Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học "Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng" được nghiên cứu với mục tiêu: Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020); Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mô phòng thí nghiệm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -------------------*--------------------- PHẠM THỊ HÀ TRANG NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ TRÊN NGƯỜI Ở HAI XÃ TRỌNG ĐIỂM THUỘC NINH BÌNH, PHÚ YÊN VÀ CHẾ TẠO KIT LAMP ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN TẠI CỘNG ĐỒNG Chuyên ngành : Dịch tễ học Mã số : 972 01 17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2024
Công trình hoàn thành tại Viện sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Trần Thanh Dương 2. TS. Trương Văn Hạnh Phản biện 1: ………………………………………………… Phản biện 2: ………………………………………………… Phản biện 3: ………………………………………………… Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Vào hồi giờ ngày tháng năm 20 Có thể tìm đọc luận án tại: 1. Thư viện Quốc gia Việt Nam 2. Viện Sốt rét - Thư viện Ký sinh trùng và Côn trùng học.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ 1. Phạm Thị Hà Trang, Trương Văn Hạnh, Hoàng Đình Cảnh, Trần Thanh Dương, (2024), Thực trạng và một số yếu tố liên quan đến nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người tại xã Yên Lộc, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình (2018-2020). Tạp chí Y học Việt Nam, Tập 538, tháng 5/2024 (số 2), tr: xxx- xxx (Bài báo đã được Tạp chí chấp nhận đăng). 2. Phạm Thị Hà Trang, Trương Văn Hạnh, Hoàng Đình Cảnh, Trần Thanh Dương, (2024), Thực trạng và một số yếu tố liên quan đến nhiễm sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini trên người tại xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên (2018- 2019). Tạp chí Y học Việt Nam, Tập 538, tháng 5/2024 (số 2), tr: yyy-yyy (Bài báo đã được Tạp chí chấp nhận đăng). 3. Phạm Thị Hà Trang, Trương Văn Hạnh, Hoàng Đình Cảnh, Trần Thanh Dương, (2024), Nghiên cứu chế tạo kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis nhiễm trên người. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Tập X, (số Y), tr: yyy-yyy (Bài báo đã được Tạp chí chấp nhận đăng).
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm sán lá gan nhỏ là bệnh truyền nhiễm qua đường ăn uống gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng. Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới, điều kiện tự nhiên, xã hội và tập quán ăn uống, canh tác, sinh hoạt thuận lợi cho sự lưu hành bệnh giun sán, trong đó có bệnh sán lá gan nhỏ. Việt Nam ghi nhận hai loài sán lá gan nhỏ là C. sinensis và O. viverrini phân bố ở ít nhất 32 tỉnh thành. Hai địa phương Ninh Bình và Phú Yên được coi là điểm nóng với tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ khá cao với nhiều yếu tố liên quan, trong đó, nguyên nhân chính do tập quán ăn gỏi cá của nhân dân đã tồn tại lâu đời. Có rất nhiều phương pháp xét nghiệm nhiễm sán lá gan nhỏ. Gần đây, nhiều nghiên cứu có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt (đặc biệt là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng trung gian– Loop - mediated Isothermal Amplification - LAMP) với nhiều ưu điểm. Đến nay, tại Việt Nam chưa có kit LAMP được thương mại hóa để chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ trên người. Xuất phát từ những yêu cầu khoa học và thực tiễn trên đây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng” với các mục tiêu sau: 1. Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020). 2. Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mô phòng thí nghiệm. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI VÀ Ý NGHĨA KHOA HỌC, Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN 1. Mô tả, đánh giá thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ và yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại 2 xã Yên Lộc và An Mỹ của tỉnh Ninh Bình và Phú Yên, góp phần tiên lượng và xây dựng chiến lược phòng chống bệnh sán lá gan nhỏ tại khu vực có thói quen ăn gỏi cá của 02 tỉnh trên có hiệu quả.
