Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học, hóa mô miễn dịch và tình trạng methyl hóa gen rassf1a trong ung thư biểu mô tuyến tiền liệt

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:31

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu chính của luận án là: Nghiên cứu một số đặc điểm mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến tiền liệt tại Bệnh viện Quân y 103 theo phân loại của WHO (2004). Xác định sự bộc lộ một số dấu ấn miễn dịch, tình trạng methyl hóa gen RASSF1A và đối chiếu với một số đặc điểm mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến tiền liệt. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học, hóa mô miễn dịch và tình trạng methyl hóa gen rassf1a trong ung thư biểu mô tuyến tiền liệt

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUÔC PHONG ́ ̀ HOC VIÊN QUÂN Y ̣ ̣ === *** === VI THUÂT THĂNG ̣ ́ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC, HOA MÔ MIÊN ́ ̃ DICH VÀ TINH TRANG METHYL HOA GEN ̣ ̀ ̣ ́ RASSF1A TRONG UNG THƯ BIÊU MÔ TUYÊN TIÊN LI ̉ ́ ̀ ỆT Chuyên ngành: Khoa học y sinh Mã số: 9720101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Hà Nội 2018
2 Công trình được hoàn thành tại: Hoc viên Quân y. ̣ ̣ Người hướng dẫn khoa học: ̉ 1. GS.TS. Nguyên Đinh Tao ̃ ̀ 2. TS. Nguyễn Ngoc Hung ̣ ̀ Phản biện 1: PGS. TS. Nguyễn Văn Hưng Phản biện 2: PGS.TS. Quản Hoàng Lâm Phản biện 3: PGS.TS. Trịnh Tuấn Dũng Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại vào hồi......... giờ........ngày.......tháng.......năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại các thư viện: Thư viện Quốc gia
3 Thư viện Hoc viên Quân y ̣ ̣
4 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Vi Thuật Thắng, Nguyễn Đình Tảo, Võ Thị Thương Lan và cs (2014), “Nghiên cứu hiện tượng tăng methyl hóa của gen RASSF1A trong ung thư tuyến tiền liệt tại Bệnh viện 103”, Tạp chí Y dược lâm sàng 108., (9): 7781. 2. Vi Thuat Thang, Nguyen Đinh Tao, Nguyen Ngoc Hung et al. (2017), “ Study on some histopathological features and expression of some immunohistochemical markers in prostatic carcinoma”, Journal of Military Pharmaco Medicine., (8): 222 227.
5 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Ung thư tuyến tiên liêt (UTTTL) th ̀ ̣ ường gặp ở người trên 65 ̉ ̣ tuôi, bênh diên biên thâm lăng. Phân l ̃ ́ ̀ ̣ ̀ ớn cac tr ́ ương h ̀ ợp được phat́ ̣ ̀ hiên tinh c ờ qua xet nghiêm (XN) mô bênh hoc (MBH). ́ ̣ ̣ ̣ Ở Việt Nam, tỷ lệ UTTTL được phát hiện qua xét nghiệm MBH sau phẫu thuật tăng sản tuyên tiên liêt (TTL) ́ ̀ ̣ khoang 8% ̉ , tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi năm 2012 là 3,4/100.000 dân va xêp hang ̀ ́ ̀ thứ 