactor để nhân sinh khối rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp. Xuất phát từ các cơ sở khoa học và luận cứ trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài nhằm tìm kiếm những alkaloid có hoạt tính sinh học đồng thời nghiên cứu những hoạt tính mới từ những alkaloid từ đó nghiên cứu nuôi cấy tăng tích luỹ hàm lượng các alkaloid bằng cách bổ sung các elicitor. Sau đó, rễ tơ được nghiên cứu nhân sinh khối lớn phục vụ định hướng làm dược liệu bằng cách tối ưu hoá hệ thống bioreactor 20 lít "Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít”. 4
Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát hoạt tính sinh học của các alkaloid phân lập từ rễ tơ cây Bá bệnh để tìm ra những hoạt tính mới. Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu để rễ tơ cây Bá bệnh sinh trưởng và phát triển. Xác định nồng độ của ba elicitor (Salicylic acid, Jasmonic acid và Yeat extract) lên quá trình sản xuất và tích luỹ các alkaloid phân lập được từ rễ tơ cây Bá bệnh in vitro. Xây dựng được hệ thống bioreactor 20 lít để nhân sinh khối rễ tơ. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cao chiết alkaloid trong sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh Nội dung 2: Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng rễ tơ và tích luỹ các alkaloid (1) 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1- propenoic acid) (7-MCPA), (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9- hydroxycanthin-6-one trong rễ tơ cây Bá bệnh. Nội dung 3: Xây dựng kỹ thuật nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ thống bioreactor 20 lít. Đánh giá hàm lượng của các alkaloid (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one có trong sinh khối thu được nuôi cấy ở hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ tự nhiên. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về cây Bá bệnh Bá bệnh, còn gọi là mật nhân, bách bệnh, mật nhơn, bá bịnh có tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Simaroubaceae. Về đặc điểm hình thái thực vật, Bá bệnh là loại cây gỗ nhỏ, thân nhỏ, cao 2-8 m ít phân cành, lúc nhỏ ít khi có nhánh, vỏ và rễ rất đắng. Lá dài, gồm hơn 10 cặp lá chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất ngắn, gốc lá thuôn, đầu nhọn, mặt trên bóng, mặt dưới có lông màu xám. Toàn cây (trừ quả chín) có vị đắng . 5
1.2. Ứng dụng của cây Bá bệnh trong Y học cổ truyền Bá bệnh được dùng nhiều trong y học cổ truyền để chữa bệnh đau lưng, khó tiêu, thuốc bổ sau khi sinh đẻ, sử dụng để điều trị sốt, vàng da, suy mòn và cổ chướng. Bá bệnh là một trong những thuốc dân gian phổ biến cho các tác dụng kích thích tình dục và điều trị sốt rét. Nước lá nấu được sử dụng trị ngứa ngoài da, trong khi quả được sử dụng chữa kiết lỵ, vỏ được sử dụng như một loại thuốc tẩy giun. Rễ được sử dụng để chữa rối loạn chức năng tình dục, lão hóa… 1.3. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 1.3.1. Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối rễ tơ Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các rễ nhỏ có lông được sản sinh ra mạnh mẽ tại vị trí bị nhiễm bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao. Năm 1981, Takayama và Misawa đã đề xuất một hệ thống nuôi cấy lỏng có hệ thống sục khí chủ động từ bên ngoài vào với tên gọi Bioreactor. Hệ thống bioreactor là thường được dùng nhiều, chủ yếu để nuôi cấy huyền phù tế bào và sản xuất hoạt chất thứ cấp trên nhiều đối tượng nghiên cứu khác nhau và hiện nay đang có xu hướng dùng bioreactor để nuôi cấy rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp. 1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp HCTC trong nuôi cấy rễ tơ Sự lựa chọn dòng, hình thái của rễ tơ sau khi đã chuyển gen, sự tương tác giữa thực vật và vi sinh vật, giai đoạn phát triển của rễ tơ trong quá trình nuôi cấy, các yếu tố khác… 1.3.3.Ảnh hưởng của elicitor đến tích luỹ các HCTC trong quá trình nuôi cấy rễ tơ 6
Elicitor là các hợp chất kích thích mọi dạng tự vệ của thực vật. Định nghĩa rộng về các elicitor bao gồm các chất của yếu tố gây bệnh (ngoại sinh) hoặc được giải phóng bởi chính thực vật do phản ứng với yếu tố gây bệnh (nội sinh). Các elicitor có thể gây ra một loạt các phản ứng phòng vệ dẫn đến gen được biểu hiện và kích thích tích luỹ các HCTC trong điều kiện không gây ảnh hưởng đối với thực vật hay trong nuôi cấy tế bào. 1.3.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về nuôi cấy sinh khối rễ tơ thu nhận các HCTC Ở trên thế giới đã có một số tác giả nghiên cứu về rễ tơ của một số loài khác nhau, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về rễ tơ của loài Bá bệnh. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Bá bệnh mới chỉ dừng lại ở phân tích thành phần hóa học và các tác dụng dược lý, những nghiên cứu về rễ tơ của một số loài cũng còn rất hạn chế. Việc nghiên cứu thu nhận sinh khối rễ tơ của các loài cây dược liệu và thu nhận HCTC hiện nay không chỉ dừng ở quy mô phòng thí nghiệm mà đã được công nghiệp hoá bằng nuôi cấy bioreactor. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Chúng tôi sử dụng sinh khối khô rễ tơ cây Bá bệnh (90 g) và rễ tơ cây Bá bệnh được nuôi cấy trên môi trường thạch do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp. Rễ tự nhiên cây Bá bệnh được thu thập tại vườn Quốc gia Bái Tử Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn - Kỳ Thượng, Hoành Bồ, Quảng Ninh 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hoá học các chất từ cao chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng 7
hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H-COSY). Phân lập các chất từ cao chiết alkaloid Alkaloid (651mg) SKC SiO2, Grad CH2Cl2 /MeOH (25:1) F1 F2 F3 F4 F5-F11 F12 SKC SiO2, Grad Rửa kết tinh bằng SKC SiO2, Grad MeOH/H20 (3:1) CH2Cl2 CH2Cl2 /MeOH (20:1) Chất 3 Chất 1 F2.1 F2.2-F2.4 15 mg 29,6 mg Rửa kết tinh bằng Chất mới n-hexane 9-hydroxycanthin-6-one 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1- yl)-(E)-3-propenoic acid Chất 2 96 mg 9-methoxycanthin-6-one 2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro 2.1.2.1 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của A Monks (1991). Phép thử này xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). 