2 2. Đây là nghiên cứu đầu tiên xây dựng hoàn thiện được quy trình và chế tạo thành công kit LAMP chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis và O. viverrini trên người tại Việt Nam tạo ra được bước đột phá về giải pháp kỹ thuật trong chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis và O. viverrini trên người, đóng góp vào công tác chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời, đáp ứng yêu cầu thực tiễn phòng chống nhiễm sán lá gan nhỏ trên người nói riêng và các bệnh ký sinh trùng đường ruột nói chung tại nước ta. CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án dày 140 trang gồm: Đặt vấn đề 2 trang; Tổng quan: 33 trang; Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 23 trang; Kết quả nghiên cứu 41 trang; Bàn luận: 39 trang; Kết luận 2 trang. Luận án có 39 hình, 45 bảng số liệu, 10 phụ lục. Có 127 tài liệu tham khảo, có > 40% số tài liệu tham khảo trong thời gian 5 năm trở lại đây. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm sán lá gan nhỏ 1.1.1. Tác nhân gây bệnh Trên thế giới, có 3 loài sán lá gan nhỏ thuộc họ Opisthorchiidae gây bệnh cho người là Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini và Opisthorchis felineus với đặc điểm sinh học, vòng đời và lâm sàng tương đối giống nhau. Ở Việt Nam hiện chỉ ghi nhận sự có mặt của 2 loài sán lá gan lá gan nhỏ là Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini. 1.1.2. Vật chủ - Vật chủ chính: gồm người và một số động vật ăn cá. - Vật chủ trung gian thứ nhất: gồm nhiều loài ốc khác nhau tùy địa điểm nghiên cứu. - Vật chủ trung gian thứ hai của sán lá gan nhỏ gồm nhiều loài cá nước ngọt. 1.1.3. Đường lây và cơ chế lây truyền bệnh 1.1.3.1. Đường lây Ăn gỏi cá hoặc cá chưa nấu chín nhiễm nang ấu trùng sán là nguy cơ số 1 gây nhiễm sán lá gan nhỏ cho người, tỷ lệ nhiễm cao ở những cộng đồng có thói quen ăn gỏi cá. 1.1.3.2. Cơ chế lây truyền bệnh: Vòng đời sán lá gan nhỏ phức tạp, qua nhiều vật chủ.
3 1.1.4. Sức cảm thụ và miễn dịch Mọi người đều có thể mắc bệnh khi bị nhiễm sán lá gan nhỏ. Người không có miễn dịch tự nhiên với sán lá gan nhỏ, sau khi nhiễm mầm bệnh có thể dễ dàng bị tái nhiễm. 1.1.5. Một số yếu tố liên quan đến nhiễm sán lá gan nhỏ trên người 1.1.5.1. Tập quán ăn gỏi cá Thói quen ăn gỏi cá là một trong các yếu tố nguy cơ quan trọng ở những người nhiễm sán lá gan nhỏ, điều nay đã được chứng minh ở nhiều nghiên cứu tại Việt Nam và một số nước châu Á khác. 1.1.5.2. Độ tuổi, giới tính, nghề nghiệp Tuổi: Nói chung nhiễm sán lá gan nhỏ quan sát thấy ở tất cả các nhóm tuổi, tuy nhiên thường gặp ở người lớn. Tỷ lệ và cường độ nhiễm tăng theo tuổi. Giới: Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy tỷ lệ và cường độ nhiễm ở nam cao hơn nữ. Nghề nghiệp: cũng là một trong các yếu tố liên quan đến tình trạng lây nhiễm sán lá gan nhỏ. 1.1.5.3. Một số yếu tố khác: - Yếu tố kinh tế - xã hội. - Tập quán sinh hoạt và canh tác. - Yếu tố môi trường tự nhiên. 1.1.6. Các biện pháp phòng chống - Không ăn gỏi cá và các loại thực phẩm chế biến từ cá chưa nấu chín. - Không dùng phân người nuôi cá, không phóng uế xuống nguồn nước. - Truyền thông giáo dục sức khỏe cho cộng đồng về phòng chống bệnh sán lá gan nhỏ. - Định kỳ tẩy sán cho chó, mèo, lợn. - Điều trị dự phòng tại cộng đồng: Áp dụng Hướng dẫn tẩy sán lá gan nhỏ tại cộng đồng theo quyết định số 1931/QĐ-BYT ngày 19/5/2016 của Bộ trưởng Bộ Y tế. 1.1.7. Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ ở người trên thế giới và Việt Nam 1.1.7.1. Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới Bệnh sán lá gan nhỏ phân bố trên thế giới rất đa dạng ở nhiều quốc gia khác nhau. Có khoảng 680 triệu người trên thế giới có nguy cơ nhiễm.