10 về ung thư (UT) ở nam giơí. UTTTL co thê đ ́ ̉ ược điêu tri hiêu qua nêu bênh ̀ ̣ ̣ ̉ ́ ̣ được phat hiên ́ ̣ ở giai đoan s ̣ ơm. Vi vây, viêc ́ ̀ ̣ ̣ tim ra ̀ phương phaṕ phat hiên ́ ̣ va chân đoan s ̀ ̉ ́ ơm, đông th ́ ̀ ời đanh gia ́ ́ đung m ́ ưc đô ́ ̣ tôn̉ thương thi viêc ap dung môt tiêu chuân va môt bang phân loai th ̀ ̣ ́ ̣ ̣ ̉ ̀ ̣ ̉ ̣ ống nhất la ̀rât cân thiêt đê ́ ̀ ́ ̉ đưa ra phương phap điêu tri thich h ́ ̀ ̣ ́ ợp va tiên ̀ lượng căn bênh ̣ naỳ . Trên thê gi ́ ơi, n ́ hiêu nghiên c ̀ ưú (NC) chi ra s ̉ ự methyl hoa gen ́ Ras – association domain family 1 isoform A (RASSF1A) xay ra vao ̉ ̀ giai đoan s ̣ ơm cua qua trinh hinh thanh va tiên triên cua ́ ̉ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ̉ ̉ UTTTL, do ́ ̣ ́ ̣ đo viêc ap dung dâu chuân methyl hoa gen ́ ̉ ́ RASSF1A trong UTTTL
6 đang được quan tâm. Ở Viêt Nam, cac NC vê methyl hoa ADN liên ̣ ́ ̀ ́ quan đên UT m ́ ơi đ ́ ược triên khai, các NC vê MBH, hoa mô miên ̉ ̀ ́ ̃ ̣ dich (HMMD) ch ưa nhiều và chưa có NC đầy đủ nào về đăc điêm ̣ ̉ MBH ung thư biêu mô tuyên tiên liêt (UTBM TTL) theo phân loai ̉ ́ ̀ ̣ ̣ ̉ cua Tô ch ̉ ưc Y tê Thê gi ́ ́ ́ ới (WHO) năm 2004 kết hợp với xác định sự bôc̣ môṭ số dâu ́ miễn dich ́ ân ̣ và tình trạng methyl hóa gen RASSF1A trong UTBM TTL. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài với mục tiêu: a. Nghiên cứu một số đặc điểm mô bệnh học ung thư biểu mô ́ ̀ ̣ ại Bệnh viện Quân y 103 theo phân loại của WHO tuyên tiên liêt t (2004). b. Xác định sự bộc lộ một số dấu ấn miễn dịch, tình trạng methyl hóa gen RASSF1A và đối chiếu với một số đặc điểm mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyên tiên liêt. ́ ̀ ̣ 2. Những đóng góp mới của luận án + Nghiên cứu tình trạng methyl hóa gen RASSF1A trong một số trường hợp ung thư biểu mô tuyến tiền liệt. + Đối chiếu tình trạng methyl hóa gen RASSF1A với một số đặc điểm mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến tiền liệt. + Áp dụng đồng thời các dấu ấn PSA, CK34beta12, p63, CK5/6, CK7 và actin để hỗ trợ chẩn đoán, xác định típ, phân độ mô học ung thư biểu mô tuyến tiền liệt. 3. Câu truc cua luân an ́ ́ ̉ ̣ ́ ̣ ́ Luân an dài 135 trang gôm: Đăt vân đê (2 trang) ̀ ̣ ́ ̀ ; Chương 1 Tổng quan tài liệu: 40 trang; Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 20 trang; Chương 3 Kết quả nghiên cứu: 31 trang; Chương 4 Bàn luận: 40 trang; Kết luận: 2 trang; Kiến nghị: 1 trang; Danh sach bai bao: 1 trang; ́ ̀ ́ ̣ ́ ́27 bang Luân an co ̉ sô liêu ́ ̣ ; 1 sơ đô; ̀ 13 ̀ ̉ ̀ ̣ hinh; 25 anh; 148 tai liêu tham khao (2 ̉ ̣ 5 tiêng Viêt, 12 ́ 3 tiêng Anh) ́ ; Phu luc ̣ ̣ mâu phiêu nghiên c ̃ ́ ưu va Danh sach bênh nhân. ́ ̀ ́ ̣
