Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu chính của luận án là: Đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro. Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) mang khối u dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HT-29. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn 2. PGS.TS. Hồ Anh Sơn Phản biện 1: PGS. TS. Vũ Văn Khiên Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Văn Ba Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Thanh Thúy Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại Học viện Quân y Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện Quốc Gia 2. Thư viện Học viện Quân y
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) là quá trình bệnh lý phát sinh từ đại trực tràng, gây nên bởi sự tăng bất thường các tế bào có khả năng xâm lấn hay lan rộng vào các bộ phận khác của cơ thể. Là quá trình bệnh lý phát triển qua nhiều giai đoạn, hậu quả từ sự tích lũy tăng dần của đột biến gen, đột biến ngoài gen và bất thường trong con đường tín hiệu nội bào Wnt. Số bệnh nhân bị CRC và số ca tử vong do CRC vẫn tăng theo thời gian. Liệu pháp sử dụng virus ly giải tế bào u để điều trị ung thư là một phương thức biến sự sao chép của virus thành vũ khí tiêu diệt các tế bào ung thư và hầu như không ảnh hưởng đến các tế bào lành. Các chủng virus vaccin sởi (MeV) và quai bị (MuV) đã được chứng minh là có hiệu quả điều trị ung thư người. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đánh giá hiệu quả kháng ung thư đại tràng người của phối hợp MeV và MuV. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm” với các mục tiêu sau: Mục tiêu: 1. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương trình của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro. 2. Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29. Tính cấp thiết: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của phối hợp virus vaccine sởi (MeV) và quai bị (MuV) cả in vitro cũng như trên mô hình cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo đánh giá tính an toàn, cơ chế tác dụng của phối hợp MeV và MuV kháng ung thư, tiến tới các thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau sử dụng phối hợp 2 virus vaccine này điều trị bệnh nhân ung thư.
2 Đóng góp mới của luận án: Hoàn thiện quy trình nuôi cấy tế bào ung thư đại tràng người HT- 29 in vitro và ghép u trên đùi chuột nude. Đánh giá tác dụng kháng ung thư đại tràng người dòng tế bào HT- 29 của phối hợp MeV và MuV cả in vitro cũng như trên mô hình cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch. Từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo tiến tới các thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư. Bố cục luận án: Luận án có 140 trang, bao gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Chương 1: Tổng quan (36 trang), Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (28 trang), Chương 3: Kết quả (32 trang), Chương 4: Bàn luận (37 trang), Kết luận (2 trang), Kiến nghị (1 trang). Luận án có 142 tài liệu tham khảo (tiếng Anh: 142). CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Ung thư đại trực tràng 1.1. Tình hình ung thư đại trực tràng Trên thế giới, nó là loại ung thư phổ biến thứ ba ở nam giới và phổ biến thứ hai ở nữ giới, là nguyên nhân đứng thứ ba gây tử vong liên quan đến ung thư. Trong năm 2017, ước tính có khoảng 95.520 trường hợp ung thư đại tràng và 39.910 trường hợp ung thư trực tràng mới được chẩn đoán tại Mỹ. Tỉ lệ mắc CRC rất đa dạng về tuổi, chủng tộc, sắc tộc và kiểu mắc. CRC đang có xu hướng trẻ hóa người mắc (dưới 50 tuổi). 1.2. Nguyên nhân ung thư đại trực tràng 1.2.1. Đột biến gen di truyền Bệnh đa polyp tuyến và hội chứng Gardner: là do các đột biến di chuyền ở gen coli gây polyp tuyến (APC), một gen ức chế khối u. Hội chứng Lynch: là do những biến đổi ở các gen hỗ trợ sửa chữa DNA, làm cho DNA bắt cặp sai, dẫn đến phát triển ung thư. Hội chứng Peutz-Jeghers: là do những biến đổi di truyền ở gen ức chế khối u,