4 Ước tính 45 triệu người sống ở châu Á và châu Âu nhiễm bệnh (khoảng 35 triệu người nhiễm C. sinensis, 10 triệu người nhiễm O. viverrini và 1,2 triệu người nhiễm O. felineus). C. sinensis gây bệnh phổ biến nhất trong số 3 loài sán lá gan nhỏ gây bệnh ở người chủ yếu ở châu Á bao gồm Trung Quốc, Hàn Quốc, miền bắc Việt Nam và miền Đông nước Nga. Hơn nữa, những người di cư hoặc du lịch từ các vùng lưu hành bệnh sẽ làm tăng nguy cơ truyền bệnh sang các nước khác. Tương tự như C. sinensis, dân cư nhiễm sán O. viverrini thường sống ở những vùng có nhiều ao, hồ và dọc những con sông. Ước tính có khoảng 12,39 triệu người nhiễm O. viverrini tại 4 quốc gia lưu hành chủ yếu bao gồm Thái Lan (6,71 triệu), CHDCND Lào (2,45 triệu), Việt Nam (2,07 triệu) và Campuchia (1,00 triệu). Loài O. felineus ít phổ biến nhất trong số 3 loài sán lá gan nhỏ. Nó đã được báo cáo từ các quốc gia châu Âu trừ Phần Lan, Na Uy và Thụy Điển. Khoảng 12,5 triệu người có nguy cơ nhiễm O. felineus, chủ yếu gặp ở khu vực Nga, Đông Âu. 1.1.7.2. Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại Việt Nam Việt Nam là nước đang phát triển, hai đới khí hậu khác biệt tại hai miền Nam-Bắc là điều kiện thuận lợi cho cho sự xuất hiện và phân bố của 2 loài sán lá gan nhỏ: C. sinensis lưu hành ở ít nhất 21 tỉnh miền bắc và O. viverrini lưu hành ở ít nhất 11 tỉnh miền trung và khu vực Tây Nguyên, tỷ lệ nhiễm khác nhau tùy địa điểm. Các tỉnh: Nam Định (nơi cao nhất là 26,0–37,5%), Ninh Bình (tỷ lệ nhiễm dao động từ 23,5–31,0%), Phú Yên, Bình Định được coi là điểm nóng nhiễm sán lá gan nhỏ, tập quán ăn gỏi cá của nhân dân đã tồn tại lâu đời. Số liệu điều tra 5 năm gần đây của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ tại Bình Định là 6,8%; Quảng Trị 8,9%; Đăk Lăk 4,8%; Phú Yên 15,3%; Quảng Nam 4,3%; Hòa Bình 24,4%; Nam Định 11,8%; Ninh Bình 21%, Thanh Hóa 21,6%, Yên Bái 23 – 64,7%, Sơn La < 1%. Tuy nhiên, còn rất nhiều địa phương mà người dân có thói quen ăn gỏi cá nhưng chưa được đánh giá và chưa có số liệu về thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ để có thể tiến hành các biện pháp can thiệp và phòng chống bệnh.