2.1.2.2 Thử khả năng ức chế sự sản xuất của IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực bào RAW264.7, chuột và THP-1 kích thích bởi LPS Dòng tế bào được nuôi trong đĩa 48 giếng, chứa 5x105 tế bào/ml. Lấy 1 ml tế bào thêm vào 1 µl mẫu thử sao cho nồng độ cuối cùng của chất thử là (1, 3, 10, 30 µM). Ủ hỗn hợp ở 37o C, 5% CO2 trong 30 phút trước khi được kích thích với 1 µg/mL LPS (Sigma, Tokyo, Japan). Dịch nổi được thu sau 24 giờ. Nồng độ cytokine IL-6 và TNF-α của tế bào đại thực bào chuột, RAW264.7, THP-1 được xác định bằng ELISA (Quantikine ELISA của R&D) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Số liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình của ít nhất 3 lần lặp lại. Giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính ImageJ 1.50i 8
2.2.3 Thực nghiệm và phương pháp định lượng các alkaloid thông qua phương pháp HPLC-DAD. Xây dựng phương pháp phân tích mẫu Bá bệnh: kí hiệu ĐK-Bb Cột sắc ký Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm) Detector DAD, bước sóng phát hiện 272 nm. Nhiệt độ cột 25oC Tốc độ dòng 0,5 ml/ph Nồng độ mẫu 10 mg/ml Thể tích tiêm mẫu 10 µl Pha động ACN-H2O, chương trình gradient dung môi: Thời gian (phút) 0 10 35 45 60 ACN (% thể tích) 10 20 50 90 90 Định lượng các chất sạch (1), (2), (3) bằng cách so sánh diện tích pic của mẫu thử với giá trị diện tích pic trên đường chuẩn => Định lượng các chất sạch (1), (2), (3) bằng cách so sánh diện tích pic của mẫu thử với giá trị diện tích pic trên đường chuẩn. 2.2.4. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh trên bình tam giác 500 ml Một số yếu tố như trạng thái môi trường, ánh sáng, chiều dài mẫu ban đầu, khối lượng rễ cấy chuyển, các elicitor jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), yeast extract (YE) được đánh giá ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích luỹ hợp chất (1), (2), (3) trong nuôi cấy rễ tơ. 2.2.5. Xây dựng quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ thống Bioreactor 20 lít Dựa trên hệ thống bioreactor lên men vi sinh vật có sẵn thiết kế một số mẫu bioreactor sử dụng được cho các thí nghiệm nuôi cấy sinh khối với các dung tích 5 – 20 lit. Dựa vào tài liệu tham khảo, tôi lựa chọn mô hình bioreactor dạng sủi bọt dạng cầu để nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh. 9
Ống thoát khí Ống dẫn khí Ống tiếp môi trường Màng lọc khí ống nối Đầu sục khí Hình 2.5. Mô phỏng các bộ phận của hệ thống bioreactor 20 lít sủi bọt dạng cầu tự tạo CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định cấu trúc hoá học của các chất phân lập được từ cao chiết alkaloid Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học của cao chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh được nghiên cứu. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cao chiết alkaloid cho thấy cây có chứa các hợp chất β-Carboline alkaloids (7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid), hợp chất Canthin-6-one alkaloids (9-methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6- one) Chất (1): 7-methoxy- Chất (2): 9- Chất (3): 9- (9H-β-carbolin-1-il)- methoxycanthin-6-one methoxycanthin-6- (E)-1-propenoic acid one 3.2. Hoạt tính sinh học của các chất 7-MCPA , 9-methoxycanthin-6-one, 9- hydroxycanthin-6-one 3.2.