7 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Sơ lược về mô học va phân loai ung th ̀ ̣ ư tuyên tiên liêt ́ ̀ ̣ 1.1.1. Mô hoc̣ ́ ̀ ̣ gôm cac nang tuy Tuyên tiên liêt ̀ ́ ến, ống tuyên phân nhánh, ́ ống dẫn chinh va ni ́ ̀ ệu đạo TTL. Cac nang tuy ́ ến và ống tuyên đ ́ ược lot b ́ ởi ̣ ớp tế bào (TB) chế tiết ở bên trong va môt l môt l ̀ ̣ ớp TB đáy ở bên ngoai. TTL không có l ̀ ớp cơ biêu mô, ̉ ́ được bao cac nang/ông tuyên ́ ́ quanh bởi các TB cơ trơn, nguyên bào sợi và sợi collagen. Long cac ̀ ́ ́ ́ chưa chât tiêt va các th nang/ông tuyên ́ ́ ́ ̀ ể amylacea. Cać ông d ́ ẫn chinh ́ được lót biêu mô (BM) chuy ̉ ển tiêp. ́ 1.1.2. Phân loại mô bệnh học UTBM TTL theo WHO (2004) UTBM TTL gôm ̀ 4 tip: ́ UTBM đường niêu, ́ UTBM tuyên, ̣ ́ ̀ ̉ ́ ̀ ́ ́ ̀ ̉ UTBM tê bao vay, UTBM tê bao đay. UTBM tuyên gôm thê tuyên ́ ̀ ̉ nang va thê tuyên ông. ́ ́ 1.2. Ung thư biêu mô tuyên tiên liêt, tân san nôi biêu mô va phân ̉ ́ ̀ ̣ ̉ ̣ ̉ ̀ đô Gleason ̣ 1.2.1. Ung thư biêu mô tuyên tiên liêt ̉ ́ ̀ ̣ * Ung thư biêu mô tuyên: ̉ ́ u gôm cac nang/ông tuy ̀ ́ ́ ến sắp xếp hỗn độn hoăc ̣ rời rạc, tuyến cấu trúc dạng mặt sàng, các tuyến hòa nhập vào nhau hoăc u gôm cac ̣ ̀ ́ ̉ ́ đam, cac dai TB. Nhân ́ TB lớn, tăng sắc, hạt nhân to, rai rac co h ̉ ́ ́ ình nhân chia, co thê thây nhân đa hinh ́ ̉ ́ ̀ ́ ̀ ương TB sáng hơn TB tuyến lành tính. Long tuyên nang thai. Bao t ̀ ́ ́ ̉ ưa t co thê ch ́ inh thể, chất tiêt ́ màu hồng hoăc/ ̣ chất dạng mucin màu xanh nhạt. Co thê thây u ́ ̉ ́ xâm lấn dây TK, u tăng sinh xơ nhày, tuyến UT giống tiểu cầu thận. * UTBM đường niệu nguyên phat́: hâu hêt ̀ ́ làUTBM đ ường niệu kém biệt hóa kêt h ́ ợp với UTBM đường niêu t ̣ ại chỗ. Trong đo,́ có một hình ảnh đăc tr ̣ ưng, đo la: TB u gi ́ ̀ ống TB Paget năm ̀
8 giữa lớp TB đáy và TB chế tiết. Khi TB u lan vao ̀ ống dẫn, cac ông ́ ́ ̃ ấp đầy TB u va th dân l ̀ ường có hoại tử dạng trứng cá. Khi TB u xâm lấn vào mô đệm, phản ứng xơ hóa của mô đệm rất rõ. * UTBM tế bào vay: ̉ TB ung thư hình đa diện có cầu nối gian bào và chất keratin. Co thê thây câu truc u g ́ ̉ ́ ́ ́ ồm các ống tuyến, nhưng một số TB tuyến biệt hóa TB vảy (UTBM tuyếnTB vảy). * UTBM tế bào đáy: TB u có nhân hình tròn hoặc có góc, chất nhiễm sắc mịn, bào tươ ng hẹp, sắp xếp song song theo hình cọc rào, u hay bị hoại tử. Co thê thây TB u xâm nh ́ ̉ ́ ập mô đệm va dây TK. ̀ 1.2.2. Tân san nôi biêu mô tuyên tiên liêt ̉ ̣ ̉ ́ ̀ ̣ ̉ ̣ ̉ ̣ Tân san nôi biêu mô tuyên tiên liêt (prostatic intraepithelial ́ ̀ ̉ thương tăng sinh TB chế tiêt, neoplasia: PIN) la ̀ tôn ̀ vơí ́ đi kem nhưng thay đôi vê nhân TB nh ̃ ̉ ̀ ư: nhân lơn, chât nhiêm săc đâm va ́ ́ ̃ ́ ̣ ̀ ̣ phân bô không đêu, hat nhân l ́ ̀ ơn, mang nhân day nh ́ ̀ ̀ ưng vân con l ̃ ̀ ớp ̣ ̀ ̉ ̃ ̣ ơn TB đay. Trong PIN đô cao, tinh chât không đêu cua nhân ro rêt h ́ ́ ́ ̣ ́ PIN đô thâp. 1.2.3. Phân đô Gleason ̣ ́ ược chia thanh 5 đô Gleason. Điêm Gleason la UTBM tuyên đ ̀ ̣ ̉ ̀ ̉ ̣ ̉ ̃ ́ ̣ ́ ̀ ́ ẫu nguyên tông đô Gleason cua mâu chiêm diên tich nhiêu nhât (m ̣ ́ ̀ ứ nhi (m phát) va mâu chiêm diên tich nhiêu th ̀ ̃ ́ ̀ ẫu thứ phát). 1.3. Xâm lấn và di căn Khối u vùng chuyển tiếp thường xâm lấn về vùng trước của TTL, u vùng ngoại vi thường xâm lấn ra vùng sau bên. Giai đoạn muộn, u xâm lấn vào túi tinh, cổ bàng quang. TB u xâm lấn vào mạch máu và mạch mạch huyết di căn vào hạch limphô vùng, di căn vào xương chậu, xương cột sống... và các tạng. 1.4.Hoá mô miễn dịch trong ung thư biêu mô tuyên tiên liêt ̉ ́ ̀ ̣
9 HMMD là một kỹ thuật nhuộm đặc biệt, sử dụng kháng thể (KT) đặc hiệu để xác định sự hiện diện của các kháng nguyên (KN) tương ứng trên các lát cắt mô hoặc trên các loại TB có trong mô. Nguyên tắc: cho KT đặc hiệu lên mô, nếu trong mô có KN sẽ có phản ứng kết hợp KN KT. Ứng dụng HMMD trong UTBM TTL nhằm mục đích trợ ́ ́ ̣ ́ ̣ ̣ ̉ giup xac đinh: nguôn gôc khôi u; xac đinh đăc điêm MBH; phân bi ̀ ́ ́ ệt tổn thương lanh tinh v ̀ ́ ơi ac tinh; phân biêt UT xâm lân va di căn… ́ ́ ́ ̣ ́ ̀ ̀ ́ ̣ Trong NC nay chung tôi nhuôm HMMD v ơi cac KT khang ́ ́ ́ (PSA, CK34βE12, p63, CK5/6, CK7, actin). 1.5. Methyl hóa ADN trong ung thư tuyên tiên liêt ́ ̀ ̣ 1.5.1. Methyl hóa ADN: methyl hóa ADN là hiện tượng gắn thêm gốc methyl vào nucleotide trên phân tử ADN. Ở ngươi, methyl hóa ̀ ADN xảy ra ở cytosine đứng trước guanine trong phức hợp CpG tạo thành 5methylcytosine. Trong UTTTL gen ưć chế khôí u ̣ RASSF1A rât hay bi methyl hoa. ́ ̀ ̣ ́ Methyl specific PCR (MSP) la môt trong nhưng ph ̃ ương phaṕ dung ̉ ́ ̣ ̀ đê phat hiên methyl hoa. ́ Trong NC naỳ , chung tôi l ́ ựa chon gen ̣ ̉ RASSF1A đê phân tich ́ ̉ dâu chuân methyl hoa trong UTBM ́ ́ tuyến của TTL. 1.5.2. Phương pháp MSP phát hiện methyl hóa ADN Đặc điểm của phương pháp: ADN sau khi xử lý bisulfite có thể bao gồm ADN bị methyl hóa có CpG được giữ nguyên, ADN không bị methyl hóa có CpG đều bị biến đổi thành thymine. Kỹ thuật MSP sử dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kê d ́ ựa vào vùng giàu CpG cho phép phân biệt ADN bị methyl hóa với ADN không bị methyl hóa. Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