5 1.1.7.3 Một số đặc điểm về tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại hai xã của Ninh Bình và Phú Yên - Tại Ninh Bình: Điều tra của Đoàn Thúy Hòa (2020) tại Kim Sơn và Yên Khánh, Ninh Bình cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ là 20,1%. Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm sán trung bình ở nam cao hơn ở nữ (p< 0,001; OR = 3,994). Người ăn gỏi cá có nguy cơ nhiễm sán cao gấp 5,8 lần không ăn gỏi cá (p
6 1.4.2. Thành phần phản ứng LAMP Thành phần cơ bản của phản ứng LAMP: Các cặp mồi, dung dịch đệm, enzym Bst ADN polymerase, ADN khuôn, chất nhuộm màu (nếu có). 1.4.3. Cơ chế của phản ứng LAMP Ba giai đoạn chính: tạo vật liệu khởi đầu, tái bản và kéo dài chuỗi, lặp lại chu kỳ. 1.4.4. Đánh giá kết quả của LAMP Đánh giá kết quả bằng điện di và không bằng điện di. 1.4.6. Tính ưu việt của kỹ thuật LAMP Ưu điểm là nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, không cần các thiết bị chuyên dụng có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương và cao hơn các phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR. Kết quả của phản ứng LAMP có thể được quan sát ngay dưới ánh sáng thường hoặc soi dưới tia UV. 1.4.8. Một số ứng dụng của kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ ở người Nghiên cứu của Lê Thanh Hòa, Nguyễn Văn Đề và cộng sự (2012) chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini: xét nghiệm LAMP nhạy hơn 10- 100 lần so với PCR. Từ năm 2017 - 2020, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương đã thực hiện Nhiệm vụ nghiên cứu khoa học cấp Quốc Gia “Nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, giun lươn đường ruột tại thực địa”. Kết quả đã nghiên cứu chế tạo thành công các bộ kít LAMP trong đó có Bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis và O. viverrini. Độ nhạy, độ đặc hiệu đánh giá thử nghiệm tại phòng thí nghiệm đạt > 95%. 1.4.9. Chế tạo và chuẩn hóa bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ - Thiết kế mồi để xác định tác nhân gây bệnh mong muốn; - Xây dựng quy trình tiến hành phản ứng LAMP; - Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của phản ứng LAMP; - Tạo chuẩn dương cho kit; - So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện; - Đóng gói bộ sinh phẩm; - Đánh giá độ ổn định của bộ sinh phẩm trên mẫu chuẩn.
7 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu 1: Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020) 2.1.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Người dân ≥ 18 tuổi sống liên tục trên 1 năm tại 2 xã của tỉnh Ninh Bình và tỉnh Phú Yên. - Thời gian: Năm 2018, 2020: 459 người tại Ninh Bình. Năm 2019, 2020: 460 người tại Phú Yên. - Địa điểm nghiên cứu + Thực địa: xã Yên Lộc, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình và xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên. + Khoa sinh học phân tử, Khoa Ký sinh trùng Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương. 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu - Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả có phân tích với các đợt điều tra cắt ngang. - Cỡ mẫu nghiên cứu Sử dụng công thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu mô tả để xác định một tỷ lệ: Trong đó: n: cỡ mẫu tối thiểu cần nghiên cứu tại 1 xã của mỗi tỉnh. Z1—α/2 : Hệ số tin cậy, ứng với ngưỡng xác suất α = 0,05 (độ tin cậy 95%) thì Z1—α/2 = 1,96. p : Tỷ lệ nhiễm ước đoán, theo báo cáo của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng- Côn trùng Trung ương tỷ lệ này là 0,21. d: Sai số tuyệt đối cho phép, chọn d = 0,038. Với các giá trị lựa chọn cỡ mẫu tính được là 441 người/địa điểm. Thực tế, nghiên cứu 460 người ở xã An Mỹ (Phú Yên), 459 người ở xã Yên Lộc (Ninh Bình). - Tiêu chuẩn và phương pháp chọn mẫu Chọn mẫu theo phương pháp chọn mẫu chùm (Cluster Sampling) kết hợp với phương pháp chọn mẫu hệ thống (Systematical Sampling) tại mỗi chùm. Thu mẫu phân theo từng cá thể cho đến khi đủ cỡ mẫu nghiên cứu. Chọn đối tượng có khả năng trả lời phỏng vấn, đồng ý tham gia nghiên cứu và cung cấp mẫu phân. Loại trừ: Người bị bệnh tâm thần và đã uống thuốc tẩy sán trong 6 tháng gần thời gian điều tra.