3 1.2.2. Các đột biến gen mắc phải Đột biến gen xảy ra trong thời gian sống và không truyền qua các thế hệ, chúng chỉ có ở các tế bào sinh ra từ tế bào gốc bị đột biến. CRC là do đột biến gen mắc phải gây ra nhiều hơn so với các đột biến gen di truyền. 1.3. Cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng 1.3.1. Gen, vi môi trường và di truyền ngoại gen (epigenetic) Đột biến gen gây ra CRC: Bộ gen CRC có khoảng 13.000 gen đột biến, nhưng chỉ có khoảng 69 đột biến gen điều khiển được đề xuất là các đột biến có vai trò hình thành CRC. Các đột biến gen APC kéo theo là đột biến xảy ra ở gen KRAS hoặc TP53, hoạt hóa con đường tín hiệu Wnt làm khởi phát polyp tiến triển thành CRC. Đột biến gen trong con đường tín hiệu yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta (TGFβ), gen thụ cảm thể TGFβ loại II, cả gen SMAD2, SMAD4, RUNX3 và TSP1 Ít gặp hơn là đột biến các gen MSH2, MSH6, MLH1 và PMS2 cũng có vai trò hình thành CRC. microRNA là phân tử điều hòa di truyền ngoại gen của CRC: có một số microRNA tăng lên trong tế bào CRC so với tế bào đại trực tràng bình thường như: miRNA-31, miRNA-183, miRNA-17-5, miRNA-18a, miRNA-20a và miRNA-92, nhưng miRNA-143 và miRNA-145 lại thấp hơn đáng so với tế bào bình thường. Các microRNA ức chế khối u và microRNA gây ung thư: miRNA- 135a và miRNA-135b ảnh hưởng trực tiếp gen ức chế khối u APC và kích hoạt tín hiệu con đường Wnt tạo ra CRC. miRNA-122a là một chất ức chế khối u làm tăng biểu hiện gen APC. miRNA-21 tăng trong tế bào ở giai đoạn sớm CRC, miRNA-21 là chất gây ung thư. miRNA-143 và miRNA-145 cũng là chất ức chế khối u. 1.3.2. Tăng methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng Methyl hóa DNA là phản ứng cộng thêm một nhóm methyl vào vị trí 5' của cytosine dưới xúc tác của enzyme DNA methyltransferase để tạo thành 5-methyl cytosine. Tăng methyl hóa
4 làm bất hoạt gen, giảm quá trình tế bào chết theo chương trình, sửa chữa DNA và kiểm soát chu trình tế bào. 1.3.3. Giảm methyl hóa DNA trong tế bào CRC Giảm methyl hóa DNA làm mất ổn định hệ gen, điển hình là trong yếu tố nhân kích thước dài rải rác 1 (LINE-1) hình thành CRC. 1.3.4. Thay đổi Histone trong tế bào CRC Thể nhân là đơn vị cơ bản của nhiễm sắc thể, bao gồm một octamer tạo bởi bốn histone lõi (H3, H4, H2A, H2B) xung quanh có 147 cặp base của DNA phủ bên ngoài, lõi histone chủ yếu là hình cầu ngoại trừ “các đuôi” N- tận. Có ít nhất 8 loại thay đổi histone: acetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa, ubiquityl hóa, sumoyl hóa, hóa ADP-ribose hóa, proline isomerise hóa và citrulline hóa. Trong đó, acetyl hóa và methyl hóa là loại phổ biến nhất gây ra CRC. 1.4. Liệu pháp MeV và MuV điều trị CRC 1.4.1. Sinh học MeV và MuV MeV và MuV là các virus thuộc thành viên của họ Paramyxoviridae, có đường kính khoảng 100-300nm, với một lõi nucleocapsid xoắn chứa sợi RNA đơn (-). Hai protein màng: protein fusion (F) có vai trò hợp nhất màng của virus với màng tế bào đích và huyết tán; protein hemagglutinin (H) hay hemagglutinin neuraminidase (HN) chịu trách nhiệm việc virus xâm nhập vào tế bào. 1.4.2. MeV và MuV lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư đại trực tràng 1.4.2.1. Tế bào CRC có các thụ cảm thể đặc hiệu với MeV và MuV MuV chủng Urabe sử dụng các sialoglycoprotein có chứa acid sialic trên bề mặt tế bào ung thư như là thụ cảm thể đặc hiệu. MeV chủng Edmonston sử dụng các thụ cảm thể đặc hiệu CD46, Nectin-4 trên bề mặt tế bào CRC. 1.4.2.2. MeV, MuV ly giải tế bào CRC nhờ các enzyme protease Các protease có nhiều trong tế bào ung thư phân cắt glycoprotein của virus, tạo điều kiện để virus xâm nhập vào tế bào, đại diện là các matrix metalloproteinase.