10 2.1. Đối tượng 2.1.1. Nhóm bệnh nhân nghiên cứu đăc điêm mô b ̣ ̉ ệnh học 84 mẫu mô UTBM TTL (84 bênh nhân) phâu thuât n ̣ ̃ ̣ ội soi qua ̣ ̣ ại Bệnh viện Quân y 103 (6/2008 7/2017) được chẩn đoán niêu đao t ́ ̣ ̣ MBH là UTBM TTL nguyên phát. Cac bênh nhân (BN) có bênh an, ́ phiếu yêu cầu XN MBH, khối paraffin lưu giữ mẫu mô đủ để nghiên cứu. Tiêu chuẩn loại trừ: UTTTL thứ phat, UTTTL đa xa tri, dung hoa chât, BN có nhi ́ ̃ ̣ ̣ ̀ ́ ́ ều UT cùng lúc, BN không phải là người Việt Nam, UTTTL được phẫu thuật toàn bộ tuyến va c ̀ ác trường hợp không đủ các tiêu chuẩn trên. 2.1.2. Nhóm bệnh nhân nghiên cứu HMMD Sau khi đã loại 51 trường hợp không đủ tiêu chuẩn (mẫu mô hết dần do ưu tiên cắt nhuộm H.E…), còn lại gồm: + 31 mâu mô UTBM tuy ̃ ến nguyên phát của TTL. + 2 mâu mô UTBM đ ̃ ường niệu nguyên phát của TTL Nhuộm HMMD vơí cać KT khang ́ (PSA, CK 34βE12, p63, CK5/6, CK7, actin). 2.1.3. Nhóm bệnh nhân nghiên cứu methyl hóa gen RASSF1A 20 mâu mô UTBM tuy ̃ ến đủ tiêu chuẩn xét nghiệm methyl hóa. Do ưu tiên cắt nhuộm H.E và HMMD, mẫu UT hết dần nên không đảm bảo chất lượng ADN cho MSP, do đó, đã loại 64 trường hợp không đủ tiêu chuẩn. Chọn 10 mâu mô tăng s ̃ ản TTL (10 BN) đã được chẩn đoán xác định bằng MBH để so sánh tỷ lệ methyl hóa gen RASSF1A trong tăng sản TTL với UTBM tuyến của TTL. 2.2. Phương pháp nghiên cứu
11 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu tiến cứu, mô tả cắt ngang. Phương pháp lấy mẫu: lấy mẫu toàn bộ và có chủ định. Cỡ mẫu: tính toán theo công thức điều tra một tỷ lệ: Với α = 5%; Z1 /2 = 1,96; d = 0,1; p = 78%. Lăp vao công th ́ ̀ ưć trên, cỡ mâu NC la 66 mâu. Th ̃ ̀ ̃ ực tế các mảnh bệnh phẩm TTL chứa ô UT đ ̉ ược phâu thuât n ̃ ̣ ội soi thường la nh ̀ ỏ, khó đủ lượng để thực hiện nhiều kỹ thuật. Chúng tôi thu thập 84 mẫu. 2.2.2. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 2.2.2.1. Vật liệu thu thập thông tin ̣ ́ ̀ iên bản hội chẩn tiêu bản kèm theo phiếu trả lời Bênh an va b kết quả MBH của khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện Quân y 103. Hội chẩn tiêu bản để thu thập các thông tin bao gôm: ̀ típ ̉ MBH, cac thê, các bi ́ ến thể UTBM TTL. Mức độ biệt hóa của khối u được tính theo hệ thống Gleason: gồm độ 1, 2, 3, 4, 5. Điểm Gleason là tổng của độ Gleason thuộc vùng có diện tích nhiều nhất và vùng có diện tích nhiều thứ nhì. Các đặc điểm đặc trưng ác tính, chất chứa trong tuyến nang UT và UTBM tuyến phối hợp với PIN độ cao được đánh giá: có hoặc không. Mức độ bộc lộ các dấu ấn MD gôm: không b ̀ ộc lộ (), co b ́ ộc lộ (+), bôc lô y ̣ ̣ ếu (1+), trung bình (2+), mạnh (3+), rất mạnh (4+). Methyl hóa gen RASSF1A được đánh gia: không b ́ ị methyl hóa (), bị methyl hóa (+). Tất cả tiêu bản nhuộm H.E (84 BN) va nhu ̀ ộm HMMD (33 BN) đều được hội chẩn trên kính hiển vi quang học cùng với ̣ Hung Nguyêñ Manh ̀ Ngoc̣ Dung ̀ và Trân ̃ (Bộ môn khoa GPB, Bệnh viện Quân y 103). Chụp ảnh minh họa tưng tr ̀ ương h ̀ ợp.