8 - Nội dung nghiên cứu Xác định tỷ lệ nhiễm sán lá nhỏ trên đối tượng nghiên cứu và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ. - Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu Kỹ thuật phỏng vấn, điều tra KAP. Kỹ thuật Kato-Katz. Kỹ thuật real time PCR xác định sán lá gan nhỏ. - Các chỉ số đánh giá Tỷ lệ nhiễm sán lá nhỏ. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ. Một số yếu tố liên quan đến nhiễm sán lá gan nhỏ. - Các biến số nghiên cứu Gồm: tuổi, giới, nghề nghiệp, trình độ học vấn, sử dụng nhà tiêu hợp vệ sinh, có ao nuôi cá, sử dụng phân tươi để nuôi cá và trồng trọt, có nuôi chó/mèo, tiền sử ăn gỏi cá (cá sống). - Phương pháp thống kê và xử lý số liệu: Xử lý thống kê bằng phương pháp y sinh học. Sử dụng phần mềm SPSS 22.0. 2.2. Mục tiêu 2: Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mô phòng thí nghiệm 2.2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.2.1.1. Đối tượng: - Sán lá gan nhỏ O. viverrini, sán lá gan nhỏ C. sinensis. - Con trưởng thành hoặc ấu trùng của một số loài sán, giun khác thu thập từ người hoặc động vật gồm: H. taichui; H. pumilo; F. gigatica; P. heterotremus; T. solium; An. duodenale; As. lumbricoides. O. viverrini. 2.2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: Năm 2018 – 2020. - Địa điểm nghiên cứu Thực địa: xã An Mỹ (Phú Yên), xã Yên Lộc (Ninh Bình). Phòng Thí nghiệm Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương. Kiểm định kit LAMP tại Viện kiểm định Quốc gia Vacxin và sinh phẩm Y tế, Bộ Y tế. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Thực nghiệm trong Phòng Thí nghiệm và trên thực địa. 2.2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu - Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kit tại Phòng Thí nghiệm: z2 1−α/2 Pse (1− Pse) z2 1−α/2 Pse (1− Pse) nse = W2 . P = 72,9 nsp = W2 . (1−P) = 24,3
9 Trong đó: z1-α/2: Hệ số tin cậy, với độ tin cậy 95% thì z1-α/2 =1,96. Ước tính tỷ lệ dương tính là (P): 25%. Độ nhạy mong đợi của kít LAMP (Pse): 95%. Độ đặc hiệu mong đợi của kít LAMP (Psp): 95%. Sai số tuyệt đối cho phép của độ nhạy và độ đặc hiệu (W): 10%. Tính được cỡ mẫu tối thiểu xác định độ nhạy là 72,9 và độ đặc hiệu là 24,3. Thực tế, tiến hành đánh giá trên 100 mẫu: 73 mẫu dương tính và 27 mẫu phân âm tính. - Đánh giá bộ kít tại thực địa hẹp tại thực địa: 150 mẫu/địa điểm. 2.2.2.3. Các kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu - Thiết kế mồi sử dụng các phần mềm tin sinh chuyên dụng. Kỹ thuật real-time PCR. Xử lý thống kê bằng phần mềm MedCalc 19.4.1. 2.2.2.5. Nội dung nghiên cứu Sơ đồ thiết kế nghiên cứu chế tạo các bộ kít LAMP - Thiết kế bộ mồi LAMP xác định sán lá gan nhỏ. - Kiểm nghiệm độ chính xác và khả năng hoạt động của bộ mồi thiết kế Tối ưu hóa các điều kiện Tạo chứng chuẩn dương plasmid tái phản ứng LAMP: Nhiệt độ, tổ hợp mang gen của các tác nhân nồng độ MgSO4, thời gian đích sán lá gan nhỏ(sản phẩm đề tài phản ứng, chỉ thị màu. nghiên cứu khoa học cấp quốc gia). - Xác định ngưỡng phát hiện của bộ kít - Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kít - Xác định điều kiện bảo quản, tính ổn định của kit . - Đánh giá bộ kít tại thực địa. - So sánh bộ kít với bộ mồi có mục đích tương tự - Đánh giá ngoại kiểm kít LAMP Đóng gói thành phẩm bộ kít Xây dựng bộ tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định kit 2.2.2.6. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu Phân tích số liệu bằng các phần mềm tin sinh, phần mềm Quickcalc, phần mềm Medcalc.