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư của các chất thử (1), (2), (3) Các kết quả thử nghiệm cho thấy: hợp chất (2) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào tốt hơn chất (3) trên dòng KB, LU-1, MCF-7, HepG2 (bảng 3.1). So sánh cấu trúc hợp chất (2) và (3) cho thấy 2 chất này chỉ khác nhau nhóm 10
methoxy và hydroxy gắn ở vị trí cacbon số 7. Có thể nói, nhóm chức methoxy có thể đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính ức chế dòng tế bào KB, MCF7, LU-1, HepG2 của chất (2). Chất (1) có hoạt tính gây độc tế bào tốt trên dòng MCF-7 với IC50 đạt 6,3 (µg/ml). Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của các chất thử (1), (2), (3) Chất Dòng tế IC50 STT thử bào % ức chế tại nồng độ (µg/ml) 100 20 4 0,8 1 (1) MCF-7 98,8 90,6 27,7 2,9 6,3 KB 95,7 73,9 20,8 9,1 10,3 2 LU-1 97,0 76,5 25,2 9,3 8,6 (2) MCF-7 98,2 72,8 29,8 8,5 8,4 HepG2 96,9 66,7 32,3 9,2 9,3 KB 95,4 47,2 14,2 0,11 23,5 3 LU-1 92,8 61,3 32,3 11,4 11,2 (3) MCF-7 75,5 36,6 19,4 9,8 39,7 HepG2 84,2 39,9 15,1 9,2 34,2 KB: Ung thư biểu mô; LU-1 ung thư phổi; MCF-7 ung thư vú; HepG2 ung thư gan 3.2.2. Thử khả năng ức chế sự sản xuất của IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực bào chuột và người kích thích bởi LPS của chất (1), (2), (3) Các kết quả ở bảng 3.2 cho thấy b-carboline alkaloid 7-MCPA (1), 9-methoxycanthin-6-one (2) phân lập từ nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α ở cả ba dòng đại thực bào RAW264.7, chuột và người THP-1 kích thích LPS. Chất 7-MCPA được nhóm nghiên cứu Dang và cs, năm 2016 làm sáng tỏ cơ chế phân tử hoạt động chống viêm thông qua con đường p38 MAPK phụ thuộc ROS và hiệu ứng chống viêm kết hợp với hoạt hóa con đường Nrf2/HO-1. Cần tiếp tục nghiên cứu hoạt chất 9- methoxycanthin-6-one có tương tác với con đường NF-κB trong các đại thực bào được kích thích bằng LPS hay không. Chất (3) thể hiện ức chế IL-6 và 11
TNF-α ở hai dòng đại thực bào RAW264.7 và chuột, ức chế kém trên dòng THP-1. Bảng 3.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 và TNF-α của tế bào Nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 và TNF-α của tế bào IC50 (µM) STT Chất IL-6 TNF-α thử RAW ĐTB THP- RAW ĐTB THP- 264.7 ở 1 264.7 ở 1 chuột chuột 1 (1) 4,5 12,8 9,9 6,6 12,4 16,0 2 (2) 4,2 3,7 17,2 10,2 3,5 10,0 3 (3) 1,4 4,1 53,7 10,1 0,95 45 3.3. Xây dựng đường chuẩn định lượng các alkaloid trong các mẫu Bá bệnh bằng phương pháp HPLC-DAD Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn ba alkaloid (1), (2), (3) Chất chuẩn (1) Chất chuẩn (2) 9- Chất chuẩn (3) 9- 7-MCPA methoxycanthin-6- hydroxycanthin- one 6one TT Diện tích Nồng Diện tích Nồng Diện tích Nồng độ pic độ pic độ pic (µg/ml) (mAU.s) (µg/ml) (mAU.s) (µg/ml) (mAU.s) 1 0 0 0 0 0 0 2 1 44,62 10 371,63 10 427,03 3 5 310,79 25 1004,75 25 1049,06 4 10 504,07 50 1848,17 75 3692,95 5 25 1434,35 125 4285,08 125 6549,70 6 50 2821,10 250 8528,45 250 12948,40 12