5 1.4.2.3. MeV, MuV tận dụng các khiếm khuyết gen ở tế bào CRC Các khiếm khuyết di truyền trong tế bào ung thư làm cho các tế bào ung thư dễ bị nhiễm virus và tạo điều kiện cho virus nhân lên tốt hơn mà hầu như không có ở tế bào bình thường. 1.4.3. Cơ chế MeV, MuV ly giải tế bào ung thư đại trực tràng 1.4.3.1. MeV và MuV ly giải trực tiếp tế bào CRC qua hình thành hợp bào MeV và MuV ly giải tế bào ung thư bằng cách hòa màng tế bào nhiễm virus và tế bào bình thường lân cận tạo thành hợp bào (tế bào khổng lồ có nhiều nhân). Một tế bào nhiễm virus có thể hợp nhất 50- 100 tế bào lân cận tạo thành hợp bào. 1.4.3.2. MeV, MuV ly giải tế bào CRC qua trung gian miễn dịch đặc hiệu MeV, MuV tạo ra 2 loại tín hiệu nguy hiểm là tín hiệu nguy hiểm nội sinh (DAMP), các tín hiệu nguy hiểm ngoại sinh (PAMP), chúng kích hoạt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu góp phần quan trọng ly giải tế bào u như: sản xuất IFN, các cytokine, hoạt hóa tế bào NK, đại thực bào, tế bào DC, tế bào lympho T. Protein Hemagglutinin neuraminidase có vai trò như sialidase, loại bỏ axit sialic khỏi bề mặt tế bào ung thư, bộc lộ kháng nguyên ung thư, kích hoạt miễn dịch đặc hiệu tiêu diệt tế bào ung thư. 1.5. Các nghiên cứu lâm sàng của MeV và MuV Bảng 1.1. Các thử nghiệm lâm sàng của MeV và MuV N.C lâm Chủng Cách Liều, thời Bệnh sàng, bệnh Kết quả lâm sàng Năm virus điều trị gian điều trị nhân (n) Virus sởi (MeV) 1/5 bệnh nhân thoái triển hoàn toàn MeV- Tiêm 102–103 U lympho Giai đoạn 1 u tiêm, 3/5 bệnh nhân thoái triển 2005 EZ nội u TCID50 T dưới da (n = 5) một phần u tiêm, 2/3 bệnh nhân này có thoái triển một phần các u ở xa. 103–103 MeV- Tiêm 14/21 bệnh nhân có đáp ứng: thời gian TCID50 (4 Ung thư Giai đoạn 1 CEA màng sống trung bình là 1 năm; 1 bệnh nhân 2010 tuần/lần, buồng trứng (n = 21) bụng có thời gian sống 3,2 năm. 6 tháng) MeV- Tiêm U nguyên bào Giai đoạn 1 Tiến triển CEA nội u đệm đa dạng
6 Truyền Quan sát thấy MV-NIS nhân lên MeV- Giai đoạn 1 tĩnh Đa u tủy chọn lọc ở khối u, thoái triển hoàn 2014 NIS (n=2) mạch toàn u ác di căn ở 1/2 số bệnh nhân. 108–109 MeV- Tiêm Thời gian sống trung bình của bệnh TCID50 Ung thư Giai đoạn 1 NIS màng nhân là 26,5 tháng 2015 (4tuần/lần, buồng trứng (n=16) bụng 6 tháng) MeV- Tiêm màng U trung biểu 2012- Giai đoạn 1 Đang thực hiện NIS bụng mô màng phổi 2018 Ung thư biểu MeV- Tiêm Giai đoạn 1 2013- mô tế bào vảy Đang thực hiện NIS nội u (n=12) 2018 đầu và cổ, vú MeV- Tiêm U thần kinh Giai đoạn 1 2017- Đang thực hiện NIS nội u ngoại biên (n=30) 2021 MeV- Tiêm U nguyên bào Giai đoạn 2 2015- Đang thực hiện NIS nội u đa dạng (n=16) 2019 MeV- U biểu mô Tiêm Giai đoạn 1 2012- CEA buồng trứng, Đang thực hiện nội u (n=37) 2018 màng bụng MeV- Tiêm U biểu mô Giai đoạn 1 2014- Đang thực hiện NIS nội u buồng trứng (n=54) 2021 Virus quai bị (MuV) Chủng Tiêm nội u, 79/90 bệnh nhân đáp ứng với điều 105–107 Ung thư Giai đoạn 2 Urabe tĩnh