10 2.2.2.7. Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu Kiểm soát quá trình phỏng vấn đối tượng nghiên cứu và quy trình xét nghiệm phân. Mã hóa số liệu. 2.3. Đạo đức trong nghiên cứu Có đầy đủ hồ sơ đạo đức trong nghiên cứu; Đảm bảo cam kết nghĩa vụ và trách nhiệm của người nghiên cứu và quyền lợi của người tham gia nghiên cứu. Thực hiện đúng quy trình kỹ thuật. Chỉ nghiên cứu ở người tự nguyện. Tất cả những người có kết quả dương tính với ký sinh trùng được hướng dẫn điều trị tại cơ sở y tế địa phương theo phác đồ quy định của Bộ Y tế. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018- 2020) 3.1.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu Bảng 3.1. Đặc điểm nhân khẩu học của đối tượng nghiên cứu (n=919) Xã Yên Lộc (459) Xã An Mỹ (460) Tổng (919) Chỉ số Phân loại (Ninh Bình) Phú Yên SL TL (%) SL TL (%) SL TL (%) Nam 218 47,5 196 42,6 414 45,0 Giới Nữ 241 52,5 264 57,4 505 55,0 18 – 29 39 8,5 72 15,7 111 12,1 30 – 49 212 46,2 210 45,7 422 45,9 Nhóm tuổi 50 - 59 tuổi 129 28,1 145 31,5 274 29,8 ≥ 60 tuổi 79 17,2 33 7,2 112 12,2 Nông dân 291 63,4 322 70,0 613 66,7 Công nhân 38 8,3 19 4,1 57 6,2 Nghề CBCC, hưu trí 31 6,8 33 7,2 64 7,0 nghiệp Khác (đi học, buôn 99 21,6 86 18,7 185 20,1 bán, tự do) Tiểu học 100 21,8 115 25 215 23,4 Trình độ THCS 157 34,2 175 38 332 36,1 học vấn THPT 152 33,1 135 29,3 287 31,2 THCN, CĐ, ĐH 50 10,9 35 7,6 85 9,2
11 Người dân tham gia nghiên cứu ở nhóm 30 – 49 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (45,9%). Nữ giới chiếm 55%, chủ yếu là nông dân (66,7%), phần lớn có trình độ ở bậc THCS (36,1%) và THPT (31,2%). 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại địa điểm nghiên cứu Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người (n=919) KTXN Xét nghiệm nhiễm sán lá gan nhỏ p Kato-Katz (1) Real-time PCR (2) Xã (Tỉnh) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) xã Yên Lộc (459) (Ninh Bình) 75 16,33 89 19,39 xã An Mỹ (460) (Phú Yên) 73 15,90 93 20,22 < 0,05 Tổng 2 xã (919) 148 16,10 182 19,80 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ chung khi xét nghiệm bằng real-time PCR là 19,80% (tỷ lệ nhiễm C. sinensis tại xã Yên Lộc (Ninh Bình): 19,39%; tỷ lệ nhiễm O. viverrini tại xã An Mỹ (Phú Yên): 20,22%) cao hơn có ý nghĩa thống kê (p
12 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ chung ở nam là 26,81% cao hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nữ là 14,1%. Kết quả tương tự tại xã Yên Lộc (Ninh Bình) và xã An Mỹ (Phú Yên). Bảng 3.8. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ tại địa điểm nghiên cứu (n =148) Xã Xã Yên Lộc Xã An Mỹ Tổng 2 xã (Tỉnh) (Ninh Bình) (Phú Yên) CĐN trung CĐN trung CĐN trung SL(%) SL(%) SL(%) CĐN bình (EPG) bình (EPG) bình (EPG) 64 133 Nhẹ 69 (92,0) (87,7) (89,9) 241,9 ± 553,3 ± 15 395,5± Trung bình 6 (8) 9 (12,3) 109,0 226,8 (10,1) 126,8 Nặng 0 0 0 Cộng 75 73 148 Đa số đối tượng nhiễm cường độ nhẹ (89,9%), không có trường hợp nhiễm cường độ nặng. Kết quả tượng tự tại các điểm nghiên cứu. Cường độ nhiễm chung là 395,5±126,8 EPG (xã Yên Lộc (Ninh Bình): 241,9±109,0 EPG, xã An Mỹ (Phú Yên): 553,3±226,8 EPG). 3.1.3. Một số yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ ở người 3.1.3.1. Liên quan giữa nhiễm sán lá gan nhỏ và ăn gỏi cá Bảng 3.14. Liên quan giữa nhiễm sán lá gan nhỏ và tiền sử ăn gỏi cá sống (n=919) Ăn gỏi cá Nhiễm sán lá gan nhỏ Xã (Tỉnh) OR, 95% CI p sống Có Không Tổng Xã Yên Có ăn 79 194 273 7,17 < 0,05 Lộc Không ăn 10 176 186 (3,60-14,27) (Ninh Bình) Tổng 89 370 459 - Có ăn 82 157 239 9,9 Xã An Mỹ < 0,05 Không ăn 11 210 221 (5,14-13,78) (Phú Yên) Tổng 93 367 460 - Có ăn 161 351 512 8,43 < 0,05 Tổng 2 xã Không ăn 21 386 407 (5,23-13,57) Tổng 182 737 919 -