(A) (B) © Hình 3.10. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ chất chuẩn A) Chất chuẩn (1); B) Chất chuẩn (2); C) Chất chuẩn (3) Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic đáp ứng trong khoảng nồng độ khảo sát đối với các hợp chất nghiên cứu. Định lượng: Các mẫu cao chiết rễ tơ và rễ tự nhiên cây Bá bệnh được bơm vào hệ thống sắc ký với các điều kiện phân tích (ĐK-Bb) được trình bày ở phần phương pháp. Kết quả hàm lượng các chất được tính toán bằng cách so sánh diện tích pic của mẫu thử với giá trị diện tích pic trên đường chuẩn. 3.4. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và tích luỹ các chất (1), (2), (3) của rễ tơ trên bình tam giác 500 ml 3.4.1. Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh Bảng 3.4. Sự phát triển của rễ tơ Bá bệnh trên môi trường lỏng và thạch Trạng Số nhánh Chiều dài Hình thái rễ KLK CT thái môi trung bình rễ trung sau 30 ngày (g) trường trên 1 rễ bình (cm) nuôi cấy 0,49 ± Rễ nhỏ, màu CT1 Thạch 7,1 ± 1,2 7,7 ± 1,5 0,04 vàng 0,63 ± Rễ to, màu CT2 Lỏng 5,3 ± 1,3 7,5 ± 2,1 0,03 vàng 13
Môi Môitrường thạch thạch trường Môi trườngMôi lỏngtrường lỏng Hình 3.11. Sự phát triển của rễ tơ trên môi trường lỏng và thạch Rễ tơ phát triển trên môi trường lỏng cho tốc độ tăng trưởng cao hơn môi trường thạch với chỉ tiêu khối lượng khô (0,63 ± 0,03 g) so với môi trường thạch (0,49 ± 0,04 g) có ý nghĩa thống kê cao với p < 0,001. Về mặt hình thái, rễ phát triển trên môi trường lỏng (5,3 ± 1,3 nhánh) phân nhánh kém hơn trên môi trường thạch (7,1 ± 1,2 nhánh) nhưng rễ chính và rễ nhánh to hơn so với rễ nuôi trên môi trường thạch. Rễ nuôi cấy trên môi trường lỏng thích hợp nhất cho nhân sinh khối rễ tơ, phục vụ cho mục đích nuôi cấy tạo sinh khối rễ để làm nguồn dược liệu. 3.4.2. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh Ánh sáng có thể ức chế quá trình phát triển rễ tơ cây Bá bệnh và điều kiện nuôi trong tối là thích hợp nhất cho sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh. Bảng 3.5. Sự phát triển của rễ tơ ở điều kiện tối và sáng Điều Chiều dài Số Hình thái rễ CT kiện ánh KLK (g) rễ TB nhánh sau 30 ngày sáng (cm) TB /rễ nuôi cấy CT1 Sáng 0,38 ± 0,07 4,3 ± 0,9 4,3 ± Rễ nhỏ, vàng 1,5 đậm CT2 Tối 0,66 ± 0,04 8,1 ± 0,8 6,0 ± Rễ to, vàng 1,0 tươi 14
Điều kiện sáng Điều kiện tối Hình 3.12. Sự phát triển của rễ tơ ở điều kiện tối và sáng 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh Bảng 3.6. Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ Chiều Chiều Số Tỷ lệ sống CT dài rễ dài rễ nhánh sót sau 10 KLK (g) (cm) TB (cm) TB/1 rễ ngày (%) CT1 0,2-0,4 0,35 ± 0,05 8,1 ± 0,5 6,1 ±1,4 32 CT2 0,6-0,8 0,57 ± 0,03 8,2 ± 0,6 6,5 ± 1,0 61 CT3 1,0-1,2 0,74 ± 0,05 8,2 ± 0,5 6,3 ± 1,3 97 0,2 – 0,4 cm 0,6 – 0,8 cm 1,0- 1,2 cm Hình 3.14. Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ 15