12 Các mẫu mô TTL xét nghiệm methyl hóa, gồm: 20 mâu UT và ̃ 10 mẫu tăng sản TTL được phân tích, đánh giá KQ cung v ̀ ơi Vo Thi ́ ̃ ̣ Thương Lan (Phòng thí nghiệm Sinh Y Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà Nội). 2.2.2.2. Bệnh phẩm u TTL được phâu thuât n ̃ ̣ ội soi qua niêu đao ̣ ̣ Lấy 12 gam/trường hợp, nêu ̣ ̉ ́ ̃ ́ ̀ ̣ ́ bênh phâm it se lây toan bô. Các mảnh bệnh phẩm đưa vào nghiên cứu một cách ngẫu nhiên. 2.2.2.3. Bệnh phẩm được nghiên cứu kỹ thuật H.E, hóa mô miễn dịch và methyl hóa: Cố định bênh phâm ̣ ̉ trong dung dịch formol đệm trung tính 10%, sau đó được đuć trong paraffin, cắt mảnh hàng loạt với độ dày từ 3 4 micromet để làm thành các tiêu bản nhuộm H.E , HMMD và XN methyl hóa. Nhuộm H.E: 84 mâu; nhu ̃ ộm HMMD: 33 mâu, các KT đ ̃ ược sử dụng là KT khang (PSA, CK ́ 34βE12, p63, CK5/6, CK7, actin). Số trường hợp làm XN methyl hóa: 20 mẫu mô UTBM tuyến và 10 mẫu mô tăng san TTL. ̉ 2.2.3. Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu 2.2.3.1. Kỹ thuật nhuộm H.E Nhuộm H.E được tiến hành theo ky thuât mô hoc th ̃ ̣ ̣ ương ̀ quy. Sử dụng các tiêu chuẩn MBH, bảng phân loại mô khối u TTL của WHO (2004) đê chân đoan MBH, xac đinh tip, cac thê, đô ̉ ̉ ́ ́ ̣ ́ ́ ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ Gleason và đăc điêm mô bênh hoc. Sử dụng kính hiển vi quang học Olympus CX21. 2.2.3.2. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch + Hóa chất sử dụng, các kháng thể, dung dịch đệm rửa bộc lộ kháng nguyên và hệ thống phát hiện của hãng Leica.
13 + Cách đánh giá và nhận định kết quả: đánh giá theo tiêu chuân̉ ̉ McNeal và cs (1991). cua 2.2.3.3. Kỹ thuật xác định tình trạng methyl hóa gen RASSF1A + Một số bước của ky thuât MSP ̃ ̣ Tách chiết ADN từ mẫu mô đúc trong paraffin, kiểm tra chất lượng ADN tách chiết bằng PCR với mồi βglobulin, sản phẩm PCR được kiêm tra băng di ̉ ̀ ện di trên gel agarose 1,5%. Biến đổi bisulfite: ADN tách chiết sẽ được xử lý với bisulfite và tinh sạch bằng Epitect Kit (Qiagen, Cat, No 59104). Kiểm tra chất lượng ADN genome trước và sau khi xử lý với bisulfite bằng phản ứng PCR nhân bản gen βglobulin từ khuôn ADN trước và sau xử lý với bisulfate. Sản phẩm PCR được diện di trên gel agarose 1,5% để kiểm tra ADN tổng số đã xử lí hoàn toàn với bisulfite. Thực hiện phản ứng MSP nhằm xác định sự methyl hóa gen RASSF1A được thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu bằng PCR. Sản phẩm PCR phát