13 Có liên quan giữa ăn gỏi cá với tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ tại các địa điểm nghiên cứu và chung cho hai tỉnh, với các giá trị OR, 95% CI tương ứng: 7,17 (3,6 -14,27), 9,9 (5,14 – 13,78), 8,43 (5,23 – 13,57). Bảng 3.17. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và tần suất ăn gỏi cá sống (n=161) Xã (Tỉnh) Xã Yên Lộc Xã An Mỹ Chung 2 xã (Ninh Bình) (Phú Yên) Tần suất Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ SL p SL p SL p ăn gỏi cá (%) (%) (%) Ít nhất 1 lần/1 tuần 22 43,1 20 48,8 42 45,7 Ít nhất 1 lần/1 tháng 27 28,4 34 35,8 61 32,1
14 3.1.3.6. Mô hình hồi quy đa biến của tỷ lệ nhiễm sán lá nhỏ ở người dân với một số yếu tố liên quan Bảng 3.23. Mô hình hồi quy đa biến Biến dự đoán OR (95% CI) p-value Nhà tiêu hợp vệ sinh Không 1,29 (0,84 – 1,98) > 0,05 Có (ref) 1 Sử dụng phân ủ < 6 tháng trong nông nghiệp Có 1,98 (1,3 – 3,02) < 0,05 Không (ref) 1 Nhà có ao nuôi cá Có 0,93 (0,65 – 1,33) > 0,05 Không (ref) 1 Có nuôi chó mèo Có 1,33 (0,93 – 1,90) > 0,05 Không (ref) 1 Đã từng ăn gỏi cá Có 8,85 (5,46 – 14,34) < 0,05 Không (ref) 1 Phương trình hồi quy: Y (xi)= -0,028 + 0,69 (Sử dụng phân ủ < 6 tháng trong nông nghiệp) +2,18 (Có ăn gỏi cá) + Người dân có tiền sử ăn gỏi cá có nguy cơ nhiễm sán lá gan nhỏ cao gấp 8,85 lần người dân không ăn gỏi cá. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với 95%CI: 5,46 – 14,34; p < 0,05. + Người dân sử dụng phân ủ dưới 6 tháng trong nông nghiệp có nguy cơ nhiễm sán lá gan nhỏ cao gấp 1,98 lần người dân sử dụng phân ủ trên 6 tháng. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với 95%CI: 1,3 – 3,02; p < 0,05. 3.2. Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mô phòng thí nghiệm 3.2.1. Thiết kế, đánh giá lựa chọn các bộ mồi LAMP Dựa trên các tiêu chí kỹ thuật để đánh giá chọn được 2 bộ mồi cho O. viverrini và C. sinensis. 3.2.2. Đánh giá tính đặc hiệu và khả năng hoạt động của bộ mồi LAMP thiết kế. 3.2.2.1. Tính đặc hiệu của bộ mồi LAMP thiết kế về mặt lý thuyết Khi blast trình tự primer trên ngân hàng NCBI chỉ bắt cặp đặc hiệu với các trình tự gen đích nad1 của O. viverrini và C. sinenis, không lai chéo với các loài khác.
15 3.2.2.2. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của bộ mồi LAMP thiết kế trên thực nghiệm (-) 1 2 3 4 5 (-) 6 7 8 9 10 L Hình 3.2. Sản phẩm LAMP điện di trên gel agarose 2% sử dụng bộ mồi thiết kế đặc hiệu cho sán lá gan nhỏ O. viverrini và C. sinensis Bộ mồi HOV1-Nad1 xác định O. viverrini và HCS-Nad1 xác định C. sinensis đều có khả năng hoạt động tốt. 3.2.3. Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng LAMP 3.2.3.1. Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi tối ưu Trong đó: L: Thang đo 100 bp Giếng 1-10: Nhiệt độ khảo sát từ 59-680C, mỗi giếng cách nhau 10C Giếng 6: Sản phẩm LAMP với khoảng nhiệt độ ủ mồi 640C Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm khảo sát nhiệt độ ủ mồi của phản ứng LAMP chẩn đoán O. viverrini. Kết quả khảo sát chọn được nhiệt độ tối ưu cho phản ứng LAMP chẩn đoán O. viverrini là 640C, C. sinensis là 630C. 3.2.3.2. Kết quả khảo sát nồng độ MgSO4 Trong đó: L: Thang đo 100 bp (-): Chứng âm (+): ADN khuôn nồng độ 10-3 ng/µl Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm LAMP khảo sát với các nồng độ MgSO4 Kết quả cho thấy nồng độ MgSO4 8 mM được lựa chọn là nồng độ tối ưu cho kít LAMP.