Trong thí nghiệm này mẫu rễ cắt với kích thước từ 1-1,2 cm cho tỷ sống cao nhất (97 %) và KLK thu được cũng cao nhất đạt (0,74 ± 0,05 g), CT3 có ý nghĩa thống kê so với công thức 1 và 2 với p < 0,001. Như vậy, rễ được cắt với kích thước 1-1,2 cm là thích hợp nhất cho thu sinh khối. 3.4.4. Ảnh hưởng khối lượng rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh Công thức có 0,3 g lượng rễ tơ ban đầu được lựa chọn là công thức thích hợp nhất cho sinh trưởng và phát triển của rễ tơ nuôi cấy trong 100 ml môi trường phục vụ nuôi cấy trên hệ thống bioreactor Bảng 3.7. Sự phát triển của rễ tơ trên 100 ml môi trường với khối lượng rễ ban đầu khác nhau KLT rễ Tỷ lệ tăng Chiều dài rễ Số nhánh CT ban đầu KLT (g) trưởng trung bình trung (g) (lần) (cm) bình/1 rễ CT1 0,1 3,0 ± 0,13 30 8,0 ± 0,45 6,4 ± 0,8 CT2 0,2 5,8 ± 0,1 29 8,1 ± 0,63 6,0 ± 0,4 CT3 0,3 7,9 ± 0,18 26,3 8,1 ± 0,31 6,1 ± 0,56 CT4 0,4 7,8 ± 0,14 19,5 7,8 ±0,4 6,1 ± 0,4 Hình 3.15. Sự phát triển của rễ tơ trên 100 ml môi trường với lượng ban đầu khác nhau 3.4.5. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tăng trưởng và tích luỹ hợp chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6- one của rễ tơ cây Bá bệnh. 16
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sinh trưởng và phát triển rễ tơ 20 30 CT 0 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày ngày 25 ngày ngày KLK-SH 0,03 ± 0,06 ± 0,07 ± 0,25 ± 0,50 ± 0,78 ± 0,79 ± (g) 0,006 0,02 0,02 0,02 0,03 0,04 0,03 KLK-WP 0,03 ± 0,06 ± 0,08 ± 0,26 ± 0,23 ± 0,58 ± 0,59 ± (g) 0,006 0,01 0,02 0,01 0,01 0,02 0,05 KLK-MS 0,03 ± 0,06 ± 0,05 ± 0,22 ± 0,38 ± 0,68 ± 0,67 ± (g) 0,006 0,01 0,01 0,01 0,02 0,03 0,04 KLK thu được sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường SH (0,79 ± 0,03) đạt giá trị cao nhất có ý nghĩa thống kê so với nuôi cấy trên môi trường WP (0,59 ± 0,05 g) và MS (0,67 ± 0,04 g) với P < 0,05. Hình thái rễ trên cả ba môi trường đều thuôn dài, phân nhánh nhiều và màu vàng trắng. Tuy nhiên, ở môi trường SH rễ chính kéo dài và to hơn ở môi trường MS và WP. Như vậy môi trường SH là môi trường thích hợp nhất cho sinh trưởng và phát triển của rễ tơ Bá bệnh (bảng 3.8). Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tích luỹ chất 7-MCPA CT 0 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày 0,0057 ± 7-SH 0,0006 - - - - - - 7- 0,0057 ± 0,0013 ± 0,007 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,009 ± 0,0069 WP 0,0006 0,0011 0,0015 0,0021 0,0051 0,0007 ±0,0009 0,0057 ± 7-MS 0,0006 - - - - - - Sau khi đánh giá sự tăng trưởng và tăng sinh khối của rễ tơ ở các giai đoạn tăng trưởng khác nhau, các phân tích HPLC được tiến hành để xác định hàm lượng ba chất (1), (2), (3) ở mỗi giai đoạn tăng trưởng của rễ tơ. Kết quả cho thấy có sự hiện diện của chất (2), (3) ở tất cả các nghiệm thức với sự 17
thay đổi hàm lượng chất khác nhau trong từng giai đoạn, chất (1) có ít hoặc không có ở các nghiệm thức khác nhau. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tích luỹ 9- methoxycanthin-6-one CT 0 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày 0,04 ± 0,011 ± 0,022 ± 0,023 ± 0,133 ± 0,106 ± 0,102 ± 9Me-SH 0,014 0,012 0,015 0,015 0,032 0,037 0,024 9Me- 0,04 ± 0,057 ± 0,088 ± 0,089 ± 0,143 ± 0,429 ± 0,241 ± WP 0,014 0,023 0,012 0,022 0,033 0,059 0,068 0,04 ± 0,055 ± 0,042 ± 0,106 ± 0,126 ± 0,145 ± 0,057 ± 9Me-MS 0,014 0,017 0,017 0,054 0,055 0,012 0,034 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tích luỹ 9- hdroxycanthin-6-one CT 0 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày 9Hy- 0,075 ± 0,018 ± 0,027 ± 0,026 ± 0,05 ± 0,05 ± 0,066 ± SH 0,005 0,002 0,003 0,003 0,003 0,005 0,005 9Hy- 0,075 ± 0,044 ± 0,031 ± 0,15 ± 0,137 ± 0,147 ± 0,3 ± WP 0,005 0,005 0,005 0,018 0,07 0,011 0,036 9Hy- 0,075 ± 0,025 ± 0,039 ± 0,087 ± 0,089 ± 0,091 ± 0,037 ± MS 0,005 0,005 0,004 0,006 0,08 0,007 0,04 Hình 3.16. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ sau 30 ngày nuôi cấy. 18
Rễ tơ nuôi cấy trong 30 ngày trên môi trường WP tạo ra hàm lượng chất (1) cao nhất ở ngày thứ 20 (0,02 ± 0,0051 % KLK) (bảng 3.9), chất (2) cao nhất trong 25 ngày (0,429 ± 0,059 % KLK) (bảng 3.10), chất (3) cao nhất trong 30 ngày (0,3 ± 0,036 % KLK) (bảng 3.11). 3.4.6. Ảnh hưởng của jasmonic acid (JA) lên sự sinh trưởng và tích luỹ chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6- one của rễ tơ cây Bá bệnh. Bảng 3.12. Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid có trong rễ tơ cây Bá bệnh % Khối lượng khô JA KLK Chất (1) Chất (2) Chất (3) (mg/l (g) ) 0 0,67 ± 0,04 0,018 ± 0,007 0,337 ± 0,100 0,26 ± 0,040 1 0,61 ± 0,06 - 0,388 ± 0,051 0,111 ± 0,064 4 0,6 ± 0,07 - 0,513 ± 0,114 0,147 ± 0,021 8 0,54 ± 0, 05 - 0,874 ± 0,125 0,465 ± 0,043 16 0,41 ± 0,06 - 0,119 ± 0,056 0,052 ± 0,009 0 1 4 8 16 (mg/l) Hình 3.18. Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh Elicitor dẫn truyền tín hiệu (JA) có nguồn gốc từ các hormone nội sinh có hiệu quả lớn lên khả tích lũy alkaloid, nhưng ức chế tăng trưởng rễ. Chính vì vậy, môi trường nuôi cấy bổ sung 0,8 mg/l JA thích hợp nhất cho tích luỹ chất (2) 9-methoxycanthin-6-one (0,874 ± 0,125 % DW) và (3) 9- 19
hydroxycanthin-6-one (0,465 ± 0,043 % DW), không thích hợp cho tích luỹ chất (1). Trong nghiên cứu tiếp theo cần tìm hiểu thêm các elicitor khác có khả năng tích luỹ chất (1) nhiều hơn trong quá trình nuôi cấy. 3.4.7. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sự sinh trưởng và tích luỹ chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6- one của rễ tơ cây Bá bệnh. Bảng 3.13. Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ. % Khối lượng khô SA KLK Chất 1 Chất 2 (9- Chất 3 (9- (mg (g) (7-MCPA) methoxycanthin hydroxycanthin- /l) 30 ngày 20 ngày -6-one) 25 ngày 6-one ) 30 ngày 0 0,67 ± 0,04 0,018 ± 0,007 0,337 ± 0,100 0,26 ± 0,04 5 0,66 ± 0,1 - 0,912 ± 0,034 0,464 ± 0,034 10 0,65 ± 0,09 - 0,245 ± 0,076 0,208 ± 0,087 20 0,54 ± 0,08 - 0,083 ± 0,006 0,084 ± 0,009 40 0,43 ± 0,10 - 0,083 ± 0,005 0,182 ± 0,058 Elicitor dẫn truyền tín hiệu (SA) có nguồn gốc từ các hormone nội sinh có hiệu quả lớn lên khả tích lũy alkaloid, nhưng ức chế tăng trưởng rễ, chính vì vậy, môi trường nuôi cấy bổ sung 5 mg/l SA thích hợp nhất cho tích luỹ chất (2) 9-methoxycanthin-6-one và (3) 9-hydroxycanthin-6-one nhưng ức chế sự tích luỹ chất (1) 7-MCPA . 0 5 10 20 40 (mg/l) Hình 3.21. Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh 20