hiện methyl hóa bằng cặp mồi đặc hiệu RASSF1AM210F/RASSF1AM211R có kích thước là 170 bp. Để phát hiện gen RASSF1A có cytosine không bị methyl hóa, phản ứng MSP cũng được thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu bằng nested PCR. Sản phẩm PCR lần 1 với cặp mồi đặc hiệu RASSF1AUn F1/RASF1AUnR1 được pha loãng 100 lần và sử dụng làm khuôn cho phản ứng lần 2 với cặp mồi RASSF1AUnF2/RASSF1AUn R2. (bảng 2.3.) Bảng 2.3. Trình tự nucleotide các mồi cho phản ứng PCR và MSP Tên mồi Trình tự nucleotide (5’>3’) GLF CAACTTCATCCACGTTCACC GLR GAAGAGCCAAGGACAGGTAC
14 RASSF1AM210F GGGTTTTGCGAGAGCGCG RASSF1AM211R GCTAACAAACGCGAACCG RASSF1AUnF1 GGGGTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG RASF1AUnR1 TAAACACTAACAAACACAAACC RASSF1AUnF2 GAGAGTGTGTTTAGTTTTGTTTTTG RASF1AUnR2 CCACAAAACAAACCCCAACTTCAA 2.3. Xử lý số liệu: Dư liêu ̃ ̣ được xử ly băng ́ ̀ phần mềm SPSS13. 2.4. Vân đê đao đ ́ ̀ ̣ ức trong nghiên cứu: Cac nguyên tăc y đ ́ ́ ưc trong ́ nghiên cưu đ ́ ược đam bao. ̉ ̉ Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phân bố tỷ lệ bệnh nhân măc ́ UTBM TTL theo nhóm tuổi Tỷ lệ BN măć UTBM TTL cao nhất ở nhóm tuổi 7079 (42,86%); trung binh 74,34 ± 9,27; không g ̀ ặp tuổi dưới 40. 3.2. Kết quả xác định một số đăc điêm mô b ̣ ̉ ệnh học 3.2.1. Xac đinh tip MBH UTBM TTL theo WHO (2004) ́ ̣ ́ Bảng 3.2. Xác định típ mô bệnh học Típ mô bệnh học UTBM Số lượng Tỷ lệ (%) (n=84) 1. UTBM tuyến 82/84 97,6 UTBM tuyến nang 80/82 97,6 UTBM tuyến ống 2/82 2,4 2. UTBM đường niệu 2/84 2,4 3. UTBM tế bào vảy 0 0 4. UTBM tế bào đáy 0 0 3.2.3. Tỷ lệ UTBM tuyến phối hợp và không phối hợp với PIN độ cao Bảng 3.4. UTBM tuyến phối hợp và không phối hợp với PIN độ cao Mô bệnh học Số lượng Tỷ lệ p
15 (n=82) (%) Phối hợp PIN độ cao 60 73,2
16 Bảng 3.10. Phân bô t ́ ỷ lệ u có đặc điểm đặc trưng ác tính va u ̀ ́ ̣ ̉ ́ ́ ́ ểm Gleason không co đăc điêm ac tinh theo nhom đi Điểm Gleason Gleason 24 Gleason 57 Gleason 810 Tổng số Đặc điểm n=14 (%) n=58 (%) n=10 (%) (%) đăc tr ̣ ưng ac tinh ́ ́ Có 1/14 (7,2%) 47/58 (81%) 9/10 (90%) 57 (69,5%) Không có 13/14 (92,8%) 11/58 (19%) 1/10 (10%) 25 (30,5%) Tổng số 14 (100%) 58 (100%) 10 (100%) 82 (100%) Hệ số tương quan rho=0,523; p