16 3.2.3.3. Kết quả nồng độ betaine đưa vào phản ứng LAMP Kết quả chọn bổ sung betaine nồng độ 0,2 M vào thành phần phản ứng LAMP chẩn đoán O. viverrini và không bổ sung betaine vào thành phần phản ứng LAMP chẩn đoán C. sinensis. 3.2.3.4. Kết quả khảo sát lượng thể tích ADN tổng số đưa vào phản ứng Kết quả lựa chọn lượng ADN đưa vào phản ứng là 4 µl. 3.2.3.5. Khảo sát thời gian tối ưu cho phản ứng LAMP Kết quả lựa chọn 60 phút là thời gian tối ưu cho phản ứng của kít LAMP. 3.2.3.6. Kết quả khảo sát chất chỉ thị màu cho phản ứng LAMP Nồng độ HNB 100 µM và được lựa chọn là nồng độ tối ưu sử dụng cho các bộ kít LAMP. 3.2.3.7. Khảo sát ngưỡng phát hiện của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ Giai đoạn một: Kết quả xác định ngưỡng phát hiện sơ cấp của kit LAMP chẩn đoán O. viverrini là 10-7 ng/µl (3,08 x101 số bản sao/µl), C. sinensis là 10-7 ng/µl (3,06 x101 số bản sao/µl). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hình 3.9. Ảnh sản phẩm LAMP quan sát bằng mắt thường xác định ngưỡng phát hiện sơ cấp của kít LAMP Giai đoạn hai: Kết quả phân tích xác định ngưỡng phát hiện LOD 95% của kít LAMP chẩn đoán O. viverrini là 2,30 x 101 số bản sao gen/µl 1 1 (95% CI: 1,77 x 10 - 3,69 x10 bản sao gen/μl); C. sinensis là 2,66 x 101 bản sao gen/µl (95% CI: 2,05 x 101 - 4,15 x101 bản sao gen/μl) 3.2.4. Đóng gói thành phẩm bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ Bộ kít được đóng gói 50 phản ứng/bộ gồm: 01 Tờ hướng dẫn sử dụng và bảo quản của bộ kit và 06 ống hóa chất.
17 3.3. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ, so sánh bộ mồi 3.3.1. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán O. viverrini tại phòng thí nghiệm. Bảng 3.27. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán O. viverrini real time PCR Dương tính Âm tính Tổng Kít LAMP Dương tính 71 0 71 Âm tính 2 27 29 Tổng 73 27 100 - Độ nhạy là 97,26% (95% CI: 89,98%-99,82%) - Độ đặc hiệu là 100% (95% CI: 85,24%- 100%) 3.3.2. Độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP chẩn đoán C. sinensis tại phòng thí nghiệm Bảng 3.28. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán C. sinensis. Real time PCR Dương tính Âm tính Tổng Kít LAMP Dương tính 72 0 72 Âm tính 1 27 28 Tổng 73 27 100 - Độ nhạy là 98,63% (95% CI: 91,92% - 99,99) - Độ đặc hiệu là 100% (95% CI: 85,25% - 100%) 3.3.3. Kết quả so sánh bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ với bộ mồi có cùng mục đích. Cả 2 bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ đều cho kết quả xét nghiệm tương đồng với với bộ mồi đã công bố của Lê Thanh Hòa và cộng sự (2012), Rahman và cộng sự (2017) với hệ số Kappa 1,0. 3.3.4 Đánh giá độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ Kết quả xác định các bộ kít LAMP chẩn đoán O. viverrini và C. sinensis hoạt động ổn định sau 6 tháng mở nắp và 1 năm từ ngày sản xuất khi chưa mở nắp bảo quản ở -200C ± 50C, không tiến hành làm tan và đông đá bộ kit LAMP quá 3 lần.