mạch, trị và 37/79 bệnh nhân có thoái biến 1974 TCID50 tiến triển (n = 90) khí dung khối u đáng kể hay hoàn toàn. Chủng 26/200 bệnh nhân có thoái biến khối 108–109 Ung thư Giai đoạn 2 Urabe u; đa số bệnh nhân có các triệu 1978 PFU tiến triển (n=200) chứng khách quan nhẹ Chủng Tiên dưới 5/7 bệnh nhân đã mất hoàn toàn cổ Urabe da, màng trướng hoặc tràn dịch màng phổi; 108–109 Ung thư Giai đoạn 2 giảm độc bụng, nội bệnh nhân có khối u lớn không đáp 1988 PFU phụ khoa (n = 22) lực ngực và u ứng. Bệnh nhân tràn dịch màng bụng hoặc màng phổi có đáp ứng 1. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Động vật và chất liệu nghiên cứu Chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) chủng BALB/c. Virus vaccine sởi chủng Edmonton và quai bị chủng Urabe. Dòng tế bào Vero và ung thư đại tràng người HT-29. Môi trường nuôi cấy DMEM có thêm 10% FBS (Foetal Bovine Serum) và 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin), và các hóa chất khác… Bộ kit MTT đánh giá tỉ lệ tế bào sống; kit FITC Annexin V Apoptosis Detection kit (BD) đáng giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis; các kháng thể gắn
7 chất phát huỳnh quang phát hiện các tế bào miễn dịch ở lách chuột 2.1.2. Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu Thước kẹp đo u, máy camera, máy đo quang (OD), kính hiển vi quang học, tủ ấm 370 C và 5% CO2, máy ly tâm, hệ thống flow cytometry, kính hiển vi điện tử truyền qua và các dụng cụ tiêu hao phòng thí nghiệm... 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và tăng sinh các dòng tế bào Tế bào HT-29 và Vero được lấy từ nguồnbảo quản âm sâu (-800C), rã đông thật nhanh (50%) – (%CPE ở nồng độ có %CPE
8 ngày thứ 3, 4, và 5 để đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử. 2.2.5. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy Tế bào được xử lý và nhuộm theo hướng dẫn kèm theo bộ kit Fluorescein isothiocyanate, Annexin V Apoptosis Detection kit (BD). Đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử trên hệ thống FACS CANTO II (BD). 2.2.6. Phương pháp nuôi chuột chuột nude Chuột nude chủng BALB/c, được nuôi trong phòng sạch. 2.2.7. Phương pháp tạo khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên dùi chuột thiếu hụt miễn dịch và tính kích thước khối u Tạo khối u trên đùi chuột nude: Tăng sinh tế bào HT-29. Chuẩn bị chuột thiếu hụt miễn dịch, 6-8 tuần tuổi. Tiêm tế bào HT-29, nồng độ 106 tế bào/chuột vào dưới da đùi chuột. Đo kích thước khối u: Đo bằng thước kép chuẩn, đo 2 chiều Công thức tính kích thước khối u: V=D x R2 x 0,5 (mm3). V: thể tích khối u D: chiều dài khối u R: chiều rộng khối u 2.2.8. Phương pháp điều trị chuột nude bằng MeV, MuV Có 4 nhóm (10 con/nhóm): nhóm điều trị phối hợp MuV+MeV; nhóm điều trị MuV; nhóm điều trị MeV; nhóm chứng tiêm dung dịch PBS. Tiêm MeV, MuV nội u, liều 107 PFU/lần/con, 2 lần/tuần, 3 tuần điều trị. 2.2.9. Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị Theo dõi tình trạng sức khỏe chuột: cân nặng, vận động, đáp ứng kích thích, màu sắc da của chuột, phân chuột. So sánh kích thước u theo thời gian điều trị. Thời gian sống trung bình, tỉ lệ sống, chết ở các nhóm nghiên cứu 2.2.10. Phương pháp phẫu tích lấy mô u và lách chuột ở các nhóm nghiên cứu sau điều trị bằng MuV, MeV Phẫu tích lấy lách và mô u phía ngoài (2-3 mm) ở chuột sau điều trị bằng MeV, MuV, rửa sạch, (mô u thì cho vào dung dịch cố định tế bào làm siêu cấu trúc là glutaraldehyte 2% trong đệm cacodylate có pH=7,3)
9 2.2.11. Đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch ở lách chuột nude mang khối u tế bào HT-29 điều trị bằng MuV, MeV bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy Phân lập tế bào từ lách chuột, nhuộm trypan blue kiểm tra tỉ lệ tế bào sống (tế bào sống >95%), xác định số lượng tế bào xét nghiệm (106 tế bào). Nhuộm tế bào lách bằng kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang: Kháng thể kháng CD11b- tế bào bạch cầu dòng tủy, kháng thể kháng CD49b-tế bào NK, kháng thể kháng CD11c-tế bào DC, kháng thể kháng CD11c-tế bào DC trưởng thành. 2.2.12. Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào Soi, đọc kết quả trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400, JEOL, Nhật Bản (Khoa Hình thái - Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh). 2.13. Phương pháp phân tích kết quả Sử dụng phần mềm SPSS.20, GraphPad Prism, có ý nghĩa thống kê khi p
10 3.2. Chuẩn độ MeV, MuV theo phương pháp TCID50 Hình 3.4. Kết quả nhuộm xanh 5. methylen chuẩn độ TCIC50 TCID50 của MeV= 5x107,5/ml TCID50 của MeV= 5x106,4/ml Chuẩn độ TCID50 MuV Chuẩn độ TCID50 MeV 3.3. MeV và MuV ly giải trực tiếp dòng tế bào HT-29 in vitro 3.3.1. Tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV tạo hợp bào in vitro 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Hình 3.5. Hình ảnh tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV tạo hợp bào in vitro 3.3.2. Kết quả đánh giá gây độc tế bào ung thư đại tràng người HT-29 của MeV, MuV bằng nghiệm pháp MTT % tế bào sống % T B so n g 150 100 14. 50 15. 16. 0 N gày 3 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 10 10 10 10 10 10 10 M eV + M uV M eV M uV C o n tr o l Biểu đồ 3.1. KếT quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 3
11 % tế bào sống % T B so n g 150 100 50 0 N gày 4 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 M u V + M eV M eV M uV C o n tr o l Biểu đồ 3.2. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 4 % tế bào sống % T B so n g 1 5 0 1 0 0 5 0 0 N gày 5 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 M u V + M eV M eV M uV C o n tr o l Biểu đồ 3.3. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 5 3.4. Đánh giá tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết apoptosis và hoại tử sau nhiễm MuV, MeV in vitro 17. 18. Hình 3.6. Biến đổi hình thái của tế 19. bào HT-29 chết theo chương trình (A) ở vật kính 20X; (B) ở vật kính 20. 10X; (C), (D) ở vật kính 40X. 21. 22. % tế bào apoptosis % A p o p to s is 20 23. 1 4 ,4 ± 2 ,9 1 15 24. 8 ,8 ± 1 ,1 4 25. 10 6 ,1 ± 0 ,9 6 5 1 ,6 7 ± 1 ,0 2 0 N gày 5 M uV M e V M uV+ M e V C o n tro l Biểu đồ 3.4. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV
12 % tế bào apoptossis sớm % A p o p to s is s o m 2 ,1 7 ± 0 ,6 5 3 1 ,7 7 ± 0 ,4 6 2 0 ,7 7 ± 0 ,1 2 1 0 ,1 7 ± 0 ,0 6 0 Ngày 5 M uV M e V M uV+ M e V C o n tro l Biểu đồ 3.5. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV % tế bào apoptosis muộn % A p o p t o s is m u ô n 20 1 2 ,2 3 ± 2 ,7 5 15 10 7 ,0 3 ± 0 ,9 3 5 ,3 ± 0 ,8 5 5 1 ,5 ± 0 ,9 6 N gày 5 0 MuV MeV MuV+ MeV C o n tr o l Biểu đồ 3.6. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV % tế bào hoại tử % T .B h o a i tu 50 2 3 ,3 ± 1 9 ,1 40 1 9 ,1 ± 6 ,2 30 1 3 ,2 ± 1 ,6 20 7 ,7 ± 0 ,2 10 0 N gày 5 MuV MeV MuV +MeV C o n tr o l Biểu đồ 3.7. Tỉ lệ tế bào HT-29 hoại tử ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV
13 Hình 3.7. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 5 (I) Nhóm nhiễm MuV; (II) Nhóm nhiễm MeV; (III) Nhóm nhiễm MuV+MeV (Q1) vùng tế bào apoptosis sớm; (Q2) vùng tế bào apoptosis muộn; (Q4) vùng tế bào hoại tử %% tế bào apoptosis A p o p to sis 15 1 2 ,3 7 ± 1 ,1 2 10 4 ,8 7 ± 0 ,3 1 4 ,3 7 ± 0 ,4 0 5 1 ,6 7 ± 1 ,0 2 0 N gày 4 MuV MeV MuV +MeV C o n tr o l Biểu đồ 3.8. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV % tế bào apoptosis sớm % A p o p t o s is s o m 5 2 ,9 7 ± 0 ,9 4 3 2 0 ,6 ± 0 ,1 0 ,5 3 ± 0 ,2 1 1 0 ,1 7 ± 0 ,0 6 0 N gày 4 M uV M e V M uV+ M e V C o n tro l Biểu đồ 3.9. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV % tế bào apoptosis muộn % A p o p t o s is m u o n 15 9 ,4 ± 0 ,3 5 10 4 ,3 3 ± 0 ,1 5 3 ,7 7 ± 0 ,4 5 5 1 ,5 ± 0 ,9 6 0 N gày 4 M uV M e V M uV+ M e V C o n tro l Biểu đồ 3.10. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV
14 % tế bào hoại tử % T .B h o a i tu 30 2 0 ,3 ± 1 1 ,0 1 9 ,1 ± 6 ,1 1 9 ,1 ± 6 ,2 20 1 2 ,6 ± 1 ,1 10 0 N gày 4 M uV M e V M uV+ M e V C o n tro l Biểu đồ 3.11. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 4 nhiễm MuV, MeV Hình 3.8. Kết quả phân tích 1. dòng chảy các tế bào ung thư đại 2. tràng người HT-29 nhiễm MeV, 3. MuV ở ngày thứ 4 4. (I) Nhóm nhiễm MuV (II) Nhóm nhiễm MeV 5. (III) Nhóm nhiễm MuV+MeV Q1: vùng tế bào apoptosis sớm Q2: vùng tế bào apoptosis muộn Q4 là vùng tế bào hoại tử % tế bào apoptosis % A p o p to s is 8 5 ,4 3 ± 0 ,3 2 6 3 ,7 7 ± 0 ,2 5 3 ,2 ± 0 ,1 7 4 1 ,6 7 ± 1 ,0 2 2 0 N gày 3 M uV M e V M uV+ M e V C o n tro l Biểu đồ 3.12. Tỉ lệ tế bào apoptosis ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV
15 % tế bào apoptosis sớm % A p o p t o s is s o m 1 .5 0 ,8 3 ± 0 ,3 5 1 .0 0 ,6 ± 0 ,1 0 ,5 ± 0 ,0 0 .5 0 ,1 7 ± 0 ,0 6 0 .0 N gày 3 M uV M e V M uV+ M e V C o n tro l Biểu đồ 3.13. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV % tế bào apoptosis muộn % A p o p t o s is m u o n 4 ,6 ± 0 ,1 5 4 3 ,2 7 ± 0 ,2 5 2 ,6 ± 0 ,2 3 1 ,5 ± 0 ,9 6 2 1 0 N gày 3 M uV M e V M uV+ M e V C o n tro l Biểu đồ 3.14. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV % tế bào % Tế hoạitửtử bào hoại Ngày 3 Biểu đồ 3.15. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV
16 Hình 3.9. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 3 (I) Nhóm MuV (II) Nhóm MeV (III) Nhóm MuV+MeV Q1 là vùng tế bào apoptosis sớm Q2 là vùng tế bào apoptosis muộn Q4 là vùng tế bào hoại tử. 3.5. MeV, MuV kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép trên chuột nude 3.5.1. Kết quả ghép u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 Bảng 3.1. Kết quả tạo khối u tế bào HT-29 trên đùi chuột nude Số ngày sau tiêm tế Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày bào HT-29 thứ 1 thứ 3 thứ 5 thứ 7 thứ 8 (n = 40) (n=40) (n=40) (n=40) (n=40) Các chỉ số theo dõi Số chuột có u 0 10 24 32 40 Tỷ lệ có u (%) 0 25 60 80 100 Hình 3.10. Kết quả ghép u tế bào HT- 29 dưới da đùi chuột nude (A) ngày thứ 3 sau tiêm tế bào HT-29; (B) ngày thứ 5 sau tiêm tế bào HT-29; (C) ngày thứ 7 sau tiêm tế bào HT-29; (D) ngày thứ 8 sau tiêm tế bào HT-29.
17 3.5.2. Kết quả điều trị chuột nude mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 bằng MeV, MuV Bảng 3.2. Kết quả theo dõi sức khỏe chuột sau điều trị MeV và MuV Số Mức độ đánh giá Tiêu chí theo dõi TT Bình thường Kém 1 Vận động 40 con 0 2 Đáp ứng với kích thích 40 con 0 3 Phân chuột 40 con 0 4 Da chuột 40 con 0 Trọng lượng chuột (gam) T r o n g lu o n g (g a m ) 34 32 30 28 26 24 S a u d ie u t r i M eV +M u V MeV MuV C o n tr o l OV Biểu đồ 3.16. Thay đổi trọng lượng chuột sau điều trị bằng MeV, MuV A B Biểu đồ 3.17. Kết quả kích thước khối u sau điều trị bằng MeV, MuV (A): So sánh kích thước u ở ngày điều trị thứ nhất (B): So sánh kích thước u ở ngày điều trị thứ 29 N gày 60 5 1 ± 2 ,9 4 2 ,4 ± 9 ,2 4 3 ,2 ± 8 ,3 40 3 0 ,6 ± 2 ,1 20 0 M e V+ M uV M uV M e V c o n tro l Các nhóm NC S au d ie u O V tr i Biểu đồ 3.18. So sánh thời gian sống trung bình của chuột sau điều trị MeV, MuV
18 % sống sót 100 MeV+MuV MeV MuV 80 Control 60 40 20 00 0 Số ngày Biểu đồ 3.19. Kết quả tỉ lệ chuột còn sống sau điều trị bằng MuV, MeV 3.5.3. Đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột nude mang khối u đại tràng dòng tế bào HT-29 được điều trị bằng MuV và MeV 3.5.3.1. Phân lập tế bào từ lách chuột nude điều trị MeV, MuV Hình 3.11. Lách và tế bào lách chuột nude ở các nhóm nghiên cứu 3.5.3.2. Kết quả tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột nude +-Tế bào bạch cầu dòng tủy % CD11b % C D 11b + 40 2 5 ,6 5 30 1 6 ,3 20 8 ,4 10 3 ,2 7 0 C ác nhóm N C M e V M uV M e V+ M e V C o n tro l % CD49b+-Tế bào NK % C D 49b + 25 1 2 ,9 5 20 9 ,3 5 15 5 ,6 10 5 1 ,2 3 0 C ác nhóm N C M e V M uV M e V+ M e V C o n tro l