17 Bảng 3.13. Phân bố tỷ lệ u chứa tinh thể/chất tiết kết đặc màu hồng va u không ch ̀ ưa tinh thê/chât ́ ̉ ́ tiết kết đặc màu hồng theo ́ điểm Gleason nhom Điểm Gleason Gleason 24 Gleason 57 Gleason 810 Tinh thê ̉ Tổng (%) n=14 (%) n=58 (%) n=10 (%) & chât k ́ ết đặc màu hồng Chứa 14/14 (100%) 55/58 (94,83%) 1/10 (10%) 70 (85,4%) Không chứa 0/14 (0%) 3/58 (5,17%) 9/10 (90%) 12 (14,6%) Tổng 14 (100%) 58 (100%) 10 (100%) 82 (100%) Spearman rho=0,681; p
18 (3+) 9 (31%) 0/2 (4+) 0 (0%) 0/2 3.3.4. Phân bố mức độ bộc lộ PSA của tế bào u theo độ Gleason Bảng 3.17. Mức độ bộc lộ PSA theo độ Gleason (n=31) Độ Gleason Độ Độ Độ Độ Tổng Mưc đô ́ ̣ Spearman 2 3 4 5 (%) (1+) 5 2 7 (22.6%) (2+) 15 15 (48.4%) rho=0,996 (3+) 9 9 (29%) p
19 CK34βE12 và p63. 3.3.8. Tình trạng và mức độ bộc lộ CK7 va CK5/6 c ̀ ủa biểu mô đường niệu lành tính và ác tính Bảng 3.21. Tình trạng và mức độ bộc lộ CK7 và CK5/6 của biểu mô đường niệu lành tinh và ác tính ́ ́ ́ (n=33) Dâu ân Mô bệnh học CK7 CK5/6 UTBM tuyến Vùng tuyến lành tinh ́ (4+) () 31 31 Vùng tuyến ung thư () () UT đường Vùng tuyến lành tinh ́ (4+) () 2 2 niệu Vùng ung thư () () UTBM tuyến: BM đương niêu vùng tuy ̀ ̣ ến lành bộc lộ CK7, nhưng không bộc lộ CK5/6. Vung tuyên UT không bôc lô CK7 va ̀ ́ ̣ ̣ ̀ CK5/6. UTBM đường niệu: BM vung tuyên lanh bôc lô CK7, không ̀ ́ ̀ ̣ ̣ ̣ ̣ bôc lô CK5/6. Vung UT không b ̀ ộc lộ CK7 và CK5/6. 3.3.9. Tình trạng và mức độ bộc lộ actin của cac loai t ́ ̣ ế bào mô đệm ̀ ộ TB cơ trơn mô đêm TTL và c Toan b ̣ ơ trơn thành mạch bộc lộ actin. ̀ ̣ Toan bô TB xơ, TB đáy, TB nội mô không bôc lô actin. ̣ ̣ 3.4. Kêt qua nghiên c ́ ̉ ứu tinh trang methyl hoa gen ̀ ̣ ́ RASSF1A 3.4.2. Kết quả đanh gia hiêu qua cua qua trinh x ́ ́ ̣ ̉ ̉ ́ ̀ ử ly bisulfite ́ PCR v ới c ặp m ồi GLF/GLR nh ằm khu ếch đại gen β globin t ừ ADN t ổng s ố tr ướ c và sau xử lý với bisulfite đượ c trình bày trên hình 3.2.
20 Hình 3.2. Sản phẩm PCR nhân bản gen βglobin từ khuôn ADN trước (băng đỏ) và sau xử lý (băng vàng) với bisulfite của một số mẫu mô ung thư (tư p1p7) ̀ . Trươc khi x ́ ử ly v ́ ơi bisulfite, cac mâu đêu lên băng v ́ ́ ̃ ̀ ới kich ́ thươc la 250 bp. Sau khi x ́ ̀ ử lý với bisulfite, chúng tôi không thu được sản phẩm nay. ̀ Điều đó chứng tỏ các mẫu ADN tổng số đã được xử lý hoàn toàn với bisulfite. 3.4.3. Kết quả xác định sự methyl hóa gen RASSF1A ở các mẫu ung thư Băng ADN đặc hiệu của gen RASSF1A bị methyl hóa có kích thước 170 bp (ký hiệu m) được phát hiện trong 11/20 mẫu UT. Băng ADN đặc hiệu cho RASSF1A không bị methyl hóa có kích thước 137 bp (ký hiệu u) cũng được phát hiện trong 20 mẫu UT. Đây là sản phẩm đặc trưng cho các TB lành lẫn trong